Procédures modérées

138 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une microchirurgie avec clampage de l'artère et de la veine rénale pendant 22 minutes puis trois prélèvements sanguins, pour mettre au point un modèle de vieillissement rénal destiné à tester des candidats médicaments. Le porteur indique que l'anesthésie profonde peut provoquer la mort chez ces animaux de 70 à 72 semaines, et que toutes seront tuées 28 jours après la chirurgie pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme que les cultures de cellules rénales humaines ne peuvent pas reproduire la complexité physiologique ni les réponses systémiques, et conclut au recours à la souris.

Objectifs

10% de la population mondial est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique est caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale résultant à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Ces problèmes rénaux sont particulièrement exacerbés chez les personnes âgées. Il a été démontré que le vieillissement rénal accélère le développement de maladies rénales chroniques à la suite de lésions aigües de l’organe. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie chez les sujets âgés sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments à visés rénale. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité et de toxicité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques. De plus, le principe de cette procédure repose sur une microchirurgie relativement moins invasive comparée aux procédures existantes qui sont beaucoup plus lourdes pour l’animal (ex : néphrectomie unilatérale et incision des 2/3 du rein controlatéral, obstruction unilatérale de l’uretère…). Enfin, comme le vieillissement accélère l’établissement de maladies rénales chroniques, ce nouveau modèle in vivo permettra de réduire considérablement les délais d’expérimentations et les contraintes associés subit par les animaux.

Procédures

Chaque animal subira : - 1 procédure de microchirurgie : Laparotomie puis clampage de l'artère et de la veine rénale pendant 22 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - 3 prélèvements sanguin à d0 (avant chirurgie), à d2 et d6-7 post-chirurgie. Prélèvement d'environ 20 microlitre de sang par légère incision au niveau de la queue

Impact sur les animaux

Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe

Devenir

28 jours apès la procédure de microchirurgie, toutes les souris seront euthanasiées et leurs organes collectés pour analyses.

Remplacement

En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), notre société travaille sur le développement de modèle in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques ne peuvent pas être reproduit in vitro.

Réduction

Dans la première phase de mise au point du modèle, un nombre restreint de souris sera utilisé (environ 8) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Plusieurs facteurs clés pourront être alors déterminé tels que le temps idéal de chirurgie, d'ischémie et de suture. Sur la deuxième phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène de l'ischémie. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse à l’ischémie. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. La stratégie d'ischémie reperfusion unilatérale permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, dans les observations comparatives, le "groupe" contrôle sera constitué du rein controlatéral n'ayant pas subi d'ischémie-reperfusion.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur très expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, la procédure de microchirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (100mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. La souris sera aussi maintenue sous oxygène lors de la procédure chirurgicale. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture. Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effet secondaire lié au traitement et minime.

Choix des espèces

La souris est largement utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’ischémie-reperfusion au niveau rénal et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. Les souris utilisées lors de cette procédure seront très âgées (70-72 semaines). Comme décrit dans la partie introductive, les souris âgées présentent un phénotype rénal qui se rapproche des conditions retrouvées lors des maladies rénales chroniques. Afin d’accélérer le processus et d’exacerber ce phénotype, celles-ci subiront une procédure d’ischémie-reperfusion. Cette microchirurgie sur ce type d’animal permettra d’obtenir un modèle expérimental qui présentent beaucoup de similitudes avec les conditions physio-pathologiques retrouvés chez l’Homme.

822 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans la moelle épinière ou le cerveau sous anesthésie et subissent des tests de force musculaire, avant une perfusion intracardiaque mortelle permettant de prélever la moelle épinière, pour évaluer une protéine censée protéger les motoneurones dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur indique que les souris mutées présentent dès huit semaines une baisse de force musculaire et un léger comportement dépressif. Il affirme que la production de ces données précliniques sur l'animal est nécessaire pour soutenir une demande d'essai clinique.

Objectifs

Les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlent les mouvements volontaires ainsi que la respiration. Dans la sclérose amyotrophique latérale (SLA), ces cellules dégénèrent ce qui entraîne des troubles moteurs. Notre laboratoire a montré que la protéine EN1 exprimée et sécrétée par les interneurones de la moelle épinière est importante pour la survie des MN. Une injection intrathécale unique de la protéine recombinante hEN1 permet de bloquer pendant 3 mois la neurodégénérescence, et des injections répétées de hEN1 permettent de maintenir l’effet neuroprotecteur sur une durée plus longue. Ce projet a pour objectif de produire des données précliniques sur l’activité neuroprotectrice de hEN1 permettant de soutenir une demande d’essai clinique évaluant le recours à hEN1 dans le traitement de la SLA, ainsi que d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous chercherons à : 1) tester l’activité de nos lots de protéine hEN1 afin d’évaluer leur conformité et permettre ainsi leur utilisation; 2) décortiquer les mécanismes d’action de hEN1; 3) déterminer si l’effet neuroprotecteur de hEN1 implique une action sur les synapses inhibitrices des MN ; et 4) évaluer l’impact de l’hyperactivité des MN corticaux sur la mort des MN spinaux. Nous prévoyons donc d’injecter la protéine hEN1 par voie intrathécale, ainsi que des virus encodant la protéine dans le cerveau de souris par injection stéréotaxique. Ces injections seront suivies d’études comportementales, physiologiques et histologiques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégénératives est en constante augmentation à l’échelle planétaire. En France, la SLA affecte actuellement 5000 à 7000 patients, avec une incidence annuelle proche de 2,5 pour 100 000 habitants. Chez les patients atteints de SLA, les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlant les mouvements volontaires ainsi que la respiration dégénèrent, ce qui entraîne des troubles moteurs. L’espérance de vie des patients est en général inférieure à 5 ans après établissement du diagnostic. Cette maladie est progressive et fatale. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour cette pathologie. En plus de la lourde souffrance pour les patients et leurs proches, le coût de prise en charge pour la santé publique est important. La protéine recombinante humaine Engrailed 1 (hEN1) promeut la survie des MN. Ce projet aidera à comprendre les mécanismes qui sous-tendent la mort des MN chez les souris et de caractériser le mécanisme d’action de hEN1 sur la survie des MN. Ce projet servira aussi à évaluer la conformité de nos lots de hEN1 en amont de leur libération pour injection chez le patient. L’ensemble de ces expériences est d’une importance critique pour permettre la soumission une demande d’essai clinique de Phase I/II visant à évaluer la sûreté mais également l’activité d’une thérapie innovante pour le traitement de la SLA reposant sur l’injection intrathécale de hEN1.

Procédures

Les injections intrathécale se déroulent en conditions d’asepsie et d’anesthésie générale. La procédure dure en moyenne environ 15 minutes. Un maximum de 640 souris sur 5 ans seront soumis à cette procédure. Les injections stéréotaxique intracérébrale se déroulent en conditions d’asepsie et d’anesthésie générale. La procédure dure en moyenne environ 1 heure. Les animaux utilisés seront âgés de 30 jours. Un maximum de 16 souris seront soumis à cette procédure. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront âgés de 4,5 mois. La procédure prend en moyenne environ 2 heures. Un maximum de 24 souris seront soumis à cette procédure. Les évaluations de la force musculaire par tests moteurs seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront âgés de 6 semaines à 4,5 mois. Environs 15 minutes sont nécessaires pour la réalisation des 3 tests pour un animal donné. Un maximum de 552 souris seront soumis à cette procédure. Les perfusions intracardiaque seront réalisées sous anesthésie générale et prennent environ 15 minutes. L’ensemble des animaux utilisés (i.e. un maximum de 822 souris) seront soumis à cette procédure.

Impact sur les animaux

Nos expériences nécessitent des procédures de classe modérée. Pour toutes nos expériences, les souris sont anesthésiées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Cependant, et même si notre laboratoire a acquis une solide expérience en la matière, suite à une injection intrathécale ou intracérébrale ou à une enregistrement électrophysiologique, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voutée, des problèmes digestifs, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Les souris En1+/- ont été caractérisées au laboratoire et sont actuellement utilisées dans le cadre d’autres projets. Elles présentent à partir de l’âge de 24 semaines de légères modifications de leur activité locomotrice et un léger comportement dépressif. Elles présentent à partir de l’âge de 8 semaines une baisse de force musculaire, mais ne manifestent cependant aucun point limite, au moins jusqu’à l’âge de 15 mois. Les souris Gephyrin-RFP ne présentent pas de phénotype dommageable. Nous attendons donc que les souris En1+/- ::Gephyrin-RFP que nous obtiendrons dans le cadre du croisement des 2 lignées présentent un phénotype dommageable au même niveau que la lignée En1+/-. Néanmoins, une fois ce croisement obtenu, une vérification de phénotype sera réalisée.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur moelle épinière collectée afin de permettre des analyses histochimiques visant à évaluer l’effet neuroprotecteur de hEN1 sur les MNs spinaux ou caractériser l’expression de L1, de Piwil1 ou du rapporteur fluorescent Gephyrin-RFP.

Remplacement

Nos expériences devant permettre de soutenir une demande d’essai clinique, il est nécessaire qu’elles soient réalisées sur l’animal. De plus, l’expérimentation in vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de l’activité neuroprotectrice de hEN1. Enfin, nos travaux ont pour objectif d’évaluer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la mort des MNs dans la SLA, ce qui implique d’avoir recours à un modèle animal offrant ainsi un contexte physiologique pertinent pour l’étude de l’origine des déficits observés chez les patients. Dans ce cadre précis, la souris s’avère être un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques.

Réduction

Nos travaux précédents réalisés sur des animaux soumis à une injection intrathécale ainsi qu’à une évaluation comportementale nous ont permis de démontrer qu’un nombre de 8 souris par condition expérimentale permet d’obtenir une puissance statistique satisfaisante malgré d’éventuels « drops out » ou de mauvaise réalisation de l’injection. Cependant, lorsque des animaux sont utilisés dans le seul but de permettre des analyses histologiques, nos résultats antérieurs indiquent que 6 souris par groupe constituent un nombre minimum d’animaux pour une puissance statistique suffisante (www.stasticalsolutions.net/pssTtest_calc.php). Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une cage elle-même chauffée grâce à un matelas chauffant jusqu’à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leurs groupes d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement et observés et pesés chaque jour pendant cinq jours. Ensuite, en plus d’une inspection visuelle quotidienne, des relevés de poids seront réalisés au moins 2 fois par semaine et d’éventuels signes de douleur seront recherchés. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.

Choix des espèces

La souris est une des espèces majoritairement utilisées dans le domaine scientifique pour l'étude des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet ainsi une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de SLA ont été générés et caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de EN1 dans un modèle murin de la SLA ainsi qu’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la mort des MNs spinaux chez la souris En1+/-. Les premiers signes de neurodégénérescence étant observés à l’âge de 3 mois, nous prévoyons d’injecter la protéine hEN1 à cet âge afin de pouvoir évaluer sa capacité à bloquer le phénomène dégénératif. Certaines de nos expériences seront également réalisées à des stades plus précoces (à partir de l’âge de 1 mois), afin de caractériser les déficits moléculaires intervenant en amont de la mort des MNs.

4776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à trois chirurgies stéréotaxiques du cerveau puis une imagerie terminale d'environ deux heures sous anesthésie, avant d'être tuées, pour développer des techniques de microscopie et cartographier l'espace extracellulaire du cerveau sain et malade. Le porteur décrit surtout les nuisances liées à la chirurgie et au transport vers le centre d'imagerie. Il affirme qu'obtenir ces données sur l'animal sain et pathologique passe par des modèles reproduisant la complexité des maladies humaines.

Objectifs

Comprendre le fonctionnement cérébral est un enjeu sociétal majeur tant pour la connaissance générale de cet organe encore bien mystérieux que pour notre capacité à combattre et traiter les maladies neurologiques et psychiatriques. La compréhension de la vie intracellulaire des cellules cérébrales, comme les neurones, a connu une expansion incroyable au cours des dernières décennies, ouvrant par exemple la voie à des manipulations de l’activité des réseaux neuronaux. Cependant, le coeur de l’activité d’un réseau neuronal qu’est le passage d’information d’une cellule à l’autre à travers le milieu extracellulaire, reste malheureusement un processus très peu compris. La compréhension de cet environnement, où toutes les molécules de l’information cérébrale passent, reste très limitée à cause d’un manque de technologie permettant son étude en condition vivante. Le projet repose sur une capacité à développer de nouvelles approches de microscopie à haute résolution au service de l’étude de la communication cérébrale. Il a pour objectif de comprendre le fonctionnement cérébral en décryptant comment l’environnement extracellulaire du cerveau contrôle la communication entre cellules dans un contexte physiologique et dans des maladies neurodégénératives et psychiatriques. En effet, combattre les maladies neurologiques et psychiatriques nécessite une compréhension fine des désordres moléculaires en place, jusqu’à la diffusion des molécules à visée thérapeutique. L’utilisation du modèle rongeur permet d’acquérir des connaissances et de favoriser leur transfert à la clinique humaine.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’utiliser deux nouvelles approches de microscopie super résolutive développées dans nos laboratoires pour fournir une description détaillée de l’espace extracellulaire et du réseau structurel de la matrice extracellulaire dans le tissu sain et pathologique : technique d’imagerie de nano-objets uniques (suivi des nanotubes/nanoparticules de carbone). Ces approches permettront de composer, à une échelle nanométrique, une carte de l’espace extracellulaire et de sa matrice dans les régions d’intérêt. C’est pourquoi, nous proposons à travers cette étude qui regroupe quatre laboratoires de caractériser l’espace extracellulaire via des technologies nouvelles et inédites de microscopie de super-résolution

Procédures

Chirurgie stéréotaxique (1h maximum), au maximum 3 chirurgies stéréotaxiques pour les modèles pathologiques sur 4 mois. Anesthésie pendant la chirurgie (1h) et en terminal pour l'imagerie (en moyenne 2h), une fois par animal.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie stéréotaxique, mais bien cadrés par l’utilisation d’analgésiques adaptés et d’un suivi régulier des animaux. Ils sont aussi liés au transport des animaux entre leur hébergement et le centre d'imagerie, mais réduits au minimum dans le temps, avec un respect du maintien de la température.

Devenir

A l'issu des procédures tous les animaux seront euthanasiés soit à des fins d'imagerie (tranches) soit après l'imagerie in vivo.

Remplacement

L'étude de l'espace extracellulaire a connu des avancées récentes, grâce au développement de techniques comme la microscopie en super résolution appliquée aux modèles ex vivo. Pour compléter les connaissances sur le sujet il est nécessaire d'obtenir des données sur l'animal sain et pathologique, à travers des modèles animaux réalisés chez le rongeur. Nous souhaitons caractériser l’espace extracellulaire sain et pathologique, nécessitant l’utilisation de modèles animaux pouvant mimer la complexité des maladies chez l’humain. Pour la partie expérimentale sur tranche des tests de Student seront pratiqués, en revanche pour les études sur les modèles in vivo la comparaison des groupes sera effectuée grâce à une ANOVA.

Réduction

Cette étude concerne un consortium composé de 4 laboratoires français qui à la fin de l’étude récupèreront des échantillons afin d’effectuer des études histologiques ou biochimiques, complétant ainsi les études in vivo et ainsi la base de données scientifiques, limitant l’expérimentation animale à cette seule étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Ils sont acclimatés pendant deux semaines avant l'expérimentation. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité.

Choix des espèces

L'utilisation de souris dans le développement d'outil de microscopie en super résolution est pertinente dans cette phase de notre projet. En effet, la taille réduite de l'animal, son cycle de vie court et la disponibilté des modèles pathologiques permettent d'optimiser le développement d'outils pour l'imagerie in vivo de l'environnement extracellulaire. Les animaux seront utilisés à l'âge de 2 mois et jusqu'a 6 mois, pour permettre de travailler avec des animaux sains et pathologiques adultes.

696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur du poumon ou de mélanome sous anesthésie puis un suivi de la croissance tumorale sur quatre à huit semaines, avant d'être tuées pour prélever la tumeur, afin de tester si l'invalidation d'un gène nommé TREX1 renforce l'effet des chimiothérapies. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements ou s'ulcérer et que les métastases pulmonaires provoquent des difficultés respiratoires. Il affirme que cette preuve de concept ne peut s'établir que sur des modèles immunocompétents, l'animal ne pouvant plus être remplacé à ce stade.

Objectifs

L'immunothérapie est l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement du cancer mais de trop nombreux patients ne répondent pas de manière satisfaisante à ses nouvelles thérapies, en particulier les patients atteints de mélanome métastatique et de cancer du poumon. Un défi majeur dans le traitement du cancer consiste donc à faire bénéficier l’immunothérapie à un plus grand nombre de patients. Des études précliniques ont montré que les traitements cytotoxiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie stimulent les réponses immunitaires antitumorales. Une meilleure compréhension de la façon dont ce processus est régulé pourrait être exploitée pour activer le système immunitaire du patient afin que celui-ci détruise les cellules cancéreuses. Nous avons montré récemment qu'une protéine, particulièrement présente dans les cellules cancéreuses, a pour but de rendre ces cellules cancéreuses invisibles au système immunitaire, empêchant donc celles-ci d'être détruite. Nos résultats montrent que lorsque l'on supprime cette protéine, les cellules tumorales deviennent à nouveau sensibles au système immunitaire, qu'elles sont plus sensibles également aux chimiothérapies et donc qu'elles sont détruites plus facilement. Le projet qui fait l’objet de cette saisine consistera donc désormais à démontrer, dans deux modèles précliniques murins de mélanome et de cancer du poumon dont les cellules tumorales n'expriment plus la protéine, une meilleure efficacité des chimiothérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif principal de faire la preuve de concept, sur deux modèles de tumeur solide de mélanome et de cancer du poumon, que l’invalidation du gène TREX1 peut à la fois augmenter la sensibilité de la cellule tumorale aux chimiothérapies conventionnelles mais également contribuer à générer une réponse immunitaire anti-tumorale, souvent liée chez l’homme à des réponses très favorables aux traitements et soutenues dans le temps avec l’absence de récidives (rémissions complètes). Cette étude ouvrira un champ particulièrement intéressant de développement d’inhibiteur de la protéine TREX1, comme nouvelles molécules thérapeutiques permettant de potentialiser les effets des chimiothérapies et donc d’en diminuer les doses, et par conséquents réduire les effets secondaires souvent sévères associés à ces doses.

Procédures

Tout au long des expériences décrites dans ce projet aucun type de prélèvement ne sera fait sur les animaux vigiles. Les seules manipulations au cours de l'expérience seront la pesée hebdomadaire et la mesure de la tumeur trois fois par semaine. Les mesures tumorales s'étaleront sur une durée de 4 à 8 semaines. Seuls des prélèvements terminaux seront faits en fin d'expérience. La greffe sous-cutanée ainsi que l'administration sous-cutanée du traitement se fera de manière unique et sous anesthésie et le réveil des animaux sera particulièrement suivi et surveillé..

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs. Dans le modèle sous-cutané, les effets indésirables peuvent être une gêne de la locomotion ou une ulcération de la tumeur. Dans le modèle métastatique (métastases pulmonaires) les effets indésirables peuvent être des difficultés respiratoires. Le suivi quotidien des animaux nous permettra de procéder à l’euthanasie de tout animal atteignant un des points limites décrit ci-après.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

La preuve de concept du rôle de cette protéine dans la résistance aux chimiothérapies conventionnelles revêt une importance capitale dans le cadre du développement de nouvelles molécules inhibitrices de cette protéine pour le développement en clinique chez des patients atteints de mélanome ou de cancer du poumon mais également pouvant être étendus à d’autres type de cancer. Cette preuve de concept ne peut s’établir que sur de véritables modèles précliniques immunocompétents dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Seuls les modèles proposés nous permettront non seulement de mesurer l’efficacité de nos traitements en fonction de la présence ou de l’absence de l’expression de TREX1 sur la croissance tumorale et la survie globale, et d’étudier les mécanismes de la mise en place d’une réponse immunitaire anti-tumorale. A ce stade du projet il n’est donc plus possible de substituer l’animal à un modèle in vitro qui ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester le rôle de TREX1 sur l’efficacité des traitements.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 640 souris sur 3 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) des chimiothérapies lors de l'inactivation de cette nouvelle cible thérapeutique. Le nombre d’animaux a été évalué de manière à effectuer les tests statistiques adéquats pour définir la significativité de nos résultats D’autre part le projet est dessiné dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux dans le cheminement expérimental proposé, dans la mesure où la validation d’une étape donnera le feu vert à l’étape suivante uniquement si les résultats attendus sont significatifs. De la même manière la répétition d’une expérience ne se fera que si un effet est observé avec une tendance sans que le significativité statique soit atteinte. Cette répétition sera effectuée afin de montrer la reproductibilité de cette tendance. L’expertise et le recul que nous avons au laboratoire sur les deux modèles de mélanome et de cancer du poumon nous permettra de limiter le nombre d’animaux à son strict minimum afin d’avoir une validation statistique de nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage d'une superficie de 500cm2) à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. La prostration, les difficultés respiratoires, l’agressivité et l’isolement sont tous des critères d’arrêt conduisant au sacrifice des animaux avant la fin du protocole. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. L’utilisation de souris femelles dans nos protocoles expérimentaux réduit le risque d’agressivité et d’isolement. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience et seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation induite par les greffes de cellules de mélanome ou de cancer du poumon. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé. Les signes listés ci-dessous feront l’objet d’une attention particulière lors de nos visites journalières: - le volume tumoral et l’ulcération de la tumeur (observation de la tumeur et mesure) - l’absence d'hydratation ou de prise de nourriture (observation de l’état général) - la gêne de la locomotion (observation du déplacement dans la cage) - le saignement ou une perte de liquide par un orifice (observation de l’animal) - l’isolement par rapport aux autres animaux, le dos vouté, les yeux enfoncés, la respiration saccadée, l’amaigrissement (observation du comportement de l’animal).

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé dans notre étude est le modèle le plus relevant pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence des effets thérapeutiques sur le long-terme et éviter les récidives ou les résistances aux traitements actuels. Dans la mesure où nos effets passent par le système immunitaire, c'est le modèle le plus pertinent par rapport à ce qui se déroule chez l'homme. Ce modèle est considéré comme une étape obligatoire avant de potentielles applications cliniques. Les souris seront âgées de 7 semaines, âge adulte chez la souris, période à partir de laquelle le système immunitaire est complètement mature et fonctionnel, et où l'on observe une forte incidence et une forte homogénéité de prise de greffe.

540 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une à trois chirurgies cérébrales pour implanter cathéter, électrodes ou fibres optiques, et 520 d'entre eux s'auto-administrent de la cocaïne chaque jour pendant deux à trois mois, pour étudier les effets d'une stimulation cérébrale profonde sur l'addiction. Le porteur indique que les rats peuvent perdre du poids, se gêner du bloc de ciment dentaire fixé sur le crâne et se battre entre partenaires de cage. Il affirme que l'étude des comportements de consommation exige un animal vigile et libre de ses mouvements, faisant du rat un modèle qu'il juge irremplaçable.

Objectifs

L'addiction, notamment à la cocaïne, est une maladie psychiatrique pour laquelle il n'existe pas de médication efficace. Ainsi, les approches chirurgicales, telles que la stimulation cérébrale profonde (SCP) sont désormais envisagées pour réduire les comportements addictifs liés à la consommation de drogues. La SCP consiste en l’implantation d’électrodes de stimulation dans des zones profondes du cerveau afin de normaliser l’activité neuronale, responsable de comportements pathologiques en injectant des impulsions électriques à haute fréquence. Bien qu’utilisée avec succès chez l’homme, notamment pour la maladie de Parkinson et la dépression, les mécanismes cellulaires responsables des effets bénéfiques de la SCP restent largement méconnus. Nos données récentes obtenues chez le rat indiquent que la SCP du noyau subthalamique permet de réduire certains comportements pathologiques liés à l’auto-administration de cocaïne. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets bénéfiques de la SCP sur les comportements de type addiction chez le rat.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cellulaires et moléculaires du STN ciblés par le SCP pour produire ses effets bénéfiques sur les comportements addictifs. Pour cela, nous utiliserons un nouveau protocole comportemental, qui recrée fidèlement les conditions observées chez l'humain, en permettant l'observation concomitante de l'émergence de l'escalade de la cocaïne et de sa recherche compulsive. Les enregistrements électrophysiologiques sur tranches permettront de caractériser les neuroadaptations induites par la cocaïne dans le NST et de déterminer comment celles-ci sont affectées par la SCP. Ce projet permettra également de caractériser le rôle de la connexion préfrontale-NST dans les comportements addictifs. Ce projet générera des résultats à fort impact translationnel, apportant de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction, et confirmera le potentiel de la SCP du NST pour le traitement de cette pathologie.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisé sous anesthésie générale et analgésie adaptée. 180 animaux seront soumis à un seul acte (160 implantés avec un cathéter, 45 min ; 20 injectés avec un virus, 60min). 180 animaux seront soumis à deux actes (implantation de cathéter, 45min, + électrodes de stimulation, 90min). 180 animaux seront soumis à trois actes chirurgicaux chirurgies (injection de virus, 60min, + implantation de fibres optiques, 90min, + cathéter, 45min). 520 animaux s'auto-administreront la cocaïne quotidiennement durant 2-3 mois, entre 2h et 8h par jour.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les conséquences ‘classiques’ à court terme des interventions chirurgicales. Dans les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation d’électrodes ou de fibres optiques, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas ad libitum), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. Enfin, les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters, électrodes, ou fibres optiques, peuvent parfois provoquer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu. Suivant les sessions d’auto-administration durant le protocole PIE, les animaux présentent une hyperactivité marquée, qui s’estompe en moins d’une heure (la dose i.v. de cocaïne est faible). Les symptômes de manque (perte de poids, agressivité…) sont rares, car les animaux ont accès tous les jours à la cocaïne.

Devenir

Afin d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques ex vivo, sur tranches, tous les animaux du projet seront mis à mort pendant ou à la fin de des procédures.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements et choix. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.

Réduction

Notre approche, visant à réaliser des enregistrements électrophysiologiques chez des animaux préalablement soumis à un protocole comportemental, permet à elle seule de réduire le nombre d’animaux. Toutefois, dans l’optique de ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous analyserons régulièrement les données expérimentales. Nous effectuerons a posteriori des tests de puissance statistique afin de calculer la robustesse statistique de nos résultats. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale. Par expérience, 10 animaux sont nécessaires par condition testée pour permettre de mettre en évidence un effet comportemental dans les protocoles d'auto-administration de drogues ; ce nombre prenant en compte l’exclusion de certains individus suite à d’éventuels problèmes inhérents à ce type d’étude (infection, cathéter bouché etc…). Pour les études combinant auto-administration et SCP et/ou de l'optogénétique, 15 animaux par condition testée sont nécessaires pour anticiper de possibles mauvais placements d'électrodes/fibres.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. L'état de santé général de tous les animaux de l'étude est suivi quotidiennement, ce qui nous permet de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) et/ou de perte importante de poids, l’animal sera isolé et aura accès ad libitum à une nourriture enrichie. Un traitement antidouleur pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc). Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie appropriée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. Les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'homme. Afin d'améliorer la qualité des enregistrements électrophysiologiques, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez de jeunes adultes 7-8 semaines (environ 200g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer de l'ovaire, un suivi par imagerie deux fois par semaine, puis jusqu'à vingt et une injections d'un produit bloquant ou la pose chirurgicale d'une mini-pompe, pour étudier le rôle de protéines appelées prokinéticines. Le porteur indique que la maladie peut provoquer une accumulation de liquide, un amaigrissement et des ulcérations de la tumeur. Il affirme qu'après l'échec de ses essais sur des souris immunodéprimées, la confirmation dans un "organisme entier" doté d'un système immunitaire complet est "indispensable".

Objectifs

Le cancer de l’ovaire est le cancer le plus fréquent et le plus mortel parmi les cancers gynécologiques. ll est responsable de plus de 140 000 décès chaque année dans le monde. Sa forme la plus commune est le cancer épithélial de l'ovaire (CEO), généralement diagnostiqué à un stade avancé et qui représente plus de 95% des tumeurs malignes de l'ovaire. La chirurgie suivie d'une chimiothérapie à base de platine constitue le traitement standard actuel. Cependant, cette approche n’est pas toujours efficace pour améliorer la survie des patientes. Depuis une quinzaine d’années, notre groupe de recherche s’intéresse à l’étude d’une famille de protéines, les prokinéticines. Ces protéines sont spécifiquement exprimées dans les tissus endocrines (ovaire, testicule, cortex surrénal et placenta) où elles agissent sur les cellules endothéliales. Très peu de données existent quant à leur rôle dans le développement et la progression du cancer de l’ovaire, L’objectif de notre projet est de déterminer l'implication de deux protéines PROK1 et PROK2 dans le développement et ou la progression du cancer épithélial de l'ovaire (CEO) par le biais d'approches clinique, in vitro et in vivo. Nos expériences ont démontré que les taux circulants et ovariens de PROK1 et de ses récepteurs étaient augmentés chez les patientes CEO. Les prokinéticines sont également fortement exprimées par l’environnement tumoral et notamment par les cellules immunitaires. L’ensemble de ces résultats suggère que les prokinéticines contribuent au développement du CEO et que le blocage de leurs effets pourrait constituer une thérapie pour le traitement du CEO. Nos expériences précédentes sur des souris présentant une immunité fortement altérée et dans lesquelles des cellules humaines de CEO étaient injectées n’ont pas donné satisfaction, nous proposons donc dans ce projet de confirmer ces résultats dans un organisme entier vivant et possédant une système immunitaire complet, indispensable pour l’observation du développement de la tumeur ovarienne et pour le suivi de sa progression. Le nouveau modèle consistera à injecter des cellules murines du cancer de l’ovaire. Ce modèle de cancer de l’ovaire murin a déjà été utilisé et publié par plusieurs laboratoires. Il nous permettra de suivre le développement tumoral puisque les cellules seront dotées d’un marqueur bioluminescent.

Bénéfices attendus

Le cancer de l’ovaire reste une cause majeure de décès dans le monde. La recherche de nouvelles cibles dans son traitement est indispensable pour améliorer la survie des patientes. Les bénéfices attendus de ce projet seront une meilleure compréhension de rôle des prokinéticines dans le développement et la progression de ce cancer. Plus spécifiquement, les résultats de ces tests permettraient de démontrer la possible valeur thérapeutique du blocage des récepteurs au sein d’un organisme entier.

Procédures

Les animaux seront injectés avec des cellules de souris de cancer de l’ovaire, sous anesthésie gazeuse. Pour suivre le développement tumoral, elles seront imagées 10 min après une injection de luciférine pendant 15 sec. Ce suivi sera effectué 2 fois par semaine pendant 5 semaines maximum. Une partie de ces souris sera traitée par un produit qui bloque l’action des récepteurs pendant une durée maximale de 3 semaines, à raison d’un nombre d’injection maximum de 21 par souris. Pour l’autre groupe des souris, une mini pompe nécessitant une intervention chirurgicale de 10 min maximum sera posée pendant 2 semaines afin de délivrer en continu les protéines d’intérêt.

Impact sur les animaux

L’injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale ou en sous-cutané est susceptible de provoquer une modification du poids de l’animal, que ce soit une augmentation (avec le développement de liquide d’ascites) ou une diminution/ cachexie due à la progression de la maladie (affaiblissement). Des signes de stress (poils hérissés, absence de toilettage), de douleur due à une éventuelle ulcération de la tumeur ou une inflammation de la zone suturée peuvent apparaître. Des changements de comportement tels que des difficultés à se déplacer ou manger peuvent être attendus.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à la fin de la procédure en raison de l’injection de cellules cancéreuses. Leur réutilisation n’est donc pas envisageable.

Remplacement

L’équipe a récemment montré l’importance des prokinéticines dans l’environnement tumoral (cellules immunitaires, cellules des vaisseaux, adipocytes) sur des biopsies de patientes avec un cancer de l’ovaire. Nos modèles in vitro, sur lesquels nous nous sommes appuyés jusqu’à présent, limitent fortement l’avancée de nos recherches puisque la reproduction d’un environnement et notamment d’un système immunitaire y est impossible. En effet, ils ne nous permettent pas de mimer de façon précise le cancer de l’ovaire dans des conditions se rapprochant de ce qui est observé en clinique. Le recours au modèle animal est donc indispensable. Ces études sont donc à réaliser sur des animaux qui peuvent intégrer les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Nous utiliserons dans cette étude 165 souris femelles sur 5 ans. En utilisant des doses déjà testées dans d'autres études, nous éviterons de réaliser une étude dose-réponse ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les expériences seront réalisées dans un laboratoire contrôlé pour l’absence de pathogènes. Les souris sont hébergées en groupe sociaux dans un environnement contrôlé avec nourriture et eau ad-libitum. Le milieu est enrichi grâce à des maisonnettes et des carrés de coton (pour la nidification et le jeu) conformément aux règles mises en place dans l’installation. Les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins, y compris les week-ends, afin de s’assurer de leur bon état général. Une grille de « scoring » a été établie pour chaque procédure afin de définir des points limites précis. La prise en charge des souris en cas de stress, de douleur ou d’inconfort est également détaillée et connu par tous les responsables du projet. L’utilisation d’analgésiques est systématique lorsque les animaux présentent des signes de souffrance. La taille de la tumeur ainsi que le poids des souris seront mesurés 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Le projet a pour but de caractériser le rôle des prokinéticines dans le microenvironnement tumoral du cancer de l’ovaire et plus précisément sur les cellules immunitaires infiltrant la tumeur. Les souris utilisées dans nos expériences sont des souris immunocompétentes de la souche C57BL/6J pour réaliser un modèle syngénique. En effet, ce modèle nous permettra d’étudier les relations complexes entre les différents composants du système immunitaire et le développement du cancer de l’ovaire. De plus, ces souris ne présenteraient pas de risque de rejet car les cellules injectées sont d’origine murines. Plusieurs études ont démontré qu’il existe une grande similitude entre le développement tumoral chez la souris et chez la femme et dans l’expression et la régulation des gènes tumoraux et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse et de l’inflammation comme les prokinéticines sont exprimés dans des types cellulaires similaires et régulés de la même façon. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles.

Des agneaux mâles de trois à quatre mois sont infestés par voie orale de 6 000 à 10 000 larves de trichostrongles, pour que les vers se reproduisent dans leur tube digestif et que leurs fèces fournissent au laboratoire des œufs et des larves. 56 agneaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin d'infestation pour récolter les vers adultes. Ils portent un harnais de collecte pendant 40 jours ou passent 24 à 48 heures en cage métabolique, et l'infestation peut provoquer inflammation intestinale, diarrhées et perte de poids. H. contortus se nourrissant de leur sang, les agneaux infestés par cette espèce subissent quatre prises de sang à la jugulaire pour surveiller leur hématocrite. Le porteur retient des mâles, "plus sensibles aux infestations parasitaires que les femelles", pour "produire plus de parasites avec moins d'animaux".

Objectifs

Le projet a pour objectif de produire le matériel biologique (oeufs, larves infestantes) nécessaire pour les analyses que nous menons au laboratoire (adaptation des parasites aux anthelminthiques, à leurs hôtes ou au changement climatique). Nous inoculons aux moutons 6000 (isolat sensible) à 10000 larves (isolat résistant) de trichostrongle par voie orale (dose de larves permettant une infestation correcte sans toutefois déclencher de signes cliniques; variable en fonction de la pathogénicité de l'isolat). Le cycle de développement complet se déroule sur environ 21 jours. A partir de ce stade, les larves sont devenues adultes (mâles et femelles), se reproduisent et excrètent des oeufs dans la lumière du tube digestif qui sont expulsés avec les matières fécales hors de l'hôte. Ainsi, à partir de J+21 nous prélevons les matières fécales et réalisons des contrôles coproscopiques pour déterminer le point de départ de l'excrétion d'oeufs dans les fèces. Lorsque l'excrétion se stabilise, nous prélevons les matières fécales pour réaliser les coprocultures qui nous permettent d'obtenir des larves infestantes notamment. Différents procédés permettent de récupérer suffisamment de matières fécales : 1) lorsque nous avons un faible besoin de matériel biologique, les matières fécales sont obtenues par prélèvement rectal 2) lorsque nous avons des besoins intermédiaires et s'il s'agit d'une souche sensible de nématodes, les moutons sont équipés de harnais permettant de collecter les fèces. 3) Lorsqu'il s'agit d'isolats résistants, les moutons sont placés en cage métabolique 24 à 48h (au pic d'excrétion des oeufs de nématodes) pour collecter la totalité des matières fécales émises et limiter au maximum les risques de dispersion d'un isolat résistant. Dans ce cas les moutons peuvent être placés individuellement en cage mais ne sont jamais seul dans l'espace qui leur est dédié et ont la possibilité d'échanges visuels avec leurs congénères. 4) Lorsque les besoins sont plus importants, deux moutons sont inoculés avec le même isolat et sont placés ensemble en cage métabolique le temps de récolter suffisamment de matériel. La durée maximale de collecte pour obtenir suffisamment de matériel de travail et minimiser le nombre d'animaux utilisé est de 12 semaines.

Bénéfices attendus

Le projet vise à produire le matériel biologique de base (larves et adultes) aux études visant à mieux contrôler les trichostrongles de ruminants en i) comprenant les mécanismes de la résistance aux divers anthelminthiques, ii) en interrogeant leur capacité d'adaptation au changement climatique et iii) en recherchant de nouveaux composés naturels permettant de s'affranchir des anthelminthiques chimiques.

Procédures

Lorsque les vers adultes sont développés nous collectons des matières fécales quotidiennement pour les mettre en culture à l'aide d'un harnais de prélèvement adaptée aux animaux (port de harnais durant 40 jours). Les volumes varient en fonction des besoins et sont associés a des techniques appropriées (cage métabolique ou harnais pour de grosses quantités ou prélèvement intra-rectal (intervention de 30 secondes maximum) pour des besoins plus réduits). Le trichostrongle H.contortus se nourrit du sang de son hote. A ce titre, il est impératif de controler le niveau de perte sanguine des animaux infestés et déclarer le point limite atteint ou non. Pour ces infestations, une prise de sang de 5 mL à la veine jugulaire (intervention de 30 secondes) sera réalisée avant infestation (pour établir le niveau d'hématocrite physiologique) et 30, 40 et 60 jours après l'infestation. Toute coproscopie supérieure ou égale à 15000 opg nécessitera un contrôle hématocrite.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont de deux ordres: 1. l'effet de l'infestation: les trichostrongles peuvent induire une inflammation intestinale (associée à une perte de poids, des diarrhées) ou une baisse de l'hématocrite. 2. la mise en cage métabolique des moutons peut engendrer un stress consécutif à l'isolement relatif des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'infestation pour collecter et stocker les vers adultes nécessaires aux tests moleculaires (compréhension de l'architecture genétique des résistances aux anthelminthiques). Par ailleurs, les isolats multi-résistants ne peuvent pas être éliminés, ni disséminer dans l'environnement.

Remplacement

De manière à obtenir le matériel biologique nécessaire à la réalisation de nos tests biologiques et moléculaires, nous avons besoin d'entretenir nos isolats sur leur hôte naturel, l'ovin. Le passage sur l'animal est une étape obligatoire du cycle parasitaire. Nous ne sommes pas en mesure de réaliser un cycle complet du parasite in vitro.

Réduction

Les effectifs sont calculés sur la base des projets en cours et des besoins passés de l'équipe (soit au maximum 8 agneaux tous les 3 mois, soit 56 agneaux avant la fin de ce projet.

Raffinement

Des harnais équipés de pots de collecte ont été spécialement conçus pour que la collecte des matières fécales soit la moins invasive possible. Durant la mise en cage métabolique individuelle, les animaux gardent un contact visuel avec un autre congénère situé dans une cage adjacente. La dose infestante est minimisée pour permettre la production de parasites en limitant les effets indésirables sur l'hôte: elle est de 6000 larves infestantes pour l'isolat sensible et de 10000 larves infestantes pour les isolats résistants dont les capacités d'installation, de reproduction et de développement sont moindres. D'autre part nous limitons les infestations aux agneaux mâles car ils sont plus sensibles aux infestations parasitaires que les femelles, ce qui permet de produire plus de parasites avec moins d'animaux.

Choix des espèces

Les trichostrongles d'intéret sont inféodés à l'espèce ovine. Les agneaux auront entre 3 et 4 mois (environ 30 kg). A cet âge, le système immunitaire est développé mais reste permissif aux vers gastrointestinaux. Cela permet d'obtenir une efficacité d'installation et donc de production de matériel biologique optimum.

148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des tumeurs mammaires spontanées ou reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses, afin d'étudier le rôle de protéines appelées intégrines dans les cancers du sein liés au gène BRCA1. Le porteur indique que les tumeurs restent localisées et que des ulcérations sont rares. Il décrit les souris transgéniques comme des "modèles incontournables" et affirme qu'il est "indispensable" de travailler in vivo malgré les cultures cellulaires utilisées en complément.

Objectifs

Le cancer du sein représente la première cause de décès par cancer chez la femme, principalement dû à une connaissance encore incomplète des mécanismes moléculaires et cellulaires qui induisent le développement tumoral. La glande mammaire est une structure épithéliale constituée d’un système de canaux ramifiés et d’alvéoles. L’épithélium mammaire adulte est composé de cellules luminales sécrétrices du lait et de cellules basales myoépithéliales qui, en se contractant, aident à l’expulsion du lait vers les canaux. Ces deux types de cellules dérivent de la prolifération et de la différenciation de cellules souches mammaires. Or, des études récentes ont montré que l’amplification aberrante des cellules souches est à l’origine de cancers du sein agressifs associés à des mutations du gène BRCA1 (Breast Cancer 1), un gène connu pour être un suppresseur tumoral. Ces cancers appartiennent à un groupe des tumeurs pour lesquelles les thérapies ciblées utilisées dans le traitement d’autres types de cancers du sein (par exemple, les thérapies hormonales) se sont avérées inefficaces. Les intégrines sont des protéines présentes dans la surface des cellules qui permettent leur adhésion et régulent de nombreuses fonctions. Certaines intégrines sont indispensables à la multiplication et la différenciation des cellules souches nécessaires à une gestation et lactation normales. Nous souhaitons étudier le rôle de ces intégrines dans un modèle murin connu pour développer des tumeurs mammaires dont l’origine et les caractéristiques sont très similaires aux cancers du sein avec mutation en BRCA1 chez la femme. Nos premiers résultats indiquant que la perte des intégrines dans ce modèle diminue l’apparition des tumeurs mammaires, nous projetons d’analyser les mécanismes qui expliquent cette inhibition. On déterminera en particulier l’impact de la perte des intégrines dans la glande avant l’apparition des tumeurs (statut pre-néoplasique) et sur son contenu en cellules souches tumorales, connues pour leur implication dans les récidives et la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

L’interaction des intégrines avec la matrice extracellulaire qui entoure les cellules joue un rôle important au cours des différentes étapes de la progression tumorale mammaire, du carcinome in situ (tumeur en stage initiale, souvent bénin) à l’invasion tissulaire (tumeur invasif mais encore localisé à la glande mammaire) et la métastase (invasion d’autres tissues). De façon notable, certaines intégrines sont surexprimées dans les tumeurs du sein et leur expression est associée à un mauvais pronostic et à des taux de survie réduits. Notre étude permettra de déterminer la contribution des intégrines dans le développement tumoral de la glande mammaire et la régulation des cellules souches tumorales, responsables des récidives et de la dissémination métastatique. Notre approche permettra d’évaluer la contribution de ces intégrines dans les anomalies de croissance cellulaire, différenciation et invasion observées dans les carcinomes mammaires humains. A long terme, ces informations permettront de mieux appréhender les mécanismes impliqués dans la communication entre cellules épithéliales et matrice extracellulaire et notamment d’évaluer si des signaux anormalement émis par les intégrines dans le contexte tumoral peuvent constituer des cibles thérapeutiques efficaces pour le traitement de certains cancers du sein.

Procédures

Un suivi des animaux développant spontanément des tumeurs mammaires (observation et palpation) sera réalisé pendant toute la durée de l’expérience (au maximum 4 semaines après la détection des tumeurs). Des expériences de transplantation (greffe) de cellules tumorales dans le tissu adipeux mammaire de souris receveuses seront réalisées. Cette intervention chirurgicale est peu invasive, le péritoine (membrane entourant la cavité abdominale), restant intact. Elle est de courte durée (15-20 min par animal) et s’effectue sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nos souris transgéniques sont viables et ne présentent aucun problème sévère de santé à l’âge adulte. Le modèle de tumorigenèse que nous étudions n’entraînent pas de souffrance notable. Les nuisances liées au développement tumoral sont faibles et les souris portant des tumeurs seront analysées en moyenne 2 semaines après leur détection, avec un maximum de 4 semaines pour les tumeurs à croissance lente. Les tumeurs restent localisées à la glande mammaire et ne sont pas métastatiques dans notre fenêtre expérimentale. L’apparition de tumeurs sur d’autres organes reste extrêmement rare dans ce modèle. De possibles mais rares ulcérations peuvent se produire dans les tumeurs mammaires chez certains animaux. Les animaux opérés pourront éventuellement développer des tumeurs mammaires qui, d’après la littérature, reproduiront le phénotype de la tumeur originale avec, notamment, une absence de développement métastatique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses post-mortem

Remplacement

Notre projet repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées (souris transgéniques) pour définir les mécanismes qui régulent les cellules souches et leur contribution dans les cancers du sein. La glande mammaire est un tissu spécifique aux mammifères dont le fonctionnement normal est contrôlé par un ensemble complexe de régulateurs hormonaux et locaux. La souris reste à ce jour le modèle le plus pertinent pour étudier la biologie des cancers du sein. Les souris transgéniques sont reconnues comme des modèles incontournables pour explorer les mécanismes de tumorigénèse et développer des thérapies. Bien que nous utilisions des méthodes alternatives réduisant l’utilisation des animaux, en particulier des cultures pour modéliser le comportement des cellules tumorales in vitro, il est indispensable d’effectuer des expériences in vivo pour comprendre la formation et la progression des tumeurs dans leur environnement physiologique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements de glande mammaire, on utilise chaque glande mammaire d’une même souris donneuse, celle-ci étant pourvue de 5 paires de glandes. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées.

Raffinement

Les animaux seront manipulés le moins possible. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. L’apparition de tumeurs sera surveillée à partir de l’âge de 4 mois (l’âge moyen d’apparition de tumeurs dans ces souris est de 7,5 mois). Des palpations seront effectuées trois fois par semaine. Un examen complet au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution) des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie. Les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour ce projet spécifique. Les expériences de transplantation se font sous anesthésie générale. Pour minimiser les risques d’infection, les instruments de chirurgie sont stérilisés et les surfaces et la loupe utilisées, soigneusement lavées et rincées à l’éthanol. Pendant l’opération un gel de protection oculaire est appliqué aux animaux pour éviter le desséchement. Des analgésiques, sont administrés 20 min avant l’anesthésie (buprenorphine, carprofen), puis relais 24h après l’opération (ibuprofène). Après l’intervention, nous utilisons du fil de suture stérile résorbable pour refermer la plaie. En post-opératoire, les souris encore anesthésiées sont réhydratées et placées sur une platine chauffante pour éviter l’hypothermie. Les souris greffées sont surveillées tous les jours afin de déceler tout signe de mal-être et pour détecter l’apparition de tumeurs (palpation trois fois par semaine). Si elles présentent des signes de mal-être (amaigrissement, prostration), elles sont mises à mort avant la fin programmée de l’expérience.

Choix des espèces

Notre programme de recherche nécessite l’utilisation de mammifères. L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez la femme. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiques murins rendent ce modèle puissant. Enfin, c'est un animal facile à anesthésier, ce qui permet de réduire au maximum le stress qui pourrait être provoqué chez l'animal. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Pour l’analyse des tumeurs, les souris avec un phénotype potentiellement dommageable sont euthanasiées à l’âge adulte (à partir de 5-6 mois d’âge lors de l’apparition des tumeurs ou avant, pour analyse de la glande pre-néoplasique). Les tumeurs sont analysées avant qu’elles ne génèrent de signes de souffrance chez les souris. Les souris receveuses utilisées dans les expériences de transplantation sont des femelles pré-pubertaires âgées de 3 semaines. A ce stade, l’épithélium mammaire est très peu développé, on peut donc l’éliminer par microchirurgie et transplanter les cellules du donneur dans la partie du tissue adipeux resté intact.