Procédures modérées
Impact de la protéine NCOA7 sur les réponses anti-virales, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 765 modéré. Elles sont infectées par la grippe H1N1 par voie intranasale, certaines irradiées puis greffées de moelle osseuse, avec injections et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les doses peuvent être létales et provoquer jusqu'à 25 % de perte de poids, seuil au-delà duquel les souris sont mises à mort. Il justifie le recours à l'animal par la complexité de la réponse immunitaire antivirale, impossible selon lui à reproduire in vitro, et par l'accès à des souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Les virus de la grippe (virus Influenza A, IAV) est un agent pathogène responsable de la mort de près de 500 000 personnes par an dans le monde. Une meilleure compréhension de la réplication du virus de la grippe, de sa propagation dans les hôtes infectés et de son inhibition par le système immunitaire est essentielle dans le développement de nouvelles stratégies prophylactiques et thérapeutiques. L’isoforme courte de la protéine NCOA7 (ici dénommée NCOA7) est une protéine présentant une activité antivirale contre le virus de la grippe au cours des réponses immunes innées. Les données de la littérature indiquent également que la protéine NCOA7 pourrait impacter les réponses immunes adaptatives. Ces données ont été obtenues in vitro. Dans ce projet, nous souhaitons étudier l’impact de NCOA7 sur le contrôle de la réplication du virus de la grippe ainsi que sur la mise en place des réponses antivirales de l'immunité innée et adaptative in vivo, dans un modèle murin. Pour cela, des souris C57Bl/6J WT et NCOA7-/- (que nous avons générées) seront infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe (souche H1N1 A/WSN/1933). L’analyse du nombre, du phénotype et des fonctions des cellules immunitaires ainsi que la mesure de la charge virale dans le poumon et de la production de cytokines dans les organes et le lavage broncho-alvéolaire seront effectuées à différents temps post-infection.
Bénéfices attendus
Le virus de la grippe est un problème de santé publique majeure et les risques liés à l’émergence de souches virales responsables d’une pandémie sont très élevés. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme, contre une infection par le virus de la grippe et de caractériser l’importance de NCOA7 dans la mise en place des réponses immunitaires innée et adaptative.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Procédure 1 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 2 : - - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 1 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes Procédure 3 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, 30 minutes avec transport vers l'irradiateur- 1 fois par animal (procédure 4 et 5) - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 1 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 4 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, 30 minutes avec transport vers l'irradiateur- 1 fois par animal (procédure 4 et 5) - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 2 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 5 : - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 2 fois par animal – durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales ou intraveineuses; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale ; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang, l’irradiation et le transfert de moelle osseuse ; iv) le stress généré par le transport entre l’animalerie et l’irradiateur. L'infection par le virus influenza A est une procédure utilisée en routine dans le laboratoire et qui, aux doses sous létales utilisées, , ne génère pas de souffrance visible sur les animaux. Les doses utilisées dans la procédure 1 et 3 pouvant être létales, notre expérience a montré que les animaux pouvaient expérimenter une perte de poids allant jusqu’à 25% de leur poids initial entre jour 6 et 10 après infection, avant de revenir à leur poids initial entre jour 12 et 15 après infection. Dans ce cas, un point limite de 25% de perte de poids est fixé.
Devenir
Mise à mort des animaux pour analyse des organes, par dislocation cervicale ou surdose de pentobarbital. La méthode par surdose de pentobarbital sera utilisée sur des groupes d’animaux, pour permettre l’analyse des lavages broncho-alvéolaires.
Remplacement
Le role antiviral de la protéine NCOA7 a été mis en évidence in vitro, dans des cellules pulmonaires humaine. Nous souhaitons à présent mettre en évidence un rôle de NCOA7 in vivo, dans un contexte global d'infection par le virus de la grippe. De plus, des résultats préliminaires indiquent que NCOA7 pourrait égalemet jouer un rôle dans la mise en place des réponses antivirale adaptatives. La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé sur la base des expériences antérieures, afin d’assurer un calcul statistique précis et permettre une interprétation robuste des résultats.
Raffinement
Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections intra-nasales seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue lors de l'anesthésie; ii) les prélèvements de sang seront réalisées sous anesthésie à Isoflurane et après application d'un collyre; iii) les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie légère; iv) nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée) ; v) des points limites assez prédictifs et définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper toutes souffrances et tout mal être des animaux; vi) nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure. vii) pour les procédures 1 et 3, les animaux serons surveillés et pesés quotidiennement (mêmes jours fériés et week-end) après infection.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés. Dans ce projet, des souris WT (fond C57Bl/6J), des souris F5 (transgénique pour le récepteur à l’antigène des lymphocytes T et spécifique du peptide NP68) et des souris invalidées pour NCOA7 (fond C57Bl/6J CD45.2) seront utilisées. Adultes de 6 semaines à 3 mois : le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection (6 à 8 semaines) et certains animaux seront gardés jusqu’à 50 jours après infection afin d’étudier la mise en place des réponses immunitaires mémoires.
Evaluation écotoxicologique de substances et d’effluents sur les premiers stades de la vie de poissons
- Protection de l’environnement
Saumons : 5000
Autres poissons : 10000
27500 poissons vont être utilisés, aux premiers stades de vie de l'œuf au juvénile, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Poissons zèbres, salmonidés et autres poissons sont exposés à des substances chimiques et des effluents pour des essais écotoxicologiques réglementaires. Le porteur indique que ces essais peuvent provoquer des malformations pouvant conduire à la mort. Le résumé affirme que tous les poissons sont tués en fin de test, alors que le champ structuré déclare 2000 poissons zèbres adoptés.
Objectifs
La qualité des écosystèmes et leur préservation est en lien directe avec la santé. Dans ce cadre, il est important d’établir des diagnostics de l’état de ces écosystèmes et également de prédire l’impact potentiel des activités anthropiques sur ces écosystèmes. La toxicité des effluents, des produits chimiques, des phytosanitaires et biocides ou des substances sur les écosystèmes aquatiques est évaluée en utilisant différents modèles biologiques comme des bactéries, des végétaux, des invertébrés et des poissons. Les effets recherchés peuvent être aigus (mort) ou chroniques (croissance, développement larvaire). Ces essais rentrent dans le cadre de nombreuses règlementations (CLP, REACH, directive biocide, directive phytosanitaire) et permettent d’évaluer les risques pour l’environnement. Ces essais vont permettre de déterminer les valeurs de toxicité chronique (CEx = concentration entrainant X% de malformations sur les poissons ou CSEO = concentration sans effet observé) de substances ou de matrices environnementales en adéquation avec les règlementations des différents pays afin d’évaluer les risques pour l’écosystème aquatique.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus seront utilisés dans le cadre de l'évaluation du risque des substances chimiques, produits formulés, médicaments ou autre afin de déterminer les concentrations maximales acceptables dans l'environnement.
Procédures
Les animaux sont exposés à des concentrations en substances chimiques via le milieu aquatique. Il n'y a pas de prélèvements ni de procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
Ces essais peuvent entrainer des malformations plus ou moins sévères pouvant conduire à la mort des organismes.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du test afin de réaliser les mesures biologiques nécessaires (poids, taille).
Remplacement
Ces essais sont exigées par les règlementations quand des équivalence avec d'autres substances ne sont pas possibles, pas pertinent ou que les données issues de la littérature ne sont pas suffisantes.
Réduction
Les données issues d'essais aiguës ou de la littérature sont utilisées pour définir la gamme de concentration à réaliser dans l'essai définitif. Si ces données n'existe pas, un essai sur les oeufs sera réalisé pour définir la gamme.
Raffinement
Les poissons seront maintenus dans un environnement permettant une croissance optimale en termes de qualité d’eau et d’alimentation.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées par les normes et les règlementations. Les poissons utilisés seront au stade œuf jusqu’au stade juvénile conformément aux normes utilisées.
Etude de la communication entre le cervelet et le cortex cérébral chez la souris: implications pour la schizophrénie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des chirurgies cérébrales pour pose d'électrodes, une restriction hydrique d'un mois et des tests comportementaux, dont certains ne sont pas précisés, sur un modèle de schizophrénie. Le porteur signale des crises d'épilepsie possibles sous stress et une perte de poids liée à la restriction en eau. Il affirme que l'étude d'un circuit cérébral intact rend la souris nécessaire.
Objectifs
Ce projet a pour but de disséquer le fonctionnement et de comprendre les altérations de la communication entre deux régions du cerveau dont les dysfonctions ont été identifiées dans les symptômes associés à la schizophrénie chez l'homme. Ces études seront réalisées sur un modèle murin de schizophrénie et des souris contrôles. Ainsi nous allons identifier les réseaux neuronaux impliqués dans cette voie et les étudier dans des tâches comportementales adaptées à l'étude de la schizophrénie. Nous chercherons ainsi à identifier des stimulations cérébrales via le cervelet capables de compenser les altérations observées chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les interactions entre le cervelet et le cortex préfrontal chez la souris dans le contexte de l'étude d'un trouble neurodévelopmental, la schizophrénie. Les voies anatomiques impliquées dans le traitement temporel (intervalle de temps) chez la souris sont les mêmes que chez l'homme et cette propriété est particulièrement affectée chez les patients schizophrènes. En plus du progrès des connaissances dans la communication cérébello-corticale, nous testerons des protocoles de stimulation cérébrales (via le cervelet) capables de compenser les déficits de notre modèle murin de schizophrénie. L'objectif ultime du projet est d'utiliser ces résultats pour raffiner les protocoles cliniques de stimulation magnétique transranienne (rTMS) en collaboration avec des cliniciens.
Procédures
Un groupe d'animaux subira trois tests comportementaux sur une durée de une semaine. Ils auront subit une incision abdominale. Un second groupe subira un test comportemental pendant un mois nécessitant une restriction hydrique (alimentation en eau une fois par jour). Un troisième groupe subira une intervention chirurgicale d'une durée de 1 heure sous anesthésie et analgésie profonde. Un quatrième groupe subira une intervention chirurgicale d'une durée de 2 heures sous anesthésie et analgésie profonde, puis le même test comportemental que le second groupe. Ce groupe recevra une injection intra-abdominale journalière durant 8 jours. Un cinquième groupe subira une intervention chirurgicale d'une durée de 2 heures sous anesthésie et analgésie profonde, puis le même test comportemental que le second groupe. Ce groupe recevra des stimulations lumineuses pendant la tâche comportentale au niveau d'une aire cérébrale pendant 8 jours.
Impact sur les animaux
- Les animaux transgéniques peuvent présenter dans des conditions de stress intense un phénotype dommageable de type crises d'épilepsie. Une attention toute particulière sera donc portée sur l'environnement de test. - Une perte de poids consécutifs à la restriction hydrique lors de la tâche de prédiction temporelle pourrait survenir. - Des saignements consécutifs à la chirurgie réalisée pour l'insertion des éléctrodes d'enregistrement pourraient survenir. - Des effets positifs liés à l'utilisaiton d'antipsychotiques
Devenir
Dans les procédures conduisant à des enregistrements ou des anayses neuroanatomiques, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses tissulaires et histologiques.
Remplacement
Ces expériences ont pour but de comprendre comment le traitement de l'information dans les différentes zones du cervelet conduit à la régulation de la coordination motrice via la communication avec le cortex cérébral. Ainsi, le système biologique doit être intact pour pouvoir être étudié. L'utilisation de l'électrophysiologie in vivo sur la souris est nécessaire dans notre cas car l'étude doit s'effectuer sur un circuit intact pouvant impliquer des aires corticales situées à une grande distance (système impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire par exemple)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et assurer que les résultats seront statistiquement fiables. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. La validation du modèle SynII Ko pour l'étude de certains symptômes de schizophrénie chez la souris conditionnera la poursuite du projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leur besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans les cages pour favoriser la nidation et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique.
Choix des espèces
De nombreux travaux ont démontré que les souris, notamment adultse, étaient un modèle d’étude valide pour les maladies neuro-développementales. Lorsque des modèles pharmacologiques ou génétiques existent, les mêmes structures cérébrales sont impliquées et certains symptômes sont comparables. Par exemple, des études ont été réalisées à la fois chez des patients schizophrènes et des rongeurs chez lesquels la voie de la dopamine est altérée. Ces animaux reproduisent des symptômes de la schizophrénie (altération dans les tests d’interactions sociale ou de détection d’intervalles temporels) et les mêmes altérations dans les enregistrements cérébraux ont été observés chez l'homme et l'animal. De plus, des stimulations du cervelet, une aire cérébrale, ont permis de compenser une partie des déficits dans les deux espèces.
Protéger les chromosomes pour prévenir l’arthrose
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections de collagénase dans le genou pour provoquer une arthrose, chez des animaux jeunes et âgés, afin de cibler les cellules sénescentes du cartilage. Le porteur reconnaît que l'injection peut induire une douleur articulaire. Il affirme que l'étude de la sénescence dans l'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants.
Objectifs
L’arthrose est la maladie la plus repandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage. Aucun traitement n’est disponible. Il a été montré, dans une récente étude in vitro et in vivo, chez la souris ou sur des prélèvements de patients, que la sénescence cellulaire s’accumule dans le cartilage arthrosique. Cette découverte a permis de proposer une nouvelle approche thérapeutique de l’arthrose en ciblant les cellules sénescentes. Nous proposons ainsi, dans ce projet: d'établir la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite à la collagénase chez les souris jeunes et agées, puis de voir si le maintien intégral des extremités des chromosomes permet la protection contre l'accumulation de ces cellules sénescentes et donc la protection contre le développement de l'arthrose.
Bénéfices attendus
Le but est de comprendre les mécanismes moléculaires responsables de l’accumulation des cellules sénescentes articulaires qui entrainent le développement de l’arthrose. A long terme, nous éspérons : soigner l'arthrose chez la souris et proposer des thérapies chez l'Homme qui miment le transgène (télomérase).
Procédures
Procédures chirurgicales : injection intra-articulaire (2 fois avec la collagénase), le temps d'une injection (10-15 secondes).
Impact sur les animaux
L’injection de la collagénase en intra-articulaire peut induire une douleur au niveau du genou.
Devenir
A la fin du projet, une mise à mort sera effectuée pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.
Remplacement
L’analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’est donc pas possible de prévoir une méthode substitutive pour répondre à la question scientifique de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé en tenant compte des pertes éventuelles lors des protocoles et en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intra-articulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la souffrance et l'angoisse infligé aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement par l'équipe de zootechniciens et par notre groupe 1 fois par semaine. Pour le bien-être animal, il existe une grille de points limites avec un score.
Choix des espèces
Le modèle murin d'arthrose induite à la collagénase présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c’est-à-dire chez le sujet jeune après le traumatisme articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. On donc reproduira les mêmes conditions chez les souris jeunes et les souris âgées. Les animaux seront utilisés à 2 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à l’arthrose induite. Chez les souris de 18 mois pour étudier la présence de cellules sénescentes en réponse à une arthrose spontanée et naturelle. Sur les 2 modèles (jeunes et âgées), on va étudier l’effet de l’élimination de ces cellules sénescentes par à l'aide de l'expression de la télomérase.
Rôle du stress mécanique dans l’activation de l’inflammasome NLRP3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections déclenchant une inflammation, dont un modèle sévère au LPS qui altère fortement leur état général et peut entraîner la mort, la survie étant mesurée. Un modèle de maladie auto-inflammatoire porte sur des nouveau-nés dont l'espérance de vie ne dépasse pas quatorze jours. Le porteur affirme vouloir vérifier in vivo un mécanisme observé sur cellules et décrit le modèle murin comme déjà validé.
Objectifs
L’inflammation est la première réaction du système immunitaire à une agression externe (infection, traumatisme, brulure, etc…) ou interne (cellules cancéreuses) . C’est un processus universel qui concerne tous les tissus faisant intervenir l’immunité innée. L’inflammation est un processus de défense généralement bénéfique mais qui peut devenir délétère lorsqu’elle est dérégulée. Dans des maladies telles silicose, arthrite goutteuse, diabète de type 2, athérosclérose, maladie d'Alzheimer ou sepsis. ). Il existe également des pathologies génétiques spécifiques de l’inflammation appelées syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) dans lesquelles une mutation sur un gène entraine une dérégulation de l’inflammation. Ces maladies sont des maladies dites autoinflammatoires qui sont caractérisées par de l’urticaire, des atteintes oculaires, articulaires et neurologiques et qui peuvent engendrer de l’amylose (accumulation de protéines dans les organes). La cause de ces maladies est la mutation d’un gène codant pour une protéine clé dans le processus d’inflammation qui est appelée inflammasome. Cette mutation entraine un gain de fonction pour l’inflammasome dont la conséquence est une dérégulation de l’inflammation. Sur des cellules immunitaires en culture nous avons observé qu’en activant un type de protéines membranaires sensibles à la pression mécanique, nous les rendions plus sensibles aux stimuli déclenchant l’inflammation. Par ailleurs, toujours sur des cellules en culture mais porteuses d’une mutation de l’inflammasome analogue à celle retrouvée chez des patients atteints de CAPS, nous avons observé que la seule activation de ces protéines membranaires suffit à déclencher l’inflammation. Nous voulons maintenant confirmer ces observations dans un modèle murin in vivo afin de vérifier leur validité dans un contexte physiologique. Dans ce but, nous utiliserons une approche pharmacologique en administrant un activateur ou un inhibiteur de nos protéines d’intérêt sur des souris qui seront soumises à un modèle d’inflammation induite. Nous testerons également une approche génétique en générant des souris porteuses d’une mutation qui récapitule une maladie autoinflammatoire afin d’observer si le ciblage de nos protéines d’intérêt peut réduire l’intensité de l’autoinflammation.
Bénéfices attendus
L'industrie pharmaceutique fournit des efforts importants pour le traitement des maladies inflammatoires (silicose, arthrite goutteuse, diabète de type 2, athérosclérose, maladie d'Alzheimer ou le sepsis) et autoinflammatoires (Syndrome périodique associé à la cryopyrine - CAPS) médiées par un type particulier d'inflammasome. Lors de nos observations in vitro, nous avons montré sur des cellules immunitaires en culture, que des protéines membranaires sensibles à la pression mécanique jouent un rôle dans l’inflammation médiée par un type particulier d’inflammasome. Si nous confirmons cette découverte in vivo sur un modèle murin, alors ces protéines membranaires constitueront une nouvelle cible thérapeutique à explorer pour les maladies inflammatoires et autoinflammatoires.
Procédures
- Pour l’activation pharmacologique des protéines d’intérêt : au jour 1, les souris subiront une injection intrapéritonéale (IP) de l’activateur et une injection sous cutanée (SC) d’un antalgique puis, 1h après, une injection IP d’un facteur induisant une inflammation. L’injection d’antalgique est répétée toutes les 6h pendant la durée de l’observation (5j maximum) (252 souris). - Pour l’inhibition pharmacologique des protéines d’intérêt : les souris subiront, au jour 1, une injection IP d’un inhibiteur et une injection SC d’un antalgique puis, 1h après, l’injection d’un facteur induisant une inflammation. L’injection de l’inhibiteur est répétée 1x/jour pendant les 5 jours d’observation. L’injection SC de l’antalgique est répétée toutes les 6h pendant la durée d’observation (5 jours). La durée des injections n’excède pas 5 secondes (504 souris). Pour suivre les événements précoces de l’inflammation, nous avons prévus des cohortes qui subiront un prélèvement sanguin à la veine temporo-mandibulaire aux temps 3h ou 6h après induction de l’inflammation. La durée du prélèvement n’excède pas 15 secondes (504 souris). - Pour le modèle génétique de maladie autoinflammatoire : nous générerons des nouveaux nés qui subiront une injection IP d’un inhibiteur et une injection IP d’antalgique (si nécessaire) par jour pendant les 14 jours d’observation. La durée des injections n’excède pas 5 secondes (324 souris). - Pour le modèle génétique de maladie autoinflammatoire invalidé pour les protéines d’intérêt : nous générerons des nouveaux nés qui recevront une injection IP d’antalgique par jour. L’injection n’excède pas 5 secondes (108 souris)
Impact sur les animaux
Nous déclarons dans ce projet 2 modèles d’inflammation induite : - L’induction d’une péritonite : Dans ce modèle d’inflammation modéré, une inflammation localisée au niveau du péritoine (péritonite) apparaitra après l’injection d’une suspension de cristaux d’acide urique. Les souris sont mises à mort 6h après l’induction de l’inflammation pour analyse des marqueurs de l’inflammation. - Induction d’une inflammation systémique aigüe : un composant de la paroi de bactéries est injecté dans le péritoine et entrainera une inflammation systémique C’est un modèle d’inflammation sévère qui altère fortement l’état général des animaux pouvant aller jusqu’à la mort. La survie des souris sera mesurée pendant 5 jours après l’induction. Nous déclarons aussi la génération de souris modèles d’une maladie autoinflammatoire : les nouveaux nés portant une mutation sur un gène qui joue un rôle clé dans l’inflammation présenteront un syndrome inflammatoire important qui se traduit par une rougeur de la peau, un érythème, une inflammation des organes et un fort retard de croissance. L'espérance de vie de ces animaux ne dépasse pas 14 jours.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront mis à mort : - induction d’une inflammation modérée : tous les animaux seront mis à mort pour analyses post mortem. - induction d’une inflammation sévère : Une partie des animaux est dédiée pour analyse post mortem à des temps précis après l’induction de l’inflammation. Une autre partie est dédiée pour les mesures de survie. Parmi ces animaux certains décèderont du fait de l’inflammation induite. Les survivants ne seront pas réutilisés et mis à mort. - Modèle de maladie autoinflammatoire : l’espérance de vie des nouveaux nés ne dépasse pas 14 jours. Les survivants ne seront pas réutilisés et seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons observé sur des cellules immunitaires en culture qu’en agissant sur un type de protéines membranaires mécano-sensibles on peut moduler le processus inflammatoire qui est pourtant médié par un autre type de protéines dans ces cellules. Nous voulons maintenant vérifier que ce mécanisme observé in vitro, sur un type cellulaire isolé, est toujours présent in vivo à l’échelle d’un organisme ou de nombreux types cellulaires interagissent. Le modèle murin constitue un modèle déjà validé dans le domaine des recherches sur l’inflammation. Par ailleurs des lignées de souris génétiquement modifiées qui récapitulent les maladies autoinflammatoires sont disponibles et validés.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 1332 souris Nous avons prévu dans ce projet une approche pharmacologique et une approche génétique. Pour l’approche pharmacologique, des souris seront traitées par différents composés puis soumises à un modèle d’inflammation induite. Nous avons prévu deux modèles d’inflammation : Le premier est un modèle d’inflammation modéré (péritonite induite) dans lequel 18 souris par groupe seront nécessaires pour comparer statistiquement les niveaux des cytokines inflammatoires entre les groupes. Le deuxième modèle est un modèle d’inflammation sévère dans lequel 18 souris par groupe seront nécessaires pour pouvoir comparer statistiquement la mortalité entre les groupes. Dans ce modèle nous comparerons aussi, à 2 temps différents après l’induction, les niveaux sanguins des cytokines inflammatoires. Pour que la comparaison soit statistiquement fiable, les groupes seront composés de 18 souris. Par souci de réduction, si le modèle modéré nous permet de répondre à nos questions pour l’approche pharmacologique alors nous ne testerons pas le modèle sévère, évitant ainsi l’utilisation de 864 animaux Pour l’approche génétique, nous générerons dans un 1er temps, des souris invalidées pour nos protéines d’intérêt. Ces animaux seront soumis à un des 2 modèles d’inflammation décrits plus haut. Si le modèle modéré nous permet de répondre à nos questions, alors nous ne testerons pas le modèle sévère, évitant ainsi l'utilisation de 216 animaux. Dans un 2ième temps, toujours pour l’approche génétique, nous générerons des nouveaux nés présentant une maladie autoinflammatoire, traités ou non par un inhibiteur de nos protéines d’intérêt, ainsi que des nouveaux nés présentant la maladie autoinflammatoire dans lesquels nos protéines d’intérêt sont invalidées ou non. Pour que la comparaison de la mortalité entre les groupes soit staistiquement fiable, ils devront être composés de 18 animaux. Par ailleurs, les marqueurs sanguins de l’inflammation seront comparés entre les groupes à 2 âges différents. Ici encore, pour une comparaison statistique fiable, les groupes seront composés de 18 individus.
Raffinement
Pour l'approche pharmacologique, les animaux seront soumis à des modèles d'inflammation induites dont un induit une inflammation sévère. Afin de limiter autant que possible leur souffrance, des traitements antalgiques puissants (analogue de morphine) seront administrés préventivement et curativement aux animaux testés. Pour les mesures de survie, des points limites sont fixés en fonction de l'état général des animaux. Au-delà des point limites, l'état de l'animal sera considéré irréversible et il sera euthanasié. Nous avons prévu pour cette approche 2 modèles d'inflammation induite : un modèle modéré (induction par cristaux de MSU) et un sévère (induction au LPS). Si le modèle d'inflammation modérée nous permet de répondre à nos questions, alors nous ne testerons pas le modèle d'inflammation sévère. Pour l'approche génétique qui consiste en la génération de nouveaux nés présentant une maladie autoinflammatoire, nous avons établi une grille d'évaluation spécifique pour les nouveaux nés. Cette grille permettra d'établir un score en fonction des différents paramètres observés. Les nouveaux nés seront observés quotidiennement et, en fonction du score, différentes actions seront réalisées (réchauffage de la cage, réhydratation en injectant du NaCl 0.9%, traitement avec un analogue de morphine). Ce scorage spécifique nous servira également à déterminer le point limite au-delà duquel les nouveaux nés seront mis à mort. Par ailleurs, une attention particulière sera portée à la manipulation des souriceaux : passage dans la litière sale avant remise en contact avec la mère, matériel de nidification placé dans la cage, volumes injectés et aiguilles adaptés aux souriceaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal déjà validé dans le domaine de l’inflammation Par ailleurs, plusieurs lignées génétiquement modifiées sont disponibles : lignées de souris invalidées pour nos protéines d'intérêt et lignées de souris modèle d'une maladie autoinflammatoire (animaux exprimant une mutation analogue à celle retrouvée chez les patients). Pour les modèles d’inflammation induite les souris seront utilisées au stade adulte (à partir de 8 semaines). À ce stade, le système immunitaire est complètement développé. Si les souris sont trop jeunes, le système immunitaire ne sera pas mature. Si les souris sont trop âgées, le système immunitaire ne sera plus assez efficace. Pour les souris modèles d'une maladie autoinflammatoire les animaux seront utilisés dès la naissance.
Impact de l’injection de vésicules extracellulaires avec des profils coagulolytiques différents sur un thrombus veineux in vivo
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ligature partielle de la veine cave pour provoquer une thrombose veineuse, puis une injection de vésicules extracellulaires, pour étudier leur rôle dans la coagulation. Le porteur reconnaît un stress et une douleur liés à la chirurgie. La mise à mort se fait par surdosage anesthésique afin de récupérer le caillot formé.
Objectifs
La thrombose est un sujet de santé publique important puisqu'elle touche environ 70000 personnes par ans en France. L'étude des vésicules extracellulaires dans ce domaine est prometteur car elles sont de potentiel biomarqueur du risque de thrombose. Les vésicules extracellulaires sont produites par toutes les cellules de notre corps et sont impliquées dans de notre processus grâce à leur contenu en protéine. Des travaux préliminaires ont montré qu'elles transportent des protéines décrites dans les processus de coagulation, c'est à dire de formation des caillots mais également dans la dégradation, la lyse, de celui-ci. Ce projet a donc pour but de montrer la contribution des vésicules extracellulaires dans la formation et la dégradation de ces caillots.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension du rôle de ces vésicules extracellulaires dans la formation des caillots permettra d'améliorer la prise en charge des patients. En effet, le dosage des vésicules extracellulaires à partir d'un prélèvement sanguins chez les patients permettrait de les classer en fonction de leur risque de thrombose et ainsi d'instaurer un traitement préventif pour éviter l'apparition d'un caillot.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale qui consiste à une ligature partielle de la veine cave inférieure pour produire un phénomène de stase veineux pour reproduire les conditions de formation de thrombose veineuse profonde humaine. Cette intervention est de courte durée, environ 15 minutes. Les animaux recevront une injection de vésicules extracellulaires par voie caudale 30 minutes après l'intervention. De plus les animaux recevront par injections des traitements antidouleurs toutes les 12 heures après la chirurgie.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir une période de stress et/ou de douleur liée à la procédure de chirurgie qui sera exercée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par un surdosage en anesthésiant à la fin de la procédure dans le but de récupérer le thrombus formé dans la veine cave inférieure. Nous effecturons différentes analyses sur celui-ci et nous procèderons à un prélèvement sanguin de l'animaux pour mesurer différents paramètres reflétant les mécanismes de coagulation et de fibrinolyse chez l'animal.
Remplacement
Des expériences réalisées in vitro, dans le but d'étudier l'impact du profil coagulolytique de vésicules extracellulaires, nous ont permis de mettre en évidence leur mise en jeux lors de la formation et de la lyse d'un thrombus. Mais ces modèles in vitro sont très simplifiés. En effet, la formation d'un thrombus in vivo est un processus complexe mettant en jeu de nombreuses entités cellulaires, sub-cellulaires et protéiques. L’étude d'un système aussi complexe n’existe pas in vitro d’où la nécessité de l’explorer in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux strictement nécessaire pour atteindre un résultat significatif a été calculé. Avec comme objectif de résultat une diminution de 50% de la prévalence de formation d'un thrombus dans la veine cave inférieure 10 animaux seront nécessaires par bras expérimental.
Raffinement
L'angoisse des animaux sera dépistée et évitée. Les animaux seront hébergés en groupe (5 individus par cages) dans des conditions d'accès à l'eau et l'alimentation et leur milieu sera enrichi (sous la forme de carré de coton pour fabriquer leur nid) afin de limiter le stress. Des visites régulières post-chirurgie seront effectuées toutes les 12 heures pour s'assurer du bien-être de l'animal grâce à différents critères d'apparence générale (amaigrissement et posture), d'apparence de la peau et du pelage, et de l'interaction avec les autres animaux (hyperactivité, hypoactivité, prostration). Ces observations peuvent conduire à l'euthanasie de l'animal si les points limites sont franchis (par exemple une perte de poids importante). De plus, lors de ces visites une injection d'antalgique sera effectué pour limiter la souffrance de l'animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle in vivo disponible le plus simple à exploiter aux vues des données existantes dans la littérature, de sa taille et de sa disponibilité. Les animaux seront utilisés entre 6 et 8 semaines de vie (poids compris entre 18 et 25g) ce qui permet d'avoir un modèle comparable aux données décrites dans la littérature.
Evaluation de nouveaux composés pharmacologiques ciblant les hétéromères opioïdes mu-delta pour soulager les douleurs neuropathiques (établissement 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2432 souris vont être utilisées, dont 848 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit une lésion partielle du nerf sciatique qui provoque une douleur neuropathique irréversible, avant des injections quotidiennes et des tests de sensibilité, pour évaluer des composés analgésiques. Le porteur indique que les administrations répétées peuvent provoquer constipation, tolérance, addiction et dépression respiratoire. Une partie des souris est tuée pour analyse des tissus, l'autre transférée vers l'établissement partenaire du projet.
Objectifs
La douleur neuropathique affecte 8 à 10% de la population et, dans nombre de cas, est réfractaire aux traitments actuellement disponibles. Les hétéromères opioïdes mu-delta représentent une nouvelle entité fonctionnelle formée par l'association des récepteurs mu et delta opioïdes. Les données de la litérature indique que l'activation de ces hétéromères induit une analgésie associée à moins d'effets indésirables telles que tolérance et dépendance. Toutefois, les ligands actuellement disponibles présentent de sérieuses limitations soit ils ne passent pas la barrière hématoencéphalique, ce qui limite leur potentiel pour la clinique, soit ils manquent de sélectivité. Le CYM51010 réduit la sensation douleureuse en conditions neuropathiques mais active les récepteurs mu ou delta non associés. Le MP135 présente une séléctivité accrue mais également des effets indésirables forts chez l'animal naïf. Son efficacité n'a par ailleurs pas été évaluée en conditions neuropathiques. Notre projet a pour but de synthétiser des dérivés du CYM51010 qui soient sélectifs des hétéromères mu-delta, présentent une analgésie forte avec peu d'effets indésirables tels que tolérance, dépendance et dépression respiratoire. L'évaluation des molécules sera réalisée en souris naïves ou neuropathiques après lésion partielle du nerf sciatique. Ces nouveaux composés seront comparés à la morphine, composé de référence en clinique, et aux deux petites molécules ciblant les hétéromères mu-delta déjà disponibles, le CYM51010 et le MP135. L'utilisation de lignées de souris déficientes pour l'un ou l'autre récepteur permettra de vérifier la sélectivité des composés. Finalement, l'utilisation de nos lignées génétiquement modifiées exprimant des versions fluorescentes des récepteur mu et delta permettra d'étudier in vivo les mécanismes sous-jacents à l'action des composés, notamment leur internalisation . L'objectif est à terme de proposer de nouveaux composés pour traiter la douleur chronique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront une meilleure connaissance du rôle physiopathologique des hétéromères mu-delta. L’obtention de composés sélectifs des hétéromères permettra de les cibler in vivo, d’isoler et d’étudier leur contribution spécifique à différents processus dont la nociception. Cet aspect est très fondamental car il permettra d’engager une étude mécanistique des voies de signalisation et des circuits neuronaux impliqués. Ceci est impossible actuellement car les composés existants activent également les récepteurs non associés. D’autre part, obtenir des composés sélectifs permettra, nous l’espérons, d’obtenir une bonne réponse analgésique avec moins d’effets secondaires et d’ouvrir une nouvelle voie thérapeutique.
Procédures
Un groupe de souris adultes sera testé quotidiennement pendant 10 secondes sur une durée de 15 jours et recevra une injection quotidienne d’une durée de 10 secondes pendant 10 jours (soit au total 3 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 15 jours). A l'issue de cette période, une partie d'entre elles sera testées pendant 30 minutes dans un second test. Un deuxième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes, recevra après la chirurgie une injection quotidienne de 10 secondes pendant 10 jours et sera testé 20 fois dans deux tests de durée respective de 10 secondes et 3 minutes (soit au total 63 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 35 jours). A l'issue de cette période, une partie d'entre elles seront testées pendant 30 minutes dans un troisième test. Un troisième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes et sera testé 10 fois dans deux tests de durée respective de 10 secondes et 3 minutes (soit au total 32 minutes de test sur une période de 35 jours). A l'issue de cette période, elles seront testées pendant 4heures dans un troisième test
Impact sur les animaux
La lésion partielle du nerf sciatique induit une douleur de type neuropathique non réversible qui se traduit par une sensibilité accrue au froid transitoire et sensibilité mécanique augmentée de façon persistente. Pour cette raison, l'efficacité des composés sera tout d'abord testés en souris non douloureuses afin de réduire le nombre d'animaux subissant cette procédure. L'administration répétée des composés pourra induire de la constipation, tolérance, addiction et dépression respiratoire. Les trois derniers sont l’objet de l’étude. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable.
Devenir
une partie des animaux est euthanasiée à la fin de chaque procédure pour analyse des tissus in vitro, une autre partie est transférée dans l'établissement partenaire du projet
Remplacement
L'effet analgésique et les effets indésirables des composés ne peuvent être évalués que sur organisme entier et vivant et ne peuvent être mesurés par une approche en cellules ou en organoïdes.
Réduction
le nombre d’animaux nécessaires au projet a été évalué mathématiquement pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes de 2-5 animaux du même sexe pour respecter leur besoins d'interaction sociale et leur cage enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunels pour éviter la prise par la queue et reduire le stress des animaux. L'apparition éventuelle de signes de souffrance ou de détresse est surveillée quotidiennement en portant une attention particulière à tout changement de l’état général (perte de poids supérieure à 15%, défaut de toilettage, plaie ouverte, blessure, déshydratation) ainsi qu'à l'état comportemental (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité). Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur est réalisée. Dans les tests comportementaux, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) même en absence de réaction de l'animal. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et du gel oculaire est apliqué durant la procédure. Un suivi postopératoire quotidien (pesée, observation de l'œdème inflammatoire) est effectué pendant 3 jours.
Choix des espèces
la souris a été choisie car ces animaux peuvent être modifiés génétiquement et cette espèce est un modèle validé du comportement humain pour les questions abordées dans ce projet. L'utilisation des souris génétiquement modifiées n'exprimant que le récepteur opioïde mu ou delta permet d'évaluer la sélectivité des composés pharmacologiques à tester et celle des animaux exprimant une version fluorescente des récepteurs mu et delta permet de visualiser directement les changements dans leur distribution induits par les traitements. Ces lignées de souris ont déjà été utilisées avec succès pour évaluer des traitements de la douleur neuropathique et la distribution des récepteurs en conditions physiopathologiques. L'étude comportementale nécessite le développement complet du système nerveux soit des souris agées de 6 semaines ou plus
Elucider le rôle du cil primaire dans le développement de la fibrose et de l’inflammation rénale à l’aide d’un modèle murin de néphronophtise.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont gavées cinq jours de suite pour déclencher une maladie rénale héréditaire, puis suivies par recueil d'urine en cage métabolique. Le porteur signale que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et que les animaux peuvent développer une soif et des urines excessives. Il affirme que les modèles cellulaires, y compris les organoïdes rénaux, ne permettent pas d'étudier un rein vascularisé.
Objectifs
La néphronophtise est une maladie rénale héréditaire rare affectant l’enfant et le jeune adulte. La maladie se révèle par une augmentation du volume des urines et une soif excessive. En parallèle, le rein subit de nombreuses modifications qui conduisent au développement de petits kystes, associés à une inflammation du rein aboutissant à sa transformation en un tissu fibreux non fonctionnel. A terme, la maladie aboutit à l’insuffisance rénale terminale nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale, deux procédures lourdes et coûteuses. Actuellement, aucun traitement ne permet d’éviter aux patients d’évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. La néphronophtise est une maladie rénale dont les mutations affectent le cil primaire. Dans le rein, le cil primaire baigne dans l’urine et agit comme une antenne de signalisation. Les mécanismes liant les altérations du cil primaire à la destruction du rein ne sont pas bien compris. L’étude proposée ici a pour objectif d’évaluer le rôle du cil primaire sur le développement de la maladie rénale. A cette fin, nous générerons des lignées de souris génétiquement modifiées permettant de développer un modèle murin qui récapitule la néphronophtise humaine et d’enlever le cil primaire spécifiquement dans le rein dans ce même modèle. Ceci sera obtenu par gavage sur des souris adultes. Le phénotype rénal sera observé à différents temps après le gavage (1, 2, 3, 5 et 11 mois).
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats de ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de la néphronophtise.
Procédures
Les 600 animaux seront soumis à l’âge de 4 semaines à un gavage sur 5 jours consécutifs à l’aide de sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal. La durée de l’acte de gavage est d’environ 1 minute. Chaque semaine les animaux seront pesés. Pendant la durée de la procédure, chaque mois, un spot urinaire sera prélevé par massage ventral pour évaluer le défaut de concentration urinaire. Si ce défaut est observé chez certains animaux à un temps donné, l’ensemble des animaux sera soumis à une mise en cage métabolique, dans le calme dans une pièce dédiée, pendant 48 h : 24h d’adaptation et 24h de recueil des urines. Pendant les 48h, les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Enfin, l’ensemble des animaux sera soumis à un prélèvement rétro-orbital sous anesthésie générale le jour de la mise à mort à l’aide de micro-capillaires héparinés. A la fin du prélèvement, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Les patients atteints de néphronophtise souffrent de polydipsie (consommation excessive d’eau) et de polyurie (volume d’urine augmenté). Les animaux utilisés dans ce projet sont donc susceptible de développer ces symptômes après gavage au tamoxifène. Chez l’homme l’évolution des maladies rénales chroniques est indolore. A un stade très avancé lorsque la fonction rénale est très altérée (nécessitant le recours à la dialyse ou la transplantation rénale), ces maladies induisent une baisse de l’appétit et une diminution de la masse musculaire. Le protocole établit dans ce projet ne va pas jusqu’à ce stade. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Par ailleurs, la mise en cages métaboliques des animaux pendant 48h peut générer un stress lié à l’isolement.
Devenir
A l’issue de la Procédure 1, les 600 animaux seront euthanasiés afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
La maladie rénale chronique met en jeu des phénomènes complexes faisant intervenir différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules endothéliales, fibroblastes et cellules immunitaires) ainsi que des modifications structurales du tissu rénal. Nous nous intéressons particulièrement à la communication entre les cellules épithéliales rénales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Toutes les expériences préalables à l’élaboration de ce projet ont déjà été réalisées dans des lignées cellulaires de tubules rénaux. Malheureusement, à ce jour, les modèles cellulaires in vitro (y compris les organoides rénaux) ne permettent pas l’étude d’un rein in vitro ayant une vascularisation, un flux urinaire, des fibroblastes et des cellules immunitaires. Compte tenu de l’absence de modèle cellulaire complet, il n’est pas possible du substituer des approches in vitro aux modèles murins impliqués dans ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs. Pour l’étude statistique, nous utiliserons une ANOVA à 1 facteur suivi d’un test de Tukey pour comparer les groupes d’animaux deux à deux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin de réduire le traumatisme lié aux gavages répétés et réduire les risques de perforation de l’oesophage, des sondes de gavage à bout arrondie adaptées à la taille de l’animal seront utilisées. Afin de limiter les nuisances induites par le développement de la néphronophtise (polyurie, polydispie), une attention particulière sera portée à l’accès en eau avec vérification et remplacement des biberons d’eau régulièrement pour éviter toute souffrance hydrique. La propreté des cages sera également contrôlée régulièrement. Afin de limiter les nuisances induites par la mise en cage métabolique, une période d’adaptation de 24h est réalisée. De plus, la mise en cage métabolique s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné. Les souris ont accès à l’eau et à la nourriture. A la fin du recueil, les souris sont regroupées dans leur cage d’origine dont la litière n’a pas été changée. Ces souris seront mises à mort 3/4 jours suivant la fin du recueil et une attention particulière sera portée sur les mâles remis ensemble pendant cette période. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Des points limites spécifiques à la procédure ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, à la différence des poissons ou des insectes, la souris partage avec l’homme un nombre de néphrons (unités fonctionnelles du rein) fixés après la fin de la néphrogenèse et développe des maladies rénales très semblables à celles observées chez l’homme. Le développement du rein se termine, chez la souris, aux alentours du 14ème jour après la naissance. La procédure décrite dans ce projet sera réalisée sur des souris âgées de 4 semaines donc après la fin du développement rénal. Les souris seront sacrifiées à l’âge adulte à différents temps après l’induction de la délétion (1 mois, 2 mois, 3mois, 5 mois et 11 mois), temps qui ont déjà été étudiés dans d’autres pathologies rénales.
Etude préliminaire de la cinétique et du profil de sécurité non-clinique de candidats médicaments chez le macaque Cynomolgus
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
304 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant recevoir jusqu'à 15 administrations d'un candidat médicament et subir jusqu'à neuf temps de prise de sang, des prises de température rectale et deux examens des yeux sous anesthésie. Ces études de toxicité, d'un jour à quatre semaines, doivent aider à choisir les doses de futures études réglementaires, pour des molécules de cardiologie, d'oncologie, de neuropsychiatrie ou de maladies métaboliques. Les macaques des études de cinétique et de toxicité courte seront réutilisés après accord vétérinaire, 156 selon le décompte déclaré, ceux de la troisième catégorie tués par exsanguination pour prélever leurs organes, mais les effectifs donnés ("soit 12096 animaux sur la durée du projet") ne permettent pas de vérifier ce partage. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de passer sur une espèce non-rongeur", et indique qu'aucune étude statistique ne fixe le nombre de 1 à 3 macaques par sexe et par dose.
Objectifs
Il reste encore de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. L’objectif principal de la Recherche Pharmaceutique est de développer de nouvelles molécules à visées thérapeutiques qui seront évaluées durant des essais cliniques. Pour cela, un profil de sécurité de ces nouvelles molécules doit être établi conformément à la réglementation. Les études préliminaires vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique et ne sont réalisées que sur des molécules testées au préalable sur les méthodes alternatives disponibles. Ces études préliminaires sont généralement de courte durée (entre 1 jour et 2 semaines, peuvent exceptionnellement aller jusqu’à 4 semaines dans le cas de molécule de type biologique) et utilisent un nombre restreint d’animaux. Leur objectif est d’identifier le profil cinétique, les potentiels effets secondaires et de cibler la gamme de doses à tester dans les futures études réglementaires. La conception de ces études est optimisée de manière à obtenir un maximum d’informations pour rendre plus efficace l’utilisation de ces animaux. En effet, en fonction des données disponibles du médicament, les examens pourront inclure certains paramètres cliniques (suivi du comportement, de la température, du poids, de la consommation alimentaire), hématologiques, biochimiques et cinétiques nécessitant des prises de sang ou encore histopathologiques par autopsie. Ces analyses seront adaptées à la molécule étudiée et à la pathologie concernée. Les études réalisées dans ce cadre ont pour but d’aider à choisir les doses pour les études réglementaires précliniques et, à terme, permettre de sécuriser la première administration du candidat médicament chez l’humain. Dans le cadre de ce projet, différents médicaments (molécule chimique ou biologique, thérapie génique, anticorps) pourront être testés en fonction des études réglementaires à réaliser.. Cela pourra inclure l'évaluation de médicaments avec une indication en cardiologie, en oncologie, en neuropsychiatrie ou pour le traitement de pathologies métaboliques et maladies auto-immunes. Liste des études concernées - Etudes précoces d’évaluation du profil cinétique et/ou du métabolisme chez le macaque cynomolgus - Etudes précoces d’évaluation de la toxicité de courte durée chez le macaque cynomolgus - Evaluation du profil toxicologique et toxicocinétique chez le macaque cynomolgus
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement la toxicité éventuelle de candidats-médicaments en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal). Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients.
Procédures
Les études incluses dans ce projet ont une durée de 1j à 4 semaines selon le mode d’administration prévu chez l’humain. Les voies d’administrations (orale ou parentérale) sont celles prévues chez l’Homme. Des examens réguliers seront faits à l’aide de matériel adapté à l’espèce et incluent : observations cliniques, prise de température corporelle (mesure rectale), prélèvements de sang pour vérifier les paramètres hémato-biochimiques et vérifier le passage du médicament dans le sang, examen cardiologique (ECG ou mesure de pression artérielle généralement par télémétrie non invasive sur 24h maximum), collecte d’urines sur 24h maximum (via des entonnoirs placés sous les unités d’hébergement), examen ophtalmologique (sous anesthésie, technique non invasive, en début et en fin d’étude : 30minutes maximum/examen ). Administration des traitements : voie IV (de quelques secondes à 30 minutes si perfusion) et PO (moins d’une minute) et sous-cutané (moins d’une minute); en fonction de la procédure, 1 à 15 administrations max Prélèvements sanguins : durée du prélèvement (moins de cinq minutes) 9 temps maximum sur plusieurs jours par semaine en fonction du type de candidat médicament (exemple : anticorps). Le volume total prélevé par semaine ne dépassera jamais à 7.5 % du volume total circulant
Impact sur les animaux
En fonction de la classe des produits et de la dose, on pourrait s’attendre à avoir, comme mentionné dans notre grille des points limites, des changements ou modifications de l’apparence (ex : absence de toilettage), du rythme respiratoire, de la consommation alimentaire et hydrique, de la température corporelle, de l’activité comportementale, des fonctions digestives et poids corporel. On s’assurera que la somme des observations ne dépassera le degré de sévérité mentionné dans chacune des procédures en mettant des actions correctives avec le support du vétérinaire du centre.
Devenir
Les animaux de l'études précoces d’évaluation du profil cinétique et/ou du métabolisme chez le macaque cynomolgus Les animaux (n=24/an ; soit 12096 animaux sur la durée du projet) seront réutilisés après accord vétérinaire. Les animaux de l'études précoces d’évaluation de la toxicité de courte durée chez le macaque Cynomolgus Les animaux (n=1520/an ; soit 75 80 animaux sur la durée du projet) seront réutilisés après accord vétérinaire. les animaux de l'évaluation du profil de sécurité non clinique et toxicocinétique chez le macaque Cynomolgus Les animaux (n=32/an ; soit 160 128 sur les 54 ans du projet) seront euthanasiés par exsanguination pour prélèvement des organes et analyse histologique post-mortem des tissus.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives à l’utilisation d’animaux pour définir les marges « sécurité » d’un candidat-médicament. Il est indispensable de passer sur une espèce non-rongeur pour sécuriser le passage d’un composé en développement clinique (demande réglementaire).
Réduction
Pour ces études, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose en tenant compte de la disponibilité de données historiques pour de nombreux paramètres étudiés et de leur variabilité. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Il n’y a pas d’études statistiques utilisées dans ce cas. Le nombre d’animaux est classiquement défini pour répondre à l’objectif de ces études.
Raffinement
Dans les études de sécurité non clinique, il est rarement fait usage de médicaments qui risquent d’interférer avec le produit à étudier et on s’appuie sur les fiches de point-limite pour prise de décision rapide (arrêt de la dose, euthanasie de l’animal etc…). Cependant, ponctuellement, le vétérinaire peut intervenir et décider de la mise en place de soins spécifiques (adaptés à l’observation notée). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie suite à l’administration d’un traitement) et mettre en place des techniques de raffinement telles que l’habituation par renforcement positifs (training) Une grille de points limite est employée afin de limiter la souffrance inutile de l’animal en permettant de mettre des actions correctives.Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie ou signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.
Choix des espèces
Les études de sécurité non-clinique n’ayant pas pour but de d’étudier un modèle de pathologie ni un effet thérapeutique mais de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicament chez l’Homme, des PNH sains peuvent être sélectionnés à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proche de l’humain en considérant la totalité des paramètres listés ci-dessous : - Pharmaco et toxicocinétique : exposition plasmatique au médicament, élimination, fraction libre du médicament … - Métabolisme : type et quantité relative de métabolites produits - Pharmacodynamie : homologie, présence, affinité et répartition de la cible pharmacologique - Physiologique : le PNH ne doit pas présenter de réactions physiologiques spécifiques non pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme (ex : pH gastrique). - Techniques expérimentales : formulation et excipients tolérés, voie d’administration possible - Expérience des médicaments compétiteurs de la même catégorie. Les animaux utilisés dans ce projet seront de jeunes adultes ou adultes, conformément aux requis réglementaires.
Implication d’une isoforme courte de protéine structurale des jonctions communicantes dans les capacités tumorales des cellules cancéreuses prostatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
152 souris athymiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules cancéreuses prostatiques par implantation sous-cutanée ou par chirurgie intraprostatique, pour évaluer le rôle d'une isoforme protéique dans la croissance tumorale et les métastases. Le porteur mentionne une possible perte de poids et une mobilité réduite en cas de cachexie liée aux métastases. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico ne permet d'étudier la progression tumorale dans un "organisme entier".
Objectifs
Malgré les nombreux progrès réalisés au cours des dernières années dans les domaines de la prévention, de la détection précoce et du traitement du cancer, cette maladie reste un problème majeur de santé publique. Lors de la croissance tumorale, certaines cellules cancéreuses acquièrent la capacité d’envahir les tissus environnants avant de disséminer dans des organes éloignés de la tumeur d’origine. Contrairement aux tumeurs primaires, cette capacité de dissémination n’est ciblée par aucune thérapie spécifique alors qu’elle est la cause majeure des décès par cancer. L’acquisition de la capacité d’invasion et le développement de métastases représentent donc un défi thérapeutique majeur qui nécessite d’en élucider les mécanismes moléculaires. Or, les mécanismes activés pendant la migration et l’invasion tissulaire sont complexes. Des travaux antérieurs ont pu préciser qu'une protéine structurale des jonctions communicantes intercellulaires, lorsqu’elle est localisée à la membrane plasmique, jouait un rôle important dans ces mécanismes moléculaires favorisant les capacités invasives des cellules de cancer de la prostate et dans la sensibilité au microenvironnement osseux dans le contexte des métastases. Il a également été rapporté qu’une isoforme courte particulière de cette protéine, située en intracellulaire, favorise, lorsqu’elle est surexprimée, le transit de la forme structurale longue vers la membrane des cellules cancéreuses prostatiques, les rendant alors plus agressives in vitro. Le présent projet a pour objectif d’évaluer in vivo le rôle protumoral de cette isoforme courte en étudiant l’effet de sa surexpression sur la croissance tumorale et sa capacité à induire et former des métastases.
Bénéfices attendus
Dans le domaine de recherche très peu exploré de cette isoforme courte, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à la présence membranaire de la forme longue de la protéine structurale et son rôle dans la sensibilité au microenvironnement dans le cadre des métastases osseuses. La validation in vivo de l'isoforme courte en tant facteur pro-tumorigénique permettra d’une part de la reconnaitre comme un marqueur prédictif de progression du cancer de la prostate et d’autre d’en faire une cible thérapeutique anti-cancéreuse. Ce dernier aspect nous semble particulièrement important car à l’heure actuelle aucun traitement ne cible particulièrement cette capacité métastatique.
Procédures
Pour cette validation in vivo, 3 procédures expérimentales différentes vont être mises en place mais utilisant toujours les 4 mêmes clones de cellules tumorales à des fins de comparaison. Chacune des procédures correspondra à un site d’implantation/injection différent. La procédure 1 correspondra à une implantation sous-cutanée des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 5 et 10 min). La procédure 2 correspondra à une implantation chirurgicale intraprostatique des différents clones de cellules prostatiques à des souris anesthésiées par voie gazeuse (durée de l'intervention entre 20 et 30 min). Enfin, la procédure 3 correspondra à une injection intravasculaire des différents clones de cellules prostatiques à des souris vigiles afin d'étudier l'impact de l'isoforme courte sur leur capacité à développer des métastases dans différents sites secondaires (durée de l'intervention environ 10 min). Le suivi du développement tumoral primaire ou métastatique se fera par imagerie in vivo sur animaux anesthésiés par voie gazeuse au maximum deux fois par semaine pendant 4 semaines pour la procédure 1 et pendant 5 semaines pour les procédures 2 et 3 (durée totale de chaque mesure entre 5 et 10 min).
Impact sur les animaux
Il existe une possibilité de perte de poids et une mobilité réduite en cas de développement de métastases liées à une potentielle cachexie pour les procédures 2 et 3.
Devenir
Tous les animaux des trois procédures seront mis à mort en fin d'expérience par anesthésie gazeuse (isoflurane) puis dislocation cervicale. Les tumeurs primaires seront ensuite systématiquement récupérées lors des procédures 1 et 2. En cas de signal in vivo révélant la présence de métastases, les tissus correspondants seront prélevés. Ces animaux, ayant subi une induction tumorale et développant potentiellement des métastases, ne pourront pas être réutilisés pour un autre projet.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale sur souris par d'autres alternatives in vitro en l'absence de modèles virtuels ou in silico disponibles pour etudier la progression tumorale et la dissémination métastatique dans un organisme entier.
Réduction
Par une approche statistique (Snedecor et Cochran), la réduction au maximum du nombre d'animaux nécessaires en expérimentation a été prise en compte, tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour conduire une étude statistiquement interprétable. Le suivi de la croissance tumorale par bioluminescence par un imageur dedié au petit animal permet non seulement de suivre la croissance tumorale au cours du temps mais également de réduire le nombre d'animaux utilisés en permettant de collecter un nombre important de données par individu.
Raffinement
Ce projet fait suite à des projets antérieurs qui nous ont permis d'affiner au mieux les procédures expérimentales, notamment pour la définition de points de contrôle et limites (comportementaux et physiques). Ainsi, les modalités d'injection des cellules tumorales sont réalisées sous anesthésie générale, avec contrôle de la température corporelle, en présence d'antalgiques et d'anti-inflammatoires en péri et post phase opératoire afin de limiter au maximum la douleur. Des grilles de suivi ont été élaborées pour suivre au plus près le bien être animal. En cas d'apparition de signes de mal-être, un traitement à base de dérivés morphiniques est mis en place immédiatement. De plus, les conditions d'élevage sont optimisées au mieux (hébergement en groupe social de 4 à 5 souris, environnement enrichi avec des conditions de température et d'hygrométrie controlées) afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales et de l'absence d'interférences sur les résultats. Ce projet utilise des animaux immnodéprimés. Les conditions d'hébergement sont adaptées et compatibles pour le maintien du statut sanitaire requis pour ces animaux génétiquement altérés.
Choix des espèces
Afin de pouvoir comparer les résultats que nous obtiendrons à ceux de la littérature, l’utilisation de souris est complètement justifiée. C’est également un modèle animal où l’induction des tumeurs dans les souches Nude est rapide et le suivi de leur croissance facilité par un imageur du petit animal. Les souris athymiques Nude sont très largement usitées dans les études oncologiques qui utilisent des cellules cancéreuses humaines rendant impossible le recours à des souris non immuno-déprimées. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience pour les 3 procédures expérimentales. Cet âge correspond à des animaux matures sexuellement et dont la prostate est suffisamment développée pour permettre une injection standardisée.
Etudes des interactions hôtes-pathogènes appliquées à la recherche de nouveaux types d’antituberculeux.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
6704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1676 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la tuberculose, parfois co-infectées par le SARS-CoV-2, la grippe ou le pneumocoque, et reçoivent des composés par gavage jusqu'à sept jours par semaine. Le porteur indique que les surinfections peuvent provoquer des signes cliniques graves pouvant aller jusqu'à la mort des animaux. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'infection et revendique la souris comme un "modèle incontournable".
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose, et d'évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. L'intéraction entre la tuberculose chronique et d'autres pathogènes pulmonaires étant encore mal caractérisée, un autre objectif de ce projet sera de caractériser et d'étudier l'évolution de la co-infection (tuberculose et agents pathogènes viraux/bactériens pulmonaires, tels que les virus SRAS-CoV-2 et Influenza H3N2/H1N1 et les bactéries Streptococcus pneumoniae Sérotype 1) dans un modèle de souris.
Bénéfices attendus
Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,5 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2020 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19 (et avant le sida). Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent (i) à identifier de nouveaux types d'antituberculeux efficaces sur les souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis, (ii) à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec ces mycobactéries, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’infection, et (iii) à caractériser et étudier l'impact d'une co-infection pulmonaire chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.
Procédures
Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage ou voie intrapéritonéale ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale ou intranasale peut également être utilisée 3 à 4 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes pulmonaires est réalisée par voie intranasale sous anesthésie ou par voie intraveineuse ou sous cutanée sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis, puis (ii) un des autres pathogènes pulmonaires étudiés. Pour l'imagerie, les animaux sont anesthésiés et placés dans une cassette de contention pendant une durée de 5 minutes pour permettre l'acquisition des images (1 à 2 fois par semaine).
Impact sur les animaux
Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés, pouvant aller jusqu'à entrainer la mort des animaux.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire active.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires. Une approche par imagerie du petit animal, sous anesthésie, sera développée au sein du Laboratoire de Haute Sécurité pour permettre le suivi de l'infection d'un seul groupe d'animaux au cours du temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Nous espérons à terme que cela puisse réduite le nombre d'expériences.
Raffinement
De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l''infection ou le gavage. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des anmaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues.
Choix des espèces
1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux (Balb/C et C57BL/6, wild-type et KO) utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Développement de candidats vaccins ARNm anti-cytokine chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenues vigiles par contention, elles reçoivent des injections de nanoparticules lipidiques puis cinq injections quotidiennes de luciférine, avant prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie. L'expérience ne teste pas encore un vaccin mais sert à choisir la meilleure formulation lipidique à l'aide d'un ARNm marqueur. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue la réponse à un vaccin et juge le recours à la souris "incontournable".
Objectifs
Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines et conduit à l’apparition de la pathologie. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps anti-cytokine après administration d’un vaccin appelé ‘Kinoïde’. Ce dernier est présenté soit sous forme de protéine, soit sous forme de vaccin ARN véhiculé par des lipides. L’injection du vaccin Kinoïde™ a pour but d’induire chez la souris des anticorps contre la cytokine d’intérêt. Il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous oblige à les tester chez la souris. Afin de développer ces nouveaux candidats vaccins, nous devons sélectionner dans un premier temps les transporteurs lipidiques permettant de protéger l’ARN et de l’acheminer aux bonnes cellules afin d’induire la production d’anticorps. PPour cela, nous souhaiterions définir la composition des formulations lipidiques (nanoparticules lipidiques ou NPL) optimale dans lesquels seront encapsulés les ARNm afin de permettre une meilleure délivrance aux cellules et ainsi une meilleure expression de la protéine d’intérêt. Pour ce faire, nous utiliserons comme modèle un ARNm codant pour la Firefly luciférase (ARNm-FLuc). Cette dernière, après réaction avec son substrat, la luciférine, émet un photon lumineux, qui permettra d’évaluer par imagerie optique, technique non invasive et non traumatisante, le profil de distribution des différentes formulations lipidiques et l’expression de la protéine en fonction du temps. Ces travaux nous permettrons de sélectionner la meilleure formulation lipidique pour encapsuler nos constructions d’ARNm constituant ainsi une nouvelle voie de protection contre les pathologies allergiques chez l’homme.
Bénéfices attendus
L’évaluation du profil de distribution des différents transporteurs lipidiques en fonction du temps nous permettra de sélectionner la formulation lipidique optimale pour encapsuler nos ARN pour pouvoir ensuite évaluer leur d’immunogénicité .
Procédures
Les 1500 animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes recevront une injection unique de formulation lipidique NPL par voie intramusculaire dans le muscle de la patte arrière (750 souris) ou une injection sous-cutanée dans le flanc (750 souris). De plus, chaque animal vigile maintenu par contention pendant 30 secondes recevra au total 5 injections de luciférine par voie péritonéale, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours. L’anesthésie des souris lors des injections n’est pas prévue. Le prélevement sanguin est réalisé en moins de 30 secondes sur souris anesthèsiees à l'isoflurane. Chaque animal subira 3 prélèvements au total. L’imagerie sera réalisée sous anesthèsie isoflurane sur une durée de 15min, au total. Chaque animal sera imagé 1 fois par jour pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Ainsi, la température de la pièce, la ventilation et l’éclairage seront contrôlés pour limiter le stress des animaux. De plus, le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage afin de leur assurer l’espace nécessaire. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau sera fourni ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal. Les animaux disposent d'une période d'acclimatation (minimum 7 jours) avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter l'angoisse subie. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées par voie intramusculaire, sous-cutanée ont lieu de façon unique et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Seul le stress de la contention impacte brièvement leur comportement. Des effets indésirables peuvent se produire aux sites d’injection (intramusculaire, sous-cutané) tels que des rougeurs, des gonflements ou des lésions pouvant durer quelques heures à quelques jours. Une douleur musculaire localisée pourra entre autres être détectée si l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse.
Devenir
Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. Après la dernière imagerie réalisée, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale.
Remplacement
Des tests cellulaires in vitro seront effectués au préalable pour sélectionner les formulations NPL constituées de différents lipides par analyse de l’expression de la luciférase par les cellules. Cette première sélection permettra de ne tester chez l’animal que les formulations optimales et de réduire ainsi le nombre d’animaux.
Réduction
L’utilisation de l'imagerie nous permet de suivre l’évolution de l’expression et de la biodistribution des formulations lipidiques encapsulant l’ARNm injectées chez la souris en fonction du temps. Cette technique non invasive nous permet ainsi de réduire le nombre d'animaux. Si une absence de réponse pour une formulation est observée, l’étude sera interrompue et de ce fait le nombre d’animaux sera réduit.
Raffinement
Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les animaux subissent des contraintes très modérées puisque les procédures effectuées seront légères. Les injections, réalisées par voie intramusculaire et sous-cutanée ont lieu de façon unique et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Seul le stress de la contention impacte brièvement leur comportement. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance (Buprénorphine à 0,05 mg/kg par voie sous-cutanée) Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. Si un animal présente l'un des points limites à un seuil critique, une injection d’analgésique sera effectuée ou en fonction du grade il sera mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (igloo + copeaux) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Les souris utilisées seront des souris adultes, de 7 semaines avec un système immunitaire mature pour tenir compte de leur réponse humorale. En effet, il n’existe à ce jour pas de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immune à un vaccin. Cette limitation rend incontournable le recours à l’expérimentation animale, préférentiellement la souris, pour tester l’efficacité de nouveaux candidats vaccins.