Procédures modérées
Rôle d’un polluant environnemental (l’HBCDD) comme facteur de susceptibilité dans l’apparition des troubles du spectre autistique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
458 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la grande majorité tuée à l'issue et dix-huit réutilisés. Quarante rates gestantes sont gavées quotidiennement pendant quarante-deux jours avec un polluant retardateur de flamme, le HBCDD, et reçoivent une injection intrapéritonéale, pour étudier son rôle dans les troubles du spectre autistique de leur descendance. Le porteur indique que les mères sont tuées au sevrage des petits et que les ratons en surnombre, au-delà de dix par portée, sont prélevés au hasard et tués. Les descendants restants subissent des tests comportementaux puis sont mis à mort.
Objectifs
Les Troubles du Spectre de l’Autisme (TSA) se manifestent par des déficits de communication sociale associés à des intérêts restreints et des comportements stéréotypés. Alors que la prévalence de ces troubles est en augmentation dans les pays développés, seuls 25% des cas impliquent la composante génétique questionnant le rôle des facteurs environnementaux, dont les polluants chimiques, dans cette pathologie. Des résultats obtenus chez l’Homme et chez l’animal montrent des modifications des capacités motrices, de l’anxiété et de l’attention chez des individus ayant été exposés précocement à des niveaux environnementaux de retardateurs de flamme bromés dont l’HexaBromoCycloDoDecane (HBCDD), justifiant sa classification en Europe en tant que substance à très haut niveau de préoccupation. La neurotoxicité développementale de l’HBCDD a été montrée par l’équipe porteuse de ce projet qui se propose maintenant d’étudier les mécanismes sous-jacents de cette toxicité cérébrale induite par une exposition périnatale à l’HBCDD et le rôle que cette exposition pourrait jouer en tant que facteur de susceptibilité dans un modèle expérimental de Troubles du Spectre de l’Autisme. Il est donc proposé ici d’étudier l’incidence et les mécanismes sous-jacents de l’exposition précoce à l’HBCDD comme facteur de susceptibilité dans l’apparition des TSA induite par l’administration d’acide valproïque au cours de la gestation.
Bénéfices attendus
Les retombées scientifiques de ce projet visent donc à associer le modèle de Troubles du Spectre de l’Autisme précédemment validé à une exposition de la mère à deux doses d’HBCDD (HexaBromoCycloDoDecane) au cours de la période périnatale (Jour de gestation 1 à 21 jours postnataux) dans le but ultime d’étudier l’impact de l’HBCDD en tant que facteur de susceptibilité pour cette pathologie dans la descendance.
Procédures
Ce projet d’une durée de 3 ans inclura un total de 40 rats femelles Wistar gestantes ainsi que leurs descendants. Les 40 rates adultes seront réparties en 4 groupes expérimentaux (n=10 par groupe) et constitueront le lot 1. La voie orale étant la voie principale de l’exposition humaine à l’HBCDD, le polluant sera administré via la même voie par gavage. Les animaux du groupe C seront administrés quotidiennement avec le polluant à la dose de 0.1 µg/kg et le groupe D à une dose 100 fois supérieure à celle-ci. Les groupes A et B recevront le véhicule (huile neutre). L'administration durera 42 jours couvrant ainsi les périodes de gestation (21 jours) et de lactation (21 jours) de manière à mimer une exposition humaine dans un environnement contaminé pendant les 9 mois de grossesse et les 6 mois d’allaitement (durée établie par l’OMS). A l’issue de la naissance, les ratons de chaque portée seront sexés et marqués pour pouvoir être suivis individuellement et le poids mesuré tous les 3 jours jusqu’au 21e jour de vie postnatale (PND) puis 1 fois par semaine. Un suivi de l’ouverture des yeux sera réalisé entre les jours 14 et 16 de vie postnatale en tant que marqueur précoce dans les premières semaines. Le lot 1 concernera également les ratons (n=400) lors du suivi de leur développement jusque PND21 puis une partie de ces descendants (n=240) seront mis à mort. Plusieurs tests comportementaux seront effectués par le lot 2 (n=96) au cours des semaines 9 à 11 après la naissance et viseront à étudier l’expression des 3 critères comportementaux (somesthésie, activité/anxiété et interactions sociales/stéréotypies) caractéristiques d’un phénotype autistique tels que mentionnés plus avant. A la fin de l’évaluation comportementale, les animaux de ce lot seront mis à mort pour collecter des tissus. Le lot 3 (n=64) sera dédié à l’étude de la réactivité à un stress psychologique lors d’un test de stress de contention qui sera réalisé à PND90. Les animaux de ce lot seront ensuite mis à mort pour réaliser des prélèvements.
Impact sur les animaux
- L'administration orale du polluant chez les mères se fera par gavage, les effets attendus sur les animaux sont une gêne de courte durée due à l'administration de la canule de gavage. - Une injection intrapéritonéale est ensuite prévue au 12ème jour de gestation pouvant entrainer une douleur légère au point d'injection. - Le marquage, le suivi de l'ouverture des yeux et le suivi de croissance des animaux par pesée n'entrainent aucun effet indésirable. Ces interventions nécessiteront une séparation de la mère de courte durée lorsqu'elles seront réalisées sur les animaux à un jeune âge pouvant entrainer un stress de séparation. - Le test de la plaque chaude prévue dans ce protocole entrainera une sensation de chaleur sous les pattes de l'animal suffisamment importante pour qu'il exprime une gêne sans aller jusqu'à une brulure car le test est stoppé en amont. - Le test de la pince calibrée entrainera une gêne de l'animal au niveau des pattes postérieures qui seront pincées par le dispositif sans aller jusqu'à une douleur. - Les tests du labyrinthe en crois surelevé et de l'open-field mettent les animaux dans une situation stressante pour eux, l'effet attendu est donc le ressenti d'une anxiété. - Les tests de l'enfouissement des billes et celui de sociabilité de Crawley n'ont pas d'effets indésirables prévus. - Le test du résident-intrus peut amener l'animal à exprimer une certaine agressivité envers l'autre congénère réalisant le test. - Le stress de contention aura pour effet indésirable le ressenti d'une anxiété par l'animal puisqu'il sera placé dans une situation stressante pour lui. Des prélèvements sanguins seront réalisés au début et à la fin du test et entraineront alors une douleur légère liée à la piqure des aiguilles. Un suivi de température sera également réalisé par l'administration d'une sonde rectale causant chez l'animal une gêne le temps de ce suivi.
Devenir
Procédure 1 : Les 40 femelles allaitantes (groupes A, B, C et D) seront gardées en vie jusqu’au sevrage des jeunes à 21 jours, puis seront mises à mort. A la mise bas, dans le cas de portées avec un nombre de ratons trop important (>10), les animaux en surnombre seront prélevés au hasard et mis à mort. Une partie des descendants seront également mis à mort (n=240) à 21 jours postnataux. Procédure 2 : Tous les animaux seront mis à mort (n=96) à 80 jours postnataux. Les 18 rats (9 femelles et 9 mâles) ayant servi d'intrus dans les tests de sociabilité pourront être gardés en vie à l'issue des tests de comportement et réutilisés selon les besoins Procédure 3 : Tous les animaux seront mis à mort (n=64) à 90 jours postnataux. Les prélèvements réalisés sur les animaux de tous les lots serviront pour des dosages tissulaires et plasmatiques.
Remplacement
Seul le recours à l'animal peut permettre de mimer la complexité comportementale et cérébrale des Troubles du Spectre Autistique (TSA) tels qu'ils sont observés chez l'homme, justifiant le recours à un modèle animal pour cette étude. Le modèle de TSA développé chez les rongeurs par administration d'acide valproïque (VPA) est reconnu pour générer des phénotypes comportementaux comparables à ceux observés chez les autistes chez l'Homme. Aucun système alternatif ne permet de simuler le niveau de complexité de l'organisme entier nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats avec l'assurance d'une puissance statistique adéquate (60 à 80%). Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est de 40 rats adultes (40 rates gestantes) ainsi que la descendance obtenue (400 ratons),18 rats (9 femelles et 9 mâles) qui serviront d’intrus pour les tests d’interaction sociale. Le nombre de 10 rates gestantes par groupe est estimé suffisant pour pouvoir s’affranchir d’un effet propre à la portée sur la variabilité des résultats. De plus, le nombre de descendants est ajusté à 10 par portée de façon à standardiser les effets de la taille de la portée sur la croissance et le développement dans l’ensemble des portées. Dans le cas d’un nombre de ratons supérieur à 10, les animaux en surnombre pourront être utilisés pour compléter des portées nées le même jour et comprenant moins de 10 ratons. Si ce n’est pas le cas, ces animaux surnuméraires seront mis à mort. En cas d’un nombre plus faible (inférieur à 10), l'ajout d'animaux excédentaires provenant d'autres portées du même groupe pourra être réalisé si les portées sont nées le même jour. Si cet ajout n'est pas possible, des portées de 8 ratons seront considérées comme de taille minimum. Les portées de taille inférieure seront écartées et les ratons mis à mort pour des prélèvements.
Raffinement
Les femelles gestantes puis allaitantes seront hébergées avec leurs jeunes jusqu’à 21 jours postnataux. Puis les jeunes rats seront hébergés ensemble par portée après retrait de la mère entre 21 et 28 jours de vie afin de maintenir les liens sociaux formés dans la portée. A 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les animaux seront finalement placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires en termes de rapport hauteur/surface au moment où leur poids et taille le nécessiteront. L'eau et la nourriture seront disponibles ad libitum durant tout le protocole. Les cages seront maintenues dans des conditions d'hébergement contrôlées en cycle lumineux inversé (lumière allumée à 19h). Le milieu sera enrichi avec des feuilles de papier absorbant de manière à éviter le grignotage des matières plastiques des objets habituellement utilisés qui contiennent des substances de toute sorte pouvant interférer avec le polluant (HBCDD). Les tests comportementaux se feront ainsi durant la phase d’activité naturelle (phase nocturne) des rats de manière à préserver leur période de repos. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les points limites suivants relevés (diminution de la consommation alimentaire et hydrique, ralentissement de la prise de poids, modifications de l'apparence physique externe et du comportement de l'animal). Si l'un de ces points limites est atteint, l’animal sera isolé et surveillé, voire mis à mort selon une méthode réglementaire (injection létale) en cas de persistance de l’état de mal-être de l’animal. Tous les animaux seront traités par les mêmes personnes entrainées de manière à réduire le stress de l’administration des produits et de la manipulation.
Choix des espèces
Alors que le modèle de Troubles du Spectre Autistique (TSA) induit par l'acide valproïque (VPA) a été développé chez le rat et la souris, les caractéristiques comportementales du rat, en particulier au plan du comportement social diffèrent de celles de la souris et font que cette espèce est à privilégier pour induire des phénotypes comportementaux de type autistique. De plus, cette espèce est celle qui a été utilisée lors des expérimentations animales précédentes visant à mettre au point ce modèle de TSA dans un contexte de co-exposition au polluant environnemental (HBCDD) rendant nécessaire de poursuivre avec la même espèce pour cette étude. Les femelles qui seront utilisées pour la reproduction seront utilisées au même stade adulte (12-13 semaines) que dans les études précédentes de manière à obtenir des résultats comparables. Les femelles seront placées au moins une semaine avant la phase d’accouplement dans une salle d’hébergement en cycle inversé. L’œstrus (période pendant laquelle la femelle est fécondable) sera confirmé grâce à l’utilisation d’un moniteur de cycle œstral digital pour rongeur, par un personnel expérimenté et habitué à ce geste de contention manuelle légère. Une fois l’œstrus confirmé, les rates seront placées en accouplement. Pour cette étape, une seule femelle est placée en présence d’un seul mâle pendant la 2ème partie de la phase d’obscurité (après-midi). Si la femelle montre des signes de réceptivité sexuelle (comportement caractéristique de lordose c’est-à-dire d’une position permettant la copulation et frémissement des oreilles qui normalement précèdent l'acceptation de la monte), la femelle sera laissée en présence du mâle jusqu’au lendemain matin (soit une période d’environ 12h). Leurs descendants seront utilisés aux stades postnataux PND1 à PND90 afin de valider d’un point de vue comportemental, l’expression phénotypique des trois critères principaux de diagnostic des TSA qui sont : i) un déficit d’interactions sociales et une stéréotypie, ii) une atteinte de la sensibilité au niveau du système somesthésique et iii) une hyperactivité et une hyperanxiété.
Pose de cathéter veineux central chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
65 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Chaque lapin subit une chirurgie d'environ vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, dans le but d'offrir ce dispositif à des chercheurs dans le cadre de prestations ou de collaborations. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'est attendue et que les animaux supportent très bien le cathéter et le gilet. Le projet installe le cathéter pour faciliter les prélèvements et injections des expériences ultérieures auxquelles ces lapins seront soumis.
Objectifs
Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 65 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2022.
Bénéfices attendus
La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.
Impact sur les animaux
La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.
Devenir
Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.
Remplacement
Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.
Réduction
Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 65 sur 1 an.
Raffinement
Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.
Effets de souche bactérienne sur la production d’hormone
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des souches bactériennes dans l'eau de boisson pendant vingt-sept jours, hébergées seules pour mesurer leurs prises alimentaire et hydrique, et subissent un prélèvement de sang à la queue puis un prélèvement terminal par ponction cardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que l'apport bactérien pourrait perturber le transit intestinal et que la prise de sang initiale représente 15 % du volume sanguin. Toutes les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans le développement de composés thérapeutiques visant à moduler ou restaurer le microbiote afin de produire une hormone spécifique. Cette étude se déroulera en deux étapes avec une étape préliminaire ayant pour but de sélectionner la souche bactérienne la plus efficace. Dans un second temps, à partir de cette souche-candidat, une dose-réponse sera effectuée afin de déterminer la dose optimale pour les études futures.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés thérapeutiques visant l'humain. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouveau composé modulant ou restaurant le microbiote permettant la production d'une hormone spécifique.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types de prélèvement, un prélèvement sanguin à D0 par la veine caudale (2x100µL) sur animal vigile et un prélèvement sanguin terminal par ponction cardiaque sur animal anesthésié par l'administration d'un mélange de kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.). Par ailleurs, les animaux auront des souches bactériennes par l'eau de boisson de D0 à D27. Les 24 souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
La nécessité de mesures individuelles de la prise alimentaire et de la prise hydrique implique l'hébergement individuel des animaux. L'administration des souches bactériennes par eau de boisson de D0 à D27 pourrait engendrer des modifications du transit intestinal (non prévue initialement dans l'étude). La seule manipulation pouvant engendrée une nuisance est le prélèvement sanguin à D0 (200µL) par la veine caudale (représentatif de 15% du volume sanguin total). L'ensemble des souris seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par l'administration d'un mélange de kétamine/Xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/Kg; i.p.). Les souris seront ensuite euthanasiés par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d'un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et hydrique et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudés sont les suivants : le poids corporel, la prise alimentaire, la prise hydrique, la cytokine IL-10 (serum) et l'hormone ocytocine (plasma). De plus, l'étape 1 du projet nous permet de réduire drastiquement le nombre d'animaux à utiliser pour la dose-réponse de l'étape 2. Cette étape préliminaire est indispensable pour le respect de la règle des 3R.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitement seront administrés via la nourriture ou la boisson, permettant de limiter les manipulations et le stress liés à l'administration des traitements. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois spécialement conçus pour le rongeur. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques (Buprénorphine notamment). L'ensemble des souris sera euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie réalisée par injection d'un mélange kétamine/xylazine (100mg/kg et 15mg/kg respectivement; 10ml/kg; i.p.).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J est le modèle de souris le plus classiquement utilisés et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge de 7 semaines, au début des traitements. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population de jeune adulte.
Preuve de concept de la valeur ajoutée de l’utilisation de l’IRM dans l’étude d’un modèle de lymphome implanté chez la souris immunocompétente
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de lymphome leur est implantée sous la peau par chirurgie sous anesthésie, puis suivie par des séances d'imagerie IRM sous anesthésie, jusqu'à quatre par animal, pour démontrer l'intérêt de cette imagerie en oncologie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraîne la mise à mort de l'animal. Les souris sont tuées en fin de procédure pour congélation ou fixation des tumeurs.
Objectifs
Le projet présenté vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) en oncologie . L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée en clinique. Nous attendons de l'IRM qu'elle permette de raffiner les études précliniques et ainsi à terme d'optimiser la règle des 3R, mais également qu'elle permette de travailler avec des modèles tumoraux inaccessibles aux méthodes classiques. Le projet présenté rentre dans ce dernier cas de figure. Il porte sur le suivi par IRM d'un modèle de lymphome implanté en sous-cutané chez la souris immunocompétente. Ce modèle présente un intérêt fort pour comprendre les mécanismes d'apparition de résistances aux anticorps thérapeutiques, mais ne peut pas être étudié avec des méthodes conventionelles. En effet, après l'implantation sous cutanée du modèle tumoral, se développe à l'emplacement soit une masse tumorale, soit une masse inflammatoire, qui ne peuvent pas être discriminées par les méthodes d'observation et de mesure. L'IRM permettra de faire cette discrimination. Le projet prévoit d'utiliser 30 souris, 10 pour amplifier la modèle tumoral in vivo, 20 pour l'analyse IRM.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de caractériser un modèle de cancer du sang, le lymphome B, afin de développer un variant permettant de comprendre les mécanismes d’apparition de résistances à un anticorps thérapeutique. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive en oncologie préclinique, technique dont la précision permettra à terme d'optimiser les 3R dans ce contexte.
Procédures
-implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum -anesthésie fixe durant l’IRM durée maximale 30 minutes de kétamine/Xylazine sur un total de 2/semaine durant 2 semaines soit 4 injectionx maximum.
Impact sur les animaux
- Perte de poids constatée : plus de 10% non améliorée par ajout de nourriture humide en maximum 24h ; une perte de plus de 20% qui serait liée à l'évolution de la croissance entrainera une mise à mort de l’animal - implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute administration d’antalgiques au préalable ; - croissance de tumeurs sous-cutanée au niveau du flanc - anesthésie fixe durant l'IRM pour une durée maximale de de 30 minutes,4 séances maximum espacées de 3 jours au minimum
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de chaque procédure (soit pour congelation des tumeurs pour le stock soit pour fixation en formol).
Remplacement
Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire que sur l’organisme entier.
Réduction
Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement au taux d’anomalies de croissance tumoral. Nous utiliserons 10 souris + 20 souris soit 30 souris totales, et ferons une étude statistique d’analyse de contingence et un test de Fischer pour comparer avec une situation normale.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final des tumeurs seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie. La procédure d’imagerie IRM se fera sous anesthésie.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.
Nouvelles thérapies moléculaires et cellulaires dans la prévention du rejet de greffe.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie et, pour une partie, une greffe de peau entre donneuse et receveuse préalablement immunisée, pour étudier des traitements contre le rejet d'organe. Le porteur indique des complications possibles de cicatrisation, de saignement ou d'infection au site de greffe, et une déshydratation liée à un bandage trop serré. Toutes les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélèvement de sang et d'organes.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque, respiratoire ou rénale terminales sont des problèmes majeurs de santé publique. La transplantation d’organe est le meilleur traitement car elle permet d’améliorer la qualité et la durée de vie des patients. Cependant, la morbidité et la mortalité des patients transplantés restent élevées. Ceci s'explique notamment par une forme particulière de rejet d’organe, le rejet humoral. Ce dernier est causé par les lymphocytes B qui produisent des anticorps contre les protéines HLA du donneur, exprimées à la surface des cellules de l’organe transplanté. Certains patients possèdent déjà des anticorps anti-HLA avant la transplantation, parce qu’ils ont été exposés à du HLA étranger à l’occasion d’une transfusion, d’une grossesse, ou d’une précédente transplantation. Ces anticorps préexistants compliquent l’accès à la transplantation de nombreux patients. Certaines protéines HLA, comme le HLA A2, sont plus souvent en cause, parce qu’elles sont communes à une grande partie de la population. Actuellement, la seule prise en charge possible de cette immunisation du receveur contre le HLA du donneur repose sur une immunosuppression globale, visant toutes les sous classes des lymphocytes. Cette immunodépression massive expose le receveur à un haut risque d’infections et de cancers. En outre, certains plasmocytes producteurs d’anticorps anti-HLA ne peuvent pas être ciblés par les thérapeutiques actuelles, ce qui explique l’efficacité médiocre des protocoles existants. Notre projet vise à développer une approche thérapeutique plus sélective qui cible uniquement les lymphocytes B et plasmocytes qui produisent les anticorps contre une protéine HLA spécifique du donneur. Une telle approche permettrait à la fois d’obtenir une meilleure efficacité en ciblant également les plasmocytes, et une meilleure tolérance, en préservant les lymphocytes et plasmocytes qui ne sont pas impliqués dans la production des anticorps anti-HLA.
Bénéfices attendus
Cet étude permettra le développement et la validation préclinique des nouvelles stratégies de thérapie cellulaire et moléculaire visant à prévenir et traiter le rejet humoral, de façon à faciliter l’accès à la transplantation des patients sur liste d’attente.
Procédures
Les procédures #1, 2 et 3 impliquent des prélèvements sanguins hebdomadaires (100ul) sur souris anesthésiée ( pour monitorer l’efficacité, d’abord, du protocole d’immunisation (J-7 avant début du traitement) et, en suite l’efficacité, de nos traitements dans évolution du tôt d’anticorps et lymphocytes B spécifiques. La procédures #3 prévoie aussi une procédure de greffe de peau entre souris donneuse et souris receveuse pre-immunisée contre le donneur : la procédure chirurgicale est effectué une seule fois sur souris anesthésiée pendant 10-15 minutes.
Impact sur les animaux
Des complications éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure 3, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe ou du site de l'injection. Ces complications sont rares (
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale pour collecter le sang (ponction intracardiaque) et les organes d'intérêt (ratte, foie, os, poumon, ganglions) pour l'analyse des effets des traitement sur les différents sous populations de lymphocytes B.
Remplacement
Des études préliminaires sur cellules sont en cours pour établir l’efficacité in vitro des différents traitements (cellulaire et moléculaires) sur une population mixte de lymphocytes dérivés de souris immunisées contre le HLA A2. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude pré-clinique.
Réduction
Les études in vitro nous permettront d’estimer l’efficacité des différentes approches testées. Dans le cas de résultats clairement négatifs (absence d’effets), la procédure relative au traitement en question sera retirée du projet et les souris ne seront pas utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui pourront entrainer le cas échéant l'euthanasie de l‘animal par dislocation cervicale. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et à la zone de la chirurgie pour les animaux greffés.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. Il s'agit d'un prérequis indispensable à toute application de nos approches à l’Homme. De plus, l'utilisation de souris permet l'accès aux modèles transgéniques qui, ici, nous permettent de répondre à des questions précises. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).
Evaluation de l’effet hallucinogène de l’Ayahuasca chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
305 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue et le reste réutilisé ou transféré. Ils reçoivent par voie orale ou injectable des substances hallucinogènes présentes dans l'ayahuasca, la DMT et une β-carboline, subissent des prélèvements de sang et sont observés isolés pendant deux heures pour compter leurs secousses de type wet dog shakes. Le porteur indique que l'ayahuasca peut provoquer une anxiété aiguë et perturber le comportement des rats plusieurs heures durant. Selon les besoins du commanditaire en échantillons terminaux, chaque rat est tué pour prélèvement d'organes ou gardé vivant pour des formations internes.
Objectifs
Dans ce projet, les effets hallucinogènes de principes actifs pharmaceutiques seront étudiés. La N,N- diméthyltryptamine (DMT) et la β-Carboline, un alcaloïde, sont des substances psychotropes puissantes considérées comme des stupéfiants en France. Ils sont retrouvés dans la composition de l’Ayahuasca, boisson amazonienne psychédélique, ingérée traditionnellement dans un cadre chamanique, principalement à des fins thérapeutiques, d’apprentissage ou de divination. Cette boisson est produite à partir de la décoction de Banisteriopsis caapi et Psychotria viridis, des plantes contenant respectivement de la BC et de la DMT. Il existerait des bénéfices thérapeutiques de l’Ayahuasca pour les patients souffrant de dépression, d’idées suicidaires ou de graves problèmes de santé mentale. Cependant, l’Ayahuasca présente de nombreux effets indésirables en fonction de la dose utilisée (nausées, vomissements, diarrhées ou psychoses aigus conduisant même à la mort). L’objectif du présent projet est donc d’évaluer les effets hallucinogènes de plusieurs doses et compositions à partir du breuvage traditionnel de l’Ayahuasca en comparaison avec le 2,5-Dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) qui est une substance psychédélique et une amphétamine substituée. Le DOI est un agoniste sérotoninergique puissant. Le DMT a une activité pharmacologique similaire mais sa biodisponibilité orale est très faible sans les composants de l'Ayahuasca, comme la β-Carboline, qui empêchent son métabolisme dans l'intestin. En jouant sur les doses et le ratio des composants du breuvage, le sponsor souhaite obtenir un composé qu’il pourrait développer en clinique dans l’indication de troubles psychiques en limitant les risques d’effets secondaires. Les effets du DMT seul, de la β-Carboline seule et de différents ratios de DMT et β-Carbolines seront mesurés. Le sponsor souhaite ensuite étudier les effets secondaires de type nausées et vomissements chez le furet (dans le cadre d’une autorisation de projets différente). L'activité hallucinogène sera étudiée en utilisant le test de "secouement du chien mouillé" (WDS pour wet dog shake). De nombreuses substances hallucinogènes qui agissent comme agonistes des récepteurs sérotoninergiques, tel que le DOI, provoquent un mouvement rotatif paroxystique et rythmique chez les rongeurs. Pour ce projet, le nombre de WDS et de secousses isolées de la tête (HS pour head shake) chez le rat seront comptabilisés pendant un total de 120 minutes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux caractériser les effets hallucinogènes de l’Ayahuasca à différentes doses sur le modèle rongeur de WDS. L’Ayahuasca pourrait être prometteuse et être proposée comme nouvelle stratégie thérapeutique aux patients souffrant de dépression et troubles de santé mentale.
Procédures
Les rats seront traités par voie orale, par voie sous cutanée (ou par voie intrapéritonéale) avec une substance à tester ou son véhicule. Ces administrations seront réalisées sur animaux vigiles en contention et dureront moins d'une minute. Des prélèvements de sang seront réalisés pour l’étude du profil pharmacocinétique des substances. Un prélèvement sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (induction 4% pendant 4 minutes, entretien 2,5% mix air et oxygène) par ponction directe à la veine jugulaire sera réalisé. Le prélèvement de sang est très rapide (quelques minutes). Si le volume de sang souhaité par le sponsor est important, un prélèvement en intracardiaque avant la mise à mort est alors réalisé. L’effet hallucinogène des substances sera étudié avec le test du WDS qui consiste à observer les animaux sur une période de 2h et comptabiliser le nombre de WDS. Les animaux seront isolés pendant cette période et seront replacés dans leur cage d’hébergement avec leur paire dès le retour à un comportement normal. Dans le cas où le sponsor voudrait réaliser des analyses sur cerveau perfusé, alors une perfusion intracardiaque serait réalisée.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration de l’Ayahuasca et de DOI. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Ces molécules sont connues pour induire des effets indésirables et de forts effets hallucinogènes. Après administration de DOI, une activité locomotrice et exploratoire normale est décirt dans la littérature. Avec l'Ayahuasca, une anxiété aigue (diminution de l'exploration et de l'activité locomotrice) pourrait être observée. L’état comportemental des rats pourra donc être perturbé pendant les quelques heures qui suivront l’administration. L’observation des WDS nécessite d’isoler les animaux pendant 2h. Le stress de l’isolement est considéré comme aigu. Les animaux satellites subiront au maximum 3 prélèvements de sang par ponction de la veine jugulaire (technique faiblement invasive) sous anesthésie gazeuse de courte durée.
Devenir
Selon si le sponsor a besoin d’échantillons prélevés en terminal (volume de sang important et/ou organes) ou non, l’animal sera mis à mort ou gardé en vie. Les animaux maintenus en vie seront utilisés dans le cadre de formations internes ou d’améliorations de nos procédures (raffinement) ou bien seront réhabilités dans des centres de formation (université, formation d’expérimentation animale ou chirurgie).
Remplacement
Ce projet ayant pour but l’étude comportementale chez le rat de l’effet hallucinogène de préparations à tester, il est indispensable d’avoir recours à l’animal. De plus, même si les méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites pour caractériser le profil pharmacocinétique d'un composé (absorption, métabolisme et excrétion). L’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.
Réduction
L’étude est séquencée en plusieurs étapes afin de n’utiliser des animaux qu’après validation de chaque étape. Si l’induction avec le contrôle positif n’était pas concluante alors le projet serait interrompu. Un seul groupe contrôle négatif sera utilisé pour chaque étape afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les observations comportementales seront réalisées en aveugle, ce qui justifie de n'utiliser qu'un seul groupe contrôle négatif même si les voies d'administrations et les véhicules sont différents entre le contrôle positif et les préparations à tester. Le N a été déterminé en tenant compte de l'effet hallucinogène attendu du contrôle positif, décrit dans la littérature. Avec les premiers résultats obtenus au cours des études pilotes, un calcul de puissance sera réalisé.
Raffinement
L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance toute particulière sera portée au suivi des animaux afin de prévenir et de remédier au plus vite à toute apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites seront également fixés avant le début des expérimentations. Les administrations seront réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Le matériel utilisé sera adapté à l’espèce (aiguille, canule de gavage, etc.). Si l’administration des substances entrainait l’apparition de diarrhées et/ou des difficultés à se nourrir alors des croquettes ou des gels pour la réhydratation seraient placés dans la cage de l’animal. Pendant, la semaine d’acclimatation, les animaux seront habitués au moins une fois à la pièce d’expérimentation où sera réalisée les tests de WDS. Si les secousses WDS se poursuivaient après les 2h d’observations et seraient assez intenses, alors l’isolement de l’animal serait prolongé jusqu’à un retour à un comportement normal. Les prélèvements de sang se feront sur tapis chauffant avec un rétrocontrôle afin de maintenir la température de l’animal à 37°C. Pour cela, une sonde rectale reliée au tapis chauffant sera placée dans l’animal pendant le prélèvement. Après chaque prélèvement de sang, un volume de sérum physiologique équivalent à 3 fois le volume prélevé sera injecté en sous cutanée afin de compenser la perte de volémie. Dans le cas où une incision est nécessaire, une injection d'un analgésique local au niveau du site de l'incision sera réalisée au moins 15 min avant. Une analgésie générale sera apportée avant la perfusion cardiaque.
Choix des espèces
L’activation des récepteurs sérotoninergiques est responsable des effets psychédéliques chez l’Homme et induit chez le rat une réponse comportementale caractéristique de WDS. Les hallucinogènes sérotoninergiques agissent via des mécanismes d’action similaires chez l’Homme et le rat. Ces résultats démontrent que le test de WDS chez le rat est un modèle préclinique intéressant pour l’étude pharmacologique des effets hallucinogènes. Des rats adultes de 5 à 8 semaines pourront être utilisés.
Optimisation de la dose injectée de nanoparticules pour de l’imagerie bimodale (EU porteur ; EU1/3)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
45 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis des injections de nanoparticules et des séances d'imagerie IRM et scanner sous anesthésie, pour optimiser la dose à injecter. Le porteur qualifie la douleur chirurgicale de modérée, avançant que le cerveau n'est pas innervé et que seule l'incision du cuir chevelu fait mal. Il justifie le recours à l'animal par la complexité du développement tumoral, impossible selon lui à reproduire in vitro.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie guidée par l'image grâce à l’utilisation de nanoparticules. Une nanoparticule radiosensibilisante (en cours de développement clinique) a été développée pour permettre une imagerie bimodale par résonance magnétique (IRM) et tomodensitométrie (TDM). L’objectif principal de ce projet consiste à optimiser la dose de nanoparticule à injecter chez le rat pour visualiser la tumeur en IRM et en TDM. Nous avons préalablement évalué in vitro (sur cellules tumorales humaines) l’intérêt s de ces nanoparticules pour les 2 modalités d’imagerie, la toxicité des nanoparticules ainsi que l’efficacité thérapeutique en association avec la radiothérapie et avons ainsi pu démontrer leur pouvoir « radiosensibilisant » et leur intérêt pour de l’imagerie bimodalité. Nous souhaitons confirmer ces résultats très prometteurs sur un modèle de tumeur cérébrales chez le rat et optimiser les conditions d’imagerie.
Bénéfices attendus
Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.
Procédures
Chirurgie 1h sous anesthésie gazeuse. 1 fois Imagerie par bioluminescence : injection intra-péritonéale sur animal vigil (quelques secondes) puis15 min d'imagerie sous anesthésie gazeuse. 1 fois Injection de nanoparticule par voie intraveineuse dans la veine de la queue ( quelques secondes) : 2 fois à 3 jours d'intervalle. Imagerie par tomodensitométrie sous anesthésie gazeuse : 30 min; 2 fois Imagerie IRM sous anesthésie gazeuse : 20 min; 2fois
Impact sur les animaux
Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire . Malgré une opération invasive due à l’incision de la peau du crâne et à l’injection de cellules intracérébrale, la douleur engendrée par l’acte chirurgical est estimée modérée, car dès le lendemain le rat se laisse manipuler aisément, ne montre aucun signe de peur (cris, prostration, agressivité) lors du nettoyage de la plaie. Le cerveau n’étant pas innervé, la douleur principale engendrée par l’opération provient de l’incision de la peau du crâne que nous estimons légère. Utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Imageries non invasives réalisées sous anesthésie volatile.
Devenir
Animaux mis a mort à la fin de la procédure ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau ainsi que les organes seront prélevés pour analyse macroscopique et histologique.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus la distribution des nanoparticules in vivo est indispensable pour évaluer leur intérêt en imagerie. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance tumorale ainsi que la prise de contraste par les nanoparticules. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif de la procédure conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux depuis le site d’hébergement et de chirurgie vers les sites d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par les limitations de résolution offertes par l’imagerie. Les rats nude (dépourvus d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des rats mâles, sexe utilisé jusqu’à présent dans nos études antérieurs afin de pouvoir confronter nos résultats. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas sur lequel nous nous basons pour injecter les cellules tumorales dans un endroit précis du cerveau.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'une canule dans le cerveau, sont logés seuls puis reçoivent deux injections quotidiennes d'une formulation dans le liquide céphalorachidien, animal éveillé, avant des tests comportementaux. Le porteur indique que les formulations toxiques peuvent provoquer convulsions, détresse respiratoire et vocalisations, déclenchant la mise à mort. Il présente ce modèle comme un moyen de limiter le recours ultérieur aux primates non humains.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de mettre en place un modèle chez le rongeur permettant d’évaluer l'absence de toxicité de différentes formulations de tampon d’un médicament innovant pour les pathologies neurologiques en caractérisant leurs effets sur le comportement général et neurologique. Ce modèle devra permettre la détection d’effets secondaires cliniquement observables liés aux formulations de tampon administrées deux fois par jour dans le cerveau. Le but de ce modèle étant d’éliminer toute toxicité et de valider la sécurité des formulations chez le rat avant de passer à l’étape suivante des tests précliniques sur primates non humains et d'ainsi en limiter leur nombre. Il devra donc être représentatif de ce qui se passe chez le primate non humain. Pour cela, nous réaliserons l’administration de ces formulations deux fois par jour sur une seule journée chez le rat éveillé afin de suivre durant et après le processus d’injection tout signe d’effets secondaires cliniquement observables. Des analyses comportementales permettront d’apprécier le comportement général et neurologique des animaux. Enfin le prélèvement du cerveau des animaux permettra de contrôler le site d’injection et la bonne administration des formulations testées.
Bénéfices attendus
L’évaluation de l’innocuité des différentes formulations de tampon administrées dans le cerveau chez le rongeur devrait permettre de détecter précocement tout signe de toxicité afin d’optimiser et de limiter pour les tests précliniques suivants le recours aux primates non humains. Seuls les tampons ne présentant aucun effet secondaire cliniquement observable chez le rongeur seront testés dans les phases précliniques suivantes. Ces formulations sont utilisées pour un médicament innovant qui à terme, pourrait faire l’objet de tests en phase clinique pour le traitement de maladies neurologiques chez l’Homme.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour la réalisation de l’implantation de la canule de micro-injection. Sous anesthésie générale, la canule de micro-injection sera implantée au niveau cérébral. La chirurgie sera réalisée en 30 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Un maintien des rats en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les canules. Le jour de l’administration des formulations, la micro-injection a lieu sur les rats éveillés maintenus dans la main de l’expérimentateur et dure environ 5 minutes avant que le rat ne retourne dans sa cage d'élevage. A la suite de l’injection, les rats effectueront un test d’exploration libre en Open-Field (dispositif carré en polyethylène noir, enceinte de 60x60x60cm) durant 15 minutes afin d’évaluer l’activité locomotrice spontanée générale puis les rats réaliseront une batterie de tests fonctionnels durant 15 minutes Cette série de tests consistent principalement à de l’observation de l’animal dans sa cage d’élevage, une prise en main de l’animal par l’expérimentateur et une mesure automatisée de force de préhension des membres antérieurs (grip-test). Pour cela, le rat sera tenu par la queue et présenté à une barre en forme de T (mesure de force globale avec 2 membres antérieurs) puis délicatement tiré jusqu’au lâcher prise.
Impact sur les animaux
L’utilisation d’une couverture analgésique lors de la procédure de chirurgie va permettre de limiter au maximum la souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des rats implantés, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux la canule, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et par l’utilisation d’enrichissement pour améliorer leur bien-être. En cas d’administration d’une formulation toxique, des effets secondaires sont attendus : tout comportement de type convulsion, détresse respiratoire, vocalisations, prostration entrainera la fin de la procédure et la mise à mort de l’animal dans des conditions éthiques.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale 1, les 280 rats seront mis à mort dans des conditions éthiques pour le prélèvement d'organes (cerveau).
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’observer des signes cliniques comportementaux et neurologiques de toxicité. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation du projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études exploratoires précédentes du même type. La seconde phase du projet n’aura lieu que si et seulement si la première phase du projet est validée et les effectifs pourront être revus à la baisse à la suite de la première phase du projet. Ce projet a également pour objectif principal de réduire le recours aux primates non humains.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la chirurgie (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après la réalisation de celle-ci. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection au niveau de la plaie (jonction avec le ciment dentaire) ou des modifications du comportement des animaux (avant l’injection) sont observés (arrêt de prise alimentaire ou de boisson, cachexie, vocalises, piloérection, convulsions, etc), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Au moment de l’injection ou après injection, tout comportement de type convulsion, détresse respiratoire, vocalisations, prostration, automutilation entrainera la fin de la procédure et la mise à mort de l’animal dans des conditions éthiques. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage comme dispositif d’enchissement pour assurer le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa facilité de manipulation pour l’implantation de canule, de l’injection en condition vigile et de la FOB largement décrite dans la littérature scientifique pour évaluer le comportement générale et neurologique des rats. Les animaux seront des rats âgés de 3 mois à leur arrivée au laboratoire, les expérimentations déburteront 1 semaine après leur arrivée. Cela correspond à de jeunes rats adultes pour être dans des conditions identiques à celles des tests sur les primates non humains.
Exploration fonctionnelle des mécanismes de l’action antidouleur de TAFA4 chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 384 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris subit un modèle de douleur, injection de carraghénane pour une inflammation, ou chirurgie pour une lésion neuropathique ou post-opératoire, avec administration de composés par gavage ou injection. Le porteur mentionne des pertes de poids liées aux modèles lésionnels et décrit des tests comportementaux répétés. Il conclut que l'étude de la douleur est indispensable in vivo, la douleur ne pouvant selon lui être dissociée de l'organisme entier.
Objectifs
Nous avons récemment découvert une molécule particulièrement adaptée au traitement de la douleur, notamment dans le cas des douleurs post-opératoires aigues et chroniques. Nous avons également découvert que l’action de cette molécule nécessite un récepteur exprimé à la surface de toutes nos cellules appelé LRP1. Le but de cette étude est de déterminer les mécanismes physiologiques d’action de la molécule anti-douleur que nous avons identifié. Pour cela nous allons utiliser des souris dans lequel nous éliminerons séquentiellement LRP1 dans un type cellulaire donné tout en le maintenant dans les autres types cellulaires. Ainsi nous déterminerons qu’elles sont les cellules impliquées directement dans le fonctionnement de notre molécule antidouleur.
Bénéfices attendus
Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique.
Procédures
Pour le modèle de douleur inflammatoire, une unique injection de Carraghénane sera réalisée sur chaque souris. La durée d’une injection ne dure que quelques secondes et nécessite une contention rapide de l’animale vigile. En ce qui concerne les modèles de douleur neuropathique ou post-opératoire (nécessitant une chirurgie), les souris seront sous anesthésie générale. La chirurgie ne nécessite qu’une seule anesthésie par souris, car il s’agit de chirurgies de courtes durées (pas plus de 15 minutes par souris). Chaque souris ne subira qu’un seul modèle de douleur, soit une chirurgie, soit une injection.
Impact sur les animaux
Les animaux seront amenés à subir l’administration de composés par gavage ou bien par injection intra-péritonéale et sous-cutanée. De plus, ils subiront des modèles lésionnels mimant une lésion inflammatoire, post-opératoire ou neuropathique qui pourraient entrainer une perte de poids.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par inhalation d’une concentration croissante de CO2 (ou perfusion intra-cardiaque pour la procédure 1). En effet, ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.
Remplacement
Une de nos thématiques de recherche est de comprendre comment et pourquoi une personne a mal. Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Il est donc nécessaire de réaliser une étude comportementale afin d’étudier l’intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie (peau) jusqu’au cerveau. Par ailleurs, les animaux génétiquement modifiés que nous utilisons représentent des alternatives prometteuses pour des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension des pathologies humaines. En particulier, les souris génétiquement modifiées fournissent des modèles nouveaux permettant de mettre en évidence de nouvelles molécules analgésiques ayant un spectre d’action plus spécifique afin, à terme, d’améliorer la qualité de vie des patients. Ainsi, l’expérimentation sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Des stratégies seront mises en place afin de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, nous utiliserons des outils statistiques nous permettant d’évaluer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées et maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Ce projet nécessitera au maximum 984 souris.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique sera effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.
Evaluation et développement de médicaments pour le traitement des pathologies hypertensives spécifiques de la gestation.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
120 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes d'un médicament entre le 12e et le 18e jour de gestation, avec des prises de sang sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser placentas et fœtus. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grave et signale qu'un tiers des animaux livrés peuvent ne pas être gestants. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de modèle in vitro reproduisant l'interaction entre la mère, le placenta et le fœtus.
Objectifs
Décrire l'effet d'une classe médicamenteuse sur les marqueurs sanguins de la maladie (molécules circulantes dans le sang maternel) en cours de gestation animale. Décrire d'éventuels effets toxiques de cette classe méicamenteuse sur l’évolution des fœtus en cours de gestation animale.
Bénéfices attendus
Le développement de thérapeutiques est une priorité de la recherche en médecine périnatale. Le bénéfice attendu de nos recherches est d'apporter la preuve de concept sur un model d'animal gestant qu’une classe médicamenteuse permet potentiellement de ralentir l’évolution de la maladie sans effets secondaires indésirables sur le developpement foetal. Cette preuve de concept permettra de decliner des propositions d'études médicamenteuses avec des molécules déja commercialisées utilisables chez l'espèce humaine.
Procédures
L’injection quotidienne des médicaments est un acte peu douloureux et peu stressant quand il est réalisé par un opérateur entrainé. Cette procédure est réalisée quotidiennement par un très grand nombre d’équipes de recherche. L’injection de médicament sera effectuée entre le 12e et le 18e jour de la gestation. Les prises de sang (réalisées 3 fois dans notre protocole de recherche, 12e, 15e et 18e jour de la gestation) seront systématiquement réalisées sous anesthésie générale pour limiter au maximum à la fois le stress et la douleur des animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet secondaire, ni indésirable grave n’est attendu des gestes réalisés en cours de gestation (injection de médicament, prise de sang) au cours de notre protocole. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée sur les animaux jusqu’au jour de l'euthanasie.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié en fin de procédure au 7ème jour du protocole expérimental c’est-à-dire au 18e jour de gestation. L'euthanasie se justifie par la nécessité d’une prise de sang maternel de plus gros volume et l’analyse systématique des placentas et des fœtus. Nos procédures d’analyses ne sont pas possibles après la parturition et la mise bas des portées.
Remplacement
Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de remplacer l’interaction entre la mère, le placenta et le fœtus au cours de la gestation. C’est pourquoi en recherche en reproduction le modèle d’animal gestant reste indispensable à ce jour. De plus cette étape experimentale est incontournable pour repérer les éventuels effets malformatifs ou délétères pour la gestation de classes médicamenteuses.
Réduction
Compte tenu de la variabilité du nombre de fœtus par portée et de la variabilité des dosages in vivo, le nombre nécessaire pour montrer une différence significative entre deux groupes est de 8 animaux par groupe. De plus, l’établissement éleveur qui nous procure les animaux gestants, ne peut nous assurer la gestation des animaux à la livraison. Les animaux non gestants peuvent représenter jusqu’à 1/3 de l’effectif total d’animaux prévus initialement. Nous profitons de cette procédure experimentale pour tester un appareil de monitorage du pH tissulaire in vivo le jour de l'euthanasie. Le fait d'effectuer ce test au cours de notre protocole sur souris gestante, ne biaise pas nos données experimentales, n'allonge pas la procédure de manière à perturber nos analyses et surtout permet de diminuer le nombre total d'animaux utilisés pour nos recherches.
Raffinement
Les critères objectifs de souffrance et/ou la détresse d’un animal seront quotidiennement évalués. L’expérimentation sera systématiquement interrompue pour chaque animal en cas d’atteinte des points limites préalablement définis par une grille de suivi. Nous prévoyons de tester systématiquement la dose la plus faible de médicament et d’arreêer en cas d’effet mesuré significatif.
Choix des espèces
Le modèle murin est choisi pour plusieurs raisons : - Son type de placenta est proche de celui de l’expèce humaine - Les molécules responsables de la maladie humaine sont également retrouvées dans le sang maternel au cours de la gestation chez la souris. Les dosages de ces molécules chez la souris sont commercialisés. - Le modèle de gestation chez la souris est systématiquement utilisé de par le monde pour étudier de potentiels effets deletères de classes médicamenteuses en cours de gestation.
Etude chez la souris des effets neurophysiologiques d’une maladie causée par une mutation d’un canal calcique (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
438 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 81 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modélisant une maladie cérébelleuse infantile, elles subissent des chirurgies stéréotaxiques et des implantations d'électrodes crâniennes pour enregistrer l'activité cérébrale, et présentent ataxie et crises d'épilepsie. Le porteur indique que la chirurgie d'électrodes peut induire une douleur modérée et évoque l'attente des patients et cliniciens. Il justifie le recours à la souris par l'impossibilité de reproduire in vitro ou in silico les réseaux de neurones du cervelet.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation gain de fonction d’un canal calcique décrite dans une maladie cérébelleuse infantile. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation causale pourra être induite. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.
Bénéfices attendus
Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle du canal calcique dans le développement du cerveau, du cervelet en particulier. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.
Procédures
Pour ce projet, 294 animaux seront évalués pour leurs capacités motrices et cognitives dans des tests standards. 70 animaux subiront une injection i.v. d'adénovirus codant pour la cre recombinase par chirurgie « stéréotaxique » pour induire l'expression du canal calcique mutant dans le cerveau et le cervelet. Les autres animaux évalués dans cette 'procédure comportementale' sont issus de croisements permettant une expression conditionnelle de la mutation du canal. Ces différents tests, potentiellement générateurs de stress, se dérouleront sur une période d'environ 1 mois. 81 animaux subiront une chirurgie pour l'implantation crânienne d'électrodes pour l'enregistrement d’électroencéphalogramme (EEG). Sur ces animaux, l'EEG sera enregistré sur une période d'environ 1 mois, à raison d'une séance de 6 heures par semaine. 63 animaux participeront à une étude longitudinale des paramètres anatomofonctionnels par échographie photoacoustique du cerveau et du cervelet. Les mesures seront réalisées lors de courtes séances (15 min) d'acquisition sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des défauts neurologiques précoces qui vont résulter en une atrophie cérébelleuse et des troubles fonctionnels cérébelleux de type ataxie, ainsi que des crises épileptiques de type généralisée (absence). Nos procédures expérimentales pourront conduire à des effets indésirables. (i) les études comportementales du suivi locomoteur de l'ataxie pourront résulter en un stress des animaux lié à la préhension manuelle et la découverte de l'environnement expérimental que nous atténuerons par une habituation de ces animaux aux dites procédures. (ii) le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution des éventuelles dysmorphies cérébrales et cérébelleuses est une approche non invasive et non douloureuse. Comme en (i), le stress subi par les animaux se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15 min/animal). (iii) Le suivi du phénotype épileptique par enregistrement électroencéphalographique (EEG) peut induire une douleur modérée puisqu'il implique une chirurgie pour la pose d'électrodes intracraniennes.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse physio/pathophysiologique de l'ataxie cérébelleuse. Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) ne pouvant être réalisées sur les modèles in vitro et in silico de la pathologie. Les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur l'activité du canal calcique seront étudiées dans des expériences d'électrophysiologie sur lignées cellulaires et des approches in silico seront développées pour modéliser les conséquences de cette mutation sur l'excitabilité neuronale. Ces stratégies in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact du canal muté à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau, puisque les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. Quant aux études phénotypiques, par exemple les conséquences motrices d'anomalies du cervelet, elles nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 438) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement relevant. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par la recombinase Cre (lignées de souris driver, injection de virus codant pour la recombinase Cre) est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation de jeunes adultes et d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.
Administrations de candidats médicaments et collectes de sang répétées chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 450
Pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique, 4 050 rongeurs, 3 600 souris et 450 rats, vont être utilisés afin de fournir des échantillons de sang où mesurer la concentration de candidats médicaments, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rongeurs reçoivent les composés par gavage, par injection, par voie nasale ou intratrachéale, une fois ou pendant plusieurs semaines, puis subissent jusqu'à huit prises de sang en 24 heures, parfois sous anesthésie répétée. Certains sont opérés pour l'implantation d'un cathéter ou d'une pompe sous la peau et peuvent être isolés dans leur cage, et les plus gros volumes de sang sont prélevés dans le cœur, avec ouverture du thorax chez la souris. Le prestataire indique fixer ses effectifs en tenant compte des "besoins de nos clients" et ne réaliser "pas de tests statistiques" sur les données.
Objectifs
Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration unique ou répétée.
Bénéfices attendus
Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations de composés soit par voie PO, IP, SC (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine de la queue (durée inférieure à 5 minutes) ; soit par voie IN, IT, topique (durée inférieure à 1 minute) ou IV à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 5 minutes). Dans la majorité des cas il s’agira d’une administration unique, mais elles pourront également être répétées sur plusieurs jours ou semaines. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via un cathéter vasculaire, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée: quleques minutes). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 72h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur 24h, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (2 prélèvements par semaine maximum). Certains animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires (durée de la chirurgie : environ 40 minutes) et/ou de pompes osmotiques en SC (durée de la chirurgie : environ 20 minutes) . Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intra-cardiaque de façon terminale (durée inférieure à 1 minutes) sous anesthésie chez le rat, sous anesthésie et analgésie morphinique chez la souris.
Impact sur les animaux
Pour les administrations de composés, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Un ou plusieurs gavages pourront être réalisés, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille. Certaines modalités d’administration nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux. Certains animaux subiront également une chirurgie d’implantation de pompe osmotique et/ou de cathéters qui pourra nécessiter de les isoler dans leur cage d’hébergement. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés toutes les 24h sur 24 à 72h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale : dans ce cas les animaux seront anesthésiés et une thoracotomie sera réalisée pour les souris.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter différents organes.
Remplacement
Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.
Réduction
Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Nous ne réalisons pas de tests statistiques sur les données obtenues. Le nombre d'animaux par groupe (N=3 par dose ou par temps de prélèvement) a été déterminé sur la base de nos études précédentes où il est apparu qu'un nombre de 3 animaux est le nombre minimum permettant de conclure sur le profil pharmacocinétique d'un composé en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie et les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de pompe osmotique ou de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.
Choix des espèces
Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g L’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester