Procédures modérées

36 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Séparés de leur mère à deux jours et logés en cage individuelle, ils reçoivent une préparation pour nourrisson pendant dix-neuf jours puis sont abattus à vingt et un jours pour prélèvement des tissus digestifs et cérébraux. Le porteur reconnaît que la séparation maternelle et l'isolement peuvent être une source de stress, qu'il dit limitée aux premières heures. Il justifie le choix du porcelet par sa proximité physiologique avec le nourrisson humain.

Objectifs

L’enjeu de ce projet est l’amélioration des propriétés fonctionnelles des préparations pour nourrisson, pour mimer au mieux les effets bénéfiques du lait maternel. L’allaitement maternel est recommandé par l’Organisation Mondiale de la Santé pour les nourrissons en alimentation exclusive jusqu’à 6 mois. Cependant, moins de la moitié d’entre eux sont actuellement allaités par leur mère. Ainsi, les préparations pour nourrisson sont aujourd’hui l’alternative lorsque l’allaitement n’est pas possible ou souhaité. Il est donc essentiel que leur qualité soit optimale afin d’assurer une croissance et un développement adéquat du nouveau-né. Il reste à ce jour des différences entre le lait maternel et les préparations pour nourrisson, notamment au niveau des composés bioactifs retrouvés dans le lait maternel et peu ou pas présents dans les préparations pour nourrisson. Le présent projet s’intéressera à l’un de ces composés qu’est le microbiote du lait maternel. Ce dernier participe à la mise en place de l’homéostasie intestinale du nourrisson et il pourrait contribuer aux bénéfices santé associés au lait maternel. Cependant, la plupart des préparations pour nourrisson ne contiennent pas de composantes microbiennes et, quand elles en contiennent, celle-ci se limite généralement à l’ajout d’une ou deux souches probiotiques dans des concentrations non physiologiques (forte dose). Ce projet a donc pour objectif d'évaluer l'impact santé du microbiote du lait maternel pour le nourrisson. Une collection de bactéries issues du microbiote naturel du lait de femmes ne présentant pas de problèmes de santé, a été constituée. Sur la base de leurs propriétés immunomodulatrices, des consortia bactériens d’intérêt ont été retenus. L’impact de ces PPN avec une composante bactérienne variable sera étudié sur le développement physiologique de l’intestin et de son microbiote, en utilisant le porcelet mini-porc Yucatan comme modèle du nourrisson humain.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’améliorer la fonctionnalité des préparations pour nourrisson en s’intéressant à la composante bactérienne du lait de femme pour mimer au mieux les effets bénéfiques de ce dernier sur la santé du nourrisson. Son objectif est d’évaluer l’impact de deux consortiums bactériens incorporées à une dose proche de leur concentration dans le lait de femme. Les propriétés immunomodulatrices de ces deux consortiums bactériens ont été testées au préalable par différentes approches in vitro sur des modèles cellulaires. Le présent projet d’expérimentation sur porcelets fait donc suite à une sélection drastique des souches d’intérêts qui a abouti à la constitution de deux consortiums d’intérêt. L’expérimentation sur porcelets pemettra d’évaluer le réel impact de ces consortiums bactériens d’intérêt chez un individu nouveau-né présentant des caractéristiques physiologiques proches du nouvean-né humain, dans un système plus complexe que les modèles cellulaires in vitro. Ce projet participera à la conception de probiotiques de nouvelle génération, plutôt utilisés en cocktails avec des espèces et des genres variés pour avoir un spectre d'activité plus étendu, et à dose physiologique proche de celle apportée par le lait humain.

Procédures

Aucun prélèvement biologique, ni intervention chirugicale ne seront réalisés sur les animaux vivants durant la période d’expérimentation. Les paramètres mesurés concerneront la consommation alimetaire et la croissance des porcelets. Tous les animaux concernés par la procédure (n = 36) seront euthanasiés à la fin de l’expérience pour réaliser des prélèvements post-mortem de tissus et contenus digestifs et de zones cérébrales ciblées.

Impact sur les animaux

Les bactéries ont été isolées du lait de femmes ne présentant aucune pathologie (conditions d’inclusion des femmes définies dans le protocole de collecte de laits). Les bactéries sélectionnées ont été testées in vitro pour leurs propriétés immunomodulatrices bénéfiques ; à priori elles sont sans danger pour la santé du porcelet. Un effet indésirable sur l’appétit des animaux qui entrainerait une perte de poids, ne peut pas être totalement exclu. A noter que la préparation pour nourrissons (PPN) qui sera distribuée aux animaux dans ce projet est très proche d’une formule porcinisée utilisée dans un précédent projet et qui n’a engendrée aucun problème d’alimentation, ni de troubles digestifs chez le porcelet Yucatan. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. Ils seront placés dans des cages individuelles équipées de distributeurs automatiques de lait réparties dans deux salles. Ils seront alimentés avec une des 3 PPN porcinisées pendant 19 jours avant leur abattage à 21 jours d’âge et le prélèvement post-mortem d’échantillons. La séparation brutale de la mère et l’isolement relatif en cage individuelle pendant une période de 19 jours pourraient constituer une source de stress pour les porcelets. Cependant, les porcelets ne subissent pas de stress répétés (une séparation unique et définitive de la mère), ils sont hébergés dans une salle contenant 7 cages permettant des contacts olfactif, visuel et sonore avec leurs congénères, leur environnement est enrichi avec des jouets source d’interaction avec le milieu environnant et leur alimentation répond à leur besoin nutritionnel. L’ensemble de ces éléments, associé à des interactions régulières avec les animaliers se traduit par un comportement des porcelets qui ne traduit aucun état de stress au-delà des 12 premières heures post-séparation maternelle durant lesquelles les animaliers sont en permanence présents dans les salles.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par la procédure décrite (n = 36); ils seront tous euthanasiés à la fin de l’expérience.

Remplacement

Le projet s’intéressant à l’impact de l’alimentation sur les fonctions physiologiques du nourrisson, l’utilisation d’un modèle animal vivant reste indispensable pour une évaluation globale de l’effet des consortiums bactériens. Le porcelet a été choisi pour sa proximité physiologique avec le nourrisson.

Réduction

L’étape in vitro a permis de réduire le nombre de bactéries d’inétrèt et de définir deux consortiums, représentatifs du microbiote du lait de femme en termes de composition et ne présentant pas d’effets négatifs dans les tests utilisés (pas de cytotoxicité, pas de perte d’intégrité de l’épithélium, pas d’activité pro-inflammatoire aigüe). Ils seront additionnés à une PPN reconstituée et distribuée sous forme d’alimentation liquide aux porcelets. L’impact des deux consortiums bactériens sera comparé à celui d’une soultion probiotique disponible commercialement. L’effectif (nombre total = 36) a été fixé à minima afin de permettre une évaluation statistiquement significative des effets attendus (réponses physiologiques).

Raffinement

L’alimentation sera adaptée aux besoins nutritionnels des porcelets (formule « porcinisée »). Les compétences et l’expérience des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Des points limites ont été établis, entraînant la sortie de protocole ou l’euthanasie anticipée de l’animal en cas de nécessité.

Choix des espèces

Le mini-porc Yucatan est un modèle animal beaucoup plus proche de l’Homme que les rongeurs, de par sa taille, l’anatomie de son tube digestif, sa physiologie digestive, son système immunitaire et son microbiote.. S’intéressant à l’alimentation infantile, il est à noter que la dynamique de croissance et de développement des organes digestifs chez le porc nouveau-né est très proche de celle décrite chez le nouveau-né humain. De plus, il s’agit d’un animal omnivore monogastrique, ce qui en fait un modèle très utilisé pour des recherches en nutrition humaine. Enfin, sa taille et sa maturité à la naissance sont compatibles avec un allaitement avec des PPN dès les premiers jours de vie. Les porcelets seront inclus dans le protocole à 2 jours d’âge. Ils seront placés dans des cages individuelles équipées de distributeurs automatiques de lait et répartis dans deux salles (7 cages/salle). Ils seront alimentés avec une des 3 PPN porcinisées jusqu’à leur abattage à 21 jours d’âge et le prélèvement post-mortem d’échantillons tissulaires et de contenus digestifs. Trois traitements alimentaires, à avoir une PPN différant uniquement par la composante bactérienne additionnée, seront testés dans le cadre de ce projet : une PPN avec un consortium bactérien A, une PPN avec un consortium bactérien B, et une PPN avec une solution probiotique (ce traitement sera considérée comme le traitement témoin).

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie d'électroporation in utero de 30 minutes, puis la moitié des portées est placée huit jours dans un air appauvri en oxygène pour modéliser la grande prématurité. Le porteur signale une mortalité fœtale pouvant atteindre 10 % et des déficits cognitifs possibles chez les souriceaux. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reconstituer in vitro les connexions nerveuses entre régions du cerveau.

Objectifs

Contexte de l’étude : La grande prématurité résulte fréquemment en des périodes de manque d'oxygène (appelées périodes d'hypoxie) du fait notamment de l’immaturité des poumons, et aboutit donc à des perturbations profondes de la capacité du cerveau à utiliser et produire de l'énergie (on parle de capacité métabolique), et à des lésions diffuses du cerveau. Bien que le cerveau du nouveau-né présente une capacité à se réparer supérieure à celle du cerveau adulte, des études récentes suggèrent que cette réparation pourrait être imparfaite ou même inadaptée. Ainsi, la probabilité d’apparition de troubles cognitifs est très fortement augmentée à l'adolescence, chez les enfants grands prématurés par rapport à ceux nés à terme, possiblement du fait de la mise en place de réseaux neuronaux anormaux. Objectif du projet : Cette étude a pour but de tester comment les perturbations survenant autour de la naissance et notamment de périodes de manque d'oxygène à la naissance, entraînent une perturbation durable de l’activité métabolique cérébrale, et notamment de l’activité des mitochondries, qui sont les organelles responsables de l’essentiel de la production d’énergie cellulaire. Ces perturbations métaboliques entraîneraient à long terme des anomalies du développement des réseaux neuronaux qui peuvent expliquer la survenue plus tard dans la vie de troubles neurologiques variés. Ce projet utilisera un modèle murin de naissance très prématurée (manque d'oxygène chronique à la naissance), combiné à une méthode chirurgicale permettant d’exprimer des protéines fluorescentes dans des populations ciblées de neurones du cortex cérébral chez la souris. Il permettra de répondre en même temps à deux questions : - Quelles sont les conséquences d'un manque d'oxygène chronique à la naissance sur le développement à long terme du cerveau - Est-ce que ces défauts sont associés à un défaut métabolique persistant dans ces neurones.

Bénéfices attendus

Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) : - Sur un plan translationnel, ce projet permettra de mieux prédire les conséquences à long terme de lésions cérébrales survenant tôt dans la vie (pendant la période périnatale). Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale n’est pas totalement efficace, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. - Sur un plan fondamental, ce projet pourra fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie. La mise à mort sera réalisée par une éthode dérogatoire seule à même de préserver les tissus cérébraux.

Impact sur les animaux

Pour les femelles : La procédure permettant l'expression de marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries, implique une approche chirurgicale invasive avec réveil. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté de mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. Pour les souriceaux : Une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons sur lesquels la procédure est effectuée est constatée, bien qu’il soit difficile de déterminer si la résorption fétale résulte de l’élimination spontanée de fétus surnuméraires pendant la gestation, ou d’une mortalité liée à la procédure chirurgicale. La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau. Une réduction périnatale de l'oxygène ambiant (hypoxie) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses. Après la période de réduction de l'oxygène ambiant, les souriceaux rattrapent leur retard de croissance et les lésions cérébrales apparaissent réparées au niveau macroscopique. Des altérations à long terme de la connectivité cérébrale résultant de l’hypoxie périnatale peuvent en théorie entraîner des déficits cognitifs (défauts d’apprentissage, d’activité spontanée et de comportements sociaux) qui peuvent être détectés lors de tests de comportement mais sont généralement impossibles à détecter dans l’observation de comportements spontanés de souris élevées en cage.

Devenir

Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.

Remplacement

Les hypothèses de travail ont été au préalable validées dans des modèles in vitro et justifient à présent de confirmer par une approche in vivo, incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les séquelles neurologiques observées suite à une oxygénation insufisante, dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer totalement la complexité des connections nerveuses entre régions du cerveau, qui est l’objet de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Certains animaux devront être exclus de l’analyse à postériori pour des raisons techniques (mauvaise qualité du marquage des neurones et des mitochondries qu'ils contiennent ou de préparation histologique). Les animaux seront traités deux à deux (deux femelles, soit deux portées, en parallèle : groupe expérimental et groupe témoin) et les portées seront analysés au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus l’étude est prévue sur 4 âges correspondant à 4 stades de développement distincts, mais nous commencerons par les âges J11 et J45 qui correspondent aux effets les plus forts attendus dans notre étude. Dans le cas où les résultats à ces âges invalideraient notre hypothèse (étude négative), nous arrêterions l’étude sans procéder à l’étude des autres âges. L’analyse des projections nerveuses sera réalisée sur des cohortes d’animaux des deux sexes, par un test statistique de type ANOVA à plusieurs facteurs. Cette analyse permettra de déterminer la part de la condition expérimentale (normoxie/hypoxie), du sexe, de l’environnement, et leur interaction, sur le phénotype observé. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages immunohistochimiques variés, permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées a été mis en place pour optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Une méthode d’imagerie et d’analyse innovante sera utilisée pour tirer encore plus d’information par animal, en permettant d’observer les projections axonales dans l’ensemble des régions du cortex.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, les méthodes ont été établies dans cette espèce ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés aux âges suivants afin d'étudier les effets d'une réduction de l'oxygène ambiant à des étapes clés de la mise en place des réseaux de neurones du cerveau: - J(our après la naissance) 11, correspondant à la fin de la période de réduction de l'oxygène ambiant. - J21, correspondant à l’âge ou les connections nerveuses sont établies, mais où elles sont encore immatures - J45, correspondant à un âge où les connections nerveuses maturent. Cet âge est également pertinent car il correspond à la maturité sexuelle chez les souris (adolescence/jeune adulte), qui est un âge auquel plusieurs maladies neuropsychiatriques sont détectées (par exemple schizophrénie) - J90-J120, correspondant à un stade adulte et qui est également le stade où nous observons des déficits comportementaux.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne, ils reçoivent des injections répétées derrière l'œil ou dans le muscle de la patte pour déclencher une régénération musculaire et tester la forskoline. Le porteur décrit une perte de masse progressive et un comportement anxieux liés à la maladie, avec des injections d'opioïdes pour contenir la douleur. Il justifie le recours au rat par sa proximité phylogénétique et la fidélité de ce modèle à la maladie humaine, en complément du modèle canin.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire. Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la maladie pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle de rat qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Contrairement à l'ensemble des muscles du corps incluant le diaphragme et le cœur, les muscles extra-oculaires assurant les mouvements des yeux dans toutes les directions sont épargnés. Nous avons en partie identifié la raison sous-jacente à ce mécanisme et proposons ici de traiter des rats malades avec un composé mimant l'activation du mécanisme protecteur identifié dont nous espérons qu'il améliorera le fonctionnement de l'ensemble des muscles du rat. Le présent projet vise également à comparer le comportement des cellules souches des muscules extra-oculaires et d'un muscle de la jambe du rat au cours du processus normal de la réparation musculaire. Nous projetons ainsi d'identifier d'autres facteurs de maintien de la capacité régénérative des cellules souches musculaires, ce qui permettra d'ouvrir de nouvelles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

En comparant toutes ces situations à l'échelle moléculaire, nous comptons identifier les mécanismes protecteurs de la mort précoce des cellules souche pour promouvoir leur capacité de réparation du muscle. En comparant ces situations à l'échelle microscopique, nous comptons évaluer l'efficacité de ces processus dans la reconstruction musculaire. Au-delà, nous comptons identifier de nouvelles molécules déjà connues ou à découvrir pour moduler les mécanismes capables d'empêcher ou de retarder la mort précoce des cellules souches musculaires et ainsi, de promouvoir la réparation musculaire des patients atteints de DMD.

Procédures

Les animaux sont injectés deux fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie et une fois en arrière de l'oeil ou dans le muscle tibial antérieur pour induire la régénération des muscles que nous souhaitons analyser en détail au cours du temps. Les rats sont préventivement injectés 3 fois par jours pendant 2-3 jours avec une molécule qui supprime la douleur, par voie sous-cutanée, en même temps que l'examen clinique pour éviter de les déranger inutilement. Certains animaux seront en plus injectés tous les deux jours dans le ventre pendant 30 jours avec une molécule que nous pensons protectrice vis-à-vis de la maladie. Cela correspond à une quinzaine d'injections. Chaque injection dure moins de 2 minutes, réalisée par une personne très expérimentée et soucieuse de réduire l'impact négatif pour l'animal. L'injection sera réalisée plutôt au début ou en fin de journée pour éviter de réveiller l'animal. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Physiologiquement, la mort des fibres musculaires induit une amplification de la douleur, via un processus d'origine inflammatoire que nous pouvons éviter. Nous connnaissons bien les conséquences de ce mécanisme temporaire et contrôlable. Nous avons anticipé toute forme de ressenti de la douleur par des injections d'une molécule opioïde à longue action très efficace. Les rats sur lesquels nous travaillons développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de la masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement anxieux des animaux, par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une personne est dédiée à cette surveillance. Les procédures de ce projet incluent des animaux chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont limitées et sont facilement gérables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de récupérer les muscles étudiés pour analyse histologique et moléculaire approfondie.

Remplacement

L'efficacité de la forskoline sur le potentiel de régénération des cellules souches musculaires a déjà été confirmée in vitro (article en cours d'évaluation). Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à une question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : la forskoline conserve-t-elle sa capacité de stimulation efficace des cellules souches musculaires pour favoriser le processus de régénération musculaire dans les conditions du muscle dystrophique remodelé ?

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 5 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux non atteints et DMD traités avec l'excipient, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères non atteints. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux et en cas de mort de l'un d'eux, de ne pas le remplacer. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 5 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils de modification du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, système immunitaire, influence de facteurs d'environnement communs, format). Les muscles des animaux âgés de 5-6 mois sont affectés par la maladie et leurs cellules souches, engagées dans le processus de mort précoce. Il est donc attendu qu'à ce stade, les différences entre animaux non atteints et DMD seront marquées et instructives, et que l'évaluation de l'efficacité de la forskoline sera pertinente. Nous utiliserons des animaux à l'âge de 5-6 mois. Notre étude de caractérisation ainsi que nos résultats in vitro montrent que la mort prématurée des cellules souches et par voie de conséquence l'anomalie du processus de réparation musculaire, sont significativement augmentées et quantifiables à cet âge. Six mois correspond par ailleurs à la limite au-delà de laquelle le phénotype dommageable des rats DMD évolue vers une perte de masse corporelle. Dans ce projet qui n'est pas une analyse de survie, il est inutile de maintenir en vie des animaux au-delà du stade auquel leurs activités quotidiennes sont compromises par une perte de poids. Le bon état général des animaux à l'âge visé et les mesures pour prévenir ou contrer la douleur pendant et après l'altération des muscles justifient notre suggestion de classer cette procédure en procédure modérée.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Francisella novicida par voie intradermale, certaines après une injection dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine IRF2 dans la réponse immunitaire. Le porteur décrit des points limites, léthargie, prostration, détresse respiratoire, déclenchant la mise à mort, et affirme que la phase précoce de l'infection reste peu agressive. Il qualifie ces expériences d'"absolument indispensables" et justifie le recours à la souris par l'accès aux animaux génétiquement modifiés.

Objectifs

La tularémie est une maladie causée par la bactérie Francisella novicida. Elle touche les mammifères, particulièrement les lièvres et les rongeurs. Ceci permettra d’utiliser la souris comme modèle d’étude, afin d’avoir accès aux KO. La tularémie est une zoonose et peut être transmise à l’homme et causer des problèmes cutanés, digestifs ou respiratoires. C’est une maladie à déclaration obligatoire. Environ 50 cas de tularémie sont déclarés chaque année en France. La tularémie représente également une arme bactériologique. L’objectif de l’équipe est de mieux caractériser les réponses immunes induites lors d’une infection par Francisella, et notamment le rôle des Interferon Regulatory Factors (IRFs), facteurs de transcription impliqués dans la régulation de l’expression ainsi que la réponse aux interférons de type 1, cytokines essentielles pour la régulation de l’inflammasome mais dont le rôle n'est pas bien connu lors des infections bactériennes. Grâce à des travaux préliminaires dans l’équipe, un rôle d’IRF2 dans la régulation de l’inflammasome in vitro a été identifié. L'objectif serait donc de tester si IRF2 joue également un rôle in vivo dans la régulation de l’inflammasome. Pour ce faire, un modèle d’infection murin intradermal par la bactérie Francisella novicida sera utilisé. De plus, étant donné le rôle majeur des cellules Natural Killer (NKs) durant la réponse anti-bactérienne innée contre Francisella, les rôles des NKs et leur état d’activation lors de l’infection par Francisella novicida dans des souris WT ou déficientes pour IRF2 seront étudiés. Le ciblage d'IRF2 pourrait fournir de nouvelles modalités thérapeutiques pour le traitement de pathologies médiées par l'inflammasome. Les résultats attendus in vivo sont une susceptibilité à Francisella novicida conduisant à une mort prématurée des animaux IRF2 -/- infectés comparés aux WT. Le nombre d’UFC dans les organes des souris WT et IRF2 -/- sera quantifié. Les concentrations des cytokines IL-1b, IL-18 et IFN-g seront également dosées dans le sérum de ces animaux. Les résultats obtenus lors d’une infection par Francisella pourraient être extrapolés pour d’autres pathogènes intracellulaires. Des études préliminaires au laboratoire ont montré que l'expression de la Gasdermine D est régulée par IRF2. Des souris déficientes pour la Gasdermine D, protéine cytosolique qui médie la pyroptose, mort cellulaire programmée activée par l'activation de l'inflammasome, seront donc également utilisées.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux caractériser comment le facteur de transcription IRF2 affecte la réponse immunitaire de l’hôte. Une meilleure compréhension de ce système devrait aider au développement de nouveaux médicaments impliqués dans la réponse immunitaire chez l’hôte, notamment en ciblant la voie des IFN de type 1.

Procédures

Les animaux subiront une injection IV à J0 dans le sinus rétro-orbital une fois (2 minutes par injection), puis 3h après, à J0, ces mêmes animaux subiront une injection intradermale de Francisella novicida (2 minutes par injection) (Procédure #2). Les animaux seront sacrifiés 48h pi 51 minute par injection) avant la collecte des organes et du sang. Pour les Procédures #1 et 3, les animaux subiront une injection intradermale de Francisella novicida à J0 (2 minutes par injection) et seront mis à mort 48h post infection (1 minute par injection) avant la collecte du sang et des organes pour la procédure #1, et au plus tard une semaine après à J7 pour la procédure #3 (développement des symptômes).

Impact sur les animaux

Le transfert de NKs ne devrait créer aucun stress. Cependant, les injections en rétro-orbitale seront réalisées sous brève anesthésie à l'isoflurane après application d'un collyre anesthésique sur l'oeil. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroide et un antibiotique à large spectre (framycétine). Concernant l’infection, les animaux seront surveillés tous les jours avec des points limites parfaitement définis. La souche bactérienne utilisée est très bien caractérisée et les souris ne resteront pas plus de 48h en sa présence (Procédures #1 et 2), ce qui correspond à la phase précoce de l’infection, connue pour être moins agressive. Les animaux ne perdent pas de poids dans les 48 premières heures de l'infection. Pour la procédure #3, expérience de développemnt des symptômes, le nombre de CFU utilisé est moindre (1000 CFU) par rapport aux procédures #1 et 2 (5000 CFU) et les animaux seront surveillés une fois par jour dès 24h puis deux fois par jour à partir de 72h d’infection pour détecter toute forme de souffrance. Les animaux seront mis à mort en cas d'atteinte des points limites suivants: pas de mouvement de fuite lors de la saisie, prostration, dos vouté, poils ébourrifés, détresse respiratoire.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux

Remplacement

Les questions posées ici nécessitent un système complexe, et ne peuvent pas être investiguées dans des modèles in vitro ou dans des modèles in vivo utilisant des animaux invertébrés. Toutes les expérimentations préliminaires ont été réalisées in vitro, afin de valider notre hypothèse.

Réduction

De nombreux paramètres de l’hôte et de la bactérie seront étudiés sur chaque animal pour réduire au maximum le nombre de répétitions expérimentales. Une étude bibliographique a été réalisée pour utiliser les doses les plus adéquates de pathogènes au cours des expériences. Les expériences réalisées ici sont considérées comme absolument indispensables pour connaitre le rôle d'IRF2 et des NKs, in vivo. L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique, et a été réduit au maximum sans mettre en péril l'interprétation statistique de nos résultats. Ainsi, un minimum de 7 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Pour les conditions naives, 3 animaux par groupe seront utilisés. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra être diminué en fonction des résultats obtenus, notamment si le projet in vivo n’est pas concluant. Ainsi, si la procédure #1 ne montre aucun phénotype notable, les procédures #2 et #3 ne seront pas réalisées.

Raffinement

Avant les procédures, les animaux seront entrainés à être contentionnés pour éviter tout stress pendant la procédure. Lors des procédures, les points limites sont suffisamment prédictifs pour éviter l’utilisation des antalgiques et il sera toujours possible d'arrêter la procédure de manière anticipée pour qu’à aucun moment, un animal ne souffre. En effet, en cas de souffrance, l’animal sera mis à mort. Une surveillance journalière (à partir de 24h d’infection) sera réalisée pour détecter toute forme de souffrance pour les procédures #1, #2 et #3, et bijournalière à partir de 72h pour la procédure #3. Plus concrètement pour l'infection: les souris seront suivies une fois par jour pour les procédures #1 et #2 pour détecter l’apparition du moindre point limite défini plus bas. Les souris seront mises à mort par injection d’exagon en cas d’atteinte de l’un des points limites suivants : animal léthargique : pas de mouvement de fuite lors de la saisie, prostration, dos vouté, poils ébouriffés, détresse respiratoire. Pour l'injection de NKs, dans le cas où l'oeil montrerait des signes d'inflammation après l'injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticosteroide et un antibiotique (framycétine).

Choix des espèces

La pertinence physiologique d’IRF2 et de Gasdermine D dans la réponse immune à Francisella ne peut être investiguée dans des modèles in vitro ou dans des modèles utilisant des animaux invertébrés du fait de la nécessité i) de travailler dans un système intégré, et ii) d'utiliser les souris pour avoir accès aux souris KO. Par ailleurs, les invertébrés ne présentent pas d’inflammasome. De plus, la souris est un très bon modèle d’étude de la réponse immune contre des bactéries intracellulaires. Nous utiliserons des souris transgéniques IRF2 KO ainsi que des souris non transgéniques IRF2 WT issues de mêmes portées. Il ne s'agit pas d'un phénotype dommageable. Des études préliminaires au laboratoire ont montré que l'expression de la Gasdermine D est régulée par IRF2. Nous réaliserons donc les procédures #1 et #3 également sur des souris déficientes pour Gasdermine D. La Gasdermine D est une protéine cytosolique qui médie la pyroptose, mort cellulaire programmée activée par l'activation de l'inflammasome. Souris de 6 à 8 semaines. Système immunitaire mature à l’âge adulte.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de formaline et d'adjuvant de Freund dans la patte pour provoquer une inflammation douloureuse, puis subissent des tests de douleur, immersion de la queue dans l'eau à 50 °C et stimulation des coussinets au filament de Von Frey. Le porteur indique que ces tests ne provoquent pas de lésion et justifie le recours à l'animal par la nécessité d'un "organisme entier" pour étudier le circuit de la douleur. Les bénéfices annoncés, un antidouleur sans effets secondaires, restent formulés comme un objectif de développement.

Objectifs

L’objectif du projet est de valider l’efficacité, l’innocuité et les avantages thérapeutiques de nouvelles petites molécules qui ciblent un récepteur de la sérotonine, le récepteur 5-HT7. La sérotonine, également appelé 5-hydroxytryptamine, est un neuromodulateur impliqué dans de nombreux processus cognitifs tel que l’apprentissage et la mémoire, mais également dans la régulation de comportements comme l’humeur, l’anxiété, l’appétit et la thermorégulation. Le récepteur 5-HT7 de la sérotonine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) exprimé par plusieurs organes et particulièrement dans le système nerveux central et le système nerveux périphérique (ganglions de la racine dorsal, moelle épinière, cerveau). Par sa localisation, il est impliqué dans de nombreuses pathologies neurodégénératives et neuro-inflammatoires, ainsi que dans le circuit de la douleur. Les ligands actuels ciblant le récepteur 5-HT7 possèdent des limitations en termes de sélectivité et de biodisponibilité. C’est pourquoi, nous avons initié un programme de synthèse de nouvelles molécules. Des études pharmacologiques in vitro montrent que ces molécules sont plus sélectives et très affines pour le récepteur 5-HT7. L’objectif est maintenant d’évaluer leur efficacité pour le traitement de la douleur dans des modèles précliniques. Il existe des traitements de la douleur, basés sur l’utilisation d’antidépresseurs, antiépileptiques, ou bien sur l’utilisation de molécules plus fortes, tels que les opioïdes et les dérivés morphiniques. Cependant, seul 50% des patients répondent à ces traitements et la plupart du temps, les traitements qui soulagent les douleurs induisent des effets secondaires indésirables. Ainsi, notre objectif est de poursuivre le développement de nos molécules qui ciblent spécifiquement le récepteur 5-HT7 de la sérotonine, afin de développer un candidat médicament pouvant être utiliser dans le traitement de la douleur sans induire d’effet secondaires indésirables. Ce projet nécessite l'utilisation de l'animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeu dans la réponse de douleur. Les protocoles cellulaires, utilisés au préalable, ne sont pas assez complexes et représentatifs des interactions entre cellules cérébrales et périphériques ainsi que des chemins neuronaux impliqués dans le circuit de la douleur.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal attendu du projet est le développement de molécules thérapeutiques, visant le récepteur 5-HT7 de la sérotonine, décrit dans l’item 5.5.1, pour le traitement de la douleur sans induction d’effets secondaires indésirables. Le développement pharmacologique de nos candidats médicaments pourrait non seulement avoir un impact sur la santé et le bien-être des patients mais également avoir un impact économique considérable puisque les douleurs sont la cause de la plupart des arrêts maladies.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une administration unique des ligands et composés par injection sous-cutanée dans la nuque des animaux - Une administration unique de Formalin (formaldéhyde) en sous cutanée sur le dessus de la patte arrière - Une administration unique d’adjuvant de Freund (CFA, émulsion d’huile minérale et de mycobactérie inactivées par chauffage) au niveau des coussinets plantaires - Prélèvement de sang par ponction intracardiaque Les tests comportementaux de classe modérée réalisés sur les animaux seront les suivants : -Test « tail immersion » : pour évaluer la sensibilité de l’animal à la température par une réponse spinale, le test d’immersion de la queue sera réalisé. La partie inférieure de la queue de la souris sera immergée dans un bain-marie dans lequel la température de l’eau est stable et maintenue à 50°C. L’expérimentateur relèvera le temps nécessaire à la souris pour relever la queue. A la fin de l’expérience, d’une durée maximale de 20 secondes pour éviter tout risque de brûlure, la queue sera soigneusement séchée. A la suite du test d'immersion de la queue, chaque animal est observé individuellement selon la grille d'évaluation critère n°3 (3.4.13). Nous avons constaté que le temps de 20 secondes à 50°C ne génère pas de lésion. Compte tenu de la classe modérée de cette procédure, les animaux seront observés selon la grille d'évaluation (3.4.13) pour une durée de 3 jours suivant le test. -Test de Von Frey : Avant la procédure, les animaux sont habitués aux boîtes tests posées sur une grille métallique permettant de visualiser facilement le dessous des pattes. La méchanoréception basale est évaluée. Des tiges plastiques calibrées (eg. Von Frey Hair) de diamètres croissants, sont appliquées sur les coussinets du rongeur en exerçant des pressions croissantes (0.007g à 2g). La pression exercée avec ces tiges ne peut en aucun cas provoquer une lésion de la zone testée. Le temps de réaction du retrait de la patte est observé, reflétant ainsi la sensibilité tactile du rongeur. Cette procédure sera reproduite 24 heures après l’induction d’une inflammation locale des coussinets suite à une injection plantaire sous-cutanée avec l’adjuvant complet de Freund (10µl). Lors de cette procédure, le test de « Von Frey Hair » sera réalisé 3 fois sur une durée de 4 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en œuvres seront de classes modérées. Notre stratégie est thérapeutique et a pour but de tester les propriétés anti-nociceptive de ligands du récepteur 5-HT7. Ainsi, aucun effet indésirable n’est prévu sur les animaux lors de l’administration des composés. Si des signes de souffrances apparaissent au-delà des tests (>2h), un score sera établi afin de définir la marche à suivre. L’administration de Formalin, induit une inflammation au niveau du site d’injection. L’adjuvant complet de Freund (CFA, émulsion d’huile minérale et de mycobactéries inactivées par chauffage) est un mélange classiquement utilisé en immunologie afin de déclencher une réponse inflammatoire non spécifique et durable (>5 jours). Son injection au niveau des coussinets plantaires induit localement un œdème et une sensibilité tactile accrue dans la zone affectée. Cette hypersensibilité est mesurée grâce au système « Von Frey Hair » permettant de vérifier la sensibilité tactile de type méchanoréception. Les prélèvements de sang par ponction intracardiaque sont réalisés sous anesthésie gazeuse d’isoflurane et entraînent le décès de l’animal. Les prélèvements d’organes sont ensuite réalisés.

Devenir

Afin de pouvoir récolter des échantillons (sang et organes) pour analyser l'effet des différents ligands , les animaux seront mis à mort par inhalation de CO2 à l'issue de chaque procédures.

Remplacement

L’objectif du projet, évaluer l’effet analgésique de différents ligands du récepteur 5-HT7, nécessite l'utilisation de l'animal afin de considérer un organisme entier et de confronter nos ligands à la complexité des mécanimses neurologiques mis en jeu dans la réponse de douleur. Les protocoles cellulaires, utilisés au préalable, ne sont pas assez complexes et représentatifs des interactions entre cellules cérébrales, entre cellules cérébrales et périphériques ainsi que des chemins neuronaux impliqués dans les mécanismes de douleur et d'anti-douleur.

Réduction

Les approches comportementales nécessitent une cohortes de 10 animaux minimun par groupe. Cette étude se focalisera sur 5 ligands à tester. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d'assurer la validité statistique des résultats. cependant, si une molécule s'avère inefficace ou toxique elle sera abandonnée.

Raffinement

Les animaux seront suivis tout au long des procédures. En effet, l'aspect général extérieur de l'animal (posture, pelage, démarche, faciès, yeux) sera observ et associé au suivit des critères évalués par la grille de score adaptée aux procédures. Si des animaux présentent des signes de souffrance (point limite: score=2 pour un critère de la grille, ils seront mis à mort en accord avec le responsable du bien être animal de ce projet. Dans le cas où 2 animaux minimum sont mis à mort et font parti du même groupe experimental (même traitement), alors ce groupe entier sera retiré de la procédure en cours.

Choix des espèces

La souris de fond génétique C57BL/6 est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies du système nerveux central. L’existence de nombreuses lignées transgéniques sur fond C57BL/6 et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. anticorps spécifiques, sondes moléculaires …) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous souhaiterions par la suite approfondir notre étude en utilisant des souris inactivées pour le gène du récepteur 5-HT7 (5-HT7 KO) également sur fond C57BL/6, afin de déterminer la spécificité du rôle des ligands et discriminer l’implication des autres récepteurs de la sérotonine dans les résultats observés. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 à 14 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature et un comportement adulte stable.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des injections intraveineuses et des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, pour suivre la biodistribution de six molécules anticancéreuses modifiées. Les souris dont la tumeur dépasse 400 mm3 ou se nécrose sont mises à mort par dislocation cervicale. Le porteur présente l'étude comme préliminaire, destinée à sélectionner les meilleurs candidats, et revendique une réduction du nombre d'animaux grâce à l'imagerie de fluorescence.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections. Il est exprimé par les cellules immunitaires et épithéliales normales ainsi que de très nombreux cancers solides. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination empêchant les récidives. Malgré cela, aucun activateur de ce récepteur n'a jusqu’ici obtenu l'autorisation de mise sur le marché en raison d'effets toxiques, de manque d'efficacité ou d’homogénéité. Un nouvel activateur de ce récepteur a récemment été découvert, homogène, actif, spécifique et surtout très bien toléré. De nombreuses études sur souris ont permis d’objectiver l’efficacité de ce nouveau candidat médicament (non protégées, ni vectorisé), administré par voie locale (intratumorale). Afin de favoriser l'administration par voie veineuse, ce candidat médicament sera protégé (pour résister aux enzymes présentes dans le sang qui peuvent dégrader ces molécules), et vectorisé (afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales et immunitaires d’intérêt). L’objectif de cette étude est donc d’observer les effets de ces protections et vectorisations sur la stabilisation et la localisation des candidat médicament au cours du temps. Il s’agit d’une expérience préliminaire destinée à raffiner le choix des meilleurs candidats (qui devront être confirmé par la suite par des études de biodistribution plus complètes et à visées statistiques). Pour cette étude préliminaire, six différentes molécules (portant différentes combinaisons de protection et de vectorisation), seront analysées. Ces molécules seront toutes marquées avec une molécule fluorescente. C’est cette fluorescence qui permettra de les localiser et de les quantifier au cours du temps, grâce à des méthodes innovantes d’imagerie en trois dimensions. Cela permettra d’obtenir une biodistribution corporelle de ces composés. Pour chacune des six molécules, cinq souris seront injectées par voie intraveineuse. Les souris seront analysées quand leurs tumeurs atteindront 100 à 200mm3. A cette taille-là, les tumeurs sont suffisamment bien vascularisées pour permettre une délivrance à la tumeur par voie sanguine.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de de définir les bases pour une nouvelle voie d’administration d'un candidat médicament, en ciblant plus spécifiquement certains types de tumeurs ainsi que des cellules immunitaires d’intérêt, ce qui diminue les doses nécessaires à son activité ainsi que les effets indésirables. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle, permettant de poser les bases d’une nouvelle voie d’administration d’un candidat médicament anticancéreux, en vue d’une étude clinique chez l’homme. La première procédure permettra de sélectionner et caractériser le meilleur model tumoral à utiliser pour les études de biodistribution. La seconde procédure permettra de cribler les molécules modifiées sur la base de leur cinétique et quantité de distribution à la tumeur et ainsi d'évaluer le/les meilleurs candidats pour une étude clinique en injection par voie intraveineuse.

Procédures

# Greffe tumorale: injections sous-cutannées de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Injections par voie intraveineuses (produit de contraste dans la procédure-1 et molécules fluorescentes dans la procédure-2), sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Analyses par imagerie échographiques (échodoppler et echographie de contraste) sous anesthesie gazeuse (temps d'analyses cumulés de 30-40 minutes environ). # Analyses par imagerie de fluorescence 3D (non invasive) sous anesthesie gazeuse (5 minutes environ - répétées aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h ).

Impact sur les animaux

Douleurs engendrées par l’injection de cellules tumorales, la pousse tumorale, les anesthésies répétées, stress engendré lors des analyses de volume tumoral et de poids de la souris. De façon plus détaillée: #Procédure-1: (1) les animaux seront greffées avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc sous anésthésie gazeuse. (2) Suivi de croissance tumorale trois fois par semaine avec manipulation des animaux pour mesurer la tumeur et peser les animaux. (3) Lorsque les tumeurs atteignent environ 100 à 200mm3, les souris sont anesthésiées pour deux analyses en imagerie échographique consécutives (non invasive). La seconde analyse nécessitera l'injection intraveineuse (dans la veine caudale) d'un agent de contraste (toujours sous anésthésie). Le temps cumulé de ces deux analyses est d'environ 30 à 40 minutes. (4) Les souris ayant des tumeurs au-delà de 400mm3 ou nécrosée seront mises à mort par dislocation cervicale. #Procédure-2: Les animaux seront greffés avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc (du modèle déterminé en procédure-1). Les souris seront anesthésiées et injectées avec les molécules fluorescentes par voie intraveineuse (dans la veine caudale). Les souris seront alors analysées en imagerie de fluorescence (non invasive) sous anesthésie aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h (chaque analyse prenant environ 5 minutes). Après la dernière analyse à 24h, les animaux seront mis à mort et leurs organes récupérés post-mortem pour analyses.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort. Leurs organes et tumeurs seront prélevés post mortem pour analyse.

Remplacement

Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo des molecules modifiées (efficacité, stabilité, internalisation), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique physiologique complexe est nécessaire dans les donditions d'injection par voie intraveineuse afin d’analyser la biodistribution dans les organes/tissus/tumeurs au cours du temps et de définir une approche qualitative et cinétique pour poser les bases d’une étude clinique.

Réduction

La procédure-1 permet de mettre au point le modèle et de le caractériser au mieux sur un nombre limité d’animaux (5 souris par modèle tumoral – 4 modèles). Ce nombre limité d’animaux est permis grâce à des méthodes non invasives d’imagerie échographiques de pointe permettant de répondre avec précision aux questions posées sur vascularisation des tumeurs et de perméabilité de celles-ci aux traitements injectés par voie intraveineuse. Seul le meilleur modèle sera utilisé par la suite. La procédure-2 s’effectue également sur un nombre limité d’animaux (8 animaux greffées pour 5 animaux analysés par molécule – jusqu’à 12 molécules). Pour éviter la dispersion des résultats, seuls les animaux les plus homogènes en termes de taille de tumeur mais aussi en termes de vascularisation seront analysés. La cinétique de biodistribution par imagerie de fluorescence constitue en soit une réduction par rapport aux biodistribution classiques en point final à chaque temps. Cette méthode évite ainsi d’avoir à procéder à de très nombreuses mises à mort d’animaux aux différents temps d’intérêt pour obtenir les mêmes résultats. Le fait que nous ne cherchions pas de résultats statistiques mais tout en étant sur un pool de tumeurs homogène et bien caractérisé, nous permet d’avoir les résultats suffisamment robustes pour répondre à la question du criblage de ces molécules in-vivo sur ce nombre limité d’animaux.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux, en environnement enrichi avec eau et nourriture (classique et non fluorescente) à volonté, dans des conditions sanitaires permettant que leur phénotype ne soit pas dommageable. Le changement d’alimentation pour une nourriture non fluorescente est généralement très bien toléré par les animaux et n’engendre pas de diarrhées ou autres troubles digestifs. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs (significatifs d'exclusion de l'expérience et de Mise à Mort), et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de batons à ronger. Les souris seront greffées avec tumeurs en injection sous-cutanée dans le flanc sous anesthésie gazeuse, selon les conditions publiées dans la littérature. La surveillance des animaux sera effectuée trois fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. La taille des tumeurs (de 100 à 200mm3 pour les études d’imagerie), permet une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal, avec moins de risque de nécrose. L’imagerie par fluorescence et par échographie sont des processus non invasif et non douloureux mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. L'animal est anesthésié sous isoflurane et est placé dans une cassette de contention. Pour l’imagerie échographique, la souris est fixée sur un plateau chauffant réglable afin de maintenir sa température interne, contrôlable par une sonde anale. De plus les pattes sont fixées à des électrodes permettant de contrôler en direct l’ECG. Pour l’imagerie de fluorescence, de l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir constante la température de l’animal. Les animaux sont réveillés sous une lumière chauffante et sous surveillance. Tous les animaux de l’expériences seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle physiologique complexe que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris immunodéprimées, appareillage adapté comme le FMT...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies ciblées chez cette espèce. Des souris de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement matures, ce qui est nécessaire dans notre étude de biodistribution (assimilation, barrière hématoencéphalique...) etc. Les quatre types de tumeurs greffées provenant de patients humains ou d'une souche murine différente, donc toutes non immuno-compatibles, l'utilsiation des souris immunodéficientes BALB/c Nude permettra l'absence de rejet de ces tumeurs. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée.

6 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections d'hormones, des vasectomies, des transferts d'embryons ou des greffes d'ovaire pour produire et maintenir des lignées génétiquement modifiées. Le porteur décrit une activité de production pour ses "clients" et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative possible", le but étant de produire des animaux destinés à l'expérimentation. La mise à mort sert à récupérer ovaires, ovocytes ou embryons, les mâles vasectomisés et femelles receveuses étant tués une fois qu'ils ne peuvent plus se reproduire.

Objectifs

Le développement des techniques de reproduction assistée au cours des dernières décennies a révolutionné le domaine de la recherche. Aujourd’hui elles sont incontournables pour la production d’animaux d’expérimentation, la préservation de ressources génétiques précieuses ainsi que pour la génération de nouvelles souris génétiquement modifiées reproduisant des maladies humaines. L’objectif de ce projet est de proposer ces techniques dans le cadre de l’hébergement et du maintien de leur modèles expérimentaux pour lesquels la reproduction naturelle n'est pas possible ou qui nécessitent d’être exempté de certains pathogènes.

Bénéfices attendus

Les techniques constituant ce projet permettront la création et/ou le maintien de modèles génétiquement modifiés reproduisant des maladies humaines afin de mieux les comprendre et à long terme de développer des traitements. Ces techniques de reproduction peuvent également être utilisées dans le cas d’animaux porteurs de pathogènes à éliminer.

Procédures

Les femelles donneuses subissent 2 injections d’hormone intra-péritonéales (30 sec/inj) à 48h d’intervalle. Les animaux sur lesquels une chirurgie est pratiquée (durée

Impact sur les animaux

Les femelles donneuses d’ovocytes ou d’embryons subissent deux injections d'hormones par voie intra-péritonéale (30 secondes/injections) à 48h d’intervalle. Compte tenu de l’innocuité connue des substances administrées, aucun effet indésirable particulier n’est attendu suite à cette procédure. Les animaux sur lesquels une chirurgie est pratiquée (durée

Devenir

La récupération d’ovaires (P4), d’embryons ou d’ovocytes (P1) nécessite la mise à mort des animaux. Les mâles vasectomisés (P2) et femelles receveuses (d’ovaire (P4) ou d’embryon (P2)) seront euthanasiés lorsqu’ils ne seront plus en âge de se reproduire.

Remplacement

Le but de ce projet étant de produire des animaux destinés à l’expérimentation, il n’y a pas d’alternative possible.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux nécessaires dans le cadre de ce projet a été calculé en se basant sur les données de la littérature sur les taux de succès et de d’efficacité des différentes étapes des procédures. Cependant la formation continue du personnel effectuant les procédures et la répétition des gestes techniques devraient contribuer à l’amélioration du taux de réussite des procédures et donc une réduction du nombre d’animaux engagés au cours du temps. Par ailleurs, dans le cas d’animaux présentant des difficultés à se reproduire de façon naturelle, l’utilisation de technique de reproduction assistée devrait permettre de produire moins d’animaux géniteurs dans le cadre de l’élevage ou du maintien de colonies.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par l’observation générale des signes cliniques (week-ends et jours fériés inclus). Les animaux présentant des signes de souffrance seront pesés et suivis quotidiennement selon la fiche d’observation/points limites annexée à ce projet (INS-008-04). Le document joint (INS-008-04) permettra également d'assurer le suivi et la surveillance des lignées à phénotype dommageable. Les animaux ayant atteint les points limites seront mis à mort immédiatement. Une période de convalescence post-opératoire (de 7 à 10 jours) pour les animaux subissant une chirurgie est attendue durant laquelle les animaux font l’objet d’un suivi accru en ce qui concerne les signes éventuels de douleur, dans ce cas-là une nouvelle dose d’analgésie pourra être administrée.

Choix des espèces

La mise au point de l’ensemble des techniques utilisées a été réalisée sur le modèle souris dans le cadre de la création ou du maintien de modèles génétiquement altérés. Cette espèce représente l’essentiel des demandes d’expérimentation de la part de nos clients. Les mâles (quelle que soit la procédure) et les femelles receveuses (P3) sont utilisés à partir de 8 semaines d’âge (âge correspondant à la maturité sexuelle.) Les femelles donneuses d’ovocytes (dans le cas de fécondation non naturelle, P1) ou d’ovaire (P4) sont utilisés à partir de 3 semaines d’âge (âge permettant la récolte du plus grand nombre d’ovocyte et donc permettant ainsi de diminuer le nombre d’animaux utilisé).