Procédures modérées

230 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures classées en souffrance modérée, pour un enseignement de biologie du développement. Le porteur indique que les adultes ne subissent aucun traitement et servent uniquement à la reproduction, seuls leurs embryons de moins de cinq jours étant observés, puis qu'ils sont réutilisés à des fins pédagogiques. Il décrit un génotypage présenté comme non invasif, par simple repérage d'un marqueur fluorescent. Il justifie le maintien de lignées vivantes par l'intérêt de montrer aux étudiants un vertébré à embryons transparents.

Objectifs

Ce projet consiste à présenter un organisme modèle vertébré, le poisson zèbre, pour renforcer et illustrer les cours et travaux dirigés de la Biologie / Génétique du Développement. Les concepts de base de la Biologie du Développement animal visent à faire comprendre la mise en place des structures précoces, les phénomènes d'induction tissulaire, la morphogenèse et l’organogenèse dans un organisme vertébré. Nous présenterons des embryons sauvages et mutants, fixés et vivants, à des stades de développement précoces. Nous utiliserons des lignées mutantes, inductibles par la chaleur, des traitements chimiques et l'injection transitoire d'ARN guide (CRISPR/CAS9) pour induire des phénotypes précoces facilement observables à 3 jours de développement pour les étudiant.es.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra de présenter un organisme modèle vertébré aux étudiant.es de Biologie du Développement et de les faire observer en parallèle des embryons vivants et fixés pour avoir une vision dynamique et réaliste de nos enseignements.

Procédures

Les animaux générés par ce projet seront utilisés à des fins reproductives, seuls leurs embryons dans les phases de développement autonomes (avant 5 jours de développement) seront utilisés pour expérimentation et observation à 1 jour, 2 jours, 3 jours, 4 jours et 5 jours. Ils sont ensuite fixés à 3, 4 et 5 jours pour analyse moléculaire et phénotypique.

Impact sur les animaux

Dans ce projet pédagogique nos adultes ne sont soumis à aucun traitement et servent uniquement à la reproduction pour générer des embryons pour nos observations phénotypiques.

Devenir

A l'issue de la procèdure les animaux seront réutilisés à des fins reproductives pédagogiques.

Remplacement

Notre projet utilise des embryons et des larves plutôt que des poissons adultes.

Réduction

Les travaux pratiques concernent uniquement des processus embryonnaires ou larvaires avant 5 jours de développement. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à nos observations. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que d’obtenir nos embryons. De plus, le génotypage dans ce projet est dit non invasif (sélection des lignées grâce à la présence d'un rapporteur fluorescent) ce qui n'induit pas de douleur chez l'animal.

Choix des espèces

Nos enseignements visent à transmettre les connaissances sur le développement des organismes modèles vertébrés. Ils portent sur la mise en place des axes et territoires embryonnaires. Une approche éducative incluant un animal vertébré permet une meilleure appréhension des phénomènes contrôlant ces processus. Le poisson zèbre est un modèle qui présente de nombreux avantages dont la possibilité d'observer les événements embryonnaires précoces « in vivo » grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet aisément et de façon non- invasive, le recourt à l'utilisation d'approches chimiques, de lignées transgéniques inductible par la chaleur et de mutagénèse dirigée transitoire pour obtenir des phénotypes facilement observables et quantifiables précocement afin de comprendre les processus moléculaires et génétiques étudiés. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe permettant d'avoir accès à ces embryons facilement pour observer le développement précoce. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulement entre le stade 1 cellule (oeuf) et 5 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives et d'observation.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles reçoivent une injection d'un virus dans le cerveau, puis sont évaluées à quatre mois par des tests comportementaux, l'open field et le labyrinthe en Y, avant perfusion intracardiaque et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des traitements et décrit les manipulations comportementales comme indolores. Il juge encore "indispensable" le recours à l'animal, les modèles cellulaires iPS ou CRISPR n'offrant selon lui que des informations partielles.

Objectifs

Ce projet répond à des interrogations scientifiques qui sont essentielles au développement de nouvelles stratégies anti-Alzheimer innovantes ciblant MT5-MMP. Les objectifs du projet sont les suivants :

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera: A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux impliquant MT5-MMP dans : 1) le métabolisme de l’APP et plus précisément celui de ses fragments neurotoxiques, C99 et Abêta ; 2) le métabolisme de Tau ; et 3) les processus inflammatoires dans le cadre de la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités de MT5-MMP qui pourraient apporter des solutions chez l’homme.

Procédures

Le projet est organisé sur une seule procédure car les animaux de départ (nouveau-nés au stade P1) seront utilisés jusqu'à la fin de l'expérimentation (5 mois). La procédure est organisée en 4 étapes : 1) injection intracérébroventriculaire d'AAV9 dans des souris nouveau-nées. Nous injecterons par voie intracérébroventriculaire (ICV) des souris nouveaux-nées 5xFAD et leurs contrôles sauvages à P1 avec des AAV9 qui codent pour différents variants de la protéase MT5-MMP. Cette étape d'injection est d'une durée de 30 sec. 2) Génotypage des nouveaux-nés. Une biopsie de la queue (< 1 mm) est réalisée et les petits sont remis avec leur mère. Le génotypage permettra l'identification WT (sauvages) ou 5xFAD (Alzheimer). Cette étape est réalisée dans la durée de l'anesthésie. 3) Analyse comportementale. Quatre mois après l’injection, les capacités cognitives des souris seront évaluées dans des tests comportementaux, notamment l’open field et le labyrinthe en Y. La durée des manipulations dans l'open field est de 2x5min pendant 5 jours, et la durée des manipulations dans le labyrinthe est de 8min pendant 5 jours. 4) Perfusion intracadiaque et prélèvements. La durée de cette étape est d'environ 15min. Suite aux tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés, leurs cerveaux récupérés pour des analyses histopathologiques ou microdisséqués pour des analyses biochimiques. Ces analyses porteront sur différents marqueurs de la pathologie, notamment en relation avec le métabolisme de l’APP et de ses fragments les plus toxiques (e.g., C99, peptide Abêta), l’accumulation de la protéine tau, ainsi que sur des marqueurs cellulaires et moléculaires de la neuroinflammation.

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effets indésirables attendus sur les animaux liés à l’utilisation des traitements proposés. Les interventions telles que l'injection ICV chez le jeune et la biopsie de la queue sont réalisés sous anesthésie. En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique en injection IP d’un mélange Kétamine (150 mg/kg) et Xylazine (15 mg/kg) suivi d'une perfusion intracardiaque. La mort survient par les effets du surdosage anesthésique.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants (cellules iPS et système CRISPR/Cas9), ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, pour compléter nos observations in vivo (compréhension des effets bénéfiques de l’absence de MT5-MMP), nous avons développé des approches expérimentales in vitro comme des cultures primaires ou des cultures HEK ou iPS, avec des sous-expression/sur-expression de MT5-MMP, en parallèle du développement de modulateurs d’activité de MT5-MMP. Nos résultats obtenus doivent à présent être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux anti-MT5-MMP dans la MA doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle 5xFAD. Ces souris 5xFAD représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme, comparée à la MA développée par d’autres modèles des souris (9-12 mois).

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est décrit en détail au paragraphe 4.2. - WT (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 - 5xFAD (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 Soit 384 animaux Ce nombre d'animaux a été réduit au minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions et prend également en compte un certain nombre d’échec dès l’étape d’injection des AAV à P1.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et une attention particulière sera accordée aux procédures de raffinement. Les souris disposeront de nids végétaux à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l'environnement et matériau de nidification afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité tout en procurant un sentiment de sécurité chez l'animal.

Choix des espèces

Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour étudier l’impact de MT5-MMP sur les marques de la pathologie nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (5xFAD) exprimant les gènes humains codant pour l’APP et la PSEN1 (préséniline 1) portant, respectivement, 3 et 2 mutations familiales de la MA, d’où leur nom 5xFAD. Toutes les souches possèdent le même fond génétique C57/BL6 et seront générées à l'animalerie. Les animaux seront utilisés à deux stades : 1) Stade post-natal P1, dans lequel les injections d’AAVs seront faites, permettant ainsi l’expression des variants de MT5-MMP dès les premiers jours de vie post-natale. 2) Stade adulte à l’âge de 4 et 5 mois. Cet âge représente une phase précoce de la maladie dans laquelle on peut déjà observer des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique.

289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes cérébrales, puis des inhalations répétées de solvants organiques comme le toluène en chambre, avec des tests comportementaux et un test du nystagmus post-rotatoire. Le porteur indique que de fortes concentrations peuvent provoquer troubles de l'équilibre et tremblements, censés disparaître dans l'heure suivant l'exposition. Il rattache le projet à la fixation de valeurs limites d'exposition des salariés et écarte le remplacement, l'électrocorticographie n'étant pas réalisable in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la mise en place d'une méthode de suivi en temps réel de l’action des solvants organiques sur le cerveau par une mesure de l’activité cérébrale. Cette méthode d’enregistrement sans fil permettra de mesurer ces effets chez des animaux vigiles et libres de leurs mouvements lors de l’inhalation des solvants dans des chambres à atmosphère contrôlée. En outre, divers tests comportementaux seront réalisés en fin d’exposition afin de mettre en relation les modifications de l’activité du cerveau avec d’éventuelles déficiences motrices et/ou sensorielles. Ceci permettra d’avoir une vue d’ensemble sur les effets neurotoxiques aigus d’une exposition aux solvants organiques volatils.

Bénéfices attendus

L’e xposition des salariés à des solvants peut conduire à une dépression du système nerveux central et mener à une altération de leurs performances psychomotrices. L’exposition aux solvants peut donc être responsable de d’accidents du travail. Ainsi, afin de protéger la santé des salariés et limiter l’exposition de ces derniers à de fortes doses de solvant, des valeurs limites d’exposition ont été mise en place. Néanmoins, les relations doses/réponses des solvants sur l’activité cérébrale sont mal connues. Ce projet vise à proposer une méthode de mesure objective de l’effet des solvants sur le système nerveux central et d’améliorer les connaisances sur les risques liés aux expositions aiguës aux solvants organiques.

Procédures

Procédure 1 : Etude pilote (N=16) : N=12 : Chirurgie (1h) ; Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; inhalation « toluène » + électrocorticographie (4 x 8h) ; mise à mort et prélèvement de tissus N=4 : Mise à mort et prélèvement de tissus Procédure 2 : Mesure de l'activité cérébrale par électrocorticographie et analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=56) N=14 par dose de solvant : Chirurgie (1h) ; [Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; Comportement (30min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 3 : Mesure du nystagmus post-rotatoire suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : Chirurgie (45min) ; [Inhalation « contrôle » (4 x 8h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 4 : Analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : [Inhalation « contrôle » (4 x 8h); Comportement (30min); Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 5 : Prélèvement sanguin et de tissus neuronaux suite à l’exposition aux solvants (N=96) N=8 par temps de prélèvement (temps 1 : à la fin du 4ème jour des périodes « solvant » ; temps 2 : à la fin de la semaine post-exposition). Les animaux seront mis à mort par prélèvement final du sang et du cerveau (5 minutes maximum, sous anésthésie profonde). Dans le cas où les quantités de solvant dans le sang ou le cerveau sont égales à zéro après une semaine de récupération lors de la phase expérimentale 1, le nombre de rats mis à mort au temps 2 pourra être réduit à n=4 pour les expérimentations suivantes.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant. Ils pourront présenter des signes cliniques tels que des troubles de l'équilibre ou des tremblements. Ces signes cliniques devront, néanmoins, disparaître dans l'heure qui suivra la fin de l'exposition.

Devenir

La totalité des animaux prévus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable pour obtenir des résultats exploitables puisque : - notre approche expérimentale, qui vise à étudier l’activité cérébrale par électrocorticographie, n’est pas possible in vitro. - notre projet étudie les atteintes au niveau comportemental et neuro-sensoriel, expérimentations qui ne peuvent être réalisées que sur l'animal vivant.

Réduction

Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux requis soit réduit à son minimum. Autant que possible, l’utilisation de chaque animal a été optimisée pour récolter un maximum de mesures, à la fois fonctionnelles, comportementales et histologiques. Sont décrites ci-dessous les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux : 1) Les animaux seront leurs propres contrôles : Ils seront exposés initialement à une période de 4 jours d’air ambiant (période « contrôle ») puis 4 jours à des vapeurs de solvants organiques (période « solvant »). Les mêmes mesures fonctionnelles et comportementales seront réalisées pendant et à la fin de ces deux périodes pour comparaison. 2) Lors de la phase expérimentale 2, les effets fonctionnels et comportementaux de trois doses incrémentales du même solvant seront testés sur les mêmes animaux. Chaque exposition à une dose de solvant sera précédée d’une période « contrôle » afin de s’assurer que les animaux sont bien à leur niveau basal en terme de fonction cérébrale et de comportement. 3) Les animaux dont l'activité cérébrale sera mesurée pendant l'exposition aux solvants réaliseront également certains tests comportementaux, et seront ensuite mis à mort pour analyse histologique des tissus d’intérêt. 4) Les animaux dédiés aux tests comportementaux, mais dont l’acitivité cérébrale n’est pas enregistrée, seront également utilisés pour le dosage des solvants dans les tissus d’intérêt afin de réduire au maximum le nombre d’animaux concernés par la procédure de prélèvement seule.

Raffinement

1. Pe ndant toute la durée du projet, les animaux seront traités avec douceur et compassion par le personnel compétent. Des caresses seront prodiguées lors de chaque manipulation. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les animaux seront hébérgés (si possible) par deux. Leur environnement sera enrichi par un tunnel en carton. 2. Concernant les chirurgies : - Afin d'atténuer la douleur, les animaux recevront un analgésique pré-opératoire et un anti-inflammatoire non stéroïdien sera délivré à l'animal (deux fois à 24h d’intervalle) après les chirurgies. - Pendant l'intervention chirurgicale : o Un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement oculaire o La température corporelle de l'animal sera maintenue à l’aide d’une couverture chauffante thermorégulée. - A la fin de l'intervention chirurgicale : o Une pommade sera appliquée afin d’accélérer le processus de cicatrisation. o Une injection de sérum physiologique sera faite afin de palier la déshydratation de l’animal, inhérente à la chirurgie - Suite à l’intervention : o Le réveil des animaux se fera dans une armoire chauffante ; ils bénéficieront d’une surveillance accrue avant le retour dans leur pièce d'hébergement. o De la nourriture sous forme de bouchon et sous forme gélifiée sera mise à disposition à l'intérieur de la cage. o Les animaux bénéficieront d'une période de suivi post-opératoire de 5 jours pendant laquelle ils seront observés (afin de déceler tout signe de douleur ou toute modification comportementale) et pesés quotidiennement. o Les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter l'exploration de sites d'incision et de suture par leurs congénères et la détérioration du dispositif implanté, mais seront mis dans des cages transparentes afin de garder un contact visuel entre eux. 3. Concernant les inhalations de solvants : - Les animaux seront habitués progressivement à être placés dans les enceintes d'inhalation afin de diminuer le stress lié à ce nouveau lieu. - Pendant la période d'exposition, les animaux seront observés toutes les 2 heures et une fiche de suivi clinique individuelle sera remplie en cas d'observation de signes de souffrance chez un animal. 4. Concernant les tests comportementaux : - Les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins deux semaines avant le début des expositions.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal s’est porté sur les rats Long Evans. En effet, le rat présente un métabolisme des solvants proche de celui de l'Homme. De plus, les tests comportementaux utilisés ici visent à évaluer les atteintes des solvants sur le fonctionnement de l’oreille interne. Les expérimentations, donc, doivent être menées sur des souches de rat pigmentées car, comme chez l'Homme, la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne (les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants). Les rats seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 3 mois) car l'oreille interne ainsi que les cytochromes présents dans le métabolisme des solvants doivent être matures.

756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite, avec injections intra-articulaires et prélèvements de sang sous anesthésie, pour évaluer une protéine et repositionner des médicaments existants. Le porteur indique que l'arthrite provoque une douleur et fixe un point limite au score maximal aux quatre pattes ou à 20 % de perte de poids, seuil déclenchant la mise à mort. Il affirme que la complexité de la maladie ne peut être étudiée qu'au niveau d'un "organisme entier", les rubriques réduction et raffinement se réduisant à quelques lignes.

Objectifs

1)-Evaluation du rôle de la protéine QKI5 dans l'inflammation de l'arthrite et dans l'érosion osseuse. 2)-Evaluation de médicaments qui induisent QKI5 ou de lentivirus-QKI5 dans l'inflammation de l'arthrite et dans l'érosion osseuse (Repositionnement de médicaments déjà existants sur le marché).

Bénéfices attendus

Compréhension du rôle de QKI5 dans l'arthrite et l'inflammation. Repositionnement de médicaments qui induisent QKI5 pour une application anti-inflammatoire et anti-érosion osseuse.

Procédures

Aucun prélèvement sur animaux vigiles, aucune procédure chirurgicale. Prélèvements de sang sous anesthésie. Injections IP de serum ou de médicament Injections intra-articulaires sous anesthésie. Durée de la procédure pour chaque souris : 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'arthrite induite par les différents modèles provoquera une douleur dont l'intensité sera examinée suivant le codage suivant : Le point limite est atteint lorsque le score de l’arthrite est de 12 (3 à chaque patte) et le score total (apparence générale, apparence des orbites, apparence des oreilles, prise alimentaire ou boisson) est > 15 ou lorsque la perte de poids est de 20 % . Les modèles présentés ici ne sont pas nouveaux et ont été décrits de façon extensive dans la littérature par d'autres auteurs.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux justifiée par l'impossibilité de réutilisation.

Remplacement

la complexité de la maladie ne peut être étudiée qu’au niveau d’un organisme entier. Cependant, chaque fois que cela sera possible, les analyses seront effectuées sur des cellules en culture. Réduire : Raffiner : La douleur des animaux sera réduite au maximum par l’utilisation des anesthésiques et l’euthanasie si cela est nécessaire.

Réduction

Le nombre de souris sera limité au strict nombre nécessaire pour une signification statistique des résultats. Six à 8 souris par groupe d’expériences seront utilisées. Les tests statistiques Mann-Whitney et t de Student seront utilisés.

Raffinement

La douleur des animaux sera réduite au maximum par l’utilisation des anesthésiques et l’euthanasie si cela est nécessaire.

Choix des espèces

Les souris possèdent des articulations dont l’inflammation reproduit l’arthrite humaine. Seule l’espèce Mus Musculus possède les souches nécessaires (Transgéniques, KO, KI) Age adulte : 8 à 16 semaines pour l'expérimentation car le système immunitaire est mature. A partir de 8 semaines pour les prélèvements de souris K/BxN car elles sont adultes et que l'arthrite est bien établie.

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale d'un virus exprimant une forme mutée de l'alpha-synucléine pour induire une lésion type Parkinson, puis une injection d'amphétamine avec observation du comportement rotatif, avant perfusion intracardiaque. Le porteur indique que la chirurgie cérébrale peut provoquer stress, douleur locale et variations de poids, et que les cerveaux seront prélevés pour analyse. Il présente le projet comme un préalable à une demande d'essai clinique de thérapie génique et écarte le remplacement, l'in vitro n'offrant pas le contexte physiologique.

Objectifs

La maladie de Parkinson se caractérise notamment par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire. Via le recours à de multiples modèles animaux de cette pathologie, notre laboratoire a démontré le rôle essentiel de la protéine EN1 pour la survie de ces neurones. Il est à noter qu’une seule et unique injection de EN1 permet une activité neuroprotectrire pendant >12 semaines, suggérant que son mécanisme d’action repose sur des leviers épigénétiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer si faire exprimer EN1 de façon durable via des vecteurs viraux de type AAV permettrait de prolonger son effet neuroprotecteur. Pour ce faire, nous prévoyons de développer un modèle murin de lésion progressive et chronique des neurones DA de la substance noire via l’utilisation d’un vecteur viral (type AAV) codant pour une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine. L’expression durable de EN1 sera induite grâce à l’injection d’un second AAV. Afin de soutenir une prochaine demande d’essai clinique pour l’utilisation de vecteurs viraux permettant une expression durable de la protéine thérapeutique hEN1 chez les patients atteints de la maladie de Parkinson, ce projet a deux objectifs. Objectif 1 : développer un modèle murin de lésion progressive et chronique des neurones DA de la SN via l’utilisation d’un vecteur viral (type AAV) codant pour une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine. Objectif 2 : Utiliser des vecteurs viraux (type AAV) pour permettre une expression durable d’EN1 dans le but de prolonger son effet neuroprotecteur.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’investigations précliniques qui devront permettre la soumission d’une demande d’essai clinique pour l’utilisation d’un outil de thérapie génique chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet développe un modèle murin de lésion chronique qui permettra de mieux rendre compte de l’aspect évolutif de la pathologie humaine. Quant à l’utilisation de vecteurs viraux permettant une expression durable de EN1, elle devrait permettre une action neuroprotectrice prolongée et offrir de nouvelles perspectives pour le traitement de la maladie de Parkinson.

Procédures

Ce projet contient 3 procédures avec plusieurs interventions par procédure. Un maximum de 292 souris seront utilisées dans ce projet. 1) Injection stéréotaxique intracérébrale : La chirurgie se déroule en conditions d’asepsie et d’anesthésie et analgésie générale sur des souris âgées de 60 jours au minimum. Un maximum de 292 souris seront injectées d’un adeno-associated virus. La procédure dure moins d’une heure. Les souris seront gardées un maximum de 16 semaines après injection. 2) Injection intrapéritonéale d'amphétamine pour stimulation du système nigrostriatal et suivi du comportement rotatif : La procédure se déroule sur animal vigile. Après une injection intrapéritonéale d’amphétamine, l’animale est filmé pendant 10 min dans une boite ouverte. Un maximum de 204 souris seront soumis à cette intervention. La procédure dure moins de 30 minutes. 3) Perfusion intracardique : La procédure se déroule en conditions d’anesthésie et analgésie générale. Un maximum de 292 souris seront soumis à cette intervention. La procédure dure moins de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Nos expériences nécessitent des procédures de classe modérée. Pour toutes nos expériences, les souris sont anesthésiées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Cependant, et même si notre laboratoire a acquis une solide expérience en la matière, des souris peuvent ne pas supporter la chirurgie ou avoir un mauvais placement du site d’injection stéréotaxique. Aussi, suite à une injection stéréotaxique intra-cérébrale, il est possible que les animaux soient stressés, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite. Après une période de surveillance post anesthésique, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec leurs congénères. Nous ne nous attendons pas à une certaine mortalité dû aux molécules injectées. Dans le cadre du suivi des animaux selon les paramètres définis dans une grille d’évaluation du bien-être, à la suite d’une injection intracérébrale, les animaux seront observés quotidiennement pendant 5 jours (puis 2 fois par semaine), afin de détecter au plus vite les signes de perturbations du bien-être animal et d’intervenir dans les plus brefs délais.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau collecté afin de permettre des analyses histochimiques permettant d’évaluer la lésion induite par la surexpression de la synucléine et/ou l’effet protecteur de EN1 sur les neurones DA de la SN.

Remplacement

Ici, nous chercherons à développer un modèle murin de la maladie de Parkinson avec des AAVs dont l’expression a été déjà validé. Nos expériences devant permettre de soutenir une demande d’essai clinique, il est nécessaire qu’elles soient réalisées sur l’animal. L’expérimentation in vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de l’activité neuroprotectrice de EN1. Enfin, le développement d’un modèle chronique de la maladie de Parkinson n’est pas réalisable in vitro car la diffusion et toxicité de la protéine synucleine mutée ne peuvent être évaluées que dans le contexte physiologique.

Réduction

Sur la base de notre expérience antérieure, nous prévoyons d'utiliser 8 souris par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Pour les analyses histologiques, nos résultats préliminaires indiquent que 6 souris par groupe constituent un nombre minimum d’animaux pour avoir suffisamment de puissance statistique (www.stasticalsolutions.net/pssTtest_calc.php). Nous proposons n=8 pour maintenir la puissance statistique en cas de décès au cours de la chirurgie ou de mauvais placement du site d’injection stéréotaxique. Les données quantitatives obtenues feront l’objet d’une analyse de variance, suivie de tests post hoc. Si les distributions des moyennes sont normales, nous utiliserons des tests statistiques paramétriques (Student ou Anova). Si ce n’est pas le cas, nous opterons pour un test non-paramétrique (i.e. Mann-Whitney). Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux, la caractérisation de nos différents lots/type de virus étant notamment réalisée sur des effectifs réduits. En effet, dans le cadre des expériences visant à optimiser les conditions d’utilisation de nos AAVs, nous prévoyons d’avoir recours à des injections bilatérales afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une cage elle-même chauffée grâce à un matelas chauffant jusqu’à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leurs groupes d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement et observés et pesés chaque jour pendant cinq jours. Ensuite, en plus d’une inspection visuelle quotidienne, des relevés de poids seront réalisés au moins 2 fois par semaine et d’éventuels signes de douleur seront recherchés. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.

Choix des espèces

La souris est une des espèces majoritairement utilisées dans le domaine scientifique pour l'étude des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet ainsi une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de maladie de Parkinson ont été générés et caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de EN1 dans un modèle murin de maladie de Parkinson, une maladie neurodégénérative pour laquelle l’âge moyen d’apparition des premiers symptômes est de 57 ans en France. Nous utiliserons donc exclusivement des souris adultes dont l’âge sera voisin de 60 jours.

250 lamas vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des anticorps par immunisations suivies de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la plupart sont gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, une minorité étant tuée pour prélever la quasi-totalité du sang. Les effets décrits se limitent au stress de la contention, des injections et des prélèvements, répartis sur environ vingt-cinq études par an pendant cinq ans. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode substitutive" et que cette production animale est "indispensable" à la recherche.

Objectifs

Les lamas sont aujourd'hui des animaux très utilisés dans la recherche basée sur les anticorps, les biotechnologies... En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, le plus faible coût de production, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de lamas. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic…

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements.

Devenir

Dans certains cas (très rares chez le lama), les animaux inclus pourront être mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité de volume sanguin circulant. Dans le cas où le prélèvement terminal de la quasi-totalité du volume sanguin circulant n'est pas nécessaire (très souvent le cas), les animaux inclus pourront être gardés en vie et maintenus sur le site avec leurs congénères. Ils pourront ensuite être réutilisés dans d'autres études après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux nécessite une immunisation de l'animal et donc son utlisation. Il n'existe aucune méthode substitutive pour cette production qui est indispensable à l'avancement de la recherche, de la médecine, du développement de test de diagnostic...

Réduction

Le nombre d'animaux est choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Le lama permet d'obtenir des quantités de sérum suffisantes à l'atteinte des objectifs du projet, sans porter atteinte au bien-être animal. Ainsi, 1 ou 2 lamas seront immunisés par étude permettant ainsi d'obtenir une quantité suffisante de sérum. Le nombre de 2 lamas pour une étude sera choisi dans le cas de certaines études où il y a besoin de prendre en compte le facteur diversité/variation génétique qu'il peut y avoir entre 2 animaux. Un nombre de 25 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 250 lamas sur 5 ans. Sur ces 250 lamas, il y aura des possibilités de réutilisation de lamas d'une étude pour une autre étude, après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser. Dès que le caractère naïf des lamas n'est pas demandé et n'est pas utile pour l'étude, des lamas issus d'études précédentes seront utilisés dans le respect de leur bien-être et si leur état de santé le permet. Ainsi, cela permettra de réduire le nombre de lamas différents utilisés.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : pâture extérieure, litière de paille, brosse à vache, objects à manipuler...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lama sera ici utilisé pour la production d’anticorps. En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. Les animaux sélectionnés seront de jeunes adultes (entre environ 9 mois et environ 6 ans) car c'est à ce stade qu'ils sont entièrement immunocompétents.

7 812 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés, ils subissent prélèvement de nageoire pour génotypage, bains chimiques, chocs thermiques et imageries répétées sous anesthésie, pour étudier une malformation du crâne liée au gène Fgfr3. Le porteur indique que des malformations craniofaciales, microcéphalie et scoliose, sont attendues et que les poissons dépassant les points limites seront mis à mort, l'atteinte n'étant pas présentée comme systématique. Il qualifie d'"indispensable" le développement de nouvelles thérapies et conclut au recours au poisson zèbre pour reproduire ces mécanismes.

Objectifs

Les craniosynostoses sont des maladies génétiques qui résultent d’un défaut du processus d'ossification et entrainent une fusion prématurée d’une ou plusieurs sutures crâniennes associées à des malformations crâniofaciales. Outre les problèmes esthétiques ces malformations sont responsables de troubles fonctionnels majeurs dus aux conflits de croissance entre crâne et encéphale qui provoque une hypertension intracrânienne. Aujourd’hui les traitements des craniosynostoses consistent en des interventions chirurgicales lourdes et répétées. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est indispensable et nécessite une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeux au cours de l’ossification dans des conditions normales et pathologiques. Les objectifs du projet seront de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la formation de la voûte crânienne en utilisant des poissons zèbres génétiquement modifiés. Les modèles de poisson zèbres utilisés et développés au cours de ce projet présenteront des malformations crâniofaciales mimant la pathologie humaine (microcéphalie, défaut des sutures) dont le caractère dommageable ne sera présent que tardivement au cours du développement environs 2 mois après la naissance. Les modèles de poissons zèbre développés permettront également de tester l'efficacité de différents composés pharmacologiques qui sont susceptibles de corriger ces malformations au cours de la formation de la voûte crânienne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’un point de vue fonctionnel de mieux définir le rôle de Fgfr3 dans l’ossification membranaire. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les osteochondrodysplasies liées à des mutations de fgfr3. La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des craniosynostoses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients. L’établissement de ces modèles de poissons zèbres permettra d’effectuer le criblage de molécules.

Procédures

Procedure 1 à 8: Les animaux génétiquement modifiés subiront une fois dans leur vie des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour génotypage. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte par bain rapide de benzocaïne (1min), puis un segment de 2-3mm de la nageoire caudale est coupé. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Procédure 3: Les animaux seront baignés une fois dans du rouge alizarine et une fois dans de la de la calcéine pendant une nuit chacun. Procédure 4: Les poissons seront baignés 1 fois dans du tamoxifène pendant 7 heures Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 30 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 5: Les poissons seront baignés 1 fois dans de l'actiflash pendant 7 heures. Ils seront irradiés avec un laser UV 1 fois pendant 200fs sous anesthésie générale et maintenues dans de l'hydrogel durée 5 min. Les poissons subiront un choc thermique à 37°C 3 fois pendant 1 heure. Les poissons seront imagés 2 fois en 10 jours pour cela ils seront maintenus sous anesthésie générale dans de l'hydrogel pendant 5 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L) Procédure 6: Les poissons seront imagés 4 fois en 4 semaines pour cela ils seront maintenues sous anesthésies générales dans de l'hydrogel pendant 3 minutes environs (temps nécessaire pour le positionnement, pour l'acquisition et le retour dans l'eau de nage sous anesthésies générales (benzocaïne 75mg/L). Procédure 7: les poissons subiront une seule fois dans leur vie une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale (benzocaïne 75mg/L) , l'anesthésie durera 5 min maximum. Procédure 8: les poissons seront soumis à un traitement pharmacologique par balnéation pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation Fgfr3 pPro262Arg, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lesion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis dans le projet seront euthanasiés. D'autre part les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs aux anesthésies répétées, aux chocs thermiques à 37°C, aux isolements nécessaires pour les acquisitions et pour le génotypage des poissons.

Devenir

l'ensemble des poissons de ce projet seront mis à morten fin de procédure

Remplacement

Pour la procédure 8, la sélection des molécules les plus spécifiques et efficaces permettant potentiellement d'améliorer le phénotype pathologique des poissons fgfr3P262R se fera au préalable in vitro afin de ne pas utiliser de poissons lors de cette étape de sélection.

Réduction

Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Les procédures d'imagerie in vivo se feront de maniere longitudinale (Un même individu est analysé à différents temps) ceci permettant d'augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d'individus analysés.

Raffinement

Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Afin d’effectuer le suivi des poissons ceux-ci seront regroupés par génotype et un dénombrement des poissons affectés par symptôme sera effectué quotidiennement. Des malformations squelettiques sont attendues pour les poissons fgfr3lof/lof et pour l’ensemble des poissons exprimant une mutation fgfr3 pPro262Arg ; l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial (microcéphalie, aplatissement de la face) et axial (scoliose, retard de croissance) ne sera pas un critère éliminatoire. La majorité des procédures seront pratiquées à des stades précoces (environs 6 à 10 semaines post fécondation du développement de la voûte crânienne), stade où les malformations crâniofaciales dommageables sont nulles ou très légères et ne sont pas susceptible d'induire de la souffrance. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion…) ou comportementaux (poisson amaigri, immobilité…) sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Les poissons dont le score dépasse les points limites définis dans le projet seront euthanasiés par surdosage de benzocaïne à une concentration dans l'eau de nage de 375mg/L pour une durée de 15 min. La mort des poissons est visualisable par la perte de flottaison qui suit une période d'anesthésie qui est observée en moins de 2 minutes. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un confocal de type spinning disk permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie qui sera réalisée dans une solution de benzocaïne tamponnée à 75mg/L. Lors de l'acquisition d'images ou de l'irradiation des poissons avec un laser UV, les poissons seront maintenus dans de l’hydrogel. Ce milieu aqueux permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations. Enfin des tests préalables seront réalisés pour réduire au maximum la dose et la durée d’exposition des poissons à des composés pharmacologiques.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette crâniofacial et de la voûte crânienne. La voûte crânienne présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires (ossification membranaire) et moléculaires (conservation des principales voies de signalisation régulant l'ostéogénèse) impliqués au cours de son développement. De plus l’accessibilité du crâne chez le poisson zèbre et l'existence de nombreuses lignées transgéniques permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. Enfin chez le poisson zèbre, Fgfr3 est conservé et exprimé fortement au cours de la formation de la voûte crânienne, contrairement à la souris. L’analyse du phénotype squelettique se fera du stade larvaire (5jpf ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 2 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois). Une grande partie des procédures seront réalisées entre 4 semaines et 8 semaines pendant la formation de la voûte crânienne.