Procédures modérées
Stimulation optogénétique transcrânienne des interneurones corticaux dans un modèle de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau puis l'implantation d'une micro-LED sur le crâne, avant des tests moteurs et des injections de L-dopa destinées à reproduire les mouvements anormaux des patients parkinsoniens. Le porteur indique que le modèle provoque hypoactivité, perte de poids et mouvements involontaires, qu'il décrit comme non douloureux. Il affirme qu'aucune simulation informatique ne reproduit la physiopathologie cérébrale et sa traduction comportementale.
Objectifs
Ce projet a pour but de tester le potentiel thérapeutique d'une méthode peu invasive de stimulation du cerveau dans la maladie de Parkinson. Le traitement symptomatique de la maladie de Parkinson repose sur la substitution de la dopamine manquante par la L-Dopa. Cependant, après plusieurs années sous L-Dopa, les patients développent des complications motrices : les dyskinésies (mouvements anormaux involontaires). Une alternative thérapeutique non médicamenteuse peut alors être proposée à certains patients: la stimulation cérébrale profonde à haute fréquence du noyau subthalamique (HFS-STN), un des noyaux des ganglions de la base. Il s’agit d’un traitement neurochirurgical symptomatique très efficace, mais qui présente l’inconvénient majeur d’être invasif et de ne profiter qu’à une minorité des patients du fait de critères d’éligibilité stricts (environ 10%). Certains types de neurones dans le cortex moteur sont activés par la HFS-STN, et la stimulation directe de ces neurones par la lumière (grâce à une fibre optique implantée dans le cerveau) dans des souris transgéniques parkinsoniennes permet de reproduire partiellement les effets bénéfiques de la HFS-STN sur les symptômes moteurs dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie thérapeutique moins invasive que la stimulation cérébrale profonde, donc pouvant potentiellement bénéficier à plus de patients. Dans cette étude, nous optimiserons cette voie thérapeutique chez des souris modèle de la maladie de Parkinson sur deux axes : 1) en mettant au point une méthode d'activation neurones moins invasive : illuminer à travers le crâne à la place d'insérer une fibre optique dans le cerveau 2) en comparant les effets de la stimulation sur de nouvelles localisations pour sélectionner celle qui induit les meilleurs effets bénéfiques sur les symptômes parkinsoniens.
Bénéfices attendus
Cette étude s'insère dans un projet plus large de mise au point de techniques alternatives à la stimulation cérébrale profonde dans la maladie de Parkinson. En effet cette technique est très invasive et ne peut donc bénéficier qu'à environ 10% des patients. Certains types de neurones du cortex moteur, activés par la stimulation cérébrale profonde, constituent des cibles thérapeutiques plus superficielles donc moins invasives. La stimulation par la lumière de ces neurones améliore les symptômes moteurs dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la souris, mais nécessite l'insertion d'une fibre optique dans le cerveau. Cette étude permettra de tester et mettre au point une méthode moins invasive de stimulation par la lumière des neurones du cortex : à travers le crâne intact.
Procédures
Les souris du lot de mise au point subiront 1 chirurgies d'injection cérébrale sous anesthésie générale de courte durée (
Impact sur les animaux
Les souris utilisées pour la mise au point technique et dans le groupe contrôle non parkinsonien n'auront que peu d'effets indésirables : en effet, les lignées transgéniques utilisées n'ont pas de phénotype dommageable, et toutes les mesures sont prises pour prendre en charge la douleur péri-opératoire. Pour les souris modèles de la maladie de Parkinson, nous nous attendons à diminution de l'activité et une perte de poids durant les deux premières semaines, pendant lesquelles elles bénéficieront d'un suivi renforcé pour minimiser au maximum les nuisances. Après stabilisation, ces souris présenteront également des modifications à long terme du comportement moteur (légère hypoactivité, asymétrie de l'usage des membres). Ces modifications sont inhérentes au modèle parkinsonien, et nécessaires pour tester les effets bénéfiques de la stimulation, et ne causent pas de douleur. Après induction des dyskinésies (mouvements anormaux involontaires), les souris présenteront temporairement après chaque injection des mouvements involontaires (rotations, posture tournée d'un côté, tics des pattes et tics faciaux). Là aussi ces nuisances sont non douloureuses et nécessaires pour pouvoir tester les effets bénéfiques de la stimulation dans les conditions les plus proches de celles vécues par les patients parkinsoniens.
Devenir
Il est nécessaire de mettre à mort les animaux dans toutes les procédures pour pouvoir effectuer une vérification histologique des aires corticales ciblées et du modèle parkinsonien.
Remplacement
Pour étudier le bénéfice des stimulations proposées sur les symptômes moteurs de la maladie de parkinson, il est nécessaire d'utiliser des animaux produisant un comportement moteur (et modèles de cette maladie). Aucune méthode de simulation informatique ne permet de récapituler la complexité de la physio-pathologie cérébrale, et encore moins sa traduction comportementale. Les structures cérébrales étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.
Réduction
Trois conditions sont testées sur les mêmes animaux (Parkinson, et 2 états dyskinétiques) pour réduire le nombre total d'animaux utilisés.
Raffinement
Toutes les mesures sont prises pour minimiser les nuisances subies par les souris: une anesthésie et analgésie appropriée lors des chirurgies, un suivi post-opératoire quotidien et adapté tout au long de l'utilisation des animaux, et renforcé dans le cas des modèles de la maladie de Parkinson (maintien au chaud, nourriture appétante et hypercalorique, surveillance et maintien de l'hydratation, analgésique selon nécessité), pendant tout le temps nécessaire à la stabilisation (en général 2 semaines). Les souris sont hébergées dans une animalerie agréée et disposent de matériel d'enrichissement (coton pour faire des nids, petites maisons ou tubes pour se cacher).
Choix des espèces
Il est nécéssaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures étudiées ne sont pas présentes, ou sont organisées différement chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, nous utilisons le modèle souris qui permet l'utilisation de lignées transgéniques nécessaires à cette étude. adulte : il est nécessaire d'étudier l'effet de la stimulation cérébrale sur un animal dont le cerveau est complètement développé
Etudes d’innocuité d’un médicament destiné au chat
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
225 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart (215) tués et un petit nombre réutilisés ou adoptés. Ils reçoivent des administrations répétées d'un vaccin, des prélèvements de sang et des écouvillons, et sont euthanasiés quand un prélèvement terminal ou une nécropsie est requis. Le porteur présente ces tests comme une exigence réglementaire d'évaluation de l'innocuité sur l'espèce cible. Il affirme que les essais in vitro ne peuvent pas se substituer aux études sur l'animal vivant.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’innocuité d’un vaccin sur le chat ainsi que sur son environnement (animaux en contact, environnement, humains).
Bénéfices attendus
Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européenne 2010/63/UE, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH, EMEA) et d’autres exigences spécifiques à chaque pays. Ces études permettent in fine d’assurer le soin des animaux avec des vaccins présentant un risque minimal. Elles permettent également aux propriétaires de disposer des meilleurs traitements pour leurs animaux.
Procédures
Administrations de produit : 1 à 4 administrations sur une durée de 2 à 16 semaines. Cet acte peut être effectué sous anesthésie selon la sensibilité de l'animal. L'acte technique a une durée de 1 à 2 minutes. Prélèvements sanguins : 1 à 10 prélèvements sur la durée de l'étude. L'acte a une durée de 1 à 2 minutes. Des écouvillons (conjonctival ou pharyngé ou salivaire, nasal ou rectal) peuvent être effectués en fonction de l'objectif de l'étude. 0 à 10 écouvillons sur la durée de l'étude. Cet acte technique est inférieur à 1 minutes
Impact sur les animaux
La contention peut être une contrainte pour l'animal. Celle-ci doit être adaptée pour que la technique soit la plus rapide, moins douloureuse et moins traumatisante. La répétition des administrations et des prélèvements sur le long terme peut occasionner une douleur de quelques minutes.
Devenir
Les animaux, sur lesquels un prélèvement sanguin terminal ou une biopsie post-mortem du site d’injection ou une nécropsie est requis(e), sont euthanasiés. Les animaux dont les points limites sont atteints sont euthanasiés pour raison éthiques. En fonction des études antérieures et si leur statut le permet, les animaux peuvent être utilisés dans d’autres projets. En fonction du produit administré et de l’état de l’animal et si les circonstances le permettent (acquéreur sérieux, bonnes conditions d’accueil après examen du candidat par la SBEA), les chats peuvent être adoptés. La réutilisation et l'adoption de l’animal est de la responsabilité du vétérinaire désigné qui évalue le bien-être des animaux à la fin de la procédure expérimentale.
Remplacement
Il est nécessaire d’utiliser des animaux vivants car l’innocuité doit être réalisée sur l’animal. La diffusibilité, la persistance et l’intégration de l’agent vaccinal doivent être réalisées dans l’organisme cible pour que les conclusions soient valides. Il s’agit d’exigences réglementaires. Les essais in vitro et in vivo sur des espèces alternatives permettent d’obtenir des informations complémentaires et prédictives, mais ne peuvent se substituer à des études in vivo sur l’espèce cible. De plus, les procédures expérimentales sur l’espèce cible ne disposent pas toute d’un modèle in vitro ou in vivo sur espèces alternatives. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à inclure est très souvent une exigence réglementaire. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste (analyse statistique, historique, définition des objectifs…) de façon à limiter les études non conclusives. Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour chaque étude une période d'acclimatation systématique des animaux est prévue dans le but de limiter leur stress et de stabiliser leur état physiologique. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Une anesthésie de l’animal peut être envisagée lors de certains actes, ainsi qu’une alternance des zones ou site de prélèvements lorsque cela est possible. Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans la majorité des cas, les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur l’espèce cible est une exigence règlementaire. Le chat est l’espèce cible pour le produit testé. Les chats utilisés ont entre 8 et 104 semaines. L’âge dépend des besoins pour les études d’innocuité et de diffusibilité qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répond à l’exigence expérimentale d’utilisation du vaccin mis sur le marché et des exigences des autorités.
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’AVC hémorragique intracérébrale chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
605 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la tête leur injecte de la collagénase pour provoquer une hémorragie cérébrale, suivie d'IRM, de tests de score neurologique et de force d'agrippement, puis d'une perfusion intracardiaque létale pour prélever le cerveau. Le porteur indique que le modèle peut entraîner des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire, une désorientation et une perte de poids. Il précise que le projet fait l'objet de financements industriels et affirme qu'aucune méthode alternative n'apporterait le même niveau d'information.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester cinq stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’hémorragie : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos cinq stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC hémorragique chez le rat par gavage (per-os), par administration intrapéritonéale (i.p) ou bien par injection directe sur le site hémorragique pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique.
Bénéfices attendus
Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la réduction du déficit sensorimoteur, limiter la lésion ainsi que l’inflammation causé par un saignement cérébral. Chez l’homme, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS), non traumatique, résulte d’une irruption importante de sang dans le parenchyme cérébral, suite à une rupture de micro-vaisseaux. Cette étude pourra mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques dans la lutte contre ce type d’AVC hémorragiques, n’ayant aujourd’hui aucun traitement de référence permettant de réduire les effets délétères d’un hématome sur le parenchyme cérébral.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le cerveau. Cet act chirugical durera 15 minutes. Pour les groupes traités par injection directement sur le site hemorragique, une seconde pipette sera insérée au même endroit ou la collagénase a été injectée, 20 minutes post-AVC. Cet acte durera 6 minutes. A J+1 et J+14, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post hémorragie. La mesure du score neurologique durera 10 minutes. En prenant compte des temps de récupération, la mesure de la force d’agrippement durera entre 25 et 30 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. L'hémorragie cérébrale provoque une désorientation au moment du réveil post-chirurgical. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l'hémorragie. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Lors de l'administration des traitements par voie intrapéritonéale, la contention et l'injection peuvent engendrer un stress et une douleur. Un acte rapide réalisé avec du matériel adéquat par du personnel compétent limite drastiquement cette douleur et le traumatisme provoqué.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 10%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront en groupes sociaux avec un ou plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et buchette en bois), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi biquotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. L'expérimentateur ou l'animalier pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5°C grâce à un système de couverture chauffante, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, puis à une désinfection à la Chlorexidine et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intracérébrale. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids de 300g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’hémorragie.
Caractérisation de la prolifération de tumeurs primaires de prostate
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
216 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à neuf injections dans l'abdomen puis développent un cancer de la prostate avant d'être disséquées pour étude de la prostate. Le porteur présente l'étude comme un projet pilote destiné surtout à mettre au point le protocole expérimental. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité des lésions précancéreuses.
Objectifs
Afin de mieux comprendre l’évolution des cancers de la prostate (CaP), ce projet pilote ,utilisant des lignées de souris génétiquement modifiées, vise à déterminer le protocole expérimental pour identifier les populations cellulaires qui prolifèrent dans les lésions précancéreuses présentant des mutations et une cinétique similaires que celles trouvées chez l’Homme.
Bénéfices attendus
ce projet pilote déterminera le protocole expérimental permettant d'identifier les populations cellulaires qui prolifèrent dans les lésions précancéreuses.
Procédures
Les souris subiront au maximum 9 injections intra-péritonéales espacées de 1 à 10 mois, soit 1 injection quotidienne en intra-péritonéales pendant 5 jours de tamoxifène dans un premier temps, et 1 injection quotidienne d'EdU pendant 4 jours au temps de cinétique choisi. Aucune autre intervention n'est prévue.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques injectées développeront des cellules tumorales qui évolueront en cancer de la prostate (CaP). De plus, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (pas de zone rouge autour de la zone ou de présence de pus).
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure 1 et 2 afin d'être disséqués pour l'étude de la prostate.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de différencier les rôles de différentes molécules pouvant être impliquées dans le développement du CaP, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 2 lignées de souris différentes soit 216 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions statistiquement significatives. Par ailleurs, des études préliminaires in vitro et des études pilotes pour identifier le protocole efficace ont été réalisées afin d’éliminer certaines hypothèses et de mieux définir les expériences à effectuer sur les modèles in vivo.
Raffinement
Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé, est inactif après stimulation, ou si les points d'injections présentent des signes d'infection ou d'inflammation il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave (blessure importante par exemple), l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes, de 8 semaines à plus d'un an afin de faire une cinétique en fonction de l'âge.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
16 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux puis des injections quotidiennes d'immunosuppresseurs pouvant s'étaler sur seize semaines, avec des prélèvements de sang répétés, l'immunosuppression pouvant provoquer des infections opportunistes et une perte de poids. Ce criblage sert à préparer une thérapie génique destinée à des enfants atteints d'une maladie osseuse rare. Le porteur décrit la souris comme une "espèce inférieure" servant à trier vecteurs et traitements avant des essais sur primates, qu'il présente comme le "modèle de prédilection".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large qui inclut un projet déjà en cours dans le même établissement utilisateur. L’objectif du programme est de développer des traitements pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente. La SEDc est une dysplasie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée phénotypiquement par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de la rétine et d’une perte d'audition. Cette pathologie est due à des mutations perte de fonction dans le gène du collagène de type 2. L’objectif de ce projet est d’identifier un traitement immunosuppresseur pouvant être utilisé en combinaison avec un traitement de thérapie génique pour différents types de dysplasies squelettiques. Les traitements de thérapie génique basés sur l’utilisation de vecteurs viraux peuvent induire des réponses immunitaires pouvant réduire l’efficacité du traitement (diminution du niveau d’expression du gène d’intérêt ou élimination des cellules transduites) et empêcher la ré-administration efficace de ce dernier (réponse mémoire dirigée contre le vecteur viral). Il est donc nécessaire d’inhiber de façon transitoire les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à la fois d’identifier la ou les constructions de vecteurs viraux les moins immunogènes, et la stratégie d’immunosuppression la plus efficace entrainant le moins de complications. Ces résultats, combinés à ceux d’un autre projet en cours permettront d’identifier, chez la souris, la combinaison vecteur viral / immunosuppression la plus efficace et la moins toxique. Ces étapes de pré-sélection chez la souris permettront de diminuer le nombre de sujets dans les futures études sur animaux supérieurs (type primates) aux caractéristiques plus proches de celles de l’Homme. Le bénéfice final du projet est de développer des traitements (combinaison thérapie génique / Immunosuppression) pour différents types de dysplasies du squelette, notamment la dysplasie spondyloépiphysaire congénitale (SEDc), la collagénopathie de type 2 la plus fréquente.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou deux injections de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, et de multiples injections d’immunosuppresseurs par voie intrapéritonéale. Ces dernières se feront sur une durée maximum de 16 semaines (injections IP quotidiennes sur un maximum de 21 jours consécutifs ou injections hebdomadaires sur un maximum de 16 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements répétés de sang (toutes les semaines, ou toutes les deux semaines sur une durée maximale de 16 semaines) dans la mesure du possible (effectués sur des animaux d’un mois minimum). Ces prélèvements s’effectueront sous anesthésie au niveau de la veine mandibullaire en alternant chaque côté. Des prélèvements de sang terminaux seront également effectués sous anesthésie sur tous les animaux par la voie rétro-orbitale.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection de vecteurs viraux (résultats obtenus dans le cadre d’un précédent projet). Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. En cas d’infection, les souris pourraient être sujettes à des pertes de poids ou des signes d’inactivité.
Devenir
Toutes les souris utilisées au sein de ce projet seront mises à mort par dislocation cervicale, asphyxie au CO2 ou injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital sodique (de type Euthasol 140 mg/kg ou Euthoxin 500 mg/kg). La mise à mort est nécessaire afin de récupérer un ensemble d’organes (rate, foie, moelle osseuse, plaques de croissance…) pour évaluer à la fois la biodistribution des vecteurs viraux testés, mais aussi l’effet du traitement (vecteur viral et immunosuppresseur) sur la réponse immunitaire cellulaire.
Remplacement
Globalement, la construction des vecteurs viraux et l’optimisation de ces derniers se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Les différents vecteurs viraux produits sont précédemment testés in vitro afin de valider leur capacité à transduire efficacement des cellules modèle (HEK293). Si la transduction n’est pas efficace, le vecteur ne sera pas sélectionné pour les études in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier des traitements immunosuppresseurs d’intérêt, d’autant plus sachant que la patientèle sera constituée en totalité d’enfants. Il est très difficile de valider une stratégie d’immunosuppression par des tests in vitro sachant que cela nécessite la présence d’un système immunitaire complet et fonctionnel. Certains immunosuppresseurs seront tout de même évalués à l’aide des tests in vitro mentionnés précédemment afin de confirmer qu’ils n’impactent pas la capacité des vecteurs à transduire efficacement les cellules modèles.
Réduction
Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 8 animaux par groupe sera suffisant pour comparer de manière significative les niveaux d’anticorps et les réponses cellulaire induites. En effet, l’utilisation d’outils statistiques (calcul de puissance de test et de taille d’échantillons, https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#) permet de définir un nombre minimal d’animaux de 8 par groupe, en considérant un seuil de significativité (p
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage et par sexe dans une pièce à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage sera soumise à un enrichissement du milieu de type tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Les souris sous immunosuppresseurs présenteront un système immunitaire éteint. Elles seront ainsi plus sujettes à des infections opportunistes et aux complications qui pourraient en découler. L’hébergement des animaux en zone SPF (Specific Pathogen Free) dans des cages ventilées, l’utilisation de hottes de change, ou de hotte à flux laminaire pour les expérimentations, et l’apport d’aliments irradiés, permettront de réduire ces risques au minimum. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima deux fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée (observation et pesée quotidienne) et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude et/ou d’un vétérinaire
Choix des espèces
Afin d’identifier une combinaison vecteur / immunosuppression applicable en clinique chez l’homme, il est important de la valider au préalable au sein d’un modèle animal. En effet le système immunitaire fonctionne au travers de mécanismes complexes qu’il est impossible de reproduire fidèlement en dehors d’un organisme vivant. Les primates non humains représentent le modèle de prédilection de par son anatomie proche de celle de l’Homme. Il est cependant impossible de cribler autant de paramètres différents (vecteur, dose, immunosuppresseur, dose, fréquence) chez cette espèce. Nous allons avoir besoin d’une espèce inférieure, i.e. la souris, pour cribler les vecteurs mais aussi les traitements immunosuppresseurs pertinents. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles (1 à 22 jours). Les études qui consistent à évaluer la cinétique de la réponse immunitaire (Procédure n°1), cribler les différents traitements immunosuppresseurs (Procédure n°2) et évaluer l’efficacité d’une seconde injection de vecteur viral (Procédure 3) seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 5 à 8 semaines. Étant donné que les destinataires finaux du traitement seront des enfants, l’efficacité du traitement combinatoire thérapie génique + Immunosuppresseur devra être confirmé chez un modèle de souris d’âge similaire, soit des souris juvéniles avec des traitements allant de la naissance jusqu’à un âge de 4 mois maximum (procédures n°4 et 5).
Dermatologie
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 1000
Cochons : 100
2 600 cochons, souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, une partie des rongeurs (800) étant réutilisée et le reste tué. Ils subissent l'induction de maladies de peau comme le psoriasis, des biopsies cutanées et des évaluations de grattage sous anesthésies répétées, l'isolement prolongé classant certaines procédures en sévères. Le porteur indique que l'ingestion d'imiquimod par toilettage peut provoquer chez la souris une perte de poids, une déshydratation et une hypothermie. Sur le remplacement, il affirme que les tests in silico ou in vitro ne peuvent pas suppléer le modèle animal faute d'un environnement biologique intact.
Objectifs
Les origines des pathologies de la peau sont souvent multifactorielles. Le psoriasis, par exemple, est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui touche 1 à 3% de la population mondiale et pour laquelle il existe souvent une prédisposition familiale héréditaire (30 % des cas). Un dérèglement du système immunitaire est aussi incriminé. De plus, des facteurs extérieurs, comme le stress, la fatigue, les infections, certains médicaments par exemple, peuvent favoriser la survenue de poussées de psoriasis. Le psoriasis ou l’hypersensibilité de contact, tout comme un grand nombre de pathologies de la peau sont souvent associés à des démangeaisons qui entrainent un besoin incontrôlable de se gratter. Le prurit peut aussi survenir sur une peau saine, sans raison apparente. Les causes des démangeaisons sont très variées : éruptions cutanées, peau sèche, piqûres, réactions allergiques, maladies affectant le système nerveux ou d’autres organes. Quel que soit la ou les causes, le fait de se gratter n’améliore pas la situation, au contraire, il contribue à son aggravation. Le projet concerne des tests d'évaluation de réactions ou d'affections cutanées chez le rongeur et le porc, de comportements de grattage chez le rongeur et de cicatrisation chez le rongeur. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments à lutter contre certaines affections cutanées (psoriasis, allergie, dermatite atopique, démangeaisons) ou à améliorer la cicatrisation.
Bénéfices attendus
Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter contre certaines affections cutanées (psoriasis, allergie, dermatite atopique, démangeaisons) ou à améliorer la cicatrisation. Par exemple, même si les corticoïdes, appliqués par voie topique ou orale, sont fréquemment utilisés pour traiter de nombreuses affections cutanées, ces derniers ne restaurent pas la barrière que constitue l’épiderme. Leur utilisation est de plus fréquemment accompagnée d’une immunosuppression, ce qui a pour conséquence de prolonger leur utilisation à des doses fortes entrainant ainsi de nombreux effets secondaires (atrophie de la peau, augmentation du risque d’infection). Pour ces raisons, de nouveaux traitements, sans effets secondaires majeurs, sont en développement.
Procédures
Dans la procédure d'évaluation de grattage, les rats et les souris sont rasés (sous anesthésie gazeuse). A la fin de la procédure (évaluation du grattage), des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans la procédure d’évaluation de la cicatrisation chez la souris, les souris sont rasées (sous anesthésie gazeuse) et une exérèse de la peau est réalisée (sous anesthésie gazeuse et sous traitement analgésique) à l’aide d’un punch à biopsie (2 biopsies d’un diamètre de 5 mm). Pour évaluer l’évolution de la cicatrisation (et appliquer les traitements topiques le cas échéant) les souris sont légèrement anesthésiées (anesthésie gazeuse) de façon régulière pendant 3 semaines maximum (généralement 1 fois maximum par jour). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans les autres procédures chez le rongeur (rat et souris), les animaux sont anesthésiés (anesthésie gazeuse) et rasés/épilée (zones à traiter). Pour évaluer l’évolution des lésions cutanées et appliquer les traitements topiques, les animaux souris sont légèrement anesthésiées (anesthésie gazeuse) de façon régulière sur une période pouvant aller d’une à trois semaines maximum selon la procédure (généralement 1 fois maximum par jour, sauf 2 fois par jour pour le modèle de sécheresse de la peau). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans la procédure chez le porc, les animaux sont placés sous sédation légère (injection de tranquillisants) pour la phase dite de sensibilisation, la phase dite de challenge, pour l’application des traitements topiques et pour les prélèvements sanguins (le cas échéant). Cette tranquillisation est réalisé en plusieurs occasions sur une période généralement de 9 jours maximum (généralement 1 fois maximum par jour). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires.
Impact sur les animaux
Pour les procédures chez le rongeur, les animaux peuvent être isolés pendant plusieurs jours. Cet isolement est nécessaire pour éviter les morsures/griffures occasionnées par les congénères qui pourraient introduire un biais dans l'évolution et donc l'évaluation des lésions (aggravation des symptômes). De plus, l’isolement permet aussi d’éviter l’ingestion inter-individuelle des traitements appliqués de façon topique (traitements sous forme de pommade, de crème,…). Dans la procédure d'induction de psoriasis chez le rongeur, l’ingestion possible de l’imiquimode (par le toilettage) peut induire une toxicité (observée plus particulièrement chez la souris) dont la conséquence est une perte de poids (et éventuellement une déshydratation et une hypothermie). Pour les procédures chez le rongeur (sauf modèle de grattage et modèle de sécheresse de la peau), même si cela demeure extrêmement rare, une attention particulière sera apportée à l’apparition de lésions ulcératives et/ou infectées, ainsi qu'à l’infection/surinfection de la plaie induite par la biopsie (modèle de cicatrisation uniquement). Pour la procédure chez le porc, une contention est nécesaire pour appliquer les traitements. Pour minimiser le stress de cette contention, les aniamux sont placés sous sédatif
Devenir
A l'issue la procédure d'évaluation de grattage, les rats et les souris peuvent être réutilisés s'ils n'ont pas été soumis à un prélèvement terminal et s'ils n'ont pas reçu de substances dont les effets à long terme ne sont pas connus. Les autres procédures chez le rats et la souris sont classées sévères (du fait de la durée d'isolement des animaux). Ils sont euthanasiés à l'issue de la procédure. De plus, des prélèvements terminaux (ex: peau et/ou sang) sont souvent réalisés pour analyse à la fin de la procédure. Ils sont euthanasiés à l'issue de la procédure. De plus l'évolution corporelle importante du porc ne permet pas sa réutilisation dans une nouvelle procédure.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement positif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 8-10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux..
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure), jouets (porcs). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres physiologiques des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux étant largement décrits chez le rat et la souris. L’utilisation du porc voit également son intérêt de par les caractéristiques de sa peau qui sont proches de celle de l’Homme. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique (Avci et al., 2013, Expert Opin Drug Discov. 8(3): 331-355). Principalement porcs sevrés, âge minimum de 4 semaines, conformément aux données historiques (manipulation encore aisée à cet age) et à la bibliographie scientifique (Mollison et al., 1998, Current Pharmaceutical Design. 4: 367-379).
Système hépatique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2400
4 800 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils servent à provoquer des atteintes du foie pour tester des médicaments, l'un des modèles imposant chez le rat une chirurgie de ligature du canal biliaire suivie d'une jaunisse, d'une ascite et d'une perte d'appétit. Le porteur indique que le stade de coma hépatique n'est pas atteint car les animaux sont tués avant, et que le prélèvement du foie ne permet pas leur maintien en vie. Sur le remplacement, il affirme que les cultures d'hépatocytes ne peuvent pas suppléer le modèle animal, faute de reproduire un environnement biologique et immunologique intact.
Objectifs
La stéatose hépatique non alcoolique (NASH) représente la première cause d’hépatopathie chronique dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par un dépôt excessif de lipides dans le foie (stéatose), d’une inflammation et d’une nécrose hépato-cellulaire pouvant évoluer vers la cirrhose. L’hépato-toxicité liée aux médicaments, aux plantes médicinales ou aux agents chimiques est un problème de santé publique. Le foie joue un rôle essentiel dans la transformation et l'élimination des médicaments. Mais lorsque la quantité ou la puissance du toxique dépassent les capacités métaboliques du foie, il peut se produire une destruction de cellules hépatiques: c'est l'hépatite toxique. La toxicité hépatique des médicaments est l’une des principales causes d’arrêt dans le développement de substances ou de retrait de médicaments. Par exemple, le paracétamol (antalgique et antipyrétique de référence) est l'un des médicaments les plus utilisés et est considéré comme une substance d'utilisation sûre, du moins à doses thérapeutiques. Toutefois, le potentiel hépatotoxique du paracétamol en cas de surdosage, accidentel ou plus souvent à visée suicidaire, est néanmoins connu de longue date. L’exposition à des produits chimiques est également un problème croissant dans les sociétés industrielles. Le risque est plus difficile à apprécier que pour les médicaments car il n’existe pas de réseaux spécifiques centralisant les effets secondaires rapportés par des cliniciens. De plus, les effets à long terme à des expositions intermittentes à doses variables, susceptibles de produire des maladies chroniques du foie et des cancers, restent peu connus. Parmi les agents chimiques identifiés, on retrouve le tétrachlorure de carbone (CCl4). L’hépatite auto-immune est une maladie d’étiologie inconnue, qui progresse spontanément vers la cirrhose et l’insuffisance hépatique. Certains modèles murins d’hépatite auto-immune sont induits par des produits chimiques tels que la concanavaline A. Enfin, l'obstruction des voie biliaires (cholestase), dont l'origine peut être diverse, entraine également des nombreuses complications. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments (par la réduction de l'hépatite, du NASH) ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes une hépatotoxicité.
Bénéfices attendus
Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter l'hépatotoxicité chronique (NASH) ou aigüe (intoxication, cholestase). Par exemple, il n’existe pas, pour l’instant, de traitements médicamenteux établis pour traiter le NASH et le risque associé de développer d’autres affections du syndrome métabolique (par exemple augmentation du risque de développer un diabète) Jusqu’à présent, le traitement reste basé sur le contrôle de chacun des facteurs de risque métabolique (limiter le surpoids par le régime et l'exercice physique et/ou combattre l'insulino-résistance par la prescription de médicaments qui améliorent la sensibilité des tissus périphériques à l'insuline).
Procédures
Dans les procédures chez la souris (modèles d'hépatotoxicité aigüe et NASH), un prélèvement sanguin terminal (euthanasie sans réveil) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane est réalisé. Dans les procédures chez le rat (modèles d'hépatotoxicité aigüe, NASH et cholestase), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane est réalisé (juste avant l'euthanasie). Selon les besoins de l'étude (et plus particulièrement pour les procédures NASH et cholestates, des prélèvements sanguins supplémentaires (fréquence à adapter en fonction des besoins de l'étude) peuvent être réalisés (sous anesthésie avec retour à l'état conscient). Dans le cas des prélèvements intérmédiaires, le volume prélevé sur chaque animal sera inférieur ou égal à 15% de sa volémie et ne pourra être répété que toutes les 2 semaines au minimum. Dans la procédure cholestase, une phase de chirurgie est nécesaire. Les rats sont anesthésiés (anesthésie gazeuse isoflurane) et reçoivent une administration d'un anti-inflammatoire non stéroïdien. Une laparotomie médiane est pratiquée en condition d'asepsie. Le canal biliaire est répéré, liguaré puis sectionné (entre 2 ligatures). Les plans musculaires et cutanés sont suturés et l'animal est placé près d'un dispositif chauffant jusqu'au réveil. Pendant la phase de récuprération post-chirurgicale, les animaux recoivent un traitement antibiotique et de nouvelles administrations de l'anti-inflammatoire non stéroïdien. NB: un groupe d'animaux subit la même procédure (anesthésie, laparotomie...) à l'exception de la ligature/section du canal biliaire. Les animaux de ce groupe (groupe Sham) servent de contrôle.
Impact sur les animaux
A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Dans ce type de procédures, il est attendu une hépatotoxicité aigüe (intoxication, cholestase) ou chronique (NASH). Dans les modèles aigüs d'intoxication, une perte d'appétit et de poids peut être observées sur la durée de l'évaluation (généralement dans les premières 24 heures). Dans le modèle de cholestase (ligature du canal biliaire), les animaux doivent être hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (quelques jours). Après la ligature du canal biliaire, une jaunisse apparait progressivement. Elle peut être accompagnée par de l'ascite (à un stade plus tardif, environ 4 semaines) et une diminution de d'appétit. Le stade d'encéphalopathie hépatique (et de coma), observé chez l'homme à un stade terminal, n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). Dans le modèle du NASH, il n'est pas attendu de nuisances ou d'effets indésirables sur les animaux.
Devenir
Chez la souris (procédures 1 à 4), le volume du prélèvement sanguin terminal et le prélèvement du foie (pour analyses, procédure 4) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie. Chez le rat (procédures 4 et 5), le prélèvement du foie (pour analyses) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie. Chez le rat (procédures 1 et 2), l'éventuelle toxicité long terme de la substance d'induction et l'eventuel prélèvement du foie (pour analyses) ne permettent pas le réveil et le maintien en vie.
Remplacement
En amont des tests in vivo sur les modèles d’hépatotoxicité aigue (acétaminophène, CCl4 ou concanavaline A), des tests in vitro (culture d'hépatocytes) peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (comme par exemple les tests de viabilité cellulaire), les hétatocytes en culture ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, et chez le rat uniquement, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système hépatique du rat et de la souris dans les modèles décrits, sont prédictifs de leur efficacité en clinique. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.
Étude de l’interaction nerfs – tumeur au cours du développement du cancer de la glande mammaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe d'un million de cellules tumorales dans la glande mammaire sous anesthésie, puis est tuée par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque entre 3 et 28 jours plus tard, pour étudier l'influence des fibres nerveuses sur le cancer du sein. Le porteur indique que les cellules mises en co-culture avec des neurones peuvent donner des tumeurs plus volumineuses voire des métastases. Sur le remplacement, il décrit un test de co-culture in vitro déjà mis au point mais affirme qu'il ne reproduit pas la complexité de l'organe, d'où le recours aux souris.
Objectifs
Les cancers du sein sont la première cause de décès liés au cancer dans le monde occidental chez la femme. Dans ce cancer l'environnement autour des cellules cancéreuses joue un rôle crucial. Récemment, un nouvel élémentde cet environnement tumoral a été identifié : les prolongements des neurones (axones) du système nerveux périphérique. S’il est maintenant clairement établi que certaines cellules de l'environnement tumoral influencent la progressiondu cancer, le rôle des cellules nerveuses et notamment des fibres nerveuses infiltrant les tumeurs reste mal compris. Nous proposons donc d’étudier l’influence du système nerveux dans le développement des cancers du sein. Ainsi, le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle de l’innervation au sein des tumeurs mammaires et de caractériser les interactions entre les projections nerveuses et les cellules tumorales. Nos données in vitro ont montré que les cellules cancéreuses de cancer du sein de souris co-cultivées avec des neurones étaient capables de proliférer plus rapidement que les cellules cancéreuses cultivées seules. Nous souhaitons donc à travers ce projet valider ce résultat chez la souris. Dans un premier temps, nous étudierons le développement tumoral d’une implantation dans la glande mammaire de cellules cancéreuses de souris ayant été au préalable en co-culture pendant 6 jours avec des neurones. Nous utiliserons comme contrôle des cellules tumorales ayant été en culture seules 6 jours avant implantation. Afin d’étudier la cinétique du développement tumoral, nous procéderons à des euthanasies au bout de 3, 7, 14 et 28 jours (ou atteinte d’un point limite). Pour finir, dans une deuxième et dernière procédure, nous souhaitons vérifier que le caractère pro-tumoral des cellules cancéreuses est bien dû à la présence des neurones. Pour cela, nous induirons une mort des neurones en traitant nos cellules avec une drogue en co-culture avant l’implantation dans la glande mammaire. Nous utiliserons comme contrôle des cellules cancéreuses ayant été en culture seules 6 jours avant implantation et traitées avec la drogue induisant la mort neuronale. Afin d’étudier la cinétique du développement tumoral, nous procéderons à des euthanasies au bout de 3, 7, 14 et 28 jours (ou atteinte d’un point limite).
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va donc identifier de nouvelles interactions entre les neurones et les cellules cancéreuses applicables dans la lutte contre les cancers. A ce jour, les thérapies couramment utilisées en clinique ciblent principalement les cellules tumorales (chimiothérapie) et, plus récemment, le microenvironnement tumoral en visant les vaisseaux sanguins de la tumeur. L’identification des mécanismes à l’origine du dialogue entre les neurones et les cellules cancéreuses sera une avancée majeure pour le traitement des cancers et pourra déboucher vers de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de lutter contre le développement de la tumeur primaire mais aussi des métastases.
Procédures
Les souris reçoivent une injection de 1 000 000 de cellules tumorales implantées avec une seringue à insuline (29 G) au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 2-3 minutes, temps nécessaire à l’injection des cellules dans la glande mammaire).
Impact sur les animaux
La lignée de cellules cancéreuses utilisée est issue d’un carcinome mammaire spontané apparu chez la souris femelle, et est décrite comme peu agressive et non métastatique. En effet, ces cellules ne sont pas capables de sortir du site d’injection primaire et le volume tumoral moyen à 28 jours n’excède pas 1cm3. Aucune métastase n’est donc détectée dans les poumons, le foie et les ganglions lymphatiques 7 semaines après implantation. Dans nos procédures, nous nous limiterons à 28 jours post implantation afin de limiter au maximum la souffrance animale. Cependant, nos données in vitro montrent que la co-culture de ces cellules avec des neurones sympathiques augmente les capacités oncogéniques des cellules tumorales. Il est donc possible que les cellules cancéreuses ayant été en co-culture soient plus agressives et donnent donc des tumeurs plus volumineuses ainsi que des métastases. Dans nos procédures, nous utiliserons une fiche de score adaptée et nous nous limiterons à 28 jours post implantation afin de limiter au maximum la souffrance animale.
Devenir
Dans l’ensemble des procédures, les euthanasies seront réalisées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. En effet, nous procéderons à une euthanasie par dislocation cervicale dans un premier temps car nous souhaitons effectuer des tests de prolifération et d’invasion in vitro ainsi que des coupes fines du tissu avec des marqueurs spécifiques afin de visualiser la tumeur ou les métastases possibles sur le foie et les poumons. Ces expérimentations sont toutes compatibles avec une euthanasie par dislocation cervicale. Dans un deuxième temps, nous souhaitons réaliser une description plus précise des phénomènes observés lors de notre étude, nous devons donc travailler sur des tissus dont la structure morphologique et l’organisation cellulaire sont parfaitement conservées. Pour cela, une perfusion intracardiaque sous anesthésiant est préconisée suivie d’une exsanguination induisant la mort de l’animal. La technique de perfusion intracardiaque est détaillée dans chacune des procédures. Pour les animaux ayant ateint un point limite, l'euthanasie se fera par dislocation cervicale.
Remplacement
Nous avons mis au point un essai in vitro de co-culture de cellules cancéreuses et de neurones qui permet de récapituler le mieux possible les interactions entre neurones et cellules cancéreuses. Nous avons observé que la croissance des fibres nerveuses déclenche une augmentation de l'invasion et de la prolifération des cellules cancéreuses. Même si nous avons exploité au maximum les données in vitro, nos co-cultures ne récapitulent pas la complexité́ de l’organe. En effet, une tumeur se développe par l’interaction des cellules cancéreuses avec leur environnement tumoral très complexe constitué de cellules immunitaires, de vaisseaux sanguins, de fibroblastes ect… La culture in vitro des cellules tumorales avec uniquement un seul constituant du microenvironnement tumoral (ici, les neurones) ne reproduit donc en aucun cas un développement tumoral physiologique d’où notre recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est choisi afin d’obtenir une taille d’effet d’intérêt avec un nombre de souris minimum. Le nombre de souris se justifie par la taille moyenne des tumeurs 28 jours après implantation des cellules tumorales.
Raffinement
Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme ,4/cages, avec une alternation jour/nuit de 12h, eau et nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (maisonnette en carton, carrés de coton). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d’acclimatation suite à la livraison des souris sera de 5 jours, à la fin de laquelle les souris recevront les cellules tumorales. L’injection des cellules tumorales est réalisée sous anesthésie générale. Le suivi sera effectué 3 fois par semaine et évalué via la grille de score associés à des critères de mal-être . Un score cumulé limite entrainera la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des fibres nerveuses dans le développement tumoral du cancer du sein. Dans cette optique, nous souhaitons utiliser le modèle d’implantation de cellules tumorales dans la glande mammaire. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Ce modèle est un outil puissant et couramment utilisé dans l’étude des cancers du sein. Les implantations de cellules tumorales seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines, âge auquel la glande mammaire est mature/formée. Dans les nos 2 procédures les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 3, 7, 14 et 28 jours après implantation des tumeurs. En effet, afin d’étudier le comportement des cellules tumorales co-cultivées avec les neurones, il est nécessaire de regarder à différents temps du développement tumoral. Ainsi nous pourrons mieux comprendre comment les cellules tumorales deviennent plus agressives lorsqu’elles sont en contact avec les neurones et déceler des mécanismes qui s’opèrent au début du développement.
Etude d’immunogénicité, protection et suivi en stabilité d’un vaccin universel contre la grippe chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent deux injections dans la patte sans anesthésie, et 30 % d'entre elles sont infectées par la grippe par voie nasale sous anesthésie, l'infection pouvant provoquer une perte de poids, les souris atteignant -20 % de leur poids étant alors mises à mort. Le projet vise à tester un candidat-vaccin ciblant la nucléoprotéine du virus et à contrôler des lots destinés au marché humain. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro ne peut reproduire la réponse immunitaire et que le modèle souris est imposé par les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aiguëe, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux qui circulent dans toutes les régions du monde. On estime à un milliard le nombre de cas, à 3-5 millions le nombre de cas graves et entre 290 000-650 000 le nombre de décès liés à la grippe dans le monde. Des pandémies de grippe surviennent occasionnellement en plus de la grippe saisonnière annuelle, avec un impact sanitaire et économique considérable. La vaccination est la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle fonctionne en induisant des anticorps spécifiques à la souche de grippe circulante, visant à cibler les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins sont partiellement efficaces : 32% pour les personne âgées et 43% sur les adultes en raison du fait que les souches virales en circulation mutent tous les ans. Pour pallier la mutation des protéines de surface, les vaccins sont reformulés chaque année. Cependant, le virus de la grippe possède également une protéine contenue à l’intérieur de l’enveloppe virale, la nucléoprotéine (NP), qui diffère peu d’une souche à l’autre, ce qui fait d’elle une cible pertinente pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. Ainsi un vaccin qui induit une réponse protectrice contre une protéine peu sujette aux mutations pourrait donc conférer une protection plus durable non seulement contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre une nouvelle pandémie et pourrait donc avoir améliorer l'efficacité du vaccin. Un candidat-vaccin, contenant la nucléoprotéine de la souche A de la grippe est capable d’induire une réponse immunitaire de type cellulaire permettant une protection contre différentes souches du virus de la grippe chez la souris. Ce projet a donc pour objectif d’améliorer les vaccins actuels contre la grippe, en ouvrant la voie vers le développement clinique d'un candidat-vaccin qui pourra être utilisé seul, avec un adjuvant ou en association avec les vaccins saisonniers actuellement sur le marché. Les lots de vaccins destinés aux études cliniques chez l’homme doivent subir des tests concernant leur efficacité et leur activité biologique chez la souris. Enfin il est nécessaire de procéder à des études de stabilité, afin de vérifier que le médicament expérimental sera stable pendant la période de stockage prévue de sa libération à son administration aux patients
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’améliorer l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et pandémiques actuels. Ce candidat-vaccin produira, en plus de la réponse humorale habituellement observée à la suite d’une vaccination contre la grippe saisonnière ordinaire, une forte réponse des cellules T ainsi qu’une protection de longue durée contre l’antigène le plus conservé de la grippe : la nucléoprotéine NP. Afin d’obtenir une autorisation d’essai clinique chez l’homme (Phase IIA, III), il est nécessaire de réunir suffisamment de données concernant l’efficacité et l’innocuité de ce candidat-vaccin in vivo. Une preuve de concept de l’efficacité et de l’innocuité du candidat-vaccin seul ou coadministré avec un vaccin saisonnier ou avec un adjuvant sera effectuée dans un modèle physiopathologique infectieux, c'est-à-dire après inoculation de la grippe. La production et le contrôle qualité des vaccins répondent à des normes très strictes (réglementation européenne et bonnes pratiques de fabrication) qui doivent être respectées pour la libération des lots de vaccin, la surveillance de sa sécurité et son contrôle pour une utilisation chez l’homme. Un test chez la souris, comme contrôle de l’activité biologique est imposé à la libération des lots, et également dans les études de stabilité réalisées suivant les ICH pour contrôler une potentielle évolution des vaccins au cours du temps, et dans les conditions de stockage définies (température, humidité de l'air, lumière). Le suivi en stabilité permet de définir la date limite d’utilisation du vaccin.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne). 30% des animaux seront infectés par voie intra-nasales sous anesthésie profonde (70 mg/kg de Kétamine et 9 mg/kg de Xylazine, par injection intra-péritonéale)
Impact sur les animaux
Pour les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe et le dernier etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Le geste de l'immunisation intramusculaire est très peu invasif pour l'animal. Également, les volumes injectés ne dépassent pas 50μl évitant au maximum tout type de douleur musculaire et aucune souffrance n'est attendue en réponse aux formulations vaccinales injectées. La procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, l'infection virale peut entraîner une perte de poids chez les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.
Remplacement
L'efficacité d'un vaccin dépend de sa capacité à induire une réponse immunitaire, avec un mécanisme d’action spécifique, un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types de cellules immunitaires et une organisation particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, les tests de protection contre une infection virale ne peuvent être menés que par des études in vivo. Pour la procédure: Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, nous étudions et essayons de mettre en place un test in vitro qui puisse répondre aux exigences de la réglementation pour remplacer les études sur les animaux, mais cette étude est toujours en recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires dans les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe ). Des groupes de 10 souris sont nécessaires dans les procédures ( Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins ou pour l'etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) pour l’utilisation d’un test plus performant et une analyse statistique plus stricte pour la libération de lots vaccins. L’analyse et l’estimation du nombre d'animaux à utiliser se font en amont de l’expérimentation.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant une semaine au PBES. L’immunisation est réalisée par voie intra musculaire. C’est une voie permettant l’obtention d’une bonne réponse immunitaire et qui est peu invasive pour l’animal. Les animaux en expérimentation sont observés au moins une fois tous les 2 jours et ce pendant 7 jours après les immunisations. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local sera appliqué. Pour la procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, les infections virales intra-nasales sont réalisées sous anesthésie profonde. De jour 43 à jour 56 après infection les souris feront l’objet d’une surveillance régulière et seront pesées quotidiennement pendant 2 semaines, un point limite est fixé à une perte de 20% de poids du poids initial.
Choix des espèces
Une partie des réponses immunes médiées par les lymphocytes T sont initiées dans les ganglions lymphatiques, qui drainent le site de l’immunisation, et qui vont pouvoir circuler dans les divers organes lymphoïdes et certains tissus comme le parenchyme pulmonaire. Cependant, aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique de circulation. Egalement, de nombreuses études déjà réalisées sur le modèle souris avec ce pathogène permettent d'optimiser les essais en limitant au maximum le nombre d'animaux, ainsi que la souffrance de l'animal. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques. Nous allons utiliser des animaux sevrés de 6 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge là et non vieillissant.
Développement d’une biothérapie pour une maladie rare : Syndrome d’ostéolyse carpotarsienne multicentrique (MCTO) (2022-I-002)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
16 270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un modèle d'une maladie osseuse rare avec atteinte rénale, reçoivent des injections de vecteurs lentiviraux, des prélèvements de sang et d'urine et une biopsie d'oreille, puis sont toutes tuées pour analyse des organes, pour une preuve de concept thérapeutique. Le porteur annonce un bénéfice "certain à long terme" pour les patients, formulé au conditionnel, face à ce nombre très élevé d'animaux mobilisés d'emblée. Il affirme le recours au modèle animal "inévitable" malgré des tests menés in vitro et une recherche bibliographique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie osseuse avec troubles renaux associés. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie notamment les problèmes rénaux associés.
Bénéfices attendus
Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice certains à long terme pour ces patients.
Procédures
Les animaux sont soumis à des injections de vecteurs lentiviraux (30 secondes), ainsi que des prélevements de sangs (5 minutes) et d'urine (30 minutes). Les prélèvements de sang sont sur animal anesthésié et un animal aura maximum de 3 prélèvements dans sa vie. Les prélèvements d'urine se font sur animal non anesthésié et un maximum de 6 prélèvements sera fait Les animaux auront également une biopsie d'oreille pour savoir s'ils sont porteur de la maladie (20 secondes).
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet présente les signes cliniques caractéristiques de la maladie. En effet, ces animaux sont de plus petite taille et présentent un poids inférieur par rapport aux souris non malades de même âge. Cependant les chercheurs ayant générés ce modèle ne rapportent aucun problème pour ces animaux à se mouvoir ou à s’alimenter. Les souris ont également une altération de la fonction rénale et une ostéoporose associée à une destruction partielle des os des pattes chez la souris malade. Toutes ces altérations sont caractéristiques de la pathologie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, le projet nécessite d'étudier la structure des organes afin de vérifier l'efficacité du traitement testé et cela ne peut se faire que sur animal euthanasiés.
Remplacement
Globalement, la production du traitement et l’optimisation se fait et continue à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés sur cellules. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation du modèle animal de la maladie est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.
Réduction
Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à réduire le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus. Ce nombre est basé sur nos expériences passées avec différents modèles animaux de maladies osseuses.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe à maximum 5 par cage. Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les malocclusions des incisives. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures.
Choix des espèces
Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il a été construit pour mimer la pathologie et en effet, les auteurs du papier original démontrent bien que les principales caractéristiques de la pathologie sont retrouvées. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.
Caractérisation et mode d’action de la Cochline contre les infections bactériennes à Pseudomonas et à Staphylocoques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par voie intranasale, sous anesthésie, par les bactéries Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus, puis tuées par dislocation cervicale six à quarante-huit heures plus tard pour prélèvement d'organes, afin d'étudier le rôle d'une protéine, la cochline, dans la réponse immunitaire. Le porteur indique que l'infection provoque douleur, fièvre et perte de poids pendant la durée de l'expérience. Il juge l'utilisation d'animaux "essentielle" car l'étude ne peut être menée sur des lignées cellulaires.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques est un enjeu mondial majeur dans le traitement contre les infections bactériennes. Stimuler le système immunitaire de l'hôte représente une alternative prometteuse afin de diminuer l'antibiorésistance. Les mécanismes endogènes contrôlant l'immunité antibactérienne restent insuffisamment compris, en partie parce que les protéines potentiellement impliquées dans une telle régulation restent peu étudiées. Un exemple est la cochline, protéine de la matrice extracellulaire. Il a récemment été décrit que la protéine circulante cochline (codée par le gène Coch) augmente la réponse innée de l'hôte contre deux bactéries Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. L’absence de cochline entraîne un défaut de contrôle de la propagation bactérienne au site d’infection (poumon) et sa dissémination dans l’organisme (sang, rate), et une diminution de la survie des souris à ces modèles infectieux. L’absence de cochline est associée à une diminution du recrutement de cellules immunitaires innées. Il a aussi été montré que l'administration de cochline recombinante limite la colonisation bactérienne de lésions cutanées dans un modèle murin d’épidermolyse bulleuse. Ainsi, le ciblage de la « voie cochline » présente un fort potentiel thérapeutique contre les infections bactériennes dans le contexte de l’accroissement des antibiorésistances.
Bénéfices attendus
A court terme, le projet consiste à décrire de façon très complète les défauts de la réponse immunitaire dans les souris transgénique n’exprimant pas la cochline suites aux infections bactériennes. Ce projet permettra donc la caractérisation complète et détaillée de « la voie cochline ». A plus long terme, le ciblage de la voie cochline pourra apporter une option thérapeutique innovante visant à augmenter la réponse de l’hote notamment lors d’infections bacteriennes résistantes aux antibiotiques.
Procédures
Les animaux seront pesés (vigile), identifiées par marquage caudal au feutre (vigile) puis traités pour limiter la souffrance avec du paracétamol dans l’eau de boisson 12h avant infection puis pendant tout le temps de l’expérience (vigile). Les animaux seront alors anestésiés par injection intrapéritonéal (vigile) pendant une dizaine de minutes au cours desquelles ils seront infectés en intranasal avec les bactéries Pseudomonas Aeruginosa ou Staphylococcus Aureus Newman. Après 6h-48h suivant les expériences, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale (vigile) ou injection intrapéritonéale (vigile) pour prélèvement de différents organes et échantillons post-mortem
Impact sur les animaux
Douleur induite par une infection bactérienne pulmonaire, fièvre, perte de poids, activité et mobilité réduite. Ces effets dureront au maximum 48h (temps d’expérince le plus long avant mise à mort)
Devenir
Chaque procédure nécéssitant l’analyse sur des organes vitaux (poumon, rate) les souris devront être mises à mort à la fin de chaques procédures.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse du système immunitaire et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles. Ainsi pour limiter le nombre de souris utilisées, nous réaliserons les procédures expérimentales préliminaires avec 4 souris par groupes pour déterminer, à l’aide d’un calcul de puissance, le nombre adéquat de souris pour les autres procédures. Pour les procédures expérimentales de détermination de la dose infectieuse , nous ne testerons pas toutes les doses proposées en même temps mais testerons en premier 2 doses et testerons ensuite des doses à la hausses ou à la baisse parmi celles proposées en fonction des résultats préliminaires obtenus. Pour les procédures d'expérimentations les nombres indiqués correspondent au maximum. Les nombres de souris par groupe seront revus à la baisse en fonction des résultats des procédures préliminaires permettant des calculs de puissance. De plus les résultats des groupes contrôles négatifs (sans infection) pourront être utilisés pour les différentes procédures.
Raffinement
Nous avons optimisé les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et le stress subis par les animaux. En particulier, nous avons mis en place une surveillance adaptée lors des procédures afin de ne jamais induire un dépassement de point limite de souffrance. Afin de limiter la douleur lors de l’infection intranasale, nous anesthésierons les souris par injection intrapéritonéale (dans l’abdomen). Pour limiter la douleur post-infection nous administrons par voie orale via l’eau de boisson du paracétamol (doliprane 2.4% à 0.6mL/L) qui sera maintenu pendant toute la durée de l'expérimentation. Afin de limiter le mal-être et l'angoisse des animaux, nous mettrons en œuvre des mesures d'acclimatation de 5 jours après leur arrivée en zone d'hébergement, et nous maintiendrons au maximum les groupes sociaux.
Choix des espèces
Le rôle de cochline dans la réponse immune a été établi par 4 publications utilisant la souris. Utiliser le modèle souris nous permettra donc de ne pas répéter des expériences inutiles en étudiant la littérature existante, et de comparer aisément nos résultats avec ceux de nos confrères afin de progresser plus rapidement. De nombreux anticorps spécifiques reconnaissant les marqueurs du système immunitaire murins nous permettent de faire des études sur ce modèle. Les animaux auront entre 5 et 8 semaines de vie à leur arrivée en zone expérimentale. Après une semaine d'acclimatation, ils entreront en procédure. Nous travaillons avec des souris adultes pour nous affranchir d'éventuels problèmes d'immaturité du système immunitaire lié au développement.
Système nerveux autonome
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
300 rats vont être utilisés, dont 250 opérés sous anesthésie et tués sans réveil et 50 réutilisés après avis vétérinaire, dans des procédures impliquant selon les cas un niveau de souffrance modéré. On leur pose un cathéter dans la carotide ou un implant de télémétrie dans l'aorte, puis on provoque à plusieurs reprises une chute de tension par basculement brutal de leur position, pour tester des médicaments contre l'hypotension orthostatique. Le porteur affirme ces modèles "nécessaires" à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et juge qu'ils "ne peuvent pas être remplacés" par des méthodes alternatives. L'impact du produit lui-même est déclaré faible, l'atteinte venant surtout de la chirurgie et des manipulations.
Objectifs
L’hypotension orthostatique est définie comme une chute brutale de la pression artérielle qui survient lors du passage de la position couchée à la position debout. Par gravité, le passage en position debout résulte en une accumulation sanguine dans le pool veineux (jambes) qui en retour induit une diminution transitoire du retour veineux, du débit cardiaque et de la pression artérielle. Chez le patient sain, la pression artérielle revient rapidement à des valeurs normales grâce au mécanisme réflexe sympathique. Toutefois, certains médicaments, tels que les antagonistes des récepteurs adrénergiques ou les vasodilatateurs (les antagonistes des récepteurs à l’angiotensine II par exemple), diminuent ce réflexe sympathique, aggravant l’hypotension orthostatique et pouvant ainsi conduire à l’étourdissement et la perte de connaissance. Ces effets secondaires peuvent réduire considérablement le champ d’application thérapeutique de ces médicaments et limiter leur utilisation clinique. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments (par la réduction de cette hypotension) ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes une hypotension orthostatique pouvant conduire à une syncope.
Bénéfices attendus
Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter les problèmes d'hypotension orthostatiques, ou à la recherche de tels effets secondaires de certains traitements (pour les caractériser voire pour aider à affier leur champ d'application).
Procédures
Dans le modèle anesthésié, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Un cathéter est positionné dans une artère carotide pour la mesure en continue de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque. L'hypotension orthostatique est provoquée (en plusieurs occasions) par un changement abrupte de position de l'animal qui passe d'une position horizontale à une position inclinée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvement de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (immédiatement avant la mise à mort). La procedure (sous anesthésie) n'excède pas 2 heures et les animaux sont immédiatement mis à mort (sans reveil préalable). Dans le modèle éveillé, les animaux sont dans une première phase équipé (sous anesthésie) d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continue de la pression artérielle (par cathétérisme de l'aorte abdominale) et de la fréquence cardiaque. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum), l'hypotension orthostatique est provoquée (sous anesthésie gazeuse légère et transitoire) par un changement abrupte de position de l'animal (appelé procédure de Tilt) qui passe d'une position horizontale à une position inclinée. Cette procédure de Tilt peut-être répétée en plusieurs occasions et à des jours différents. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sur animal vigile ou anesthésié au gaz isoflurane) pendant le test et/ou en fin de test.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Dans le modèle chez le rat éveillé, certaines périodes d'hébergement en cage individuelle (avec enrichissement) sont cependant nécessaires: 1) pendant la phase de récupération post-chirurgicale, afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères (généralement pour un période d'une semaine maximum); 2) pendant les mesures (généralement un peu plus de 24h), car le système de télémétrie ne fonctionne qu'avec une fréquence d'émission des signaux. Un hébergement groupé ne permet donc pas d'identifier la source d'émission d'un signal (interférence entre les implants).
Devenir
Pour les procédures modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisable.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux autonome. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la capacité de régulation du système nerveux autonome, l'intégrité du système nerveux autonome ne pouvant être respecté que chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif. Dans la procédure mise en place chez l'animal anesthésié et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal, réduisant aisni le nombre d'animaux utilisés. Dans la procédure mise en place chez l'animal éveillé et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal à des jours différents, réduisant aisni le nombre d'animaux utilisés. Nos analyses statistiques (basées sur des analyses de variances et test de Dunnett) indiquent qu’un effectif de 8 animaux par groupe (nombre de groupes variables, 2 en standard) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux issus du modèle chez le rat éveillé (étude par télémétrie) peuvent également être réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subi de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le système nerveux autonome du rongeur est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rats sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique.