Procédures modérées

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de tétrachlorure de carbone tous les deux jours pendant huit semaines pour induire une fibrose du foie, avant une mise à mort par ponction cardiaque et prélèvement d'organes. Le porteur affirme que la fibrose ne provoque aucune douleur et vise à comprendre le rôle de cellules souches et l'effet de la metformine sur cette pathologie. Il indique que le modèle cellulaire ne suffit pas et conclut que le passage par l'animal est inévitable pour cette étude.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de la fibrose hépatique. La fibrose hépatique est caractérisée par l'accumulation excessive des constituants de la matrice extracellulaire dans le parenchyme hépatique. Cette pathologie est la complication majeure de toutes les maladies chroniques du foie induites par une infection virale, des perturbations métaboliques, l'abus d'alcool. Une fibrose hépatique non contrôlée peut entrainer in fine une cirrhose du foie, un dysfonctionnement hépatique et un carcinome. A ce jour, il n’existe aucun traitement ni moyen de diagnostic précoce. Aussi, plusieurs voies de recherche et de développement sont en cours pour palier à ce déficit. Notamment la metformine, un traitement du diabète de type 2 qui présenterait des effets anti-fibrotiques intéressants. Dans le foie, comme dans les autres organes, les cellules effectrices de la fibrose sont les myofibroblastes. D’origine encore largement débattue, les myofibroblastes dériveraient principalement des cellules stromales mésenchymateuses (MSC). Lors de leur différenciation en myofibroblastes, les MSC expriment une combinaison spécifique de cytokines, facteurs de croissance, hormones ainsi que des miARN et pourraient par ce biais réguler les phénomènes de fibrose. Il existe plusieurs méthodes pour induire expérimentalement une fibrose hépatique chez l’animal de laboratoire. Nous utiliserons le modèle de fibrose induite par l’injection intrapéritonéale de tétrachlorure de carbone (CCl4) chez les souris C57BL/6. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 50 individus pour la durée que couvrira ce projet. L’objectif de notre étude est de comprendre le rôle des MSC dans le développement de la fibrose hépatique, d’identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans la pathogenèse de la fibrose hépatique et d’étudier la capacité de la metformine à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression de la fibrose hépatique. Permettant ainsi une prise en charge plus précoce de cette pathologie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans le développement de la fibrose, d’identifier les miARN biomarqueurs du développement de la fibrose, permettant ainsi une prise en charge plus précoce de cette pathologie et étudier la capacité de la metformine à induire une régression de la fibrose hépatique.

Procédures

Les souris subiront une injection intrapéritonéale tous les 2 jours pendant 8 semaines (n=50). L'injection durera à chaque fois en moyenne 5 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections se feront avec une bonne contention de l'animal. Pour respecter le bien-être animal une application de crème analagésique (Lidocaïne) et une désinfection de la zone à l'aide d'une compresse alcoolique seront réalisées avant les injections. La fibrose hépatique ne provoque aucune douleur. La ponction cardiaque (1 mL) sera précédée d’une anesthésie volatile par isoflurane (1,5 à 2%) et suivie d'une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires.

Devenir

Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%). Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique).

Remplacement

Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules souches mésenchymateuses hépatiques apportent quelques résultats sur leur capacité de différenciation en myofibroblastes, ainsi que sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas à modéliser le processus de fibrose dans son ensemble. Le passage par l'in vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules souches mésenchymateuses dans le développement de la fibrose hépatique, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité de la metformine à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression de la fibrose hépatique.

Réduction

Réduction du nombre : Le développement d’une fibrose par le CCL4 ayant déjà été publié, nous n’avons pas besoin de réaliser une étude pilote et le nombre d’animaux a de ce fait pu être réduit. Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les groupes d'animaux entre eux.

Raffinement

Les souris seront dans des cages adaptées à 5 individus, avec une litière adaptée, de la nourriture et de l’eau en continue, de quoi se cacher et de quoi ronger, en quantité suffisante pour ne pas générer de comportements agressifs. En cas d’agressivité la taille des groupes d’animaux sera ramenée à trois individus par cage. Les souris seront observées quotidiennement, pour suivre leur état clinique et déceler d’éventuels problèmes (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque (1mL) sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés. Les injections se feront avec une bonne contention de l’animal par du personnels formés et entrainés. Pour respecter le bien-être animal une application de crème analgésique (Lidocaïne) et une désinfection de la zone à l'aide d'une compresse alcoolique seront réalisées avant les injections.

Choix des espèces

Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont largement utilisées comme modèle pour la formation de fibrose hépatique induite par le CCl4. Par de nombreux aspects, ce modèle reproduit la maladie chronique du foie humaine. Il reproduit la phase aigüe de la maladie humaine caractérisée par l’induction d’une réponse inflammatoire suivie par le développement de la fibrose hépatique chronique. Souris adultes de 6 à 8 semaines

175 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de lésion de la substance noire puis huit injections de venin d'abeille, avec des tests moteurs (cylindre, labyrinthe en croix, rotameter), pour évaluer un effet antiparkinsonien. Le porteur indique que la chirurgie et les injections répétées peuvent provoquer perte de poids, inflammation de la suture et lésions cutanées, et que tous les cerveaux seront prélevés après mise à mort. Les retombées annoncées restent un préalable à une éventuelle étude chez l'homme, tandis qu'une partie des données servira à un travail dirigé d'étudiants.

Objectifs

Chez l'homme, la MP engendre des déficits moteurs tels que l'akinésie , la bradykinésie, la rigidité musculaire et le tremblement de repos. Chez l'animal, la catalepsie peut être mesurée et est un bon indice du symptome d'akinésie de la MP : une étude pilote sur le modèle pharmacologique nous a permis de connaître la dose efficace ainsi que la cinétique de différentes molécules candidates antiparkinsoniennes : le venin d'abeille (Bee Venom, BV 1/3/5 µG/kG)/ et le venin d'abeille sans son composé allergène, le deltaBV (1/3/10 µG/kG). Toutefois, il est nécessaire de valider les effets de cette molécule dans un autre modèle animal de la MP (modèle chirurgical) imitant la dégénérescence des neurones dopaminergiques. Ce modèle consiste en la lésion unilatérale totale de la substance noire. Ce modèle nous permettra d'aller plus loin dans la connaissance de l'effet thérapeutique des diverses molécules au moyen de plusieurs tests moteurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples : - Reproduction de l'effet bénéfique de la première étude utilisant un autre type de BV (alyostat)- Mise en évidence de l'effet bénéfique du dBV : pré-requis à une étude ultérieure chez l'homme. - Collecte de données pour la réalisation d'un TD

Procédures

Dans le modèle chirugical de la MP, les rats seront opérés (chirurgie de 45 min) puis seront injectés 2 semaines après en ip avec le BV ou le dBV selon le groupe. Ils seront injectés au total 8 fois : en J16/J19/22/25/28/31/34/37 et 40. En J40 les groupes lésés (soit 8 groupes) recevront une dose d'apomorphine (0.1 mG/kG). Les animaux seront testés ensuite en comportement , au niveau du test du cylindre et du cross maze (J16/J22/J28/J34) et au niveau du rotameter (J40)

Impact sur les animaux

La lésion induit plusieurs effets indésirables : une perte de poids après la chirurgie, une possibilité d'inflammation au niveau de la suture. De plus, les injections ip ou sc répétées peuvent induire des lésions cutanées au site d'injection.

Devenir

L'ensemble des animaux (175) sera euthanasié et leur cerveau sera prélevé afin d'effectuer des vérifications histologiques de la lésion.

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez le rat qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. Le modèle chirurgical de lésion unilatérale de la substance noire chez le rongeur induit des symptômes moteurs (assymétrie posturale)qui ne peuvent être observés que sur l'animal vigile.

Réduction

56 rats proviennent d'une étude antérieure. Les données collectées lors de cette étude vont pouvoir servir de base pour de nombreuses promotions d'étudiants de 2ème année de BUT. De plus, cette étude repose sur l’utilisation d’un modèle chirurgical de la MP et de tests comportementaux validés par la communauté scientifique internationale, ce qui permet d’utiliser le minimum d’animaux necessaire pour obtenir des données fiables. Des études statistiques en amont (GPower) ont été effectuées pour aboir une significativité de 5% avec le nombre d'animaux étudiés.

Raffinement

Tout au long de cette étude, les animaux seront observés, pesés et manipulés. Ils seront maintenus par 2 dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad lib. Lors de la chirurgie, ils seront anesthésiés avec un mélange de Kétamine (100 mG/mL) à la dose de 60 mG/kG et Métomidine (1 mG/mL) à la dose de 0.25 mG/kG. Après s'être assuré de l'efficacité de l'anesthésie (retrait de la patte après pincement), les yeux sont recouverts d'une pommade occulaire. De la lidocaîne est introduite également au niveau des oreilles 15 minutes avant la mise en place de l'animal dans le cadre stéréotaxique. Le rat est ensuite positionné dans le cadre sur une couverture chauffante pour maintenir sa température ( contrôlé par sonde anale). Après désinfection de la peau du scalp à la bétadine et injection sous-cutanée d'un anesthésique local (0.1 mL/ de lidocaïne 0.4 % 15 minutes avant), une incision est effectuée afin de révéler le crâne. Après avoir injecté la neurotoxine ou son solvant, la peau est agrafée. De la bétadine est appliquée sur la suture et le rat reçoit une injection sc d'analgésiques (Buprénorphine 0.05 mG/kG). L'animal est ensuite laissé au calme pendant 2 semaines et observé régulièrement (grille de score binaire et note état corporel en annexe). Lors de l'étude pharmacologique, si un abcès apparaît après les injections intrapéritonéales, l'expérimentateur nettoiera la plaie à la bétadine et reportera les injections pour le/les animaux concernés.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix dans cette pathologie au regard des différents tests comportementaux qu'il peut effectuer. Par ailleurs, la plupart des études portant sur cette neuropathologie repose sur le modèle rat de la MP, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, nos travaux antérieurs sur le venin d'abeille ont été réalisés chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats issus de nos projets. Le projet vise à établir l'effet bénéfique du BV et du dBV chez le sujet jeune adulte. Comme pour tous nos travaux précédents, nous utiliserons des animaux d'environ 4 mois (matures sans être âgés), nous permettant de comparer les résultats avec nos données antérieures. De plus, les coordonnées stéréotaxiques (atlas de Paxinos et Watson) ont été établies pour des rats de ce poids.

Pour mesurer les effets de candidats médicaments sur la fonction cardiovasculaire, 84 macaques, soit 72 macaques à longue queue et 12 macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit l'implantation chirurgicale d'un émetteur de télémétrie, puis reçoit les produits par différentes voies, avec des prises de sang et, le cas échéant, des tests "neuro-comportementaux" que le porteur ne détaille pas. Il compte parmi les bénéfices attendus, pour les macaques eux-mêmes, des "outils de raffinement de plus en plus adaptés". Tous sont destinés à être réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire, y compris un projet "sans réveil", c'est-à-dire mené sous anesthésie jusqu'à leur mise à mort.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardio-vasculaires chez le primate non-humain vigile en utilisant la télémétrie, méthode d'enregistrement de différents paramètres permettant de laisser l'animal totalement libre de ses mouvements dans la volière pendant les mesures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire . Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (le primate non humain) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.

Procédures

Dans ce projet une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie, composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté sera réalisée sur les animaux. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies. Les animaux auront également des administrations de produits par différentes voies ainsi que des prélèvements de sang. Des tests neuro-comportementaux pourront également être réalisés.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l’objet d’échange avec les fabricants des candidats médicaments testés pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiper au mieux de potentiels signes cliniques. La chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie est composée d’un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le primate non humain car il n'existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets cardiovasculaires. Or, avant toute utilisation chez l'homme, l'animal constitue un passage obligatoire pour l'évaluation de l'efficacité ou la sécurité d'un médicament. A ce jour, le primate non humain est une des espèces de non-rongeurs adaptée à ce type de modèle.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • l'utilisation de la technique de télémétrie permettant de recueillir des informations sans manipulations animaux, •la validation du système de télémétrie et validation pharmacologique du modèle, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le primate non humain est, pour certains candidats-médicaments, l’espèce animale la plus adaptée car la plus proche de l’homme en termes de métabolisme et d’exposition. Le système cardiovasculaire du primate non humain est également très proche de celui de l'homme, donc les effets observés sont plus facilement extrapolables. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

260 souris et lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 230 tués à l'issue et 30 lapins proposés à l'adoption. Des tiques sont placées sur leur dos dans des capsules pour se nourrir de leur sang, ce que le porteur reconnaît provoquer une gêne et des démangeaisons. Chaque animal ne sert qu'une fois en raison de l'immunité développée contre les tiques. L'élevage vise à maintenir des colonies de tiques saines pour des expériences d'infection.

Objectifs

Le présent projet vise au maintien, en laboratoire, de colonies de tiques, dont les tiques de l’espèce Ixodes ricinus, « sans agent pathogène» afin de pouvoir réaliser des expériences d’infection expérimentale avec divers agents pathogènes pour analyser leur transmission par cet arthropode. Les tiques étant des hématophages stricts(ne mangent que du sang), il est nécessaire de les nourrir régulièrement avec du sang, ce qui est réalisé suivant les stades concernés sur souris vigiles (pour les larves et les nymphes) ou sur lapin vigile (pour les nymphes et les adultes). Pour cela les différents stades de tiques sont placés sur les animaux (dans une capsule fixée sur le dos des souris ou capsules fixées sur le dos des lapins) afin de permettre leur gorgement. Une fois gorgées, les tiques se détachent toutes seules, sont récupérées puis placées en flasque de culture cellulaire en attendant leur métamorphose.

Bénéfices attendus

Le maintien d'un élevage de tiques saines permet de pouvoir développer des projets de recherche portant sur les tiques elle-mêmes : étude du microbiote des tiques, développement de vaccin antimicrobiote de tique, neurophysiologie des tiques ; mais également sur les interactions entre les tiques et les agents pathogènes qu'elles vectorisent (bactéries, parasites et virus) afin de mieux comprendre ces systèmes et de trouver des moyens de lutte contre les tiques et les agents pathogènes qu'elles transmettent.

Procédures

Il n'y aura aucun prélèvement réalisé sur les animaux, juste la récupération des tiques gorgées présentes dans les capsules.

Impact sur les animaux

Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris ou les lapins utilisés mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques (larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez le lapin ou la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort du lapin/souris.

Devenir

Pour les souris, tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les lapins: environ la moitié (30) seront mis à mort si les tiques gorgées avaient des agents pathogènes (tiques collectées en forêt) , et l'autre moitié (30) seront proposés à l'adoption via une association. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé au sein de notre équipe, il est utilisé lors des essais de transmission des agents pathogènes. Cependant son efficacité ne permettant pas toujours de maintenir un assez grand nombre de tiques, il est donc necessaire de maintenir l’élevage de tiques sur lapins et souris.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. Pour chaque élevage, les gorgements seront réalisés au rythme de 1 par stade de tiques (3 stades) tous les 3 mois nécessitant à chaque fois 4 lapins et 5 souris. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.

Raffinement

Les souris et les lapins sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des lapins et souris avec pour les souris : un maison en plastique par cage, un support pour grimper ; pour les lapins : une balle en plastique dure, un baton de bois à ronger. Les souris sont hebergées à raison de une souris par cage pour éviter le retrait de la capsule par ses congénères.

Choix des espèces

Les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et n'acceptent de se gorger que sur certains animaux dont les souris (larves et nymphes) et les lapins (nymphes et adultes). De plus, afin de maintenir un élevage, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade. Les tiques adultes et nymphes prélevant un volume de sang important, le gorgement sur lapin évite (1) la spoliation sanguine de l’animal hôte contrairement au gorgement sur souris, et (2) le recours à plus d’animaux. Adultes pour les souris et les lapins Age Minimum 5 semaines pour les souris pour pose des capsules Age indifférent pour les lapins

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau puis prélevée de façon répétée par biopsies sous anesthésie, jusqu'à un volume tumoral de 2 000 mm3 déclenchant la mise à mort. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux utilisés dans d'autres études. Il reconnaît des risques d'hémorragie, de nécrose et de dissémination tumorale liés aux biopsies.

Objectifs

L’Organisation Mondiale de la Santé a établi en 2020 que le cancer était, selon les pays et leur développement socio-économique, la 1e ou la 2e cause de mortalité avant l’âge de 70 ans, avec 10 millions de décès par an dans le monde. En France, les cancers représentent la première cause de décès chez l’homme et la deuxième chez la femme. En 2040, il est estimé que 28.4 millions de cancers seront nouvellement diagnostiqués chaque année dans le monde, soit une augmentation de 47% par rapport à 2020 (19.3 millions de nouveaux cas). Cette augmentation est principalement liée au vieillissement des populations, mais aussi à d’autres facteurs de risque (tabagisme, habitudes alimentaires, expositions aux UV, sédentarité, pollution…). Actuellement les traitements conventionnels du cancer sont la chimiothérapie et la radiothérapie qui sont associés à des effets secondaires importants et pour lesquels les patients peuvent développer des résistances. Il est donc important de pouvoir développer de nouveaux traitements ciblant spécifiquement les cellules tumorales et limitant les effets secondaires associés. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, l’efficacité anti-tumorale des composés, issus de pré-sélections grâce à des tests in vitro, est évaluée in vivo chez des souris greffées avec des cellules tumorales. Les mécanismes d’action, pharmacocinétique ou biomarqueurs, sont évalués au cours de ces études à partir de prélèvements des tumeurs. Une des limites majeures actuelles à ces prélèvements de tumeur pour caractériser les effets des traitements est qu’ils ne peuvent être effectués qu’en procédure terminale pour l’animal. Pour pallier cela, il est souvent prévu d’inclure plusieurs cohortes d’animaux qui sont alors euthanasiées à différents temps de l’étude afin d’accéder à des analyses longitudinales d’efficacité du traitement. Ces études n’étant pas menées sur les mêmes animaux, elles peuvent être biaisées par des variabilités interindividuelles et rendre difficile l’interprétation ou imposer une augmentation du nombre d’animaux par groupe pour compenser ces variabilités. Ce projet a pour but de développer une technique de biopsie longitudinale de tumeur greffée chez la souris. Ce prélèvement régulier d’un très petit échantillon de tumeur permettra de caractériser au cours du temps et sur un même animal l’évolution de la tumeur par l’étude de paramètres histologiques, pharmacocinétiques, géniques et/ou protéiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de définir la technique la plus appropriée pour réaliser des prélèvements répétés de tumeur tout en ayant un impact minimal sur la morphologie et la croissance de la tumeur, l’évolution de la pathologie et le bien-être animal. La mise en place de biopsies longitudinales dans les études d’efficacité de traitements anti-tumoraux présente de nombreux intérêts : -Etant donné que le prélèvement est réalisé sur le même animal, nous pourrons ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études futures pour faire les analyses de biomarqueurs dans la tumeur. En effet, il ne sera plus nécessaire d’ajouter des cohortes d’animaux supplémentaires pour réaliser des prélèvements terminaux au cours du temps. -Chaque souris étant son propre contrôle, nous pouvons mieux caractériser le mécanisme d’action d’un traitement et ainsi mieux en définir l’efficacité puisque nous réduisons la variabilité interindividuelle associée aux prélèvements terminaux. -L’évolution de biomarqueurs spécifiques en réponse à un traitement peut être plus précisément définie puisque suivie sur le même animal. Ainsi les bénéfices associés à ces mises au point sont à la fois de réduction du nombre de souris utilisées et à la fois scientifiques (caractérisation des mécanismes d’action, diminution de la variabilité, suivi de biomarqueurs plus spécifiques)

Procédures

-Greffe de cellules tumorales : pour chaque animal, une injection unique sous la peau du flanc sur animal vigile. Ce geste est réalisé sans anesthésie car une contention maitrisée et un geste rapide (

Impact sur les animaux

Au cours de cette mise au point, nous serons vigilants sur les effets indésirables suivants qui peuvent survenir chez la souris : -Une perte de poids qui pourrait excéder 20% du poids initial. Le poids des animaux sera donc mesuré tout au long de l’étude (y compris avant et après biopsie) afin d’évaluer, entre autres, le rétablissement des animaux. Une biopsie ne pourra être envisagée que si la souris a récupéré son poids d’avant la biopsie précédente. Si une perte de poids d’au moins 20% du poids initial est observée, les animaux seront euthanasiés. -Il se peut que nous voyions apparaitre des nécroses soit au niveau de la tumeur, soit au niveau des points de prélèvements. Une surveillance particulière sera apportée, et les animaux présentant des tumeurs creusées, exsudatives ou des lésions/nécroses >8mm de diamètre seront euthanasiés. -Lors de la biopsie de la tumeur, l’incision faite dans la tumeur (par l’aiguille ou par le prélèvement chirurgical) pourrait entraîner une libération des cellules tumorales et provoquer une dissémination de la tumeur, entrainant la formation potentielle de métastases. Une palpation autour de la tumeur et de l'abdomen sera réalisée pour détecter l’apparition de ces métastases. La présence de métastase sera confirmée après euthanasie de la souris par une autopsie. -Enfin, un risque inhérent à toute biopsie est le risque d’induire une hémorragie. Les tumeurs étant vascularisées, il est possible d’endommager un vaisseau lors du prélèvement à l’aiguille. Aussi une vigilance particulière sera apportée au cours de l’étude et une surveillance accrue sera exercée au cours du prélèvement et pendant quelques heures suivant la biopsie.

Devenir

Lorsque la tumeur atteint un volume de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tumeur (que ce soit pour le groupe ayant eu des biopsies ou le groupe sans biopsie).

Remplacement

L’effet de traitements anti-cancéreux ciblant le système immunitaire ou spécifiquement les cellules cancéreuses ne peut être évalué qu’après un traitement aigu ou chronique de plusieurs semaines (selon le candidat médicament à tester) chez l’animal car il résulte de l’intégration de toutes les interactions métaboliques, hormonales, immunitaires et vasculaires impliquées dans le développement des cancers et de la pathologie. Une telle intégration n’existe pas pour des cellules ou organes isolés. Il n’y a donc pas à ce jour de méthodes in vitro substitutives.

Réduction

Ce projet a pour but de définir les conditions optimales de biopsie de tumeurs greffées en sous-cutanée. Il contribue ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans les futures études d’efficacité de traitement et de pharmacodynamie en permettant de réaliser des prélèvements répétés de tumeur sur le même animal. Ainsi la variabilité interindividuelle est réduite et la caractérisation des effets du candidat médicament est améliorée. Ces études seront réalisées sur des modèles déjà optimisés en termes de conditions de greffe. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est ainsi réduit. Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour définir les conditions optimales de biopsie et estimer la variabilité des paramètres mesurés. Cette étape permettra in fine d'établir le nombre d'animaux nécessaire par groupe pour les études d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. Les prélèvements répétés de tumeurs permettront d’évaluer des paramètres morphologiques (par des techniques d’histologie), des paramètres protéiques (par Western Blot ou par les techniques d’immunohistochimie), des paramètres géniques ou biochimiques.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale par pied à coulisse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Elle permet une mesure rapide et régulière au cours du temps chez la souris vigile. Les tumeurs sont mesurées plusieurs fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour surveiller l’atteinte éventuelle de points limites. En cas de volume tumoral supérieur à 1500 mm3, une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel pour leur permettre d’exprimer leur instinct de nidification (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est dispersé dans la cage pour favoriser le fouissage. Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et du comité d’éthique, et les points limites, seront appliquées. Quelle que soit la méthode utilisée (prélèvement transcutané ou chirurgie), la procédure de biopsie est réalisée sur animal anesthésié et s’accompagne toujours au préalable de l’administration d’un analgésique afin de prévenir la douleur. A l’issue de la biopsie, l’animal est placé dans une enceinte chauffée pendant la phase de réveil, et surveillé pour s’assurer qu’il ne présente pas de signe de douleur. Nous nous assurerons du rétablissement de l’animal après chaque biopsie et tout au long de l’étude.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. Et la recherche en oncologie est réalisée dans sa grande majorité sur des modèles murins de greffes de cellules tumorales humaines. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

3 072 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'une maladie de calcification, elles reçoivent un régime gras, des gavages, des injections et une cryolésion cardiaque, avant prélèvement de tissus. Le porteur qualifie le phénotype de "non dommageable" tout en reconnaissant qu'une association testée n'a jamais été évaluée et pourrait entraîner une mortalité. L'étude cherche des pistes thérapeutiques contre le pseudoxanthome élastique.

Objectifs

Le pseudoxanthome élastique (PXE) est une maladie métabolique rare causée par des mutations du gène ABCC6 exprimé majoritairement dans les hépatocytes. Elle est caractérisée par un processus de perte d'élasticité et de calcification touchant principalement la peau, la rétine et les artères. La peau (récepteur) est le seul tissu accessible chez l’humain alors que le foie (émetteur) reste accessible uniquement chez la souris Abcc6-/- du fait de l’absence d’hépatopathie chez les patients. Du fait des connaissances partielles de sa physiopathologie, le PXE reste une maladie incurable. De façon notable ABCC6 n’est pas exprimé significativement dans les organes atteints par la maladie. Dans le plasma des patients PXE, il a été montré une diminution des taux de pyrophosphate inorganique (PPi), molécule endogène aux propriétés anti-calcifiantes. L’objectif général est de comprendre les mécanismes du PXE, puis de tester l’efficacité et la sécurité de stratégies thérapeutiques (Diètes, Médicaments, Thérapies géniques) afin d’aboutir à des essais cliniques chez les patients et améliorer leur prise en charge.

Bénéfices attendus

Sur le PXE: Aspects Cognitifs : Physiopathologie, rôle de l’hépatocyte, cibles thérapeutiques Aspects Cliniques : Amélioration de la prise en charge des patients, prévention des complications, thérapie génique Au dela du PXE: Pathologies vasculaires calcifiantes chroniques liées au diabète et à l’insuffisance rénale chronique. Amélioration des connaissances sur les pathologies liées à l'âge.

Procédures

1) Évaluation de la composition corporelle, 2 minutes sur animaux vigiles 2) Administration du régime athérogène HFD. 3) Administration de molécules par gavage oral, sous-cutanée et intrapéritonéale, quelques secondes sur animaux vigiles 4) Prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale, quelques secondes sur animaux vigiles 5) Mesure de la dépense énergétique, du comportement alimentaire et de l'activité physique, 5 jours sur animaux vigiles 6) Injection intra-péritonéale de LPS, quelques secondes 7) Cryolésion cardiaque sous anesthésie. 8) Imagerie In-vivo sous anesthésie, cela peut aller de 1 minute à 1heure.

Impact sur les animaux

La souris Abcc6-/- a une durée de vie équivalente à celle d'une souris WT. Son phénotype est non dommageable. L’association HFD+LPS n'a jamais été testée dans le modèle Abcc6-/- et nous n'avons aucune donnée sur l'impact en termes de mortalité. Cette association est donc exploratoire. Si nous constatons une létalité trop importante, cette association sera abandonnée. Les données de la littérature de cette association dans d'autres modèles murins sont rassurantes. Même si l'extropolation au modèle Abcc6-/- ne peut se faire sur le plan scientifique, nous faisons l'hypothèse que le phénotype ne sera pas dommageable compte tenu de la durée de vie de la souris Abcc6-/-.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus pour analyse complémentaire.

Remplacement

Ces expériences sont indispensables car nous voulons d’une part mieux comprendre la physiopathologie du PXE en la recentrant sur le foie, de caractériser le ou les substrats endogènes transportés par Abcc6 en réponse à différentes diètes et de thérapeutiques permettant de bloquer la fragmentation et la calcification des fibres élastiques. D’autre part, nous espérons que ce projet apportera des connaissances qui permettront de fournir des résultats précliniques transposables dans des essais cliniques chez les patients. Le PXE est le prototype d'une maladie métabolique "endocrine" où le foie (l'émetteur), principale source d'expression d'Abcc6, n'est pas touché par la pathologie et les cibles sont les organes périphériques n'exprimant pas ou peu la protéine Abcc6. La substitution totale et complète d'un tel système physiopathologique par d'autres méthodes alternatives n'est pas possible. Enfin, comme il n'existe pas d'hépatopathie chez les patients, il est non éthique de proposer aux patients une biopsie de foie.

Réduction

le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables pour valider les données obtenues à la fin de la procédure. Un test statistique ANOVA, étudiant la significativité des résultats nous permettra de traiter les données tout en prenant en considération la mortalité possible des souris en cours d’expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une structure agrée qui tient compte de l' éthique animale. L'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté dans chaque cage afin de minimiser le stress induit par l'hébergement. Le raffinement sera complété par une surveillance journalière des animaux pour s'assurer que les conditions de bien être sont respectées. De plus, le suivi hebdomadaire du poids des souris et de leur comportement constitueront les principaux points limites. Pour réduire la douleur nous utiliserons un antalgique. Pour notre protocole, une grille de score avec des points limites adapatés a été mise en place.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée sera la souris C57BL/6J KO pour le gène Abcc6 et WT. La souris est un bon modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme (95% du patrimoine génétique identique). Notre travail se base sur l’étude de lignées de souris génétiquement modifiées. L’absence ou la sélectivité relative des outils pharmacologiques disponibles pour étudier la signalisation d’intérêt fait de ces animaux un outil d’étude approprié et puissant. Pour élucider cette maladie complexe qu'est le PXE, une souris transgénique a été générée par ablation du gène Abcc6 chez la souris. Les souris Abcc6-/- développent des calcifications de la peau, des vaisseaux et de la rétine, reproduisant ainsi le phénotype humain du PXE non dommageable. La minéralisation des vibrisses débute dès l'âge de 5 semaines et progresse jusqu'à l'âge de 2 ans. Nos investigations débuteront sur des animaux adultes de 6 semaines étant donné que le phénotype PXE débute à 6 semaines d'âge jusqu'aux âges de 3, 6, 12 et 18mois, soit 16,5 mois de traitement au maximum. Les différentes interventions auront pour but de comparer le phénotype des souris et d'identifier les molécules susceptibles d'inhiber ou de moduler favorablement le phénotype.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un allergène leur est appliqué sur les oreilles sous anesthésie gazeuse, provoquant un eczéma, avant mise à mort pour prélèvement des oreilles et des ganglions. Le porteur décrit un léger épaississement et des rougeurs avec démangeaisons lors de la phase allergique. L'étude porte sur des molécules impliquées dans la dermatite atopique et vise l'identification de cibles thérapeutiques.

Objectifs

La dermatite atopique est une maladie de la peau pouvant être associée à d'autres affections telles que l'asthme ou la rhinite allergique. La dermatite atopique, caractérisée par l'apparition d'eczéma, affecte 20% des enfants et 3% des adultes. Un allergène est une molécule inoffensive contre laquelle l'organisme déclenche une réponse immunitaire disproportionnée menant à la mise en place d'une inflammation localisé au niveau du point de contact (la peau dans le cas de la dermatite atopique). La mise en place de la réponse immunitaire allergique induit l'activation des cellules immunitaires et la production d'anticorps spécifique de l'allergène. Si l'animal est réexposé à l'allergène, les anticorps reconnaissant spécifiquement l'allergène vont engendrer la mise en place d'une réponse immunitaire rapide provoquant l'inflammation de la peau caractérisée par des rougeurs et démangeaisons. En utilisant un protocole permettant d'induire une allergie à un allergène expérimental connu, nous pensons montrer que deux molécules (IL-3 et TSLP) produitent par les cellules de la peau jouent un rôle important dans la mise en place de la production d'anticorps spécifiques de l'allergène et donc dans la mise en place de l'allergie. En effet des données préliminaires du laboratoire montrent que ces deux molécules jouent un rôle clef dans le recrutement au niveau de la peau des cellules immunitaires (tel que les basophiles) impliquées dans la mise en place de la réponse inflammatoire lors d'une allergie cutanée. D'autres données préliminaires du laboratoire suggèrent qu'une nouvelle population de cellules dendritiques activées par TSLP est impliquée dans l'induction de lymphocyte T régulateur ayant un rôle anti-inflammatoire, représentant ainsi une potentielle cible thérapeutique de choix pour traiter les maladies inflammatoires de la peau. Nous souhaitons identifier les réseaux cellulaires et moléculaires à l'oeuvre dans ce modèle.

Bénéfices attendus

La charactérisation d'une voie de signalisation impliqué dans le recrutements des cellules pro-inflammatoires au niveau de la peau dans le contexte de l'allergie constituerais une nouvelle cible thérapeutique de choix pour traiter la dermatie atopique affectant 20% des enfants et 3% des adultes. L'identification d'une population de cellule immunitaire induisant des lymphocytes anti-inflammatoires constituerait également une nouvelle cible thérapeutique de premier choix dans le traitement de la dermatitie atopique, et aussi d'autres pathologies impliquant le système immunitaire (maladie autoimmune et cancer). En effet, cibler ces cellules pourrait permettre de moduler la réponse immunitaire à notre convenance, à savoir de la limiter dans le cas des maladies allergiques ou auto-immunes, ou à l'inverse, de la favoriser dans le cas du cancer.

Procédures

Aucun prélévement sur animaux vigiles ou procédures chirurgicales ne sont prévues dans le cadre de cette demande de projet. Pour la procédure d'application topique d'un allergène : l'application de l'allergène au niveau de l'oreille gauche des animaux durant trois jours (jour 0, 1 et 2) permettra de mimer la phase de sensibilisation à l'allergène. Quatre jours plus tard, au jour 6, une application d'allergène sera effectuée au niveau de l'oreille droite afin de mimer la phase effectrice de l'allergie. Cette application est réalisée sous anesthésie gazeuse légére. Chaque application d'allergène dure 30 secondes, soit 4 traitements de 30 sec chacun = 2 min au total). Pour la procédure d'application topique de l'allergène et application d'un dérivé de la vitamine A : En plus du traitement avec l'allergène décrit ci-dessus, nous appliquerons un dérivé de la vitamine A sur l'oreille droite. Cette application, réalisée sous anesthésie gazeuse est effectuée 2 heures avant le dernier traitements avec l'allergène (correspondant au jour 6 du protocole d'application de l'allergène). Chaque application de ce dérivé de la vitamine A dure 30 secondes, soit 1 traitements de 30 sec chacun = 30 sec au total).

Impact sur les animaux

Les trois premiers traitements avec l'allergène vont induires la sensibilisation des animaux à l'allergène, aucun effet indésirable n'est attendu à ce moment la. Les animaux développeront un léger eczéma au niveau du site d'application de l'allergène lors du dernier traitement avec l'allergène correspondant à la phase de "challenge" allergique.

Devenir

A l'issue des procédures "application topique de FITC/DBP" et "application topique de FITC/DBP et application topique d'acide rétinoique" les animaux seront mis à mort pour dose croissante de CO2 puis les oreilles ainsi que les ganglions lymphatiques drainants la peau seront prélevés pour des analyses histologiques, de cytométrie en flux, de rt-qPCR et ELISA.

Remplacement

Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe ou par d'autres laboratoires. Les phénomènes à l'oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et confirmer les résultats obtenus précédemment.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un total de 8 lignées de souris génétiquement modifiées afin d'identifier les rôles de différentes molécules et cellules de la réponse immunitaire. Chaque lignée sera constituée de quatre groupes de 6 animaux, pour un total de 24 animaux au maximum. Deux groupes serviront à l'analyse de l'expression des gènes dans les ganglions lymphatiques et au niveau des oreilles des animaux. Ces animaux permettront également d'effectuer une analyse histologique de la peau. Les deux autres groupes seront utilisés pour caractériser les populations de cellules présentes dans ces organes. Dans le cas de IL3-KO, une seconde cohorte de 24 animaux est prévu pour étudier le rôle de l'acide rétinoique. L’effectif de 24 animaux par lignée est l’effectif minimal qui nous permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres mesurés. De plus le challenge allergique au niveau de l'oreille droite des souris nous permettra d'utiliser l'oreille gauche non challengé en tant que contrôle (contrôle sans inflammation de la peau). (Suite à un test statistique de normalité, nous effectuerons des test ANOVA à 2 voies afin de comparer deux génotypes (contrôle et mutant) traité au FITC/DBP ou non.)

Raffinement

Les souris seront maintenus en groupe pendant toute la durée des expériences. L'application de du mélange FITC/DBP se fait par application cutanée, ce qui nécessite une anesthésie gazeuse légère. Lors du challenger allergique au FITC au jour 6 on observe un léger épaississement et une rougeur des oreilles. Cela peut être accompagné de légères démangeaisons, mais qui ne modifient pas le comportement des souris (toilettage, posture et activités normales). Néanmoins, si une souris dépasse les points limites fixées par la grille de score propre à chaque procédure expérimentale, elle sera retirée de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié immédiatement.

Choix des espèces

Les phénomènes à l'oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques. Le système immunitaire de la souris est relativement similaire à celui de l'être humain, avec notamment la présence d'un système immunitaire adaptatif. Le fonctionnement du systéme immunitaire de la souris étant très proche de celui de l'Homme. De plus, la peau des souris au niveau des oreilles est très similaire à la peau humaine. Ce modèle est donc pertient pour étudier des pathologies inflammatoires de la peau, dans le cas présent la dermatite atopique, qui touche 20% des enfants et 3% des adultes. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d'étudier le système immunitaire mature à l'âge adulte.

400 truites vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 40 tuées à l'issue pour prélèvement de tissus et 360 renvoyées en élevage pour la commercialisation de leurs oeufs. Un marqueur électronique leur est injecté dans le muscle dorsal et des prises de sang mensuelles sont réalisées sous anesthésie pendant six mois. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu, la truite ayant un accès veineux facile. L'étude vise à définir le rythme d'alimentation optimisant la production d'oeufs.

Objectifs

Chez une espèce saisonnée comme la truite-arc-en-ciel dont la période de reproduction se déroule en hiver, l’application d’une photopériode longue et constante en période hivernale permet induire une ponte en début d’été. Cette technique est massivement utilisée par les éleveurs français pour produire des œufs tout au long de l’année mais avec une certaine hétérogénéité de réponse et de qualité des œufs issus de ces pontes décalées. Actuellement, les recherches en nutrition aquacole portent essentiellement sur le remplacement de la farine et l’huile de poisson dans les aliments aquacoles, notamment par des matières premières d’origine végétale. Toutefois, le remplacement de la farine de poisson et huile de poisson par de nouvelles matières premières augmente le plus souvent le coût de l’aliment. Ceci est d’autant plus vrai pour la production d’œufs de truite où la qualité de l’aliment, notamment l’apport en acide gras essentiel, est primordial pour maintenir les performances de reproduction des animaux et la qualité des œufs et ces nouvelles matières premières riches en acides gras essentiels (huile de micro-algues par exemple) autre que la farine et l’huile de poisson coûtent très chères. L’alimentation avec un aliment de qualité mais coûteux pourrait être limitée à des périodes où les apports alimentaires sont déterminants dans la production d’œufs de qualité. Par conséquent, de nombreuses questions se posent quant au rythme d’alimentation à appliquer pendant le cycle de reproduction pour s’adapter au mieux aux besoins physiologiques des poissons et ainsi optimiser les performances de reproduction et la qualité des œufs (nombre, taille, qualité).

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra d’identifier les périodes au cours de la vitellogénèse (accumulation et formation de substances de stockage dans un oeuf) de la truite où les apports alimentaires sont déterminants dans la production d’œufs de qualité (taille, nombre, viabilité, survie après fécondation). Ainsi cette étude permettra d’étudier les processus de stockage, de mobilisation et de transfert à l’œuf des différents nutriments au cours d’un cycle complet de vitellogénèse sous photopériode. Elle permettra d’établir le lien entre la physiologie de la nutrition (stockage, mobilisation et transfert des nutriments) et la physiologie de la croissance et de la reproduction (évolution des hormones de reproduction) au cours du cycle de vitellogénèse.

Procédures

Chaque procédure sera réalisée sous anesthésie (MS222). Un pit tag, pour permettre l'identification individuelle des femelles de truite, sera injecté en début d'expérimentation dans le muscle supérieur dorsal. Des prélèvements de sang seront réalisés une fois tous les mois (6 prélèvements maximum par individu) sur une durée d'expérimentation de 6 mois. La quantité de sang prélevée sera de 2ml sur des femelles adultes d'environ 2kg.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent aux besoins nutritionnels des poissons. Les prises de sang seront réalisées une fois tous les mois sur les animaux. L'injection du pit tag et les prélèvements de sang (2ml) seront réalisés sur des poissons de grandes tailles (environ 2kg) préalablement anesthésiés (MS222). Le pit Tag une fois injectée créera une petite blessure au niveau de la piqure, le poissons devraient cicatriser et récupérer en quelques jours (le taux d'infection avec ce type de procédure reste très faible). La prise de sang ne posera aucun effet indésirable car les vaisseaux sanguins de la truite sont d'accès facile et leur volume sanguin important. La fréquence de prélèvement (une fois tous les mois) ne créera pas non plus d'effets indésirables car la capacité de l'organisme à remplacer le volume sanguin prélevé ne sera pas impactée. Au moment de la ponte, 10 poissons par traitement (total = 40 poissons) seront euthanasiés et des prélèvements de tissus seront réalisés en vue d’analyses biologiques.

Devenir

40 poissons seront euthanasiés en fin d'expérimentation pour permettre les prélèvements de tissus en vue d'analyses biologiques. Les 360 poissons non euthanasiés repartiront dans un circuit classique d'élevage pour la commercialisation des oeufs.

Remplacement

L'étude porte sur l'impact d'une stratégie alimentaire sur la reproduction des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.

Réduction

Nous avons prévu une densité optimale d’animaux par bassin permettant d’éviter les comportements agressifs qui peuvent survenir avec un petit groupe de poissons (relation dominant/dominé). Pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une densité minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et éviter tout comportement agressif (relation dominant/dominé). La densité d'élevage utilisée au cours de cette expérimentation correspond à celle préconisée en aquaculture biologique. Les animaux après leur reproduction repartiront dans un circuit classique d’élevage. Nous avons choisi de réaliser des prises de sang au cours de l'élevage (procédures expérimentales qui restent de classe légère) pour minimiser le nombre de poissons euthanasiés pour des prélèvements biologiques. De plus, nous identifions les femelles par des pit tags pour avoir comme unité statistique un poisson et non un bassin, ce qui nous permet également de réduire le nombre d'animaux mis en expérimentation. Cependant, dans le cadre de cette expérimentation, nous allons étudier l’impact de nos traitements sur la croissance de nos animaux et nous avons donc besoin d’au minimum deux bassins par traitement pour éliminer l'effet bassin. Nous ne pouvons pas réduire plus le nombre de 100 individus par traitement car c'est le nombre minimal nécessaire pour obtenir une densité optimale au bien-être du poisson (20 à 25kg/m3 pour des génitrices, bassins de 4.5m3).

Raffinement

Les conditions d’élevage seront optimisées (biomasse faible de 20kg/m3, bassin de 4.5m3, taux de renouvellement d'eau de 200%/heure). Le taux de renouvellement d'eau important permettra de maintenir l'eau des bassins claire et sans dépôt de matière en fond de bassin ainsi qu'un taux d'oxygenation optimal. La température de l'eau variera avec la saison de 8 à 12°C, ce qui reste dans l'optimum de température pour la truite arc en ciel. Le comportement et les mortalités seront contrôlés 2 fois par jour lors de l’alimentation des animaux. Si une perte de poids anormale ou un comportement atypique étaient observés (comportement de fuite anormal pendant l’alimentation, léthargie, hyperactivité locomotrice, perte d’intégrité physique suite à un cannibalisme ou à des comportements agressifs), les animaux concernés seraient euthanasiés. La personne qui effectuera les prélèvements de sang est familiarisée avec l’espèce animale et la technique choisie. Les animaux seront manipulés avec ménagement et calme. Une faible quantité de sang sera prélevé (2mL sur des animaux de 2kg) ce qui ne provoquera pas d'effets notables sur le volume d'éjection cardiaque ou sur la pression artérielle.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale (première production piscicole française). Les animaux matures auront déjà pondu une première fois et entreront dans leur deuxième période de reproduction. Les truites ont deux ans et font 2kg

960 canards mulards vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'épointage du bec et le dégriffage par cautérisation infrarouge à un jour d'âge, puis tous sont élevés en claustration et gavés pour la production de foie gras. Le porteur reconnaît que l'épointage provoque un stress et une douleur aiguë modifiant le comportement jusqu'à deux semaines. L'étude compare ces pratiques dans le mode d'élevage qu'il décrit lui-même comme "le plus contraignant" pour l'animal.

Objectifs

En élevage le canard de Barbarie et le canard Pékin peuvent manifester des comportements anormaux, dont la cause principale n’a pas été identifiée, générant des problématiques de picage et de griffures causant des lésions et portant ainsi atteinte à leur bien-être. Les méthodes principales permettant de prévenir ou de contrôler ces comportements sont l’épointage et le dégriffage. L’épointage est réalisé par cautérisation de l’extrémité bec du caneton à 1 jour à l’aide d’un faisceau infrarouge afin de limiter sa croissance. Le dégriffage est réalisé selon le même procédé sur la pointe des griffes. Il n'existe pas de données bibliographiques sur ces problématiques chez le canard mulard, hybride issu d’un mâle Barbarie et d’une femelle Pékin. Or, ces pratiques préventives sont potentiellement douloureuses. L’objectif du premier essai est donc de caractériser et de comparer le comportement, l’état corporel et les performances zootechniques (croissance pondérale, efficacité alimentaire, poids des pièces de découpe) de lots de canards ayant été soit épointés, soit dégriffés, épointés et dégriffés ou n’ayant eu aucune intervention (lot témoin) afin d'obtenir des données liées à ces pratiques. Ces animaux seront élevés en claustration, le mode d’élevage le plus contraignant pour l’animal qui soit pratiqué en élevage, notamment lors de la mise à l’abri en période d’influenza aviaire. Un environnement contraignant devrait mettre en exerge les différences entre lots. Selon les résultats issus de ce premier essai, un second essai nous permettra de tester un levier pour limiter les effets indésirables en l’absence des pratiques d’épointage et de dégriffage (enrichissement de l'hébergement, lumières, accès extérieur, densité...). L'objectif appliqué étant de définir les modalités d'élevage les plus adaptées à la biologie du canard afin de favoriser son bien-être .

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer de données spécifiques au canard mulard sur les problématiques du picage et des griffures en conditions de confinement, ce mode d'élevage étant celui devant être adopté lors des périodes d'influenza aviaire. Ces essais permettront d’évaluer, faute de données disponibles pour cette espèce et ce mode de production, les conséquences de l’arrêt de ces traitements en conditions défavorables (confinement), sans autre changement dans la conduite, dans un objectif d’amélioration du bien-être animal. En fonction des résultats obtenus, différents leviers seront in fine proposés à partir d’éléments issus de la bibliographie disponible chez d’autres espèces afin de pallier les problèmes rencontrés et l'un d'entre eux sera testé expérimentalement

Procédures

Les animaux seront soumis à des contentions (manipulation individuelle par un opérateur formé et mise en caisse adaptée à l’âge et l’espèce des animaux) nécessaires à leur pesée et à l'évaluation de leur état corporel (7 au maximum par animal au cours des 12 semaines d’élevage). La durée totale de chaque contention n'excèdera pas 30 minutes. A l'âge de 84 jours ils seront placés dans des caisses de transport et transférés de loges de 30 animaux à des parcs collectifs de 4 canards. Ce transfert n'excèdera pas 1 heure. 120 animaux seront épointés au couvoir à 1 jour d'âge par application d'un faisceau infrarouge sur la pointe du bec. 120 animaux seront dégriffés selon la même méthode, le faisceau infrarouge étant appliqué sur la pointe des griffes, parmi ces 240 animaux. 120 animaux seront à la fois épointés et dégriffés selon ces procédés.

Impact sur les animaux

En l’absence de traitement du bec, les animaux sont susceptibles d'exprimer des comportements mutuels d’arrachage des plumes (picages), pouvant amener à des lésions plus ou moins graves et donc à une altération de leur bien-être. Ce risque est généralement accru vers l'âge de 6 semaines. L'épointage est effectué au couvoir peu après l'éclosion par chauffe de la pointe du bec à l'aide d'un faisceau infra-rouge. Cette méthode inhibe la multiplication des cellules à la pointe du bec et limite son développement. L’épointage provoque également un stress et une douleur aiguë transitoires qui, chez les canards Pékin et Barbarie, se manifestent par des changements comportementaux (augmentation du repos et diminution des comportements nécessitant l'utilisation du bec tels que l’alimentation, l’abreuvement, le lissage des plumes et l’exploration) pouvant être observés jusqu'à 2 semaines après l’épointage. En l’absence de traitement des griffes et d'accès à l'extérieur pour assurer leur abrasion, les animaux sont susceptibles de se blesser mutuellement (griffures), notamment si le lot s’avère réactif à des évènements soudains (réactions au bruit notamment). Le dégriffage est une procédure similaire à l'épointage avec un traitement infrarouge sur l'extrémité des griffes afin de limiter leur croissance. Les canards en phase d’engraissement suivront une procédure de gavage, susceptible dans de rares cas où elle serait mal réalisée de générer des lésions dans leur oesophage. Le mode d’hébergement en loges collectives limitera leurs possibilités de mouvements, bien qu’en engraissement les animaux aient une activité amoindrie et plus de repos immobile lié à la digestion.

Devenir

Les animaux seront abattus en abattoir agrée en fin d'essai afin d'effectuer des mesures sur leurs performances zootechniques (poids des pièces de découpes: cuisse, magret, peau du magret, poids du foie, test de fonte).

Remplacement

Le comportement des animaux en élevage étant étudié, l’animal vivant ne peut pas être remplacé par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Réduction

960 animaux répartis en deux essais de 480 canards mulards mâles seront requis. Pour chaque essai cela représente 120 canards par modalité, soit 30 animaux par parc. Pour comparer statistiquement les modalités et détecter des différences entre-elles, un effectif minimal de 99 animaux par modalité est nécessaire, soit 25 animaux par parc. Après vérification sur des données de croissance pondérale d'un essai précédent, cet effectif permettra de différencier les lots dès un écart de moyenne de 343g. Ce projet étant le premier mesurant des paramètres liés à l'épointage et au dégriffage, un tel effectif permettra également de détecter des effets faibles lors de l’utilisation des tests statistiques. Afin de pallier les aléas expérimentaux, l'effectif par loge est fixé à 30 animaux pour s'assurer un nombre minimal de valeur pour tester statistiquement les hypothèses. L'hétérogénéité des réponses chez les canards mulards sera également prise en compte au sein de chaque modalité.

Raffinement

Les mesures de comportement seront réalisées par vidéos pour ne pas cause de stress par la présence d’un humain. Les mesures nécessitant la manipulation des animaux seront regroupées afin de limiter les contentions, qui seront réalisées sur le nombre minimal d'animaux nécessaire (25 par loge). Le transport de l'élevage à l'engraissement se fera parcs par parcs pour minimiser le temps passé en caisse de transport (moins d'1h). Les animaux seront élevés en groupe et surveillés quotidiennement. En engraissement avant chaque repas un contrôle du jabot sera effectué par le gaveur par palpation. Ce contrôle de la digestion permet de limiter le risque de blessures en limitant le volume du jabot et la dilatation de l'oesophage, en ajustant la dose d'aliment donnée. Cela permet aussi de détecter les éventuelles lésions. En cas de lésions sévères ou de perforation de l'oesophage l'animal est euthanasié car cette blessure est irréversible. Le gaveur étant entraîné à réaliser l'embucage, le nombre d'animaux lésés est rare. Le picage et les griffures pouvant occasionner des lésions sévères, une grille d’indicateurs sera mise en place afin de déterminer le point limite, c’est-à-dire le moment ou la souffrance et/ou la détresse de l’animal doit être pris en charge et des actions mises en place. La grille regroupe des critères auquel un score est attribué selon leur déviation d'un état normal (aspects : taille, poids, état du plumage, lésions ; physiologie : respiration, consommations ; comportement : agressivité, isolement, postures, boiteries, troubles de l’équilibre). Lorsque la déviation est mineure la surveillance est renforcée jusqu’à retour à un état normal. Les conditions d’ambiance pourront être modifiées (ventilation, température). En cas de déviation modérée des mesures sont prises pour atténuer la souffrance (nettoyage de la plaie, mise en infirmerie jusqu’à cicatrisation, modifications de la complexité de l’hébergement : ajout d’objets à manipuler, de litière…). En cas de déviation grave l'animal sera euthanasié si le retour à l’état normal est impossible ou nécessite un isolement prolongé, source importante de stress car le canard est un animal social. Si dans un parc au moins la moitié des animaux présentent des déviations modérées à sévères la surface de la loge pourra être doublée et le vétérinaire pourra être consulté.

Choix des espèces

Les travaux ont un objectif finalisé d’application au sein de la filière palmipède à foie gras (canard). Il n’est donc pas pertinent de choisir une autre espèce animale que le canard gras, et en l’occurrence le canard mulard mâle, espèce légalement autorisée pour la production de foie gras (règlement CE 1538/91 de la commission du 5 juin 1991, portant modalités d'application du règlement (CEE) n° 1906/90 du Conseil établissant des normes de commercialisation pour les volailles). Les animaux utilisés pour l’essai seront âgés de 1 à 94j. De 1 à 83j, ils seront élevés au sol en loges collectives de 6m². Seront suivis le comportement, l’état corporel et les performances des canards en élevage. Après transfert dans un autre bâtiment, les animaux seront engraissés par gavage de 84 à 95j en loges collectives afin de mesurer les effets potentiels des paramètres testés jusqu’à la fin du cycle de production classiquement suivi pour la production de foie gras. Seront suivis le comportement, l’état corporel et les performances des canards lors de l’engraissement par gavage. Ces âges correspondent à ceux retrouvés en élevage de canard gras standard.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles subissent des échocardiographies sous anesthésie et des tests d'effort sur tapis roulant, avant prélèvement terminal du coeur. Le porteur indique un déficit de poids dès la naissance et des points limites déclenchant la mise à mort en cas d'anomalie cardiaque. Cette caractérisation prépare un futur projet de test de candidats médicaments.

Objectifs

Dans cette Demande d'Autorisation de Projet, nous voulons caractériser finement le modèle souris du Syndrome de Barth en terme de suivi de poids, d'endurance, et de fonctionnement mitochondrial et cardiaque. Cette caractérisation permettra de mettre en avant des défauts du modèle souris qui serviront dans une future demande d'Autorisation de Projet où nous testerons la capacicté de candidats médicaments à supprmier ces défauts (dans l'optique de proposer un médicaments à des patients atteints du syndrome de Barth). Ce projet est conçu pour permettre le déroulement des procédures expérimentales de tests de composés médicaments, à suivre, dans les conditions les plus respectueuses de l’animal et de l’environnement.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome de Barth, dans nos animaleries afin de vérifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. La caractérisation du modèle souris au niveau du poids, du comportement, de la force musculaire ainsi que les analyses sur échantillons d'urine, de sang et d'organes seront réalisées dans une Demande d'Autorisation de Projet en cours. La présente demande d'Autorisation de Projet permet d'aller plus loin dans la caracterisation du modèle souris en réalisant échocardiogrammes et tests d'effort et d'endurance sur des appareillages uniquement présents dans une autre animalerie que celle où sont produits les animaux.

Procédures

pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants. - échocardiographies - tests d'endurance sur tapis roulant - prélèvements terminaux du coeur sur animaux sacrifiés

Impact sur les animaux

Les caractéristiques du phénotype dommageable décrites par nos collaborateurs sont les suivantes : poids inférieur de 20 à 25% dès la naissance, défaut au niveau des ventricules cardiaques (plus fins : fonctions diastolique et systolique réduites), défaut au niveau de la morphologie des mitochondries (augmentation de la taille, baisse dans la densité des crêtes). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse échographique nécesite une analyse sous anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données échographiques. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux du coeur. Afin d'utiliser au maximum tous les animaux, des prélèvements de coeurs seront effectués pour des analyses qui permettent d'évaluer l'état et le fonctionnement des mitochondries de coeurs. Si des défauts sont mis en avant chez la souris modèle du syndrome de Barth par rapport à la souris sauvage, nous pourrons par la suite, dans une prochaine demande d'Autorisation de Projet, tester la capacité des candidats médicaments à supprimer ces défauts.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés dans toutes les expérimentations de la procédure . Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés. Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 12 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 25% d’animaux en plus, soit 15 souris par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent grâce à la grille de score des points limites. Le poids sera suivi 2 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48h aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des mutants est inférieur de 20 à 30% dès la naissance : si on dépasse les 25% d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront élevés jusqu'au sevrage dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP juste après le sevrage et utilisés durant 6 semaines. En effet le déficit de poids se voit normalement dès la naissance, il est donc intéréssant de corréler ce déficit avec d'autres phénotypes délétères (fonctions cardiaques et test à l'effort/endurance). Avant d'utiliser les animaux nous attendons qu'ils soeint sevrés.