Procédures modérées

71 086 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent un produit par gavage quotidien, les femelles subissent des lavages vaginaux et les petits nés sont suivis jusqu'à l'âge adulte, avant mise à mort pour examen des organes. Le porteur présente ces tests de toxicité sur la reproduction comme "indispensables" et "nécessaires" réglementairement pour la mise sur le marché de produits. Les effets attendus incluent des atteintes de la gestation, de la mise-bas et du développement des descendants.

Objectifs

Ce projet permet l'évaluation de la toxicité d'un produit chez le rongeur (rat ou souris) sur les fonctions de reproduction et/ou le développement de la descendance ou d'animaux juvéniles, conformément aux lignes directrices : - ICH M3(R2), S5(R2): Pre- and Post-Natal Development (PPND) - OCDE 416 (Two-Generation Reproduction Toxicity Study) et OCDE 443 (Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study) - FDA- CDER Guidance for Industry, Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products. Les procédures peuvent être indispensables dans un dossier de mise sur le marché ou d'enregistrement d'un produit et permettre aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition (informations sur les effets toxiques majeurs : détermination d'une dose sans effet adverse afin de déterminer une marge de sécurité pour l'utilisation/l’exposition humaine).

Bénéfices attendus

A ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais aucun ne permet d’intégrer globalement l’impact sur la fonction de reproduction. Ce projet correspond aux tests nécessaires et reconnus règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce) de différents produits.

Procédures

Les animaux (adultes principalement, parfois des juvéniles) sont traités, le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière, avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux. Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle, observations ophtalmologiques, mesures de pattes, évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. Le produit administré peut cibler chaque phase du cycle de reproduction. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

En raison de la complexité des organismes vivants et des processus de développement, de conception et des échanges dynamiques entre mère et descendance, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’intégrer l’impact global sur la fonction de reproduction. Les tests in vivo de ce projet ne sont pas remplaçables et restent nécessaires règlementairement pour évaluer l’impact de l’exposition maternelle ou l’impact global sur la fonction de reproduction de différents produits (ex : médicaments, produits chimiques).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les procédures et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés à l’âge des animaux utilisés dans ce projet (ex : sonde de gavage, tube de contention). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. En cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation, etc.

Choix des espèces

Bien que le rat soit l’espèce la plus fréquemment utilisée, le rat et la souris sont des espèces de choix car : - elles sont recommandées par les lignes directrices, - elles présentent une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de petits générés par gestation, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rongeur, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - elles font l’objet de données historiques robustes. Le produit sera administré à des animaux adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement) car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements, pour évaluer l’effet du produit sur l’appareil reproducteur. Dans certaines études, le produit pourra également être administré aux juvéniles pour évaluer l’effet sur le développement ou dans le cadre de produits pharmaceutiques à visée pédiatrique. Ces âges sont requis par les lignes directrices et/ou correspondent aux âges d'utilisation chez l'humain. Sauf dans les cas ci-dessus, les petits qui naissent dans le cadre des études ne sont pas traités avec les produits mais sont suivis pendant la lactation ou jusqu'à l’âge adulte (selon les lignes directrices ; observation de la survie et du développement de la descendance).

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont isolées quinze jours puis placées en cages métaboliques, le porteur reconnaissant que l'isolement et le passage en analyseur de masse corporelle provoquent un stress modéré. L'étude vise à caractériser le comportement alimentaire et la dépense énergétique de souris porteuses d'une mutation liée à l'obésité. Le porteur affirme que l'exploration du métabolisme énergétique ne peut se faire que sur un "organisme entier".

Objectifs

Lors des dernières décennies, l'obésité et le surpoids ont atteint les proportions d’une épidémie mondiale impactant 1.9 milliard d’adultes en surpoids et plus de 650 millions d’obèses en 2016. Plusieurs études ont clairement montré que les voies de l’immunité innée sont impliquées, notamment via leur activation par les bactéries du microbiote intestinal, dans la mise en place de l’obésité et des maladies métaboliques qui y sont associées. Récemment une nouvelle voie de l’immunité innée a été identifiée. Cette voie implique un récepteur intestinal. Chez l’homme, des mutations du gène de ce récepteur ont été associées à l’obésité, à la prise de poids et au diabète de type 2. Une lignée de souris mutées pour ce récepteur a donc été développée afin de mieux caractériser les effets de cette voie de signalisation sur la mise en place de l'obésité et afin de comprendre les mécanismes sous-jacents liant cette voie à l’obésité. Par rapport à des souris contrôles issues de la même fratrie, la prise de poids de ces souris en réponse à un régime riche en lipides est réduite de 20%. Cependant aucune mesure de la structure détaillée des repas ainsi que des données sur la balance énergétique ne sont disponibles à ce jour. Or il a clairement été montré que la structure des repas (quantités d'aliments ingérés, taille, heure et fréquence des repas) ainsi que le statut de la balance énergétique sont déterminants dans la prise de poids. Afin d’identifier les mécanismes liant ce récepteur et la prise de poids il est nécessaire de caractériser précisément la structure des repas, de même que la dépense énergétique des animaux et leur composition corporelle précise. L’ensemble de ces paramètres peuvent être obtenus de manière non invasive via l’utilisation de cages métaboliques et d'un analyseur de la composition de la masse corporelle.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes régulant le comportement alimentaire et la dépense énergétique est essentiel dans le cadre de la lutte contre les maladies métaboliques telles que l’obésité. En effet l’obésité, pandémie mondiale aux conséquences médicales et économiques multiples et dévastatrices, est une pathologie résultant d'une dérégulation de la balance énergétique et implique notamment une dérégulation de la prise alimentaire et/ou de la dépense énergétique. Le modèle de souris portant une modification du recepteur intestinal, compte tenu de la résistance à l'obésité qu'elles développent indique que l'étude de cette voie de signalisation et de son lien avec le comportement alimentaire et/ou la dépense énergétique peut permettre la découverte de nouvelles cibles therapeutiques utiles dans la lutte contre l'obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis à un isolement durant 15 jours. L’analyse métabolique ( 8 jours) n’induit pas de douleur à l’animal, elle ne necessite pas de médicamentation. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal. Aucun prélévement n'auront lieu sur animal vigile. Les animaux seront monitorés tous les jours, ils seront pesés: 1 fois/ jours (2 minutes/animal) lors de l'individualisation, puis 1 fois à l'entrée et à la sortie des cages calorimétriques. Leur composition coporelle analysée (3 minutes/animal) de maniére non invasive 1 fois au debut de l'individualisation puis à l'entrée, lors du changement de régime et à la sortie des cages calorimétriques, soit 4 fois durant l'expérience.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée totale de l'isolement des animaux est de 15 jours. De même les souris seront placées pendant 2 minutes dans un analyseur de masse corporelle. Cette technique bien qu'étant non invasive peut entrainer un stress modéré durant le temps de l'analyse. Aucune douleur n'est attendue durant le protocole. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux sera surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 10% du poids initial. L’analyse métabolique n’induit pas de douleur à l’animal. Elle est non invasive pour l’animal et limite au maximum le stress de l’animal.

Devenir

Aprés que les animaux sont retirés des cages métaboliques, leurs poids et leurs composition corporelle évaluées. Il n 'y a pas de nécéssité de conserver les animaux, ainsi les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre immunité innée/régime alimentaire et comportement alimentaire/dépense énergétique/composition corporelle. Enfin, l’exploration du métabolisme énergétique et des comportements attenants ne peut se faire que sur un organisme entier, en raison de l’organisation et de la coopération des tissus métaboliques actifs.

Réduction

Afin de réduire de nombre d'animaux nous proposons dans cette étude d'étudier le comportement alimentaire, la dépense énergétique et le composition corporelle sur les mêmes animaux. D’après les études de comportement déjà menées en laboratoire, nous estimons que 8 souris par groupe expérimental sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives (P value de 5% avec une puissance de 80% ) compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. La lecture métabolique effectuée sur plusieurs jours permettra de réduire la variabilité intrinsèque de l’animal et inter animal, et limite le nombre d’animaux utilisés. Enfin le changement de régime au cours de l'analyse et sur les mêmes animaux permettra aussi d'évaluer les capacités adaptatives de l'animal lors d'un changement de régime.

Raffinement

L'analyse calorimétrique et la mesure de la composition corporelle sont deux analyses non invasives. -L’animal est hébergé dans une cage d’hébergement classique (500 cm2) dans le système de calorimétrie indirecte. -Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, un abri en propylène rouge ainsi que deux carrés de coton et une nacelle pour faire leur nid. -les capteurs sont encastrés dans le couvercle de la cage et ne gênent pas l’animal, -l’air des cages est renouvelé à un taux de 2litres/min (débit calibré pour une mesure précise de la consommation de O2 et la production de CO2). Le mal-être a des conséquences directes sur les paramètres de la balance énergétique (prise alimentaire, activité locomotrice, dépense énergétique) et in fine sur la qualité et la validité des données obtenues. Pour cela, les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle plus suivi de la prise alimentaire et hydrique et du gain de poids). Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés et calculés quotidiennement au moyen du système de calorimétrie, le tout est effectué de manière automatique, de jour comme de nuit et sans intervention de l’opérateur. Des points limites et des critères d'arrêt de l'expérience ont été prévu en cas d'anomalie de comportement ou d'alimentation. Si un de ces paramètres affiche une valeur anormale, l'opérateur/responsable en recherchera l'origine.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est le seul modèle de souris transgéniques disponible qui permet d’étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude du métabolisme et est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation. de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre souris et homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris et du transport intestinal du fructose sont un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les animaux adultes (entre 10-12 semaines) seront utilisés. c'est à dire à l’âge adulte : (1) lorsque toutes les structures cérébrales sont stabilisées pour ne pas impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au cours du temps ; (2) la masse de l’animal est plus stable à l’âge adulte ce qui permet une analyse fiable et robuste durant le temps de l’expérimentation.

6 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs veines saphènes sont traitées sous anesthésie par six techniques utilisées contre les varices humaines, avec un suivi échographique jusqu'à 28 ou 56 jours, avant mise à mort pour analyse des veines. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu car la sécurité est déjà validée chez l'humain, et surveille malgré tout hématomes, brûlures et nécroses. Il décrit le mouton comme le "modèle de référence" pour évaluer les traitements vasculaires.

Objectifs

Les varices sont des manifestations de la maladie veineuse chronique et leur prévalence est estimée à 25%. Elles sont liées à une perte d'élasticité des parois veineuses et à leur élargissement, ou à des lésions des valvules veineuses qui ne fonctionnent plus correctement. Plusieurs techniques sures et efficaces sont disponibles mais les mécanismes d’actions locales sur la paroi veineuse n’ont été que très peu analysés. L’objectif du projet est d’étudier six techniques existantes afin d’identifier les mécanismes d'action et les réactions inflammatoires locales.

Bénéfices attendus

Les varices sont des manifestations de la maladie veineuse chronique et leur prévalence est estimée à 25%. Les complications si les varices ne sont pas traitées sont des ulcères veineux. Le coût du traitement des ulcères veineux de jambe est très élevé ; le traitement des varices peut réduire l’incidence des ulcères de jambe de 50%, est il est donc très interessant d'un point de vue médiccal, économique et sociétal. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives les varices. Cette étude permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de ces différentes techniques existantes des traitements de varice et aidera à terme le praticien à choisir la technique la plus adaptée en fonction du type de patient à traiter et de limiter les risques de récidives.

Procédures

Les veines saphènes, des brebis, seront traitées par différentes techniques utilisées chez l’homme pour le traitement des varices (Radiofréquence, laser 980 nm ou 1940 nm, clarivein, veinaseal, mousse fibroveine) . Le jour du traitement, la zone à traiter sera marquée et des mesures seront effectuées par échographie. Le traitement se fera sous anesthésie et dure environ 20 minutes par veine saphène. Un suivi échographique aura ensuite lieu 7 jours, 14 jours puis 28 jours après le traitement. Si nécessaire, les animaux seront sédatés pour cet examen. Au bout de 28 jours, 3 brebis seront mises à mort après prélèvement de leurs veines saphènes traitées sous anesthésie générale dans le but de faire une analyse anatomopathologique. Les 3 dernières brebis auront une nouvelle échographie 56 jours après le traitement avant d’être aussi mises à mort après prélèvement de leurs veines saphènes traitées sous anesthésie générale dans le but de faire une analyse anatomopathologique. Pendant la première semaine post-traitement la zone traitée sera inspectée quotidiennement afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.

Impact sur les animaux

Le traitement se fera sous anesthésie et analgésie et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendue. A l'issu du traitement, aucun effet indésirable n’est attendu car la sécurité de la procédure est déjà largement validée chez l’homme. Les points à surveiller seront la réaction de la peau dans la zone de traitement : hématome au point de ponction, matting de la peau (cordon marron le long du trajet de la veine), brûlure, nécrose.

Devenir

Les six brebis du projet seront mises à mort à la fin de l'étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter les points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant. Le modèle ovin est le modèle de référence pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires.

Réduction

Le traitement sera appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons de veines saphènes. Un minimum de 6 brebis est nécessaire (soit 12 veines saphènes) pour évaluer les 6 traitements avec des prélèvements des veines saphènes à deux temps (J28 et J56).

Raffinement

Les brebis arriveront sur place au minimum une semaine avant la procédure pour leur permettre de s’habituer au lieu et ainsi de diminuer leur stress. Les ovins étant des animaux grégaires, les brebis seront logées en groupe, sur une litière de paille afin de les occuper et auront accès à de l'eau et du foin ad libitum pour respecter leur fonctionnement de ruminants. De plus, le personnel animalier observera régulièrement le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. Durant le traitement, les brebis seront placées sous anesthésie générale avec une association médicamenteuse permettant d’obtenir un effet anesthésique et analgésique. Afin d’éviter le dessèchement de leur cornée, une pommade ophtalmique est appliquée dans leurs yeux. Enfin, durant les examens angiologique, si les animaux présentent des signes de stress ou d’agitation, ils sont sédatés ou anesthésiés selon l'avis du vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est recommandé comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme (diamètre et profondeur des veines saphènes) et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié pour évaluer l'occlusion veineuse. Les animaux sont adultes afin d'avoir une structure comparable à l'homme. De plus, certains animaux étant gardés plus de deux mois, il n'est pas possible d'utiliser des animaux en croissance..

135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué, puis leur mémoire spatiale est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes, répété plusieurs fois par jour sur plusieurs jours, pour étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale. Le porteur décrit un déficit moteur et sensoriel faible et transitoire, qui disparaîtrait en trois jours. Les retombées pour les patients victimes d'AVC sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre la contribution des plaquettes.

Objectifs

En France, l'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, c’est à dire l’occlusion d’un vaisseau cérébral par un caillot sanguin, touche une personne toutes les 4 minutes. Les conséquences d’un AVC sont sévères : 25% des patients décèdent de leur AVC, 40% garderont un handicap et 25% développeront une démence. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang soit un dispositif médical permettant de le retirer mécaniquement. Malheureusement, ces traitements ne sont possibles que lors des 6 premières heures après la survenue de l’AVC ce qui limite considérablement leur utilisation. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements pour étendre la fenêtre thérapeutique à la phase aiguë de l'AVC, mais aussi pour améliorer la réparation et /ou la récupération des dommages neurologiques post AVC. Des études récentes ont montré que des thérapies ciblant l’inflammation cérébrale pouvaient stimuler la modification structurale ou fonctionnelle du réseau neuronal (remodelage cérébral) et favoriser la récupération post-AVC à long terme, sur le plan de la motricité mais aussi en limitant/empêchant la démence. Un caillot sanguin est formé essentiellement de plaquettes. Ces dernières jouent un rôle essentiellement dans la coagulation du sang mais sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs pertinents d'autres processus physiopathologiques, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. A ce jour, leur contribution à la réparation neurovasculaire n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase aiguë. Étant donné que les plaquettes peuvent produire des facteurs favorisant le remodelage cérébral et/ou neuroprotecteurs, elles pourraient être impliquées dans les processus de remodelage cérébral après un AVC. L’objectif de ce projet vise à étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale à long terme, et en particulier les conséquences d’un déficit en plaquettes sur la mémoire et l’apprentissage à long terme dans un modèle murin d’AVC.

Bénéfices attendus

L’AVC ischémique est aujourd’hui la 2nde cause de démence dans le monde, faisant d’elle une maladie chronique. Les plaquettes étant des réservoirs de facteurs neurotrophiques (protéines responsable de la croissance et de la survie des neurones) et de réparation cérébrale, facteurs connus pour être impliqués dans les processus de remodelage cérébral à long terme, il est nécessaire de comprendre leur contribution dans le développement de ces troubles de la mémoire. L’étude des mécanismes de mémoire et d’apprentissage dans des modèles d’AVC à long-terme nous permettrait ainsi d’obtenir une première réponse quant au rôle des plaquettes dans les processus de réparation post-AVC à long terme et dans le développement de ces troubles de la mémoire.

Procédures

Le Barnes maze consiste à explorer la mémoire spatiale, c’est-à-dire le temps mis par la souris pour se souvenir de l’endroit où a été placée une boite noire sous un labyrinthe circulaire de 20 trous. C’est une procédure observationnelle sans geste technique. La souris est placée dans un labyrinthe de Barnes permettant d’évaluer le temps nécessaire à une souris pour se souvenir de l'emplacement d'une zone cible. La souris sera simplement observée pendant 4 minutes. Cette phase d’observation sera réalisée 3 fois par jour pendant 4 jours, puis renouvelée 1 fois sur une journée après 2 jours de repos (même zone cible) et enfin pendant 3 jours en changeant l’emplacement de la zone cible. Entre chaque essai sur une journée, les souris seront laissées 1h au repos.

Impact sur les animaux

Ce modèle d’AVC conduit à un faible déficit et transitoire de la fonction motrice et sensorielle. Ces troubles disparaissent en quelques jours (3 jours en général)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet dans un autre établissement pour lequel une autorisation a déjà été obtenue.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place de manière intégrée au cours du temps après l’accident vasculaire cérébral, en particulier le comportement de la souris tels l’apprentissage et la mémoire.

Réduction

Les modèles d’AVC développés chez la souris sont parfaitement connus et maitrisés par les membres de l’équipe impliqués dans ce projet, ce qui permet l’évaluation précise du nombre d’animaux nécessaire afin de réaliser des statistiques ayant une puissance suffisante pour interpréter les résultats.

Raffinement

Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentées, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. Le bien-être de l’animal est également assuré par un enrichissement de son milieu environnemental (coton pour nidification). La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. En cas de douleurs, l’administration d’antalgique et d’analgésie sera réalisée. Si la douleur persiste, l’animal sera euthanasié. L’évaluation du comportement neurologique n’est pas douloureuse ; il s’agit de données d’observation. Toutes les précautions environnementales sont prises pour éviter le stress de l’animal. Les souris seront isolées dans une pièce calme adaptée à l’évaluation cognitive réservée exclusivement aux animaux de ce projet.

Choix des espèces

En se basant sur les nombreuses publications au sein de notre laboratoire, Les souris mâles seront évaluées sur le plan cognitif à l'âge adulte (fin des tests à 6 semaines après l'induction de l'accident vasculaire cérébral réalisée chez des souris adultes de 12 semaines). Nous utilserons que des souris mâles pour eviter des interférences avec le cycle hormonal des femelles.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une irradiation localisée du côlon à dose unique pour provoquer des lésions tardives, puis sont tuées afin de prélever le côlon. Le porteur indique une dépilation de l'abdomen et affirme qu'à cette dose les animaux ne perdent pas de poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour étudier ces séquelles des radiothérapies pelviennes.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne

Bénéfices attendus

La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers. L’objectif des médecins est la recherche d’un compromis entre le contrôle des tumeurs et la limitation des dommages aux tissus sains autour de la tumeur. En effet, dans le cas du traitement des cancers en zone abdominale, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon ou le rectum qui sont des « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement de leur épithélium muqueux. La toxicité induite par la radiothérapie du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, et donc impacter fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Le nombre de patients survivants au traitement d’un premier cancer et leur durée de vie augmentent grâce aux progrès de la médecine. L’augmentation de cette survie est associée à une augmentation du risque de complications. Une prise en charge globale du traitement du cancer intégrant le suivi des patients à long terme (> 20ans) est donc indispensable. De plus, réduire les risques de séquelles du traitement du cancer dans sa globalité et améliorer la qualité de vie des patients est un objectif du troisième plan cancer. À ce jour, la complexité physiopathologique de la PRD encore mal décrite, associée au contexte septique intestinal, limite l’efficacité des thérapies disponibles ainsi que la mise en place de nouvelles thérapies efficaces et pérennes. Les options thérapeutiques disponibles pour le traitement des complications des radiothérapies sont insuffisantes. Ce projet, utilisant des techniques d’exploration innovantes, permettra d’améliorer les connaissances sur l’effet des irradiations sur le tissu colique et de déterminer des nouvelles voies de traitement.

Procédures

Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane pour la réalisation de l’irradiation localisée (max 20 min)

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation locale du colon à la dose unique de 26 Gy, les souris vont avoir une dépilation au niveau de l’abdomen (zone irradiée). A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Les animaux sont observés tous les jours. Les animaux présentant une perte de poids trop importante seront euthanasiés

Devenir

Les animaux seront euthanasiés, les colons seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Le développement des séquelles coliques nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vaisseaux, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes.

Réduction

Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaire (Cytométrie en flux, single cell, culture et co-culture) et moléculaires des groupes de 20 animaux sont nécessaires. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux : one- way ANOVA suivi d’un test de Tukey.

Raffinement

Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation afin d’avoir développement des lésions attendues : utilisation de la dose de 26 Gy qui ne génère pas d’ulcères tardifs graves du colon mais de la fibrose comme les patients qui ont bénéficié d’une radiothérapie fractionnée. - Hébergement en groupe (5 animaux par cage) avec enrichissement (coton et igloo en carton) -Observation quotidienne des animaux suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration) - Les animaux seront pesés régulièrement.

Choix des espèces

Le modèle d’irradiation de la souris permet de reproduire des lésions colorectales similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (8 semaines).

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une microchirurgie du cerveau sous anesthésie puis des enregistrements EEG sous contention répétés sur vingt-trois jours, avant d'être tués pour prélever sang et cerveau, afin de tester une molécule anti-épileptique. Le porteur indique des douleurs liées au cadre stéréotaxique et un stress lié à la contention. Il présente ce modèle génétique d'épilepsie absence comme "incontournable" pour évaluer un nouveau médicament.

Objectifs

L'épilepsie est le syndrome neurologique le plus répandu, avec environ 70 millions de patients dans le monde. Elle se caractérise par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, comme une absence de manifestation visible caractérisant les épilepsies absences, ou des convulsions généralisées très spectaculaires dans beaucoup de formes d’épilepsies. Il existe de nombreux médicaments anti-épileptiques (MAEs) sur le marché, dont l’objectif est de contrôler (supprimer) les crises d’épilepsie. Néanmoins, 30 % des patients ne peuvent pas être libérés des crises malgré le large panel de MAEs disponibles. Le développement de nouvelles molécules, est donc nécessaire. C’est le sens de ce projet, visant à évaluer une nouvelle molécule dont les bénéfices ont déjà été démontrés in vivo. Il envisage de tester l’effet de la molécule sur un modèle rat d’épilepsie absences reconnu comme un modèle classique d’épilepsie généralisée d’origine génétique.

Bénéfices attendus

Les épilepsies absences affectent majoritairement les jeunes enfants. Le nombre journalier de crises peut être très élevé. Au-delà de l’impact immédiat que ces crises peuvent avoir au moment où elles se produisent (le jeune patient apparaît pour l’extérieur comme « dans la lune »), les crises peuvent altérer profondément les performances scolaires, via des mécanismes de défaut de consolidation mnésique durant le sommeil, induisant de ce fait des retards importants dans les différents apprentissages. Le développement de MAEs pertinents dans ce syndrome pourrait permettre de maintenir à un bon niveau les capacités d’apprentissage et de mémoire. De surcroît, au-delà de l’intérêt direct pour cette forme d’épilepsie, l’épilepsie absences est un modèle d’épilepsie généralisée d’ordre génétique incontournable pour l’évaluation d’un nouveau MAE.

Procédures

Micro Chirurgie cérébrale sous anesthésie général et analgésie, 30 min par rat sur 48 rats. Limitation de mobilité légère (monitoring EEG), 10 X 3h étalé sur 23J sur 48 rats.

Impact sur les animaux

Des douleurs (prise en charge par l’anesthésie et l’analgésie) liées au placement de l’animal dans le cadre stéréotaxique et à l'incision de la peau au dessus du crâne. Stress momentané (quelques minutes) dû à la contention de l’animal nécessaire pour connecter le système électroencéphalographique au rat.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement du sang et du cerveau

Remplacement

Les processus physiopathologiques conduisant à la récurrence des crises épileptiques sont différents d’un syndrome à un autre. Il n’est pas donc pas envisageable d’utiliser une approche in-vitro, encore moins in-silico, en remplacement de l’approche in-vivo puisque le trait évalué (fréquence des crises épileptiques) correspond à la réponse mettant en jeu tout un processus physiologique intégré chez un sujet respirant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit autant que possible tout en garantissant l’atteinte de l’objectif scientifique visé. Ainsi, la taille des échantillons a été calculée de sorte à mettre en évidence de façon statistique une réduction de 30% de la fréquence des crises épileptiques.

Raffinement

Le protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Ceci se traduit par une visite quotidienne à l’animalerie pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. En outre, avant les procédures chirurgicales et les enregistrements EEG, les rats seront emmenés aux salles d’expérimentation, pour habituation et diminution du stress induit par la nouveauté.

Choix des espèces

Ce modèle génétique d’épilepsie absences établi chez le rat a été validé aussi bien pour la période d’installation de l’épilepsie (épileptogénèse) que pendant la période où l’animal est considéré comme présentant une épilepsie stabilisé. Dans ce modèle d’épilepsie absences, les crises apparaissent spontanément et progressivement à partir de l’âge de 2-3 mois chez tous les rats et se stabilisent à l’âge de 6 mois, atteignant alors un plateau. Nous réaliserons donc les chirurgies et les enregistrements EEG à partir de l’âge de 6 mois.

104 cochons vont être utilisés, 26 truies et 78 porcelets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les animaux étant gardés vivants dans l'élevage expérimental à l'issue. Les truies subissent des prises de sang au lasso nasal, des collectes de fèces après stimulation anale et des traites précédées d'une injection d'ocytocine, les porcelets étant séparés de leur mère quarante minutes avant chaque prélèvement. Le projet décrit les oligosaccharides du lait de truie pour la filière porcine, avec l'objectif affiché de réduire les troubles digestifs des porcelets au sevrage. Le porteur reconnaît la contention comme stressante et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour des animaux de ce poids.

Objectifs

Les oligosaccharides sont des composés du colostrum et du lait, présentant une grande diversité de structure, non digérés par les jeunes mammifères mais utilisés par les bactéries intestinales. Dans l’espèce humaine, ils auraient des effets bénéfiques sur le microbiote intestinal des bébés (effet prébiotique), contre des pathogènes, bactéries, virus et parasites (effet anti-adhésion) et sur l’activité des cellules intestinales épithéliales et immunitaires. Leurs effets dépendraient de leur structure. Chez les animaux d’élevage, cependant, leurs bénéfices sont peu ou pas connus. En élevage porcin, les porcelets sont très susceptibles aux troubles digestifs (diarrhées notamment), qui sont généralement traités par des antibiotiques. Dans l’enjeu de démédication des élevages et d’amélioration du bien-être des animaux, il est impératif de développer des stratégies préventives qui permettent d’améliorer la santé des porcelets. Dans ce contexte, le projet vise d’abord à décrire les oligosaccharides du lait de truie et leur diversité de structure et ensuite à étudier les liens entre ces profils en oligosaccharides du lait et le microbiote intestinal et la santé des porcelets.

Bénéfices attendus

A court terme, les données sur les oligosaccharides du lait de truie, quantité et diversité de structure, alimenteront une base de données multiespèce qui sera mise à disposition dans un répertoire public. Le projet apportera aussi des connaissances nouvelles sur le lien entre les profils d’oligosaccharides et la santé intestinale des porcelets allaités. A plus long terme, ces connaissances permettront de tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets, en étudiant les effets d’oligosaccharides spécifiquement identifiés comme potentiellement bénéfiques. Nous fournirons ainsi des pistes à la filière porcine pour développer un aliment premier âge pour porcelet allaité qui serait enrichi en oligosaccharides bénéfiques, aliment qui permettrait de réduire les problèmes digestifs des porcelets au sevrage, une phase critique en élevage.

Procédures

Les truies seront soumises à une prise de sang (à 109 jours de gestation), une collecte de fèces (à 6 jours de lactation), une collecte de colostrum à la mise bas et 3 collectes de lait à 6, 20 et 27 jours de lactation. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. Si une stimulation anale légère est nécessaire pour stimuler la défécation, celle-ci ne dure pas plus d’une minute. La traite pour collecter le colostrum et le lait dure entre 5 et 15 minutes. Les porcelets seront soumis à 3 prises de sang et 3 collectes de fèces à 6, 20 et 27 jours d’âge. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes et celle de la collecte de fèces est limitée à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La prise de sang par ponction dans la veine jugulaire nécessite de tenir la truie au lasso nasal afin qu’elle soit la plus rapide et la moins douloureuse possible. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. Cette contention, même brève, est stressante pour la truie. A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative approuvée et utilisable de manière systématique sur des animaux de cet âge, de ce poids et de cette force. Les truies sont récompensées par un morceau de pomme à l’issue de la procédure. La collecte de fèces est réalisée à la défécation naturelle ou après stimulation anale légère, donc sans stress ni douleur. La collecte de colostrum n’entraine pas de douleur et tout au plus une gêne de la truie à l’approche des expérimentateurs. Par contre, chaque prélèvement de lait nécessite de séparer les porcelets de leur mère pendant 40 minutes avant le prélèvement. Les porcelets sont alors placés dans une caisse placée à proximité de leur mère afin de réduire le stress engendré chez les porcelets et la truie. Cette séparation est requise pour que le lait s'accumule dans la mamelle, elle facilite la traite. Les porcelets sont remis avec leur mère dès la fin du prélèvement. Le prélèvement de lait nécessite aussi une injection préalable d’ocytocine en intramusculaire afin d’induire l’éjection du lait, engendrant la douleur de la piqure. Les porcelets seront soumis à 3 prises de sang et 3 collectes de fèces à 6, 20 et 27 jours d’âge. La prise de sang est faite dans la veine jugulaire avec un dispositif de type Vacutainer en maintenant les porcelets immobilisés en décubitus dorsal. L’immobilisation ne dépasse pas 5 minutes et la durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. La collecte de fèces est réalisée sur des porcelets allaités. Le lait étant très digestible, l'obtention de quelques grammes de fèces peut être difficile, notamment à 6 et 20 jours d’âge. Elle nécessite de tenir le porcelet et de faire une stimulation anale avec un thermomètre tout en appuyant sur l’abdomen. Mais cette étape ne sera pas nécessaire pour tous les porcelets car la collecte se fait au moment de la prise de sang qui favorise la défécation. La durée de contention de chaque porcelet est limitée à 5 minutes.

Devenir

Le projet sera mené sur des truies et leurs porcelets jusqu'à la fin de la période d'allaitement. Les porcs sont ici l'espèce cible du projet qui consiste à apporter des éléments scientifiques sur le lien entre des composés spécifiques du lait, les oligosaccharides, et le microbiote et la santé intestinale des porcelets. Les connaissances serviront de base pour tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets sous la mère qui permettrait de réduire les problèmes diggestifs des porcelets au sevrage. En élevage porcin, le sevrage est une phase critique pour les porcelets. Truies et porcelets poursuivent leur carrière dans l'élevage expérimental.

Remplacement

Les deux objectifs du projet sont de décrire les profils en oligosaccharides du colostrum et du lait de truie et d’étudier les liens entre ces profils et le microbiote intestinal et la santé des porcelets. Le projet porte donc sur le continuum truie-sécrétions lactées- porcelets et nécessite d’être réalisé sur des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus est de 104 au maximum ; il correspond à 26 truies et 78 porcelets (3 porcelets/portée x 26 portées). Le nombre de truies (26 truies à la mise bas pour au final 20 truies avec un jeu de données complet) est suffisant et nécessaire pour décrire les profils en oligosaccharides du lait et leur variabilité au sein de truies d’un même génotype, d’un même élevage et conduites de la même façon. Il est suffisant aussi pour suivre la cinétique d’évolution de ces profils sur 4 semaines de lactation. Pour les porcelets, seul un nombre limité de porcelets par portée seront soumis aux interventions invasives. Ils seront représentatifs des porcelets de poids moyen dans la portée. Le choix de 2 et 3 porcelets pour les collectes de sang et de fèces permet d’évaluer l’effet de la mère dans les analyses. Deux ou 3 porcelets sur 20 portées (au final) permettent aussi de suivre la cinétique d’évolution du microbiote fécal et des indicateurs de santé des porcelets pendant leur phase d’allaitement. Ce choix est basé sur nos expériences précédentes, validées. Les cinétiques seront étudiées par analyse de variance comportant l’effet temps de prélèvement et l’effet truie.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel expérimenté et en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée des contentions des truies et des porcelets sera limitée à 5 minutes. Les prises de sang seront stoppées au bout de 2 minutes. Les collectes de fèces seront aussi interrompues si sans succès au bout de 5 minutes. Truies et porcelets seront particulièrement surveillés après chaque intervention invasive.

Choix des espèces

Le projet sera mené sur des truies et leurs porcelets jusqu'à la fin de la période d'allaitement. Les porcs sont ici l'espèce cible du projet qui consiste à apporter des éléments scientifiques sur le lien entre des composés spécifiques du lait, les oligosaccharides, et le microbiote et la santé intestinale des porcelets. Les connaissances serviront de base pour tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets sous la mère qui permettrait de réduire les problèmes diggestifs des porcelets au sevrage. En élevage porcin, le sevrage est une phase critique pour les porcelets. Le projet porte sur la transmission d’éléments de la truie aux porcelets via le colostrum et le lait. Il utilise donc des truies en lactation et des porcelets allaités par ces truies.

1 088 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un surdosage de paracétamol par injection pour provoquer une atteinte du foie, puis sont tuées par dislocation cervicale afin de prélever foie, rate et reins. Le porteur affirme que le surdosage entraîne un inconfort mais aucune douleur dans les vingt-quatre heures. Sur le remplacement, il affirme que l'intoxication au paracétamol est un processus complexe non modélisable in vitro et une étape préclinique "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de trouver de nouveaux traitements de l'insuffisance hépatique induite par le paracétamol.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements de l'intoxication au paracétamol basés sur l'utilisation de la N-Acétyl Cystéine et d'inhibiteurs de nécrose régulée.

Procédures

Deux injections intrapéritonéales pour procédure 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs", une injection intrapéritonéale et une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie isoflurane pour procédure 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse", et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale avant sacrifice par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Le traitement par un surdosage contrôlé de paracétamol entraine certes un inconfort des animaux mais il n’est pas accompagné de douleurs dans les 24h qui suivent son injection (actions antalgique et antipyrétique du paracétamol).

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après la procédure n° 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs" (soit 960 souris) ou la procédure n° 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse" (soit 128 souris). Tous les animaux (1088 souris) sont mis à mort après la procédure n°3 "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale" afin de prélever les différents organes (rate foie et reins) pour les analyses.

Remplacement

S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celle posée dans notre projet cherche à identifier le rôle protecteur d’une molécule vis-à-vis d’une pathologie, l’intoxication au paracétamol qui implique un grand nombre d’évènements moléculaires et cellulaires. Cette pathologie est un processus complexe non modélisable in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris engagées (1088) dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques par des tests non paramétriques Kruskal-Wallis, Mann et Whitney et Spearman.

Raffinement

L’étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaise induits par le traitement. Enfin nous avons anticipé l’étude de tous les organes pertinents (3) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d’informations.

Choix des espèces

Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Adulte de 9 semaines pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes.

2 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie puis reçoivent des traitements ou des vaccins, l'infection étant létale chez la souris transgénique hACE2 avec atteinte du système nerveux central. Le porteur indique que la mise à mort est imposée par la gestion du risque lié à l'agent pathogène. Il présente cette recherche sur modèles animaux comme "essentielle" à la gestion de la crise sanitaire.

Objectifs

Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SRAS- CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SRAS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SRAS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire des rongeurs modèles de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SRAS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, en particulier muqueux, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SRAS-CoV-2.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.

Procédures

L’inoculation de la souche virale est réalisée en 8 minutes, par voie nasale sous anesthésie à l’isoflurane, en prise unique. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés en 2 minutes, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire à l’animal vigile. Le traitement par voie nasale est administré en 8 minutes sous anesthésie à l’isoflurane. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés en 10 minutes, au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié. Le volume de sang prélevé est de 100 à 300 μl selon l’espèce.

Impact sur les animaux

Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SRAS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection. En revanche, dans les mêmes conditions, l’infection est létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires. Cette lignée de souris est la seule à ce jour qui présente une létalité. L’impact physiopathologique de l’infection des autres lignées de souris utilisées dans ce projet sera systématiquement évalué. Il a été observé que l’infection de souris non transgéniques pour hACE2 par la souche murinisée MACo3 entraîne des symptômes légers ou modérés.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies vaccinales et thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées (cellules VeroE6 ou Calu3). L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 ainsi que le choix de l’antigène vaccinal sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Les modèles d’infection à SRAS-CoV-2 chez les rongeurs sont validés et totalement maîtrisés. L’utilisation de la souche historique française dénommée D614G définit les conditions standard des protocoles expérimentaux auxquelles se réfèrent l’étude des variants préoccupants ou VoC. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de Répétabilité et Reproductibilité satisfaisantes. La comparaison des traitements s’établit à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney).

Raffinement

Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les hamsters sont hébergés individuellement et les souris par 5 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SRAS-CoV-2 et représente un modèle de choix pour étudier la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires, l’animal contrôlant naturellement l’infection. La souris transgénique K18 ou KI exprime le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 et permet le développement clinique et virologique des infections à SRAS-CoV-2. La souris non transgénique pour hACE2 est sensible à l’infection par la souche murinisée MACo3 et présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des hamsters ou des souris de 6 à 8 semaines d’âge. Mais des hamsters plus âgés (> 6 mois) pourraient être enrôlés dans des études spécifiques selon l’évolution des connaissances.