Procédures modérées

60 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort prévue, les animaux étant réintégrés dans la colonie de l'établissement pour être réutilisés. Sensibilisés à des allergènes pour développer une dermatite atopique, ils présentent érythème, papules, pustules et démangeaisons, et subissent des prélèvements de sang à la jugulaire ainsi que des biopsies de peau. Le projet sert à tester des molécules vétérinaires sur l'espèce cible. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit cette maladie, la complexité des mécanismes n'étant pas selon lui reproductible in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place des modèles de Dermatite Atopique Canine (DAC) aigus chez le chien, et de maintenir la sensibilisation afin d’obtenir un modèle de DAC subchronique, et d’utiliser ces modèles pour la sélection de futures molécules thérapeutiques pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché. La maîtrise de ces modèles permettra d’évaluer primairement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation (interleukines, PBMCs (peripheral blood mononuclear cell)…) dans nos modèles avec et sans traitement.

Bénéfices attendus

La DAC est la deuxième cause de démangeaisons chez le chien : elle touche environ 10% de la population canine mondiale. C’est une dermatose inflammatoire, prurigineuse, caractérisée parfois par une prédisposition génétique, le développement d’allergie à des allergènes environnementaux et des altérations de la barrière cutanée. Elle se caractérise par du prurit, des lésions cutanées plus ou moins caractéristiques et nécessite des soins coûteux et chronophages de la part du propriétaire tout au long de la vie de l’animal. Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du propriétaire et de son chien, ceci pouvant être une cause de demande d’euthanasie. Le traitement et la gestion à long terme de la dermatite atopique sont difficiles. La majorité des traitements anti-inflammatoires ou immunomodulateurs sont susceptibles de causer des effets secondaires, surtout quand ils sont utilisés à forte dose et/ou de façon répétée, quotidienne ou prolongée. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de cette maladie chronique doit être évaluée sur l’espèce cible lors d’un épisode clinique. La mise en place, la maitrise et le maintien d’un modèle de DAC (aigu et subchronique) induisant des signes cliniques similaires aux lésions dermatologiques observés chez les chiens souffrant de la DAC spontanée, permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de nouvelles molécules et ainsi de sélectionner plus vite et de façon plus sûre, des molécules présentant une probabilité de succès importante sur un nombre optimisé d’animaux. Un modèle de DAC présente plusieurs avantages par rapport aux dermatites atopiques de terrain. Lors d’une inflammation expérimentale de la peau, la dose appliquée d’allergène est connue et les caractéristiques de l’inflammation/lésions dermatologiques peuvent être suivies dès la phase précoce de la maladie. Un suivi rapproché par des personnes formées dans des conditions standardisées permet une évaluation d’efficacité mais aussi de tolérance, pharmacocinétique et la possibilité de chercher des bio-marqueurs. C’est un grand avantage de pouvoir récolter autant d’informations dans l’espèce cible par procédure expérimentale dans un modèle représentatif de la DAC spontanée.

Procédures

Traitements : Lors de cette procédure expérimentale, l’administration du produit sera réalisée par voie intraveineuse (IV), intramusculaire (IM), sous-cutanée (SC), orale, transcutanée, ou autre. Le volume maximal administré sera en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires : • IV : 1-5 mL/kg • IM : 0.25-0.5 mL/kg • SC : 1-2 mL/kg • Transcutanée : le volume administré dépendra de la viscosité du produit et de l’espèce de destination. • Oral : les tablettes/comprimés ou solutions liquides seront adaptées à l’espèce de destination. Prélèvements de sang : généralement à la veine jugulaire sur animal vigile Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal, et ne dépasse jamais 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif. Un temps de repos suffisant est déterminé entre chaque phase de prélèvement si l’étude en compte plusieurs et entre chaque étude. Ainsi, pour un volume maximum prélevé correspondant à 7.5%, 10%, 15% et 20% du volume de sang circulant par kg de poids vif sur une période de 24h, le temps de récupération est de 3, 7, 14, et 28 jours respectivement. Prélèvements de fluides biologiques/tissus/matrices : Des raclages cutanés et/ou des biopsies de peau pourraient être réalisés. Dans le premier cas, le prélèvement s’effectuera avec une lame de bistouri émoussée. Dans le second cas, l’acte sera réalisé sous anesthésie locale, sur un animal vigile avec ou sans tranquillisation et suivies les cas échéant par des points de suture. Le nombre de biopsies sera limité à 3 par jour et 12 par étude pour chaque chien. La taille et la profondeur de la biopsie seront définies et argumentées dans le plan d’étude.

Impact sur les animaux

Les chiens sensibilisés dévélopperont des signes d’allergie cutanée ; l’erythème (rougeur de la peau), des papules (surélévation de la peau), pustules (soulèvement de la peau contenant du pus) et/ou de l’excoriation (écorchure superficielle). Ils peuvent aussi dévélopper un prurit passager (démangeaisons). Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 24h après l’application des allergènes. Les lésions dermatologiques les plus sévères seront généralement observées entre 72h et 96h après la première application, ensuite ils se résolvent spontanément. Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un léger inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées Avant de conduire des études d’efficacité nous avons généralement des informations de tolérance dans le chien, des réactions d’intolerance sévère à cause des produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvement sur un animal vigile peuvent occasionner un léger stress/baisse de bien-être en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil d’échantillons.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les euthanasies ne sont pas prévues. Par conséquent une réintroduction de l’ensemble des animaux qui participeront à ce projet dans la colonie hébergée au sein de l’EU est envisagée. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire la DAC et pouvoir évaluer l’état général de l’animal et l’intensité des manifestations dermatologiques, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant être reproduite in vitro.

Réduction

Les réactions allérgiques sont répétables entre chaque « challenge » pour tous les chiens sensibilisés mais avec une variabilté entre individus. L’expérience avec ce modèle nous montre qu’il ne faut pas utiliser moins de 4 et idéalement 6 ou 8 chiens par groupe pour garantir des résultats exploitables. Ce sont des études de preuve de concept : étapes précoces de l’évaluation d’un nouveau produit/composé actif. L’évaluation et l’intérprétation des résultats sont faites en comparant l’évolution des moyennes des scores dermatologiques journaliers des différents groupes de traitement. Les groupes de traitement sont : non-traité (contrôle négatif) et/ou le groupe traité avec un produit de référence (contrôle positif) et le (ou les) groupe(s) traité(s) avec le produit à évaluer. Le score moyen des chiens dans le contrôle négatif est au dessus du score défini le « seuil allergique » et le score moyen des chiens dans le groupe contrôle positif est en dessous du « seuil allergique ». Il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d’étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser l’utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre d’animaux permette d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l’efficacité du produit/des produits évalués.

Raffinement

Les animaux sont régulièrement manipulés afin de les habituer à la contention et au contact des expérimentateurs. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Pour les chiens, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons et n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire et selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la fin de la phase animale, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé. Des observations plus fréquentes sont prévues dès que requis, particulièrement après l’application des allergènes et la prise de traitements (examen dermatologique et observations cliniques générales), pour s’assurer que l’apparition des signes cliniques n’entraine pas de dégradation trop importante de l’état général de l’animal et que les traitements sont bien tolérés. Toute observation d’un état de santé ou d’un comportement anormal d’un animal fera l’objet d’un examen par un vétérinaire qui proposera les mesures adéquates pour protéger l’animal : si nécessaire, le sortir de la procédure expérimentale et/ou lui administrer un traitement. L’euthanasie (si nécessaire) sera effectuée sur site. Pendant le challenge, des personnes qualifiées évaluent quotidiennement les lésions cutanées avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères, le seuil allergique et /ou plusieurs points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront l’exclusion de l’animal de l’étude et son traitement. La réaction allergique et l’inconfort que le challenge peut engendrer sont vite et efficacement contrôlés avec par exemple des corticoïdes et/ou des shampooings. La grille d’évaluation des lésions et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés de manière rétrospective selon les résultats obtenus à chaque étude.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les modèles expérimentaux qui permettront d’évaluer les produits vétérinaires doivent être développés dans la même espèce pour plus de pertinence. L’espèce canine a été retenue comme correspondant à l’application clinique future des produits visant à traiter les signes d’allergie suite à la dermatite atopique du chien. Les modèles seront à mettre en place chez des chiens jeunes adultes sains. Ceci correspond à des animaux de plus de 6 mois avec un système immunitaire mature.

1 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souriceaux de trois jours et adultes reçoivent le parasite Cryptosporidium par voie orale puis des immunostimulants par injection intrapéritonéale, avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Le projet évalue des immunostimulants contre cette infection responsable de diarrhées. Le porteur signale que le stress de certaines lignées favorise le cannibalisme des portées, et affirme que l'étude de l'immunité intestinale ne peut se faire sans animaux, les modèles in vitro ignorant selon lui la complexité de l'environnement intestinal.

Objectifs

Les infections par le protozoaire Cryptosporidium sont très fréquentes à travers le monde. Elles conduisent à des pertes économiques importantes en santé vétérinaire puisque cette maladie provoque des diarrhées sévères chez les ruminants dès la naissance et affectent aussi la santé humaine (notamment les enfants de moins de 5 ans - 2ème cause de mortalité due aux diarrhées dans les pays en voie de développement). En absence de vaccins ou de traitements autorisés et efficaces, l’objectif du projet est d’évaluer l’effet protecteur de différents immunostimulants de l’immunité innée et de décrire les mécanismes immunologiques mis en jeu lors de ces traitements.

Bénéfices attendus

En l’absence de vaccin ou de traitements efficaces qui pourraient induire des résistances, l'utilisation d’immunostimulants pour stimuler de manière non spécifique les cellules de l’immunité est une approche très prometteuse qui pourrait être bénéfique pour toute autre infection en période néonatale puisqu’elle n’est pas basée sur une réponse spécifique vers l’agent pathogène (comme les vaccins).

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite, (une fois à l’âge de 3 jours pour les souriceaux, et une fois entre 7-12 semaines pour les adultes) puis à une administration intra-péritonéale des immunostimulants (5 jours après l’infection) (introduction aiguille) sur animaux vigiles sous contention.

Impact sur les animaux

Il est possible que la conjonction des traitements : infection et déficience génétique, immunostimulation et traitement antibiotique, puisse altérer l’état général de l‘animal.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

L’étude de l’immunologie et de la muqueuse intestinale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement intestinal (flore bactérienne et antigènes alimentaires).

Réduction

Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) a été établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Toutefois, malgré l’enrichissement, l’état de stress qui caractérise certaines lignées de souris, favorise le cannibalisme, c’est pourquoi plus d’animaux sont mis en reproduction (20 à 30% de plus, les reproductions sont gérées par la PFIE). Du point de vue statistique, nous utilisons des tests non paramétriques adaptés pour les petits échantillons mais 6 animaux par lots au minimum sont requis. Les animaux surnuméraires sont toujours utilisés et peuvent être introduits dans un autre protocole. Les immunostimulants cibleront spécifiquement des récepteurs des cellules immunitaires. Les immunostimulants non commerciaux seront tous préalablement validés in vitro pour leur capacité à stimuler fortement les cellules immunitaires avant de procéder à des études in vivo. Pour analyser les données (charge parasitaire ; cytokines ; % cellules immunitaires), nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection ou déficience génétique de l’animal ou traitement immunostimulant) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences). D'après nos expérimentations précédentes et dans ces conditions, ces effectifs et répétitions sont suffisants pour conclure du point de vue significatif ET biologique sur nos données (ex : pour la charge parasitaire avec un effet protecteur des immunostimulants d’environ 40% (faible) : puissance estimée à 95% avec un risque de 0.05% avec 6 animaux par lots). Deux animaux supplémentaires sont ajoutés dans chaque lot car de la mortalité est parfois observée dans les portées (très jeunes animaux) (indépendamment de l’infection ou d’un traitement).

Raffinement

Les souris sont hébergées en animalerie A2 en atmosphère contrôlée, à raison de 5 souris maximum lorsqu’elles sont adultes, dans un environnement enrichi (refuge en polycarbonate, feuilles de papier absorbant, copeaux, morceau de bois) ou 1 mère avec sa portée par cage, dans un environnement enrichi (papier absorbant qui diminue le cannibalisme des souris à la mise-bas, sizzle-nest, bâtonnets de coton, morceau de bois). Toute médication est proscrite pour ne pas interférer avec les paramètres immunologiques étudiés. Cependant les animaux sont suivis plusieurs fois par jour afin de prendre une décision rapide en cas d'atteinte des points limites durant tout le protocole et de limiter la douleur induite : (i) de souriceaux mis à l’écart par la mère, qui ne grossissent pas ou dont le pelage ne se développe pas (lié au retard de croissance), (ii) de souris amaigries, prostrées et avec le poil ébouriffé. Nous prenons encore plus de précautions (bruits) lors des visites lorsqu’il s’agit d’expérimentations avec les femelles gestantes et les premiers jours suivant la mise-bas

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé en tant que modèle expérimental pour étudier la cryptosporidiose. Le souriceau est représentatif de l’infection chez les jeunes ruminants. Dans les élevages, les jeunes ruminants se contaminent rapidement dès la naissance et éliminent le parasite en 3 semaines environ. Le souriceau inoculé avec le parasite entre 3 et 7 jours de vie élimine le parasite comme le jeune ruminant en 3 semaines environ. La souris adulte immunodéficiente, notamment lorsqu’elle est génétiquement modifiée pour un gène de l’immunité, est également utilisée dans la présente demande pour comprendre la spécificité du mécanisme de protection chez le jeune. Dans la présente demande, l’utilisation de souris (souriceaux, souris adulte) nous permettra de décortiquer très précisément les mécanismes de protection. Notre établissement élève de nombreuses lignées de souris transgéniques (gènes rapporteurs, déficientes, invalidation fonctionnelle etc.) pour parvenir à cet objectif. Les souriceaux sont inoculés par le parasite lorsqu’ils auront 3 jours. Les souris adultes seront également utilisées et âgées entre 7-12 semaines.

217 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et les femelles peuvent subir jusqu'à deux frottis vaginaux par jour pendant treize semaines au plus, ainsi que neuf prélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours. Elles sont aussi soumises à trois semaines de décalage horaire chronique, des avances et des retards successifs de la phase d'obscurité qui perturbent leur sommeil, pour imiter le travail posté. Le porteur prévoit le stress de l'isolement pour les femelles gestantes, une irritation modérée du vagin due aux frottis répétés et une douleur modérée due à l'incision du bout de la queue, et indique que 170 souris seront tuées, les 47 autres étant gardées en vie pour d'autres expériences ou tuées à défaut. Les retombées pour les femmes en travail posté sont renvoyées au "plus long terme", sous la forme de recommandations auxquelles l'étude doit seulement "ouvrir la voie".

Objectifs

La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.

Bénéfices attendus

A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 170 animaux. 47 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.

350 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer les seuils de toxicité d'un candidat médicament à doses croissantes. Ils reçoivent le produit par diverses voies, dont intrathécale, puis subissent des prélèvements de sang, d'urine, de liquide céphalo-rachidien et de moelle osseuse. Le champ structuré déclare les 350 animaux réutilisés, mais le porteur indique qu'ils pourront aussi être mis à mort pour prélèvement d'organes selon la demande du "donneur d'ordre". Il affirme que ces études de toxicité sont "indispensables" et que la proximité avec l'humain justifie le recours au primate.

Objectifs

Pour presque tous les types d’effets toxiques (organospécifiques, neuro-comportementaux, immunologiques, cancérogènes épigénétiques...), on estime généralement qu’il existe une dose ou une concentration en dessous de laquelle aucun effet indésirable ne se produit : il existe un seuil de toxicité. L’objectif est alors de d terminer la dose ou la concentration en dessous de laquelle la probabilité de survenue de l’effet critique sera en théorie nulle : la dose maximale sans effet nocif observable (DMSENO). Plus précisément, elle correspond à la dose la plus élevée pour laquelle aucune augmentation statistiquement (ou biologiquement) significative en fréquence ou en sévérité d’un effet nocif n'est observée dans un groupe exposé à la substance par rapport un groupe non exposé . L'objectif de ce projet est donc de tester différentes doses (en commençant par la plus faible puis en l'augmentant progressivement) d'un nouveau candidat médicament afin de déterminer la DMSENO. Les groupes de doses (un ou plusieurs animaux par dose) seront décalés dans le temps afin de pouvoir adapter la dose suivante en fonction des résultats du groupe précédent.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'évaluer la tolérance d'un candidat médicament après une à une exposition répétée ou non, de doses croissantes et d'estimer les marges de sécurité pour lesquelles aucun effet indésirable n'est observé. Ces marges de sécurité permettront par la suite de déterminer une dose initiale "sûre" pour la réalisation des essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Après une période d’acclimatation suffisante (15 jours minimum), les animaux recevront de façon répétée ou non la molécule d’intérêt, ou la combinaison de molécules, par voie entérale, parentérale, respiratoire, intra-articulaire ou intrathécale selon les recommandations du donneur d’ordre. Par exemple, pour une injection intraveineuse en bolus, l'animal pourra être contenu manuellement et pour une injection intraveineuse lente, l'animale sera contenu en siège. Pour d'autres types d'administration, les animaux pourront être sédatés ou anesthésiés. La méthode de contention dépendra aussi du poids de l’animal. Pour un animal de plus de 5 kg, une contention en siège sera priviligiée pour la sécurité du personnel. Les animaux seront entrainés à la méthode de contention Après chaque administration, des prélèvements sanguins seront effectuées pour l’étude des paramètres biologiques (hématologiques, biochimiques, immunologiques, de coagulation) de chaque animal afin de mettre en vidence une toxicité potentielle. Des prélèvements d’urine et de fécès pourront également survenir. Des prélèvements de liquide céphalo-rachidien (LCR) et de moelle osseuse (MO) sous anesthésie générale pourront galement être réalisés. Les volumes de sang, de LCR et de MO préleves et le temps de repos accordés aux animaux entre chaque prise seront en accord avec les recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels dépenderont de la molécule injectée et de la dose. Avant chaque étude, les effets indésirables seront discutés avec le client afin de mettre en place un suivi et un traitement adapté en cas d'apparition de signes indésirables.

Devenir

Les animaux seront réutilisés si le protocole le permet et si la fréquence et le volume des prélèvements ont respecté le pourcentage du volume sanguin circulant (VSC) ainsi qu'une période de repos. Le sort des animaux sera préalablement discutés avec la structure chargé du bien-être animal et approuvé par le vétérinaire. De plus, les animaux pourront être mis à mort pour récolte d'organes selon le protocole défini avec le donneur d'ordre.

Remplacement

Les études de toxicité in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la toxicité de la molécule en fonction de la dose administrée et affine la connaissance des caractéristiques de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les résultats de ces tests permettront ainsi d’ajuster la dose optimale à administrer chez l’Homme indispensable à la poursuite des essais réglementaires en clinique.

Réduction

Dans ce projet, les approches de dosage échelonnées ("en escalier": doses croissantes) permettent d'atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Une fois la première dose administrée à un faibe effectif, les observations sont ensuite notées et utilisées pour informer la dose suivante, qui peut être supérieure ou inférieure selon la nature des observations observées. Le nombre d'animaux dosés à chaque niveau doit être petit dans les études initiales (par exemple un ou deux de chaque sexe) avec des tailles de groupe augmenté une fois qu'une dose-réponse est établie.

Raffinement

Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’ étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse (grille d' évaluation du bien-être). Comme les animaux ou groupes d'animaux seront injectés par groupes de dose (à savoir de la plus faible à la plus forte dose- administration en "escalier"), les données obtenues pour les premières doses serviront à affiner la dose suivante et le suivi clinique en fonction des signes cliniques observés. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélevements ainsi qu’entre les administrations de la ou des molécule(s) étudiée(s). Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable de la procédure. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des volières conformes aux recommandations et bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal de l'installation, notamment la mise disposition de jouets dans les hébergements. Une rotation du matériel d’enrichissement, incluant une désinfection, sera organisée une fois par semaine pour éviter la lassitude et renouveler l’intérêt des animaux. Des friandises seront galement distribuées systématiquement en fin de journée aux animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendé par les manipulations. Dans le cas où les animaux feront l’objet d’une réutilisation, un avis vétérinaire sera obligatoire pour justifier du bon état de santé de l’animal. Il sera veillé à ce que la gravité des procédures expérimentales ne dépasse pas le stade modéré .

Choix des espèces

Le primate non humain (macaque cynomolgus) est choisi pour sa proximité phylogénétique avec l'Homme et du fait des similitudes des réponses immunitaires. Les molécules en développement étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinant. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le primate non humain seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. Le stade de deloppement des animaux (juvénile à adulte) ainsi que le sexe (mâle et/ou femelle) dépendra de la demande du donneur d'ordre et des objectifs des études.

6 300 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique. Selon les cas, ils reçoivent des injections deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, sont des lignées génétiquement modifiées ou ont été opérés, avant d'être mis à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélèvement de tissus nerveux. L'objet est de mesurer ex vivo l'effet de molécules candidates sur le système nerveux. Le porteur affirme que des réseaux neuronaux "plus physiologiques" sont nécessaires et qu'aucune reproduction in silico n'est possible.

Objectifs

Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleur appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le developpement de modèle rongeur génétiquement modifé (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’evaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ ou de cellulles nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le PATCH = un enregistrement à l'echelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques (composés « LEADS ») en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule, le cas échéant - afin de pouvoir déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire. Notre direction scientifique valide une stratégie d’étude, comportant plusieurs conditions, en se basant sur des données bibliographiques.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphallique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développment de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Procédure 1, par étude, 60 animaux vigiles seront injectés deux fois par jour. Ces injections seront réalisées par du personnel entrainé, qualifié et du matériel adapté. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne un mois. L’animal sera habitué à la contention, limitant le stress lors des gestes à venir. La plus grande vigilance de suivi sera portée pour éviter les problèmes dus aux injections répétées. 2700 animaux maximum entreront dans les 5 ans du projet. La Procédure 2 permettra de phénotyper 60 animaux génétiquement modifiés par étude, 2700 animaux sur 5 ans. Nous travaillerons sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Procédure 3 : 900 animaux subirront une chirurgie par notre partenaire, 15 jours avant leur envoi. Avant réception dans nos locaux, les animaux auront pleinement récuperer leur état de santé. En fonction de l’opération subie, les animaux devront être isolés depuis leur intervention jusqu’à leur MAM et donc être isolés 3 semaines. Tous ces animaux seront mis à mort par deux techniques: *- en fonction de leur âge, l’animal sortira de la zone d’hébergement par décapitation rapide sous anesthésie gazeuse; *- certains animaux sevrés seront mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthéise gazeuse.

Impact sur les animaux

Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables: La procédure 1 peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. Nous habituerons les animaux concernés à ces manipulations avant leur entrée dans le projet; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. Pour éviter, par exemple, les inflammations génerées, nous varierons les sites d’injection autant que possible et assurerons une surveillance précise des animaux pour limiter la persistance d’effets indésirables provoqués en suivant nos règles de point limites. Nous utiliserons, aussi, le matériel d’administration adapté à l’espèce, au poids et l’âge des animaux ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important. Elle sera réalisée par du personnel dûment formé et quanlifié régulièrement avec utilisation d’un analgésique ; La procédure 2 peut par : *-La nature des animaux GMs, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptômatiques. Nous adapterons, tout de même, notre surveillance et nos points limites en fonction des symptômes possibles pout anticiper toute apparition précoce de douleur, qui ne devraient pas se declencher avant leur mise à mort et nos enrigistrements dans ce projet ; La procédure 3 peut par : *-la nature des opérations faites sur les animaux reçus et opérés par notre partenaire, induire des problèmes de type post-opératoire. Nous contrôlerons avec notre partenaire que les animaux opérés sont stables et aptes à être transportés, deux semaines après leur chirurgie. De plus, les conditions d’hébergement ainsi que les points de surveillance spécifique enrichieront nos points limites et nos points de surveillance au cours des 3 semaines d’hébergement des animaux. .

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Tous les animaux génétiquement modifiés de la procédure2 et tous les animaux opérés de la procédure 3 sont mises à mort pour enregistrement électrophysiologique, ex vivo. Ces mis à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégéneratives et nos protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale que nous maitrisons.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ».Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato encephalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne sgnificativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils béneficent d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le founisseur ou le partenaire. Pour les animaux opérés, ils seront adaptés au mieux et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. Les animaux utilisés en Procédure 1 seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur inoccuité. Les animaux seront surveillés deux foix par jour et pesés. Pour la procédure 2, les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptomes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deça de la limite préetablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Pour les animaux opérés (Procédure3), les conditions d’hébergement seront transmises par notre partenaire. Les animaux seront reçus après une complète récuperation de la chirurgie. Toutefois, un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera exercé. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée ou opérée (Procédure 2 et Procédure 3) fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques ou ayant pleinement récupérés de leur chirurgie. Toutefois, la connaissance des phénotypes et chirurgies ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limite modifiés pour palier à des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux. Les animaux, des procédures 1 et 3, seront exclusivement des animaux post sevrage. L’âge des animaux de la procédure 2 dépendra de l’âge de l’apparition des symptômes de la maladie.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le foie par chirurgie ou sous la peau, parfois un traitement par injection ou par plasma froid, un suivi par imagerie sous anesthésie, puis sont euthanasiées pour prélèvements. Le projet cherche à évaluer de nouvelles thérapies contre le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome. Le porteur affirme qu'on ne peut recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et retient des souris immunocompétentes pour préserver le microenvironnement immunitaire.

Objectifs

Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un immunomodulateur appliqué chaque jour sur le dos et les oreilles provoque des lésions de psoriasis, puis des molécules candidates sont administrées avant une mise à mort par ponction intracardiaque et dislocation cervicale. Le porteur indique que l'induction s'accompagne d'une perte de poids pouvant atteindre 15 pour cent, d'excoriations et de plaies liées au léchage et au grattage, avec une mise à mort au-delà de 20 pour cent de perte de poids. Il affirme qu'il est "indispensable" de tester ces molécules sur ce modèle, aucun système in vitro ne remplaçant selon lui complètement la peau.

Objectifs

Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques ayant une activité sur le psoriasis. Ces tests sont requis pour permettre le choix des meilleures molécules ou traitements thérapeutiques avant essai chez l’homme (tests cliniques).

Bénéfices attendus

Ce projet s’effectuera chez la souris (Mus musculus). Dans cette espèce, l’administration topique d’un immuno-modulateur comme l’imiquimod permet d’induire très rapidement en moins d’une semaine des lésions de psoriasis similaires à celles observées chez l’homme: érythème, desquamation et épaississement de la peau. Ce projet utilisera donc cette molécule, l’imiquimod, sous forme de crème, comme agent inducteur du psoriasis qui sera appliqué quotidiennement sur le dos et l’oreille des animaux sur une période de 7 jours. Les symptômes de psoriasis seront évalués cliniquement par enregistrement du score d’érythème, de désquamation, d'excoriations et d’épaississement de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse. Un suivi longitudinal par imagerie non invasive optique (Tomographie par Cohérence Optique ou OCT) permettra une évaluation supplémentaire des symptômes liés à la pathologie. Suite à l’induction, mais aussi lors de l’induction, des traitements thérapeutiques seront administrés, par voie orale, topique, intrapéritonéale ou intraveineuse, aux animaux afin d’en évaluer leur efficacité thérapeutique ou prophylactique. Cette efficacité sera évaluée cliniquement par suivi quotidien du score d’érythème, de désquamation, d'excoriations et d’épaississement de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse, ainsi que par un suivi longitudinal par imagerie non invasive optique (Tomographie par Cohérence Optique ou OCT). Lorsque les procédures sont terminées, tous les animaux sont mis à mort et des échantillons de tissus sont prélevés pour analyses complémentaires (dosages de cytokines inflammatoires dans le plasma, histologie...).

Procédures

Les animaux seront administrés topiquement sur la peau du dos et des oreilles avec un immunomodulateur afin d'induire des lésions de psoriasis. Cette administration sera effectuée une fois par jour, pendant 7 jours. Des traitements seront administés quotidiennement aux animaux par voie orale, topique, intrapéritonéale ou intraveineuse afin d'évaluer leur efficacité dans le cadre du psoriasis. Une évaluation clinique des sympômes de psoriasis sera effectuée quotidiennement : scoring (erythème, desquamation, excoriations) et mesures de l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse. Un suivi par imagerie non invasive OCT sous anesthésie sera réalisé. Le sang des animaux sera prélevé une fois en cours d'étude à la veine mandibulaire à l'aide de lancettes dédiées à ce type de prélèvement. Ces prélèvements se feront sous anesthésie à l'isoflurane. Le volume maximal deprélèvment sanguin est de 0.1mL. En fin de procédure un prélèvement sanguin total sera réalisé sous anesthésie générale (isoflurane).

Impact sur les animaux

Les effests indésirables observés sur les animaux sont souvent liés à l'induction de la pathologie chez les animaux. Nous observons généralement une forte perte de poids (jusqu'à -15% ) ainsi qu'une légère déshydratration des animaux pendant les 3 premiers jours. Les animaux présentent des symptomes du psoriasis (érythème, desquamation, excoriation) pouvant entrainer l'apparition de plaies suite à du léchage ou grattage intensif. Les autres effets indésirables observés peuvent etre attribués à l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance, irritation en cas d'application topique...

Devenir

A l'issu des procédures tous les animaux seront mis à mort selon la méthode de ponction intracardiaque suivie d'une dislocation cervicale le tout sous anesthésie générale (isoflurane).

Remplacement

Afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de psoriasis pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux appliqués directement sur la peau en application externe (voie dermique / topique). - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme). Ce projet s’effectuera chez la souris (Mus musculus).

Réduction

La stratégie d'expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d'imagerie. Cette approche expérimentale permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANAOVA; seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d'initier les phases de traitement. Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence commercialisé type bétaméthasone). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70% et une différence à souligner de 20% entre groupes témoins et tersts comparativement à l'approche classique. Cette approche permet donc de réduire le nombre d'animaux de 50% au moins. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/ immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, igloo, cotons, bâtonnets de bois) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué au minimum tous les 2 jours, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. De la nourriture humidifiée ou du gel diététique sera ajouté dans leur cage. Au moindre signe de déshydratation, les animaux recevront une injection intra-péritonéale de sérum physiologique (20mL/kg). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative ; En cas de dépassement, les animaux seront euthanasiés selon la méthode prévue. (anesthésie à l'isoflurane, prélèvement sanguin terminal et dislocation cervicale).

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes type CD1, C57Bl6 ou Balb/c) sont d'excellents modèles de psoriasis. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l'évaluation du psoriasis induit dans ces espèces. Ces animaux développent des symptomes de psoriasis très semblables à ceux observés chez l'humain. De plus, ces modèles présentent certains intérêts pratiques indéniables : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Tous les animaux auront le même âge. Les résultats publiés avec ce modèle utilisent des animaux de cet âge.

Pour savoir si le récepteur CB1, un récepteur aux cannabinoïdes, règle la peur et la prise alimentaire à travers les neurones à POMC de l'hypothalamus, 1 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 792 d'entre elles reçoivent sous anesthésie une injection de virus dans le cerveau, et certaines une lentille implantée pour suivre l'activité des neurones. Chaque souris passe au plus deux tests anxiogènes, dont un conditionnement à la peur qui "augmente le niveau de stress chez les souris" selon le porteur, sans qu'il nomme les autres tests ni dise comment la peur est provoquée. Toutes sont tuées à l'issue, par dislocation cervicale ou par perfusion intracardiaque sur cœur battant sous dose létale de pentobarbital, et le porteur justifie l'effectif par "12 à 29 animaux par groupe", sans dire combien de groupes il prévoit.

Objectifs

Notre organisme répond à la peur en mobilisant des réserves énergétiques et en ajustant notre physiologie pour faire face à cette situation. Les processus par lesquels la peur affecte notre cerveau prennent naissance à différents niveaux cellulaires, ce qui a pour effet d'affecter nos réactions émotionnelles et comportementales. La peur peut entraîner des changements inadaptés, par exemple une consommation compulsive de nourriture. Dans le cerveau, la principale région qui contrôle la prise alimentaire est appelée l'hypothalamus. Parmi les neurones participant à ce contrôle, les neurones à POMC sont chargés de diminuer la prise alimentaire. D'un point de vue moléculaire, le récepteur cannabinoïdes de type 1 (CB1) régule la réponse à la peur mais également la prise alimentaire. L'objectif principal de ce projet est de comprendre si ce récepteur peut réguler la réponse à la peur et la prise alimentaire dans les neurones à POMC. Pour répondre à cette question, nous allons travailler sur deux sous-objectifs différents : 1) Étudier si CB1 module l'activité des neurones à POMC dans une situation où les souris ont peur. Etant donné que les neurones à POMC de l'hypothalamus sont activés pendant un test de peur conditionnée, nous allons également 2) Etudier si le CB1 présent au niveau des neurones à POMC régule le comportement alimentaire pendant la peur conditionnée.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons souligner la nouveauté de ce projet, puisque le rôle de la POMC dans la réponse à la peur n'a jamais encore été étudié auparavant. Les neurones à POMC ont été largement explorés dans le domaine du comportement alimentaire, mais leur rôle dans la régulation de l'anxiété et celui de la peur n'a pas encore été étudié. Il est admis que le stress ou l'anxiété altère le comportement alimentaire, ce qui peut entraîner des troubles du comportement alimentaire et l'obésité. Cependant, les mécanismes moléculaires reliant ces deux phénomènes ne sont toujours pas clairs. Dans ce contexte, les neurones à POMC et le récepteur CB1, par leur capacité à réguler à la fois l'alimentation et la réponse au stress, semblent être de bons candidats pour expliquer l’interaction entre alimentation et comportement de peur.

Procédures

Au cours de ce projet, nous réaliserons des opérations chirurgicales sur des souris afin d'injecter des particules virales dans le cerveau. Les souris subiront une seule injection de virus, certaines d'entre-elles recevront une lentille qui nous permettra d'étudier l'activité neuronale en temps réel. Ces procédures, qui durent de l’ordre de 45 minutes, sont réalisées sous anesthésie générale. Afin de prévenir toute souffrance nous réalisons également une anesthésie locale au niveau du site d'incision et les souris reçoivent un traitement analgésique pré et post-opératoire. Ce qui permet d'assurer une bonne récupération après la procédure. L'état général des souris, ainsi que le poids corporel, seront évalués les jours suivant la chirurgie. Des points limites suffisamment précoces ont été mis en place pour chacune des procédures afin d'éviter toute souffrance. Cette procédure sera effectuée sur un total de 792 souris, et seulement une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Pour les procédures chirurgicales, afin d'éviter toute douleur, nous utilisons des analgésiques en pre-opératoires et réalisons une anesthésie locale de la peau avant l'incision. Après la chirurgie, un traitement analgésique est administré pendant 48h, nous suivons le poids corporel quotidiennement et nous évaluons les animaux selon les points limites. Pour les tests anxiogènes, nous laisserons un intervalle de 7 jours entre les tests effectués sur les mêmes animaux pour leur permettre de récupérer. Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests chez les mêmes souris. Le test de conditionnement à la peur augmente le niveau de stress chez les souris. Les animaux ayant subi une peur conditionnée ne seront pas réutilisés pour ce même test ou pour un test anxiogène.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront sacrifiées à la fin de l'expérience pour récupérer les tissus et réaliser des études moléculaires. Nous sacrifierons les souris de deux manières différentes : la dislocation cervicale pour le prélèvement de tissus frais et la perfusion intracardiaque sur cœur battant afin de fixer le cerveau pour les études histologiques. La persufion intracardiaque se fait à l'aide d'une dose létale de pentobarbital mélangée avec un anesthésique local, la lidocaïne.

Remplacement

Pour évaluer l'implication des neurones à POMC et du système endocannabinoïde dans la régulation de la peur et du comportement alimentaire, il n'existe aucune alternative à l'heure actuelle que l'expérimentation animale. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement ne serait pas approprié. Le niveau de complexité de l'étude que nous proposons de réaliser est tel qu’aucun modèle informatique ne pourrait remplacer l’animal.

Réduction

Nous avons déterminé, en utilisant un calcul de puissance statistique, que nous avons besoin de 12 à 29 animaux par groupe pour obtenir des données exploitables.

Raffinement

De manière générale, les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines, en cages collectives, et seront manipulés de façon bi-hebdomadaire pendant au minimum une semaine avant le début des expériences. Ces manipulations permettront d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. Les animaux auront une période de récupération d’au moins une semaine entre chaque expérience afin de limiter le stress et l’angoisse. Les animaux soumis à un test de peur conditionnée ne seront pas utilisés pour un autre test stressant ou anxiogène, ils seront sacrifiés après le test. L’enrichissement se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnet en bois pour ronger et de tunnel en carton pour se cacher/manipuler les animaux. Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. Les souris seront hébergées en cages collectives, sauf lorsqu'elles auront à subir une chirurgie, et que la consommation de nourriture devra être consignée.

Choix des espèces

La peur et le comportement alimentaire sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente une espèce pertinente pour ce type d’étude. La grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de réponse à la peur, ainsi que l'étude du système endocannabinoïde sont réalisées chez la souris. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, ce qui implique que les résultats obtenus chez le rongeur seront transposable à l'humain, ce qui aura pour conséquence de faire avancer les connaissances dans ce domaine et à plus long terme de trouver de nouvelles voies thérapeutiques. Par ailleurs, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour répondre à nos questions ne sont disponibles que chez la souris. Les expériences ne commenceront que lorsque les souris seront adultes (8 semaines). Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude, car il a été montré que le système endocannabinoïde du cerveau de souris femelles est différent de celui des mâles, à la fois dans les conditions basales et lorsque les souris sont dans une situation de stress.