Procédures modérées

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime riche en lipides, elles subissent des gavages et des prélèvements sanguins répétés à la queue, à la mandibule et en rétro-orbital, avant d'être mises à mort pour prélèvement des tissus. L'objectif est de mesurer l'absorption des vitamines liposolubles chez la souris obèse. Le porteur affirme que le modèle animal demeure la "meilleure approche", les modèles in vitro ne reproduisant pas selon lui la complexité du tube digestif.

Objectifs

Les personnes obèses présentent souvent des taux circulants en vitamines liposolubles et en caroténoïdes effondrés par rapports aux personnes minces. Les taux de vitamines liposolubles circulants pourraient être partiellement diminués à cause d’un stockage accru de vitamines liposolubles dans le tissu adipeux. Cependant, des études chez le rongeur ont montré que les régimes à forte teneur en lipides induisaient des modifications de l’expression de transporteurs intestinaux de lipides, qui sont également impliqués dans l’absorption des vitamines liposolubles. Il est donc possible que l’absorption des vitamines liposolubles soit altérée chez les sujets obèses. Il est également possible la clairance ou l’excrétion des micronutriments soit modifiées. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de l’obésité sur l’absorption des vitamines liposolubles et des caroténoïdes chez la souris. Le nombre d’animaux par groupe sera de 10 et le nombre total d’animaux dans l’étude sera de 160.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le métabolisme des micronutriments lipidiques chez le sujet obèse, afin de proposer des supplémentations adéquates aux patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins à la mandibule, à la queue ou rétro-orbitaux 4 fois pendant la procédure, un prélèvement retro-orbitaux à jeun une semaine avant la procédure. La durée de chaque prélèvement sanguin est calculée autour de 5 minutes. Le gavage sera réalisé avec les animaux en état de vigile car on veut observer la clairance á 5 temps avant l’euthanasie des animaux pour prélever les organes. La procédure de gavage est estimé à 2 minutes hors la préparation de la seringue.

Impact sur les animaux

Afin de limiter le stress lié à la manipulation pendant les prélèvements, les animaux seront habitués à être manipulés lors des pesées hebdomadaires et lors des changements de litière. Une crème anesthésique (lidocaïne/prilocaïne 5%) sera appliquée localement avant incision et prélèvement de sang à la queue. Les prélèvements sanguins au niveau de la queue, mandibulaire ou retro-orbitaux peuvent stresser l’animal. A noter qu’il est nécessaire d’alterner les sites de prélèvement. Le premier sera fait à la queue, puis au niveau mandibulaire et enfin en retro-orbital sous anesthésie au sévoflurane (6% sévoflurane et débit d'oxygène = 1L/min, 5 min).

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis a mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques et en micronutriments) pour évaluer les effets de l’obésité sur l’absorption des micronutriments lipidiques.

Remplacement

Les modèles in vitro (culture cellulaire, chambre d’Ussing) ne reproduisent pas la complexité biologique du tube digestif (mucus, mouvement, échange entre organes, présence d’un microbiote). Le recours au modèle animal demeure la meilleure approche pour étudier l’absorption intestinale des micronutriments liposolubles puisque seul un modèle animal permet d’avoir une approche intégrée du phénomène d’absorption-efflux.

Réduction

Ce projet est constitué de 16 conditions maximums. Ce nombre est choisi en se basant sur les résultats préliminaires physicochimiques qui ont permis d’éliminer les conditions non pertinentes et donc de réduire drastiquement le nombre d’individus. Pour chacune de ces conditions, et compte tenu de la variabilité interindividuelle existant chez la souris et de la difficulté de la mise en place du protocole, des groupes de 10 individus sont nécessaires pour assurer la validité statistique du phénomène observé. En effet, notre expérience sur l’induction de l’obésité chez la souris montre, par exemple, qu’un minimum de 10 souris par lot est nécessaire pour mettre en évidence une prise de poids significative. Lors d’un protocole de ce type, les souris contrôles (alimentation standard) pesaient à la fin de l’expérimentation en moyenne 33,9 ± 0,7 g contre 40 ± 1,2 g pour les animaux nourris avec un régime riche en lipides ce qui représente une différence significative avec une p-value associée de 0.005. Il s’agit d’une obésité modeste. Un nombre plus restreint d’animaux ne permettrait pas une finesse suffisante des résultats pour répondre à nos objectifs de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Le début des régimes aura lieu après 7 jours d’adaptation dans l’animalerie. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique (lidocaïne/prilocaïne 5%) sera appliquée localement avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Toutes les procédures invasives (prélèvement sanguins retro-orbitaux, dislocation cervicale) seront réalisées sous anesthésie générale (6% sévoflurane et débit d'oxygène = 1L/min, 5 min). Les animaux auront accès à l’eau et nourriture jusqu’à 12h avant le début de l’expérimentation postprandiale et l’eau jusqu’à la fin de l’expérimentation.

Choix des espèces

Dans la littérature, les expériences de biodisponibilité des micronutriments sont le plus souvent réalisées chez la souris, dont le système de digestion et d’absorption est anatomiquement proche de celui de l’homme. De plus, le modèle de souris offre des avantages comme la facilité de la mise en œuvre et le faible coût. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en trois groupes, ils reçoivent des injections destinées à provoquer une pancréatite, une inflammation pulmonaire ou une inflammation rénale, puis un agent de contraste avant un passage à l'IRM, et sont euthanasiés sans réveil pour prélèvement des organes. Le porteur indique que ces modèles inflammatoires peuvent atteindre la respiration, la mobilité et l'alimentation, avec une mise à mort déclenchée dès une perte de poids de 15 pour cent. Il conclut qu'il est "indispensable" de recourir aux animaux, ces pathologies n'étant pas selon lui reproductibles in vitro.

Objectifs

Ce projet ouvre une nouvelle voie en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) en initiant le concept d’« imagerie enzymatique » in vivo pour une meilleure compréhension de la physiologie humaine, la détection précoce et le pronostic des maladies, et le suivi de traitements thérapeutiques. L'objectif principal est de dépasser les frontières actuelles en permettant de visualiser directement l'activité d'une enzyme dans un tissu pathologique.

Bénéfices attendus

1-De nouveaux agents de contraste possédant une forte spécificité d’action au niveau tumoral, seront développés et permettront de suivre l’activité enzymatique tumorale 2- Ceci permettra la détection de façon précoce de maladies inflammatoires chroniques pulmonaires : en effet par exemple actuellement les pathologies chroniques pulmonaires ne sont détectées que lorsque les destructions du tissu pulmonaire sont irréversibles (Bronchopneumopathie chronique obstructive (COPD), mucoviscidose). Pour les pancréatites chroniques, aucun test n’est fiable pour le moment. 3- Ce projet permettra aussi de valider l'utilité de l'IRM à champ terrestre, en termes de coût, de facilité de transport et de consommation énergétique.

Procédures

Toutes les procédures décrites dans ce document seront réalisées sous anesthésie générale. Cent vingt animaux recevront 10 injections (une par heure) d'une modécule pro-inlfammatoire pour créer une inflammation du pancréas (pancréatite) puis une injection d'agents de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés. Cent vingt animaux recevront une injection de membranes bactériennes pour créer une inflammation pulmonaire puis une injection d’un agent de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés. Cent vingt animaux recevront une injection d'une molécule pro-inflammatoire pour créer une inflammation rénale puis une injection d'un agent de contraste avant leur passage à l'IRM, puis, sans réveil préalable, seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Des nouveaux agents de contrastes seront injectés dans les animaux. Du fait de leur haute spécificité d’action au niveau tumoral, ceux-ci ne devraient pas entrainer de nuisance ou d'effets secondaires. Cependant, en théorie une baisse de tension est possible due à leur présence. Selon notre expérience elle n’entraine jamais de séquelle ou de perte d’animaux. Cependant, les modèles inflammatoires peuvent atteindre le bien-être animal en terme de respiration, mobilité, alimentation. Il est important de noter que l’examen IRM n’a jamais montré de nuisance.

Devenir

Cette euthanasie est nécessaire pour extraire les organes et réaliser des coupes histologiques pour détecter la présence des neutrophiles dans les sites inflammatoires et ainsi corréler avec le signal IRM obtenu.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé des tests de validation de la méthode in vitro où seulement l’enzyme et l’agent de contraste étaient présents. Il est désormais indispensable d’utiliser des animaux, car nous souhaitons détecter une activité enzymatique, liée à une inflammation ou une pancréatite, dans un système complexe. Ces pathologies ne sont pas reproductibles in vitro car elles nécessitent soit un système immunitaire complet soit un organe fonctionnel dans lequel une situation pathologique doit être provoquée. De plus, nous souhaitons évaluer l’efficacité de détection de nouveaux agents de contraste, qui dépend de leur bio-distribution, du temps de demi-vie dans le sang, de la localisation de l’inflammation, de la voie d’injection, etc.. Ceci ne peut être évalué qu’en condition in vivo. Cette étude ne peut pas être réalisée chez l’homme car la technologie nécessaire à la fabrication d’une IRM à champs terrestre n’existe pas pour des études humaines. De plus, les agents de contrastes sont encore expérimentaux et donc ne peuvent pas être injectés directement chez l’homme.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux à utiliser pour ce projet, des expérimentations in vitro ont été réalisées en amont, pour étudier l'effet des agents de contraste sur des neutrophiles en culture. De plus la méthode a été déjà évaluée à 0.2 tesla. Le nombre d'animaux a été évalué à 10 rats par agent de contraste, afin d'avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats significatifs. Ces résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi par des objets (bâtonnets de bois à ronger, matériaux de construction de nid, coton, maisonnette, tubes en carton) contenant de la paille, de la nourriture et de l’eau à volonté. L'utilisation d'anesthésie gazeuse, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et un ballonnet pour le contrôle de la respiration pendant les procédures permettent d'assurer un réveil rapide des animaux et donc de pratiquer plusieurs anesthésies par animal. Du gel olphtalmique sera appliqué sur les yeux afin de compenser la sécheresse oculaire lors des anesthésies. Pour limiter la souffrance des animaux développant les modèles inflammatoires, ils seront euthanasiés dès que l’examen IRM sera terminé, sans réveil préalable. Entre la mise en place des modèles inflammatoires et l’examen IRM, des points limites terminaux ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux : modification de la respiration (respiration orale/abdominale, respiration difficile/pénible et de forte amplitude), atteinte de la mobilité (marche sur la pointe des pieds, titubation, léthargie), gonflement abdominal, perte de poids de plus de 15% en 2-3 jours (pour le modèle inflammatoire rénal). Pour cela, les animaux seront pesés tous les jours. De la nourriture sous forme de gel sera déposée dans la cage si les animaux sont affaiblis ou si une perte de poids de 10% en 2-3 jours est constatée (pour les modèles inflammatoires rénaux). Lors du développement de la pancréatite, les animaux seront pris en charge par un analgésique (en pré- et post-injection), et ce, jusqu’à la fin du protocole. Pour les autres pathologies, dès les premiers signes de souffrance détectée par des signes cliniques (poil hérissé, prostration, difficulté respiratoire..), les animaux recevront un analgésique. Si les signes perdurent plus de 12h dans le cas de l’inflammation pulmonaire ou 2 jours pour l’inflammation rénale, les animaux seront immédiatement transférés pour un examen IRM avant leur euthanasie. Les animaux seront surveillés au minimum 1 fois par jour par le porteur du projet, ou le zootechnicien ou les doctorants et post-doctorants formés.

Choix des espèces

Nous débuterons le projet sur des rats car leur taille est plus importante que les souris et permet donc d'obtenir plus de signal. L’IRM à champs terrestre est en effet beaucoup moins sensible que l’IRM à hauts champs. De plus, le développement instrumental est moins difficile pour des rats que pour des souris. De plus, de nombreuses pathologies bien connues dans la littérature inflammatoires pourront y être développées. Les rats seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), car le développement des organes est terminé. De plus, plus les animaux sont gros, plus la sensibilité de l’IRM augmente. Cependant, les rats ne seront utilisés que jusqu’à 4 mois (environ 300g), car ensuite ils deviennent trop imposants pour rentrer dans l’antenne sans être trop serrés et le vieillissement pourrait interférer avec les résultats.

40 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cette phase 1/2 consistant en une intervention chirurgicale de deux à trois heures sur l'intestin, anastomose iléo-rectale ou shunt du gros intestin. Les animaux opérés sont ensuite transportés vers un autre établissement pour des mesures de digestibilité, ils ne sont pas tués à l'issue de ce projet mais réutilisés. L'objet est d'évaluer la valeur nutritionnelle de matières premières pour l'alimentation des porcs d'élevage. Le porteur affirme que l'usage de l'espèce cible est "indispensable", tout en indiquant qu'une méthode in vitro pourrait à terme réduire ou remplacer ces essais.

Objectifs

Les essais de digestibilité iléale sur porcs en croissance sont réalisés partout dans le monde, par des équipes de recherche spécialisées dans ces méthodes, afin d’évaluer de la manière la plus précise possible la valeur nutritionnelle des matières premières (MP), coproduits ou aliments destinés aux porcs, particulièrement celle des protéines et des acides aminés. En effet, les MP et coproduits ne cessent d’évoluer, par les changements des itinéraires techniques plus respectueux de l’environnement, l’apparition de nouvelles sources de protéines locales et l’optimisation des procédés. Les résultats obtenus permettent aux producteurs d’aliments et aux éleveurs d’adapter au mieux la formulation aux besoins des animaux, contribuant au maintien d’une flore digestive équilibrée et d’une bonne santé des animaux mais aussi à réduire les rejets azotés dans l’environnement, à améliorer leur santé digestive (moins de fermentations indésirables) et à appuyer la recherche sur les procédés appliqués en vue d’améliorer la qualité des MP ou leur empreinte environnementale (ex. procédé de trituration). En effet, la présence d’éléments nutritifs non digérés et en particulier les protéines, augmente les fermentations des déjections et dégrade les conditions sanitaires de l’élevage. In fine, tous ces rejets se retrouvent en tant que polluants dans l’environnement (sol, air, eau). Ce projet est la continuité dans l’acquisition des données d’un projet précédent avec les mêmes objectifs. Il contribue à la validation d’une méthode alternative ayant pour but de réduire ou remplacer à terme les essais in vivo en utilisant une méthode in vitro qui est à raffiner avec des avancées méthodologiques du procédé et en agrégeant les résultats dans des modèles mathématiques avec d’autres informations sur les propriétés physicochimiques des aliments et MP ou leurs spectres proche infrarouge. Des données de digestibilité iléale issues d’essais in vivo réalisés sur plusieurs années ont été mises en commun servant de base au projet. Dès l'obtention des modèles, des essais de validation seront nécessaires. Dans ce type de projet, l’utilisation de l’espèce d’élevage est indispensable, puisqu’il s’agit de la cible directe de la thématique. Deux parties permettent de mener à bien ce protocole : un projet de modification chirurgicale nécessaire aux mesures (1/2) et un projet avec préparation, transport des animaux avant / après préparation chirurgicale et hébergement en cage individuelle (2/2).

Bénéfices attendus

Ce projet (1/2) est la phase de préparation des animaux, nécessaire à la réalisation du projet 2/2. Le programme global permettra de continuer l’acquisition de données de digestibilité iléale chez le porc nécessaire afin de formuler au mieux les aliments d’élevage pour limiter les désordres digestifs liés à un déséquilibre protéique mais aussi les rejets dans l’environnement tout en développant les connaissances sur des matières premières notamment locales. Les essais de digestibilité permettent d’évaluer des hypothèses de manière fine et donner des valeurs de référence de la valeur nutritionnelle d’une matière première ou d’un aliment avec un nombre d’animaux très réduit. Ces matières premières ne cessent d’évoluer d’où le maintien de ce type d’essai, mais le développement en parallèle des méthodes in vitro pourra à terme réduire ou remplacer la méthode in vivo. Ces résultats sont importants pour les filières animales et de plus en plus avec le développement d’une alimentation locale. Aucune autre méthode ne permet de faire la mesure avec un meilleur rapport bénéfice / risque. La seule autre technique est avec utilisation d’un marqueur et abattage de l’animal pour prélèvement du contenu. Non seulement elle est moins précise, mais avec un nombre identique de répétitions (n=6), il faut abattre 6 porcs pour une seule matière première, alors qu’avec 6 porcs nous pouvons évaluer 10-12 matières premières.

Procédures

Les porcs sont soumis à 1 intervention chirurgicale (anastomose iléo-rectale termino-terminale ou shunt du gros intestin). Un porc subit une seule fois l'opération, qui dure entre 2 et 3h en moyenne.

Impact sur les animaux

Comme dans toute intervention chirurgicale, la douleur potentielle de l’acte est gérée par un apport d’analgésique en périodes pré et post-opératoire, et par la maitrise de la technique par l’équipe chirurgicale. L’effet indésirable ultime est la complication opératoire qui pourrait donner lieu à la mort de l’animal, mais c’est assez rare dans l’historique de plus de 30 ans de pratique. Les autres nuisances sont plutôt liées au transport, à la période post-opératoire ou aux mesures in vivo qui sont décrites dans le projet 2/2.

Devenir

Les porcs issus de la procédure d'intervention chirurgicale sont transportés ensuite vers un autre établissement utilisateur (EU), dans le cadre d'une utilisation continue, pour des mesures in vivo de digestibilité iléale des nutriments présents dans les aliments.

Remplacement

La mesure de la digestibilité iléale des acides aminés chez le porc ne peut aujourd’hui être réalisée que par des essais sur des animaux de l’espèce cible ayant suivi la procédure de préparation chirurgicale décrite dans ce projet. Ce type d’essai a déjà contribué à établir des valeurs de référence largement utilisées dans le monde, mais la production de nouvelles matières premières et coproduits, d’additifs améliorants ou de process, nécessite d’établir de nouvelles références, qui ne peuvent être évaluées que par les études in vivo. Néanmoins, ce programme sert également à alimenter les bases pour le développement d’une méthode in vitro qui pourrait à terme, réduire ou remplacer les essais sur animaux.

Réduction

Ce projet permet de préparer chirurgicalement 6 animaux qui serviront à évaluer environ 10 matières premières différentes, sans recourir à d’autres interventions. Un dispositif en carré latin permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés par année (6 répétitions) utilisés dans un essai. Ce dispositif a été validé par notre service d’études méthodologiques et statistiques. 6 répétitions par aliment nous permettent d'obtenir une puissance suffisante pour mettre en évidence des différences significatives ayant un sens biologiquement sur les différents critères d'intérêt mesurés. Le traitement des données est réalisé en deux temps : un test permettant d’écarter un arrière-effet pour toutes les variables (semaine, animal, poids des animaux), et ensuite une analyse de variance et un test a posteriori (Tukey, méthode des contrastes, …).

Raffinement

Dans le programme global, le raffinement a été réfléchi sur les deux projets le constituant, d’abord sur les conditions pré-opératoires (EU A), puis sur l’intervention chirurgicale de ce projet (EU B) et enfin sur la phase post-opératoire et d’essai du projet 2/2 (EU A). Les mesures de raffinement décrites ci-dessous sont celles concernant uniquement l’EU B. Les animaux sont transportés par le personnel de l’EU A, dans un véhicule spécialement équipé pour le confort des animaux. Ils arrivent à l’EU B le jour même de l’intervention (30 minutes de transport). L’animal est accueilli directement dans un sas chauffé pour le préparer à l’intervention. Le raffinement est assuré par les bonnes pratiques chirurgicales et par une gestion adaptée de la douleur en pré et peri opératoire. L’acte chirurgical est réalisé par du personnel formé et autorisé, sous anesthésie gazeuse générale, analgésie et antibiothérapie appropriées. Les signes vitaux sont monitorés. Après l’intervention, l’animal est préparé pour le transport (bandage de la zone abdominale et placé en observation jusqu’aux premiers signes de réveil. Puis, il est replacé dans le véhicule conditionné pour le transport, sous sédation préalable. Le choix de replacer l’animal dans l’EU A pour la phase post-opératoire a été fait en considérant le peu de km de distance (36 km, environ 30 minutes) entre les deux sites et les bénéfices pour l’animal. En fait, les animaux sont habitués à leur lieu d’hébergement avant l’opération et le retrouvent rapidement après, évitant ainsi un stress supplémentaire. Une analgésie et une antibiothérapie adéquates sont prévues avant, pendant et après l'opération.

Choix des espèces

Ces essais concernent la mesure de la digestibilité iléale des acides aminés chez le porc. Ce type d’essai a déjà contribué à établir des valeurs de référence largement utilisées, mais la production de nouvelles matières premières et coproduits, d’additifs améliorants ou de process, nécessite d’établir de nouvelles références, qui ne peuvent être évaluées que par les études in vivo sur des animaux ayant suivi la procédure ici détaillée. Les animaux sont opérés à 25-30 kg pour faciliter l’acte chirurgical, puis laissé un temps long (1 mois) de rétablisement avant la réalisation de mesures. Les mesures de digestibilité (projet 2/2) sont réalisées en phase de croissance (35 - 80 kg), ce qui refléte au mieux les animaux ciblés en élevage par ce modèle.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des douleurs inflammatoires, post-chirurgicales ou neuropathiques leur sont provoquées, par injection de carragénine ou d'adjuvant dans la patte, incision chirurgicale ou pose d'un manchon autour du nerf sciatique, puis mesurées par des tests nociceptifs répétés. Le porteur précise que ces douleurs sont recherchées car c'est le but de l'étude, et que les tests s'arrêtent au retrait de la patte. Il justifie le recours à cette lignée transgénique par le fait que la caractérisation de la douleur exige l'observation d'un animal vivant.

Objectifs

Les neurones communiquent en sécrétant des messagers chimiques appelés neurotransmetteurs. Ces messagers sont stockés à l’intérieur de la cellule dans des vésicules spécialisées qui, en fusionnant avec la périphérie cellulaire, libèrent les neurotransmetteurs au bon moment et au bon endroit. Ce processus, appelé exocytose, est à la base de la neurotransmission (transmission d’un message entre 2 neurones). Bien que de nombreuses données aient été générées quant aux protéines impliquées, le rôle de ces protéines sur les comportements nociceptifs et douloureux, ainsi que sur l'initiation et/ou le développement de douleurs chroniques ne sont que très peu étudiés. Aujourd’hui, nous disposons d’une lignée de souris génétiquement modifiées pour la synapsine II (Syn II), une protéine synaptique, pour laquelle ces comportements douloureux pourraient être altérés (ces animaux semblent présenter une hyposensibilité à la douleur). Nous voulons donc étudier l’impact de l’absence de cette protéine Syn II sur les comportements nociceptifs et douloureux, ainsi que sur l'initiation et/ou le développement de douleurs chroniques. Le projet nécessitera 640 animaux et sera conduit en respectant la règle des 3R visant à réduire le nombre d’animaux ainsi qu’à optimiser les procédures. Les souris mâles et femelles seront étudiées en proportions équitables dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

A terme, ces données permettront de mettre en évidence, pour la première fois, l’importance des protéines synaptiques dans les circuits de transmission de la douleur et dans la physiopathologie des douleurs chroniques et ainsi trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Un lot d'animaux subiront deux tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 10 jours puis ils recevront une injection sous anesthésie gazeuse d’agent inflammatoire dans une patte postérieure avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs qu’avant l’injection. Un second lot d'animaux subiront un test nociceptif d’une durée de 10 min environ par jour pendant 10 jours puis ils recevront une injection sous anesthésie gazeuse d’agent inflammatoire dans une patte postérieure avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs qu’avant l’injection, à raison de 3 tests maximum (espacés de 2h minium) par jour, pendant 22 jours maximum. Un autre lot d'animaux subiront un test nociceptif d’une durée de 10 min environ par jour pendant 10 jours puis ils subiront une chirurgie sous anesthésie générale avec incision de la patte avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 3 tests maximum (espacés de 2h minium) par jour, pendant 28 jours maximum. Un dernier lot d'animaux subiront un test nociceptif d’une durée de 10 min environ par jour pendant 10 jours puis ils subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 3 tests maximum (espacés de 2h minium) par jour, pendant 39 jours maximum.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux inclus dans ce projet induisent une douleur sur laquelle l'animal garde le contrôle: le retrait de la patte ou de la queue de l'animal met fin au test, ou l'animal change de compartiment pour un compartiment plus "confortable". Ces tests sont systématiquement arrêtés au seuil nociceptif, le cas échéant il est arrêté au point limité spécifique de chaque test (décrit dans chaque procédure). Dans les cas de modèle de douleur, les animaux vont développer des douleurs inflammatoires, post-chirurgicales ou neuropathiques selon la procédure car c'est le but de l'étude. Le développement de douleurs inflammatoires s'accompagne d'un développement d'un oedème au site d'injection de l'agent inflammatoire (patte). Cet oedème persistera maximum 5 jours avec la carragénine et 12 jours avec le CFA. De plus, l'utilisation d'antidouleurs de type anti-inflammatoire non stéroïdien ou opiacés n'est pas possible en post-chirurgical dans notres cas car cela interfèrerait avec la mise en place de la douleur que nous étudions. Néanmoins des échelles d'évaluation des points limites spécifiques à chaque modèle de douleur (grille de scoring) sont établie pour chaque animal.

Devenir

Etude sur les animaux naïfs puis étude sur les animaux après injection de carragénine dans la patte (développement d'une douleur inflammatoire): mise à mort à l'issue de la procédure - Etude sur les animaux après injection de CFA (complete freund's adjuvant) dans la patte (développement d'une douleur inflammatoire chronique): mise à mort à l'issue de la procédure. - Etude sur les animaux après une incision de la patte (développement d'une douleur post-chirurgicale): mise à mort à l'issue de la procédure. - Etude sur les animaux après la pose d'un manchon (Cuff) autour du nerf sciatique (développement d'une douleur neuropathique): mise à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité phénotypique individuelle, en se basant sur notre power analysis, chaque étude de base comporte un groupe témoin et un groupe transgénique, de chaque sexe, de 20 sujets chacun soit 80 animaux. Les animaux n'étant pas consanguins, la variabilité phénotypique est considérablement augmentée. Un calcul statistique "power analysis" a également été réalisé pour s'assurer que les résultats obtenus sont valides sur le plan statistique. Le groupe transgénique est constitué d'animaux issus de la même souche que les sujets non modifiés génétiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, chaque étude de base regroupe un ensemble de tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire grandement l’effectif.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience, l'enrichissement est systématiquement appliqué à toutes les cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Des points limites spécifiques à chaque geste ont été établis. L’induction de modèle de douleur est réalisée sous anesthésie. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal. Remarque : l'utilisation d'antidouleur de type anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et opiacés n'est pas possible en post-chirurgie dans notre cas. Les AINS tout comme les opiacés interfèrent avec les processus inflammatoires nécessaires au développement et au maintien de la douleur neuropathique.

Choix des espèces

Le but est ici de réaliser une étude sur différents paramètres nociceptifs et différents modèles de douleur afin de caractériser la lignée de souris transgéniques SynII (Synapsine 2). Nous ne pouvons pas utiliser un autre modèle que la souris car ce sont des souris transgéniques dont nous voulons connaître les caractéristiques nociceptives physiologiques et/ou éventuellement physiopathologiques. Des animaux adultes âgés d'au minimum 6 semaines (souris dont les poids est supérieur à 20g) seront utilisés car cette étude nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée à partir de cellules cancéreuses, puis elles reçoivent jusqu'à huit injections d'un anticorps, avant mise à mort au plus tard trente jours après. Le porteur décrit une perte de poids et des difficultés respiratoires possibles liées au développement de métastases. Il annonce espérer démontrer l'efficacité d'une immunothérapie et juge le modèle animal seul capable de reproduire ces mécanismes tumoraux.

Objectifs

Un des cancers du sein les plus agressifs, qui représente 15 à 20% des cancers du sein, présente un taux élevé de rechute. L’absence de thérapies spécifiques le rende difficile à traiter. Nos données montrent que les cellules de cancer du sein triple négatif résistant à une irradiation présentent de façon plus abondante une protéine particulière appelée Gal9. Cette protéine pourrait servir de cible thérapeutique pour lutter plus efficacement contre cette maladie. L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’efficacité thérapeutique d’un anticorps ciblant Gal9 dans un modèle de cancer du sein triple négatif chez la souris. Notre projet consistera dans un premier temps à faire pousser des tumeurs à partir de cellules irradiées in vitro. Les cellules seront irradiées puis injectées dans la glande amammaire. La croissance des tumeurs sera suivie et comparée à des tumeurs issues de cellules non irradiées. La deuxième phase de notre projet dépendra de l’efficacité de notre première procédure. Elle consistera à injecter des cellules irradiées ou non irradiées à des souris et de traiter immédiatement ces souris avec un anticorps ciblant Gal9. Ce traitement devrait permettre de minimiser le développement du cancer, en particulier chez les souris dont les tumeurs expriment fortement Gal9.

Bénéfices attendus

Nous espérons démontrer l'efficacité d'une thérapie ciblant Gal9 dans ce cancer particulièrement agressif. Les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif et soumises à de la radiothérapie pourraient être particulièrement éligibles à cette thérapie.

Procédures

1 Injection sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (10 minutes) Injections intra-péritonéales sur animaux vigiles (jusqu’à 8, à raison de 2 par semaine)

Impact sur les animaux

Le développement des tumeurs pourrait s'accompagner d'une perte de poids en plus d'une gêne physique pour les animaux. Des effets indésirables liés à la présence de métastases sont envisageables ; ils se traduiraient par des difficultés respiratoires plus ou moins prononcées. La grille de points limites que nous proposons permettra de tenir compte de ces potentiels effets indésirables. En ce qui concerne l'injection d'anticorps anti-(gal9), plusieurs papiers ont déjà été publiés à ce sujet et ne montrent pas d'effets indésirables particuliers.

Devenir

Les animaux seront systématiquement mis à mort à la fin de chaque procédure, au maximum 30 jours après le début du traitement. Les raisons sont les suivantes: - le score maximum de points limites sera atteint, - les souris n'auront pas de tumeur primaire mais seront susceptibles d'avoir développé des métastases pulmonaires - les souris auront bien répondu à l’immunothérapie et l’analyse des réponses immuno-inflammatoires sera nécessaire pour l'expliquer.

Remplacement

Nous avons accumulé de nombreuses expériences sur modèles cellulaires mais nous devons maintenant tester l’utilité de notre traitement sur l’animal puisqu’il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes complexes impliqués dans le développement tumoral et les réponses immunitaires associées.

Réduction

Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécéssaire et suffisant de souris. Pour chaque condition expérimentale, un nombre de 10 souris par groupe pour un total de 70 souris.

Raffinement

L’état général des souris sera contrôlé visuellement quotidiennement en ouvrant chaque cage. Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours (lundi au vendredi). La grille sera également utilisée tous les 2 jours. La souffrance des animaux ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalent à l’introduction d’une aiguille. Cependant, une grille d’évaluation de la douleur, adaptée à ce projet, a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur. En cas d’atteinte d’un niveau défini de points limites, la mise à mort de l’animal sera anticipée.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisée dans des modèles développés in vitro et vise à valider la pertinence de notre travail dans le cancer du sein triple négatif. Il est essentiel de tester la pertinence de notre cible thérapeurique dans un modèle beaucoup plus complexe que des cultures cellulaires et de tester son action anti-cancéreuse. La souris est une espèce qui permet de récapituler assez fidèlement les étapes du développement du cancer du sein en intégrant les réponses des cellules de l'immunité observées chez l'humain. Le cancer mammaire est majoritairement présent chez l'adulte. Pour cette raison, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines.

Nées transgéniques, 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Chacune subit une chirurgie de trois à six heures sous anesthésie générale pour l'implantation d'équipements miniaturisés d'enregistrement et de stimulation, puis s'habitue en deux à huit jours à porter environ 3 g d'implant et d'équipement, avant des enregistrements menés jusqu'à l'âge de 35 semaines. Le porteur reconnaît que naître transgénique constitue un "potentiel effet indésirable", que le poids de l'équipement peut causer gêne et stress, et que le stress de la chirurgie ou de la contention peut rendre les souris agressives entre elles. Le projet doit aussi mesurer le rôle de la synchronisation cérébrale du sommeil profond dans la consolidation de la mémoire, sans que le porteur décrive aucune tâche d'apprentissage ni aucun test de mémoire.

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont 1- d’élucider les mécanismes qui permettent la synchronisation des activités neuronales entre des aires cérébrales distantes pendant le sommeil profond et 2- de déterminer l’importance de cette synchronisation dans la consolidation de la mémoire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice direct de cette étude est l’amélioration des connaissances, dans deux domaines, 1- les mécanismes de base du sommeil profond, et 2- le rôle du sommeil profond dans les processus d’apprentissage et de mémoire. En plus de ce bénéfice direct, les bénéfices indirects de cette recherche fondamentales sont 1- découvrir une nouvelle région cible pour le traitement des troubles du sommeil profond, 2- mettre en évidence l’importance relative des différentes phases du sommeil pour l’apprentissage et la mémoire. 30% de la population européenne est en déficit chronique de sommeil et ceci a de nombreuses conséquences sociales et économiques. Le manque de sommeil est en effet associé à une augmentation des risques d’accidents, mais aussi a un risque accru de souffrir de nombreuses pathologies comme la dépression, l’anxiété, l’obésité, etc. D’autre part la majorité des troubles psychiatriques et des maladies neuro-dégénératives sont associées à des sommeils détériorés qui amplifieraient les symptômes. De plus en plus d’études suggèrent que le sommeil pourrait jouer un rôle important dans l’étiologie de ces pathologies. Il est donc de première importance de comprendre le fonctionnement du sommeil en conditions physiologiques et pathologiques pour ajouter une corde à l’arc thérapeutique.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie consistant en l'implantation d'équipements d'enregisterment et de stimulation miniaturisés. La chirugie d'implantation dure 3-6 heures. Une fois la chirurgie effectuée, les animaux seront hébergés en groupe et libres de leurs mouvements.

Impact sur les animaux

Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soit un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale. Le niveau de douleur de cette procédure est modéré et sera atténué par un analgésique pré-opératoire et des analgésiques pendant les 5 jours post-opératoires. La déshydratation pendant la chirurgie sera prévenue par injection de saline. Après les 5 jours post-opératoires, les animaux seront progressivement habitués à être restreint de leur mouvement pendant une brève période dans la main de l’expérimentateur. Une fois les animaux habitués à la contention, leur implant sera connecté au système d’enregistrement (caméra et/ou préamplificateur). Le poids total de l’implant + équipement est d'environ 3 g. Ce poids peut occasionner une gêne pour l’animal ainsi qu’un stress les premiers jours. Pour limiter cela, les animaux seront habitués sur 2-8 jours au port des équipements pendant des périodes de plus en plus longues 2-5 fois par jour. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés en groupe. Néanmoins, il est possible que le stress induit par la chirurgie ou la contention rende les animaux agressifs entre eux. Une manipulation très progressive sera effectuée afin de limiter au maximum les situations où les animaux devraient être séparés. Néanmoins, en cas d’agression, les animaux seront hébergés dans des cages larges avec une grille séparant deux compartiments qui permettent d’héberger deux animaux dans un environnement contigu tout en empêchant les agressions.

Devenir

A l'issue de ce protocole expérimental, les souris seront euthanasiées. En effet, il est essentiel de prélever leur cerveau afin d'effectuer des analyses complémentaires.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques se basant sur des linear mixed models qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle et de test afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.

Raffinement

Le haut niveau de complexité des chirurgies effectué sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrements pendant des mois. Dans ce projet, je combinerai les techniques d’imagerie chez l’animal libre de ses mouvements et les enregistrements électrophysiologiques ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux et d’obtenir des données encore plus riches puisque combinant deux techniques de pointe sur le même animal. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, j’ai donc raffiné les étapes d’habituation et de contention afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux.

Choix des espèces

Ce projet requiert l’utilisation de souris transgéniques. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. La souris possède une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. La diversité des modèles génétiques existants chez la souris permet tout un panel de manipulation de l’activité neuronal dans des types cellulaires donnés. Mon étude vise à déterminer comment différents types de cellules sont impliqués dans la synchronisation des oscillations. L’utilisation de souris transgéniques spécifiques permettra de répondre à ces questions. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgie seront effectuées entre 8 et 20 semaines et les enregistrements entre 10 et 35 semaines. En effet, ce projet vise à étudier les oscillations chez des animaux adultes non âgés.