Procédures modérées

1 490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Selon les lots, elles subissent une à trois chirurgies, chirurgie stéréotaxique, injection virale et vagotomie, puis portent des fibres optiques ou un cathéter gastrique pour des tests de comportement et de métabolisme. Le porteur indique des douleurs et infections postopératoires possibles et un stress lié aux dispositifs, et précise que tous les animaux sont mis à mort pour prélever des tissus. Il affirme que les expériences ne peuvent se faire in vitro car il a "besoin" d'observer une physiologie intégrée, et que les invertébrés n'ont pas les structures équivalentes aux mammifères.

Objectifs

La régulation de la prise alimentaire repose sur la balance entre besoins énergétiques et la valeur renforçatrice de la nourriture. Cette régulation résulte de l'intégration dynamique de plusieurs signaux qui façonnent collectivement les stratégies adaptatives pour le maintien de l'apport calorique et du poids corporel. Cependant, notre environnement alimentaire moderne fait évoluer les ajustements physiologiques vers des dysfonctionnements de la récompense et du métabolisme qui peuvent conduire au syndrome métabolique (obésité). Les composantes de la prise alimentaire (énergie et récompense) ont été souvent décrites et étudiées en termes de régulation par le cerveau. Cependant, dans les dernières années l’axe vagal (intestin-cerveau) a émergé comme un régulateur clé de la prise alimentaire en modulant à la fois le métabolisme énergétique et les processus de récompense. Le nerf vague représente un relai neuronal capable d’assurer le transfer de l’information intéroceptive entre les organes périphériques et le cerveau. Malgré ce rôle critique, les mécanismes sous-jacents à cette régulation en conditions physiologiques et/ou pathologiques (obésité) restent largement inconnus. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de l’axe vagal dans les processus de récompense et de métabolisme énergétique. Le projet est construit autour de 4 objectifs principaux. 1. Étudier la plasticité structurale et neuronale des neurones du système de la récompense suite à vagotomie. 2. Établir le rôle des afférences vagales intestin-cerveau dans les réponses adaptatives du circuit de récompense dans l'obésité : de l'alimentation à la détection des nutriments. 3. Interroger l'axe vagal intestin-cerveau pour restaurer les fonctions hédoniques et métaboliques 4. Explorer la signature moléculaire des neurones vagaux pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'obésité

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. En fait, à ce jour, les approches thérapeutiques les plus durables de l'obésité et des dysfonctionnements qui lui sont liés sont représentées par les chirurgies bariatriques, très efficaces mais extrêmement invasives et dangereuses, dont les mécanismes d'action restent largement inexplorés. Le développement récent de technologies de pointe et l'émergence de concepts révolutionnaires dans le domaine de la physiologie intégrative, comme le propose le projet, vont certainement élargir notre quête de connaissances et de solutions thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 5 lots à une chirurgie d'injection virale (environ 1h), puis après une période de repos de 3 semaines minimum, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles (175ul, 35ul et 35ul sur 3j à interval d'une semaine) seront fait sur deux de ces lots. -pour 4 lots à deux chirurgies (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, ou stéréotaxie 30min et après 15j de repos une vagotomie 40min), puis après une nouvelle période de repos de 15j, à des tests de comportements. -pour 1 lot à trois chirurgies qui se feront en deux fois pour le bien être de la souris (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, puis après 15j de repos une vagotomie 40min). Puis après une période de repos de 15 jours à nouveau, il seront soumis à des tests de comportements.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble des procédures il peut y avoir des douleurs ou infections post opératoires qui seront traitées par analgésie et antibiothérapie si nécessaire. Pour les procédures 1-2-3, le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement. De même pour les animaux portant un cathéter gastrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Oui selon le dessin expérimentale et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons les tests suivant: Student T Test ; One-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; Two-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; régression linéaire. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests non-paramétriques.

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux sont bien en place.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur produit des souriceaux porteurs d'une mutation du gène Nemo reproduisant la maladie Incontinentia pigmenti, puis les euthanasie sept jours après la naissance pour prélever leur cerveau. Il indique que les animaux développent une inflammation cutanée pouvant être sévère et que les plus atteints sont euthanasiés avant la date prévue. Sur les 120 animaux produits, il précise que 60 sont des mâles de type sauvage et qu'environ 20 femelles présenteront les lésions cérébrales étudiées, et affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer l'animal pour cette pathologie.

Objectifs

Incontinentia pigmenti (IP) est une sévère génodermatose liée au chromosome X qui est létale chez le garçon très tôt durant le développement. Chez la fille, la caractéristique majeure de la maladie est une dermatose qui débute habituellement peu de temps après la naissance et évolue selon une séquence d’événements spécifique. En plus de cette dermatose, les patientes IP peuvent aussi présenter des anomalies ophtalmologues, odotonlogiques et cérébrales. Le gène responsable d’IP (NEMO) code pour un régulateur essentiel de la voie de signalisation NF-kB et est localisé sur Xq28. Chez 70-80% des patientes une délétion identique du gène a lieu. L’invalidation conditionnelle de Nemo chez la souris permet d’éliminer NEMO dans tout l’organisme ou dans des tissus spécifiques. Le phénotype des souris invalidées dans tout l’organisme est très similaire à celui des patientes IP. Alors que les souris mâles meurent très tôt durant l’embryogénèse les souris femelles (Nemo+/Nemo-) se développent normalement mais présentent juste après la naissance des lésions cutanées similaires à celles qui sont observées chez les patientes IP. Les souris invalidées pour Nemo représentent donc un modèle fidèle pour étudier la dermatose liée à IP. En contraste avec ce qui a été élucidé au niveau cutané, grâce au système murin décrit ci-dessus, peu de choses sont connues concernant la base des anomalies cérébrales touchant environ 30% de patientes IP. Chez les humains, divers défauts ont été détectés parmi lesquels de l’atrophie/hypoplasie cérébelleuse, des défauts de la matière blanche périventriculaire et subcorticale avec infarctus, de l’ischémie, une hypoplasie du corps calleux et un élargissement ventriculaire qui est la cause de l’épilepsie, du retard mental, de l’hémiparésie, de la spasticité musculaire, de la microcéphalie et de l’ataxie cérébelleuse). Les causes primaires de ces défauts (développementales, vasculaires, etc…?) restent obscures, ne permettant pas un traitement rationnel des patientes. Pour tenter de comprendre les mécanismes entrainant les anomalies cérébrales des animaux atteints de dermatose liée à l’IP nous proposons d’analyser en détail le cerveau de souriceaux femelles (Nemo+/Nemo-), agés de moins de 8 jours, et de détecter s’il existe des défauts et analyser leur origine.

Bénéfices attendus

Acquérir une meilleure connaissance des défauts cérébraux des patientes IP

Procédures

Les animaux sont euthanasiés 7 jours après leur naissance et leur cerveau prélevé et analysé.

Impact sur les animaux

Les animaux développent peu après la naissance une inflammation cutanée qui peut être sévère. Dans ce cas les animaux sont euthanasiés avant la date prévue.

Devenir

Euthanasie pour récupération du cerveau

Remplacement

Modèle murin mimant une pathologie humaine, ce qui permet 1) de comprendre la pathologie et 2) de tester des traitements potentiels. Seul système génétique envisageable correspondant à ce qui a lieu chez l’humain : KO murin correspondant au KO observé chez 70 % des patientes + Transmission du défaut liée à l’X et état mosaïque comme chez l’humain. Aucune méthode alternative ne peut remplacer l’animal dans le cas de cette pathologie

Réduction

Le nombre minimum d’animaux a été défini de façon à produire les données expérimentales requises pour comprendre les mécanismes entrainant les anomalies cérébrales. 120 animaux signifient qu’après avoir utilisé une stratégie de production optimale génétiquement, 60 sont des mâles de type sauvage et 60 des femelles pouvant être atteintes de dermatose IP. Nous avons ensuite considéré la situation humaine dans laquelle, approximativement 30 % des patientes développant une dermatose présentent des lésions cérébrales : ce qui correspond à environ 20 souris.

Raffinement

Après leur naissance, les animaux sont observés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs pour contrôler l’apparition des signes cutanés : - retard de croissance - retard dans la lactation - inflammation cutanée . Un examen quotidien a lieu entre P4 et P7 permettant d’euthanasier si nécessaire des souriceaux trop atteints Elles sont surveillées après leur naissance pour détecter l’apparition des lésions cutanées, qui surviennent à peu près à P4 et sont euthanasiées au plus tard à P7 pour analyser leur cerveau.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle mimant la pathologie humaine incontinentia pigmenti. Les souriceaux seront utilisés au maximum 7 jours après leur naissance (P7). En effet, des femelles affectées par la dermatose peuvent mourir entre 8 et 10 jours après leur naissance si celle-ci est sévère.

80 souris pygmées (Mus minutoides) vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit une étude qu'il présente comme "non invasive et indolore", mesure de l'activité locomotrice par caméra et de l'activité métabolique par calorimétrie sur trois jours, tout en isolant chaque animal en cage individuelle, ce qui peut provoquer un mal-être qu'il reconnaît. À l'issue, les souris sont mises à mort et prélevées de nombreux organes, cœur, rein, tête, muscle, pour des mesures complémentaires, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent rejoindre l'élevage sous peine d'être rejetées ou tuées par leurs congénères. Sur le remplacement, il affirme que l'étude "nécessite des organismes vivants dans leur intégralité" propres à cette espèce.

Objectifs

Chez les mammifères, le déterminisme sexuel XX/XY reste très conservé, à quelques exceptions près, car toute déviation mène généralement à la stérilité des organismes hybrides. Certaines espèces comme Mus minutoides échappent à cette règle. Chez cette espèce, il existe une inversion sexuelle due à un chromosome X mutant, le chromosome X*, qui féminise les individus. Par conséquent, il existe des femelles XX, XX* et X*Y et des mâles XY chez cette espèce. Outre l’inversion sexuelle, ce troisième chromosome X* entraine de nombreuses différences phénotypiques. Les femelles X*Y ont un meilleur succès reproducteur que les autres femelles, i.e. une première portée plus précoce, une taille de portée plus grande et plus de descendants au cours de leur vie. De plus, elles présentent un comportement très masculinisé, sont plus agressives et moins anxieuses que les femelles XX et XX*. Ainsi, les études jusqu’alors menées chez Mus minutoides se sont surtout intéressées aux différences génotypiques et comportementales observées entre les différents génotypes sexuels. Peu d’études ont investigué la physiologie et encore moins l’influence du génotype sexuel sur celle-ci, chez cette espèce. Ce présent projet a donc pour objectif de poursuivre le phénotypage chez Mus minutoides en réalisant de nouvelles mesures comportementales et physiologiques (de l’animal entier jusqu’à la cellule). Pour cela, 16 femelles XX, 16 femelles XX*, 16 femelles X*Y et 16 mâles XY seront utilisés. Après deux semaines d’acclimatation, les paramètres listés ci-après seront mesurés durant 3 jours consécutifs (mesures répétées) : - L’activité locomotrice par caméra infrarouge. Pour cette analyse comportementale, la durée, la fréquence et le type de déplacement seront considérés. - L’activité métabolique grâce à un système de calorimétrie indirecte. Cette mesure permettant alors d’obtenir des mesures complémentaires à celle de l’activité locomotrice en quantifiant, par exemple, l’énergie utilisée dans les fonctions vitales pour l’animal et celle impliquée dans d’autres fonctions (comme la locomotion) sur 24h. De même, il sera possible de calculer le quotient respiratoire, la prise alimentaire et la prise hydrique des individus étudiés. Cette étude, non invasive et indolore, constitue une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences physiologiques et comportementales entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet est une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences cérébrales et comportementales entre sexes et sur le rôle de l’antagonisme sexuel dans l’évolution des chromosomes sexuels. Nous sommes également dans une excellente configuration pour comprendre les bases génétiques encore largement méconnues du déterminisme sexuel chez les mammifères, qui pourrait apporter des éléments utiles à la recherche clinique. Les animaux ne pourront pas être réintroduits dans leur élevage initial sous peine d’être rejetés voire tués par leurs congénères. Ils seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires (mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, activités enzymatiques, analyse morphométrique, etc) afin de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides et d’apporter de nouvelles connaissances sur cette espèce encore peu méconnue d’un point de vue physiologique.

Procédures

Après deux semaines d’acclimatation, les souris seront placées en cage expérimentales dans les mêmes conditions de stabulation (enrichissement précédent conservé). Pour chaque individu, les paramètres listés ci-après seront mesurés durant 3 jours consécutifs : - L’activité locomotrice par caméra infrarouge. Pour cette analyse comportementale, la durée, la fréquence et le type de déplacement seront considérés. - L’activité métabolique grâce à un système de calorimétrie indirecte. Cette mesure permettant alors d’obtenir des mesures complémentaires à celle de l’activité locomotrice en quantifiant, par exemple, l’énergie utilisée dans les fonctions vitales pour l’animal et celle impliquée dans d’autres fonctions (comme la locomotion) sur 24h. De même, il sera possible de calculer le quotient respiratoire, la prise alimentaire et la prise hydrique des individus étudiés. Cette étude est non invasive et indolore. Elle constitue une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences cérébrales et comportementales entre sexes et sur le rôle de l’antagonisme sexuel dans l’évolution des chromosomes sexuels. Nous sommes également dans une excellente configuration pour comprendre les bases génétiques encore largement méconnues du déterminisme sexuel chez les mammifères, qui pourrait apporter des éléments utiles à la recherche clinique. Les animaux ne pourront pas être réintroduits dans les élevages initiaux sous peine d’être rejetés voire tués par leurs congénères, il seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires (mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, etc) qui permettront de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides.

Impact sur les animaux

Le projet est conçu de sorte à ne pas entrainer de nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux. Néanmoins, les souris seront seules dans leur cage, pour un souci d’agressivité et de conditions expérimentales, ce qui peut mener à un mal-être de l’animal. Par conséquent, nous porterons une attention particulière au comportement et à l’état physique des souris pour éviter qu’un animal ne se retrouve en souffrance. De même, les cages seront placées les unes à côté des autres pour que les souris puissent au moins se voir et ne pas se sentir isolées. Les observations faites lors du dernier projet réalisé sur cette espèce ont permis de mettre en évidence que les souris ne montrent pas de signes de stress lorsque leur cage se situe à côté de celles de leurs congénères.

Devenir

L’élevage initial ne reprendra pas les individus utilisés dans cette procédure expérimentale pour des raisons sanitaires et également de réinsertion. La souris pygmée Africaine Mus minutoides est une espèce sociale qui vit en petit groupe. A l’issu de l’expérimentation, il sera difficile de reconstituer des groupes d’individus qui auront été isolés plusieurs jours (même si le contact visuel est maintenu entre les individus), plus particulièrement avec les mâles XY et les femelles X*Y qui peuvent se montrer très agressifs. Enfin, il existe peu d’informations sur la physiologie de cette espèce et sur les différents génotypes existants chez celle-ci : femelles XX, X*X et X*Y et mâles XY. A l’issu de ce projet, les animaux seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires : mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, activité enzymatique, analyse morphologique, etc. Des mesure qui permettraient de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides, sans mettre à mort d’autres individus. Les échantillons biologiques prélevés seront nombreux (i.e cœur, rein, tête, queue, muscle squelettique, foie, muscle, tissu adipeux brun, etc) pour répondre à diverses questions soulevées au sein de notre laboratoire et dans d’autres laboratoire (Montpellier notamment). En guise d’exemple, le muscle squelettique sera utilisé par notre laboratoire pour des analyses de bioénergétique mitochondriale et les têtes des souris seront, quant à elles, envoyées à Montpellier pour des analyses de la morphologie des cavités nasales de cette espèce.

Remplacement

Ces expérimentations nécessitent des organismes vivants dans leur intégralité, en particulier une espèce, Mus minutoides, qui ne peut pas être remplacée par une approche substitutive.

Réduction

Les manipulations sont optimisées statistiquement pour réduire le nombre d’individus utilisés : 16 individus par génotype sexuel, soit 64 individus au total. En effet, un test de puissance, à partir de données préliminaires, indique que 16 individus par condition sont nécessaires pour détecter une différence : power.anova.test (groups = 4, between.var = 1, within.var = 4, power = 0.80). Chaque individu sera utilisé à la fois pour les mesures d’activité physique, de taux métabolique et d’autres mesures complémentaires (prises alimentaire et hydrique, bioénergétique mitochondriale, etc). 4 individus supplémentaires de chaque génotype seront aussi maintenus en réserve et ne seront utilisés que dans le cas où des individus seraient écartés de la procédure expérimentale ou morts. Ainsi, dans le cas où les individus supplémentaires venaient à être étudiés, 80 animaux seraient utilisés pour ce projet. Les données obtenues à l’issu de ce projet seront alors analysées statistiquement à l’aide d’une ANOVA sur mesures répétées puisque plusieurs mesures auront été réalisées sur un même individu.

Raffinement

Les mesures nécessitent ni injection, ni manipulation des individus, excepté lors du changement de cage. Les cages d’hébergement seront enrichies de nids et de jeux, et la nourriture ainsi que l’eau seront disponibles ad libitum pour limiter la solitude des individus dans la cage. Ce même enrichissement sera conservé dans les cages expérimentales et aucun changement de cage ne sera effectué lors des mesures pour limiter le stress des animaux. Une attention particulière sera portée sur diverses manifestations : les prises hydrique et alimentaire, la présence ou non de toilettage, la modification de comportement ou de posture, l’apparition d’une hypothermie et la consistance des selles. Un individu en souffrance sera écarté de la procédure et placé dans sa cage d’hébergement initiale, plus enrichie. Si son état venait à s’aggraver, l’animal serait mis à mort par dislocation cervicale précédée d’une sédation.

Choix des espèces

L’étude de l’activité physique et du taux métabolique nécessite des organismes vivants dans leur intégralité, et en particulier des femelles et des mâles Mus minutoides. En effet, ce projet cherche à comparer quatre génotypes sexuels différents : trois génotypes féminins existant chez cette espèce (XX, XX* et X*Y) et un génotype mâle (XY). Ainsi, aucune méthode alternative n’existe pour réaliser ce projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes reproducteurs. Les mesures de taux métabolique (consommation d’oxygène) et d’activité nécessitent de choisir des individus d’âge relatif similaire afin d’éviter les variations en lien avec le stade de développement. Prendre des adultes, par exemple, évite de mesurer le taux métabolique (consommation d’oxygène) alloué à la croissance des individus en développement et de mesurer par conséquent le taux métabolique basal de l’individu.

1 496 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection intracérébroventriculaire d'agrégats de peptide bêta-amyloïde par chirurgie stéréotaxique, puis reçoivent un candidat-médicament chaque jour pendant dix-sept jours, avant un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur mesure l'activité locomotrice pour évaluer les rythmes circadiens et indique que des effets indésirables comme une sédation peuvent apparaître. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne rend compte du comportement d'un "organisme vivant entier" et conclut à l'impossibilité de remplacer l'animal.

Objectifs

Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. Des études ont montré que le manque de sommeil peut augmenter de manière significative les taux de bêta-amyloïde dans certaines régions du cerveau. L’objectif de cette étude est 1) d'examiner si une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien chez le rat et 2) dans le cas où l'injection ICV d'agrégats Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien, d’examiner l’effet d’une administration quotidienne de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées.

Bénéfices attendus

Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. 40 à 70 % des personnes ayant la MA éprouvent des problèmes de sommeil qui au fil du temps vont être amplifiés ; ce qui est épuisant pour la personne atteinte mais également pour son aidant. La prise en charge de ces troubles repose sur des traitements médicamenteux tels que des antipsychotiques ou des benzodiazépines. Mais ces médicaments ont souvent des effets indésirables inquiétants chez les personnes atteintes de la MA ; ils peuvent aggraver le déclin cognitif et accroître les risques de chute. Ainsi, ce modèle peut être utile pour le développement de cibles thérapeutiques pour traiter cette problématique.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d'Aβ (1-42) par stéréotaxie) qui dure dans sa totalité environ 45 minutes (de l'anesthésie jusqu'au réveil). Ensuite, au moment du test de comportement (test de l'activité locomotrice), les animaux reçoivent une injection par jour du candidat médicament; et ceci durant 17 jours maximum. A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang et de cerveau est réalisé sur l'ensemble des animaux. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 20 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Impact sur les animaux

1) Chirurgie : injection ICV - Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Puis, selon les groupes, une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) ou de véhicule est réalisée. 2) Administration des candidats médicaments - Les administrations sont réalisées tous les jours et pendant toute la durée de l’enregistrement de l’activité locomotrice. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle permettant d’évaluer le cycle circadien dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. La lignée de rat utilisée est : Sprague-Dawley 9-10 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.

Objectifs

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.

Bénéfices attendus

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.

Procédures

Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.

Impact sur les animaux

Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.

Devenir

Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).

Remplacement

Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.

3950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections d'un composé supprimant l'autophagie, puis une injection de cellules leucémiques, des prélèvements sanguins répétés, parfois une ponction osseuse, et un traitement oral ou intrapéritonéal, pour étudier le rôle de l'autophagie dans la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur indique des effets possibles comme du stress, une perte de poids ou une gêne de mobilité après ponction osseuse. Les souris sont tuées par prélèvement sanguin intracardiaque sous anesthésie pour les analyses.

Objectifs

Malgré un taux élevé de rémission après un traitement conventionnel par chimiothérapie, les rechutes sont fréquentes chez les patients atteints de leucémies aigües myeloïdes (LAM). Comme pour d'autres types de cancer, l'un des mécanisme impliqués dans la résistance des LAM est la reprogrammation métabolique. L’autophagie est un processus catabolique impliqué dans la dégradation et le recyclage des organelles et protéines endommagées pour participer au métabolisme. La dérégulation de l’autophagie est impliquée dans de nombreuses maladies telles que le cancer. Récemment, l’importance de l’autophagie dans les cellules du microenvironnement tumoral a également été mis en évidence. En effet, cette autophagie de l’hôte favorise la croissance des mélanomes, cancer du poumon ou cancer du pancréas en fournissant les substrats nécessaires aux cellules cancéreuses. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie de l’hôte dans la régulation du métabolisme des cellules de LAM et leur chimiorésistance.L

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le dévelopement et la résistance des LAM et les mécanismes moléculaires exacts impliqués. Cette meilleure compréhension pourra permettre le développement de thérapies ciblant directement l'autophagie ou des voies moléculaires régulées par ce mécanisme. Ce projet permettra également la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 injections d'un composé permettant d'induire une déplétion de l'autophagie dans l'ensemble des organes de la souris. Les animaux seront ensuite soumis à une injection unique de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis à des prélèvements de sang sous anesthésie espacés de plusieurs semaines afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique (plasma) pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement de durée variable selon le type de thérapie, allant de une à quatre semaines, par voie orale ou intrapéritonéale. Les animaux seront soumis à une présence humaine quotidienne afin d'observer leur état de bien-être et manipulés de façon hebdomadaire pour un suivi pondéral.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, une perte de poids, une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne par exemple. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir un gêne temporaire au niveau de la mobilité même si la douleur est inhibée avec l'analgésie. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque étude contenant plusieurs procédures. Pour les procédures suivantes: injedction intraveineuse, intrapéritonéale, orale ainsi que le prélèvement sanguin mandibulaire et jugulaire, les animaux seront gardés en vie pour continuer l'étude. Pour la procédure de prélèvement de sang par voie intracardiaque sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés sans réveil après la procédure.

Remplacement

Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans le développement leucémique et la résistance thérapeutiques, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier de façon fidèle les interactions entre la tumeur et son microenvironnement ainsi que son évolution au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro (notamment de co-culture) permettent d’obtenir une première compréhension des mécanismes, ils ne sont pas suffisants. Par exemple, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse in vitro et in vivo à l’AraC, rendant nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l'outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d'optimiser le nombre d'animaux et le nombre d'échantillons issu de l'animal.

Raffinement

L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des ainmaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites. La plupart des procédures décrites dans ce projet ont déjà obtenu l'accord d'un comité d'éthique pour l'expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du cancer et du rôle de l’autophagie dans de nombreuses pathologies. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements et à la compréhension des fonctions de l’autophagie. Ils présentent des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Dans l’étude de la LAM, nous utilisons des souris immunodéficientes et immunocompétentes contrôle ou déficiente en autophagie systémique afin d’étudier l’importance de la composante immunitaire. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe leucémique. Le traitement au tamoxifène pour induire la délétion est également plus efficace à cet âge-là. De plus, les souris de cet âge sont moins susceptibles de ressentir la douleur, la souffrance et l’angoisse.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse ou intrathécale d'un vecteur AAV et subit cinq à huit prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie, sur une période allant jusqu'à neuf mois, pour préparer un essai de thérapie génique chez des enfants atteints de leucodystrophie métachromatique. Le porteur indique des risques anesthésiques, infectieux et de fuite de liquide céphalo-rachidien. Les macaques sont euthanasiés en fin de projet pour prélever le cerveau, la moelle épinière et les organes.

Objectifs

Les vecteurs AAV sont parmi les vecteurs les plus efficaces pour transporter et intégrer des gènes d’intérêt dans des parties précises du système nerveux central, en particulier, le cerveau . Les AAV constituent une voie de thérapie pour des maladies neurodégénératives, notamment la leucodystrophie métachromatique. Le but de cette étude est de valider la capacité de transduction du vecteur AAVPHP.eB ARSA apres administration intraveineuse ou intrathecale chez le primate non humain, afin de realiser les étapes préclinique (efficacité et tolérance) et de de supporter le depot d'un CTA à l'agence du medicament en vue d'un essai clinique de phase I/II chez les enfants souffrants de leucodystrophie métachromatique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la validation de l'efficacité et de la tolérance de l'approche permettant les étapes precliniques chez le primate non humain, afin de supporter le depot d'un CTA à l'agence du medicament en vue d'un essai clinique de phase I/II chez les enfants souffrants de leucodystrophie métachromatique et de pouvoir ainsi proposer un traitement alors qu'aujourd'hui il n'existe que des soins palliatifs et les enfants decedent avant l'age de 4 ans.

Procédures

Injections intraveineuse ou intrathécale et prelevement de sang et de liquide céphalo-rachidien. Toutes les procédures sont réalisées sur animaux anesthésié et sous analgésie. Il y a au total une procédure d'injection (IV ou IT) et 5 prelevements de sang et LCR si maintien pour 6 semaines ou 8 prelevements si maintien pour 9 mois. Toutes les anesthésies durent moins de 1h30.

Impact sur les animaux

Les 3 effets indesirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux pour l'injection intrathécale - un risque de fuite de LCR - la formation d'hématomes lors des prises de sang

Devenir

Euthanasie à la fin du projet afin de collecter cerveau, moelle epiniere et organes peripheriques et fluides biologiques afin de valider la biodistribution, l'expression et la tolérance du produit thérapeutique

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de scale-up (efficacité, biodistribution, toxicité, etc) chez le gros animal (NHP). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique

Réduction

2 animaux par dose et approche est le minimum statistique pour repondre à l'objectif du projet soit 6 animaux au total Le projet va nous permettre de realiser les marquages pour evaluer l'expression et le coverage des zones ciblées ainsi que determiner la biodistribution. Il n'y a pas de statistiques faites sur les marquages. Nous nous basons aussi sur des résultast préalables obtenus sur d'autres projets pour pouvoir limiter le nombre d'animaux necessaires.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment l’intrathécale réalisée par un neurochirurgien expert de la technique. qui a déja posé le meme catheter d'injection chez des bébés achondroplastes (nain) ayant un rétrécissement du canal lombaire. Enfin, le nombre d'anesthesie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang, ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation de buprecare pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort et enfin des antibiotiques (amoxicilline) lors de l'intrathecale.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée. Les organes du NHP en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de vecteurs AAV chez le NHP est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. NHP : macaques (1-10 ans) (2 à 12kg) Les mâles NHP atteignent la maturité sexuelle à 6 ans et les femelles à 4 ans, de plus le cerveau est bien formé à ces âges-là. Sachant que nous travaillons sur une pathologie qui apparaît dans l'enfance, nous realiserons nos procédure sur un cerveau formé et myelinisé et non pas avant l'âge d'un an.

663 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vaccins puis sont volontairement infectées par la bactérie de la furonculose lors d'un challenge, avec cinq à six prises de sang sous anesthésie, pour évaluer des protocoles vaccinaux en pisciculture. Le porteur indique que l'infection peut faire souffrir les poissons et qu'un individu présentant un furoncle de plus d'un centimètre carré ou moribond est euthanasié. Aucune truite n'est relâchée ni réutilisée, l'euthanasie étant justifiée par le risque sanitaire lié à la bactérie.

Objectifs

Le projet FEAMP Medic'eau vise à évaluer les pratiques actuelles vaccinales et thérapeutiques appliquées par les pisciculteurs afin de contôler la furonculose à Aeromonas salmonicida sub. salmonicida. Sur la partie "vaccin", le projet a pour objectif d'optimiser les schémas vaccinaux afin d'améliorer leur efficacité et reduire l'usage d'antibiotiques en élevage aquacole.

Bénéfices attendus

L'évaluation des protocoles vaccinaux pratiqués actuellement par les éleveurs permettra de les optimiser afin d'augmenter la résistance des truites contre la furonculose. Les résultats permettront de présenter aux éleveurs et vétérinaires les choix les plus efficaces. Cela permettra d'augmenter le bien être des poissons en élevage d'une part, et de diminuer l'usage d'antibiotiques d'autre part.

Procédures

Prises de sang (100 µl) : 5 prélèvements (T0, T0+1 mois ; T0+3 mois ; T0+4 mois ; T0 + 6 mois ; T0 + 6.5 mois) Administration de vaccins par voie Intrapéritonéale, par voie orale via l'alimentation ou par balnéation. Challenge infectieux par balnéation. Toutes les interventions de type prélévement/administration seront effectuées après anesthésie des poissons.

Impact sur les animaux

L'evaluation d'e l'efficacité vaccinale nécessaite d'infecter les truites avec la bactérie Aeromonas salmonicida sub salmonicida. Les manifestations cliniques peuvent entrainer de la souffrance chez les animaux. Les animaux seront exclus (euthansasiés) dès l'observation de furoncles de tailles supérieure à 1 cm2 ou de poissons moribonds (mélanisme, na erratique sur le dos, arrêt d'alimentation).

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévu en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaire (impossibilité de relacher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)

Remplacement

L'objectif du projet Medic'eau étant d'évaluer l'efficacité de la vaccination contre la furonculose, cela ne peut se faire que sur animaux vivants.

Réduction

Le RPS (relative percent survival) d'un vaccin est calculé par la formule suivante : (1 - nombre de morts dans le lot vacciné après infection / nombre de morts dans le lot non vacciné après infection) x 100. On fait l'hypothèse qu'avec un schéma vaccinal testé, le RPS est de 60%. En utilisant le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/, le test de comparaison de 2 proportions observés (pourcentage de mortalité dans le lot vacciné P1 = 20%, pourcentage de mortalité dans le lot non vacciné P2 = 50%), avec un risque alpha de 0.05 et une puissance à 0,9, un nombre de 51 poissons par lot est préconisé.

Raffinement

Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute le durée du protocole (6,5 mois). Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène 1 cm2) seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés par surdosage d'anesthésique. La densité sera de 16 kg/m3, ce qui est bien en deça de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3) et les bacs seront enrichis de tubes permettant aux poissons de se cacher.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est l'hôte naturel d'Aeromonas salmonicida. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France. Les truites utilisées pèseront environ 200g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, truite portion -200-250g- et grosse truite > 1kg). Sur le terrain les problématiques sont plus importante chez les truites pesant plus de 1 kg. Du fait du matériel de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible d'élever des truites arc en ciel de cette taille (> 1 Kg) en nombre suffisant et pour permettre l'aquisition de résultats répétables. L'étude sur des poissons de poids de 200 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant entrer dans l'étude. A ce poids (200g), les animaux sont considérés comme physiologiquement proche des animaux d'un poids plus élevé (hors période de gamétogènèse).

255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie pour accéder au pancréas et y créer une tumeur, ainsi que trois injections intrapéritonéales, pour étudier le stroma de l'adénocarcinome pancréatique. Le porteur indique des risques d'infection, d'hypothermie liée à la durée de la chirurgie et d'effets digestifs de la tumeur. Toutes les souris sont tuées pour prélever des organes vitaux.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (ADK) qui a un taux de survie global de 2-9%, est actuellement la quatrième cause principale de décès liés au cancer dans le monde industrialisé et d’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunités de traitements thérapeutiques. La plupart des approches thérapeutiques jusqu’à présent se sont intéressées à cibler directement les cellules tumorales et ont jusqu’à récemment, ignoré les réactions stromales adjacentes qui sont une des caractéristiques importantes des cancers pancréatiques humains. Depuis quelques années, le dépôt de ce stroma massif a émergé en tant qu'acteur nouveau et contributeur dans l'initiation et la progression pancréatique de la tumeur. Il a été mis en évidence la présence d’une sous-population cellulaire souche péricytaire dans le stroma du pancréas de souris atteintes d’ADK. Ces cellules ont été isolées et mises à proliférer en culture pour établir une lignée permettant son étude. Par ailleurs, il a été montré une augmentation significative de macrophages spécifique dans différents modèles de cancer pancréatique. Cette population a été décrite comme pro-tumoral dans le cancer du sein et du poumon. Nous pensons que ces macrophages spécifique jouent un rôle important dans la mise en place de l’immunosuppression présente dès le début du cancer pancréatique en étant recrutés et programmés par les cellules entourant le cancer, notamment les cellules stromal. Nos objectifs seront 1) de dépléter ces macrophages spécifiques via l’utilisation de souris génétiquement modifiées 2) D’étudier cette déplétion au niveau de la masse tumorale mais aussi de l’infiltrat immunitaire.

Bénéfices attendus

On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en croissance dans les pays développés. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux (Thérapie ciblée, immunothérapie, chimiothérapie). L’accès des traitements antitumoraux au sein de la tumeur est empêché par la nature du microenvironnement qui soutient les cellules cancéreuses mutées. Ce microenvironement est modifié par les macrophages. Ces derniers représentent près de 40% des cellules immunitaires infiltrées, comprendre le rôle d’une population potentiellement immunosuppressive de macrophages permettrait de développer de futur traitement contre le cancer du pancréas.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale ainsi qu’une procédure chirurgicale de laparotomie permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à 3 injections intra-péritonéale 1 avant la chirurgie, 2 après la chirurgie, chacune dure environ 1 minute. Chaque souris sera soumise à une laparotomie permettant d’accéder au pancréas. La durée estimée est entre 15 et 20 minutes.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables dues à l’injection intra-péritonéale peuvent être ressentis. Les autres principaux risques sont l’infection due à la chirurgie ainsi que l’hypothermie due à la durée de l’acte chirurgicale. Également, la tumeur peut avoir des effets sur la souris, notamment sur son système digestif.

Devenir

L’ensemble des animaux étant soumis aux procédures seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes vitaux pour analyse.

Remplacement

Des études in vitro ont préalablement été effectué afin de déterminer le rôle des cellules stromal dans la différenciation des macrophages spécifique ainsi que le rôle de ces macrophages spécifique. Ainsi, l'utilisation d'un modèle murin afin de vérifier si ces observations ont lieu dans un environnement complexes ne peut être remplacé.

Réduction

Le nombre de souris sera réduit à minima pour permettre une analyse statistique et l’obtention de conclusions interprétables qui conduiront à ne pas répéter les expériences que nous mettons en place sur les animaux.

Raffinement

Afin de respecter le bien-être animal, les souris sont dans des cages avec un milieu enrichi et du coton pour qu’elles se fassent un nid (quotidien de l’animalerie). Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Les animaux seront observés au minimum 3 fois par semaine durant la durée de l’expérience afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse et ainsi améliorer leur bien être Afin de maximiser l’obtention des données scientifiques et raffiner nos approches expérimentales, nous établirons un suivi attentif des souris et fixerons des points limites pour réduire au maximum la souffrance des animaux et éviter l’apparition de tout signe de souffrance Dans ce cadre, un analgésique sera également utilisé dans les procédures de chirurgie afin d’enrayer la douleur chez l’animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études en cancérologie du fait de l’existence de nombreux modèles bien caractérisés. Spécifiquement, il n’existe pas d’autre espèce que la souris permettant une déplétion conditionnelle des macrophages spécifique. Les souris adultes de 6 semaines ayant un système immunitaire compétent et un pancréas développé et fonctionnel seront utilisées pour ce projet.

2700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est d'abord induit chez des souris NOD SCID, puis les mêmes animaux servent à un modèle de cicatrisation cutanée, avec des prélèvements sanguins répétés et une biopsie de peau. Le porteur indique que la biopsie cutanée provoque des douleurs inflammatoires. Les animaux sont tués en fin de protocole pour prélever la peau des plaies et analyser l'effet de molécules candidates.

Objectifs

Le processus de cicatrisation des plaies est complexe et dynamique et souvent multifactoriel qui implique des phases coordonnées et superposées, notamment la coagulation, l'inflammation, la prolifération et le remodelage visant à restaurer la fonction barrière et l'intégrité mécanique de la peau. Nous savons aujourd’hui que le diabète ralentit la cicatrisation des plaies, rendant le processus de guérison plus difficile que la normale. Cet état entraine en même temps une plus grande prédisposition au développement de plaies chroniques (délai de cicatrisation allongé, au delà de 4 semaines). En France, plus de 20.000 patients diabétiques porteurs de plaies, sont hospitalisées chaque année et près de 8.000 seront amputées d’un membre inférieur. L’objectif de ce projet est d’étudier de nouvelles molécules susceptibles d’accélérer la cicatrisation des plaies chez des souris contrôles non diabétiques en comparaison avec des souris diabétiques afin de réduire les complications liées au diabète qui sont couteuses sur le plan humain et économique.

Bénéfices attendus

Nous savons aujourd’hui que le diabète ralentit la cicatrisation des plaies, rendant le processus de guérison plus difficile que la normale. Cet état entraine en même temps une plus grande prédisposition au développement de plaies chroniques. La phase préclinique consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur qui est une étape essentielle dans le développement de médicaments à visée thérapeutique. Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules sur le processus de cicatrisation (molécules aux propriétés cicatrisantes, réparatrices ou agissant sur le remodelage tissulaire ou la migration cellulaire) chez des souris diabétiques en comparaison avec des souris non diabétiques afin de réduire les complications liées au diabète.

Procédures

Prélèvements au jour 0, 5, 10, 15 et 20 au niveau de la veine caudale ou submandibulaire (20μL; durée du prélèvement 5-10 secondes) afin de suivre l'évolution de la glycémie durant 20 jours environ chez les souirs NOD SCID (Procédure 1). Prélèvements de sang rétro orbital (500μL; durée du prélèvement 30 secondes) sous isoflurane (2%) juste avant la mise à mort (Procédure 2)

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées à la biopsie cutanée. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation.

Devenir

Les animaux de la Procédure 1 "Induction du diabète de type 1 chez les souris NOD SCID" sont tous réutilisés dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation". Tous les animaux de la Procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation" sont mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de prélever la peau au niveau des plaies pour effectuer une analyse histologique, des dosages de cytokines, qPCR. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées.

Remplacement

Remplacement : le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de l’inflammation et de la cicatrisation ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Le processus de cicatrisation des plaies est complexe et dynamique et souvent multifactoriel qui implique des phases coordonnées et superposées, notamment la coagulation, l'inflammation, la prolifération et le remodelage visant à restaurer la fonction barrière et l'intégrité mécanique de la peau. Le système vasculaire et de nombreux types cellulaires, cytokines et médiateurs sont impliqués dans ce processus. Les modèles animaux de cicatrisation sont indispensables pour la compréhension de la physiopathologie de la maladie et la validation préclinique des composés. Des études préliminaires in vitro peuvent être réalisées sur des kératinocytes afin de sélectionner des candidats médicaments mais dans ce projet l'animal est indispensable pour relier cicatrisation et diabète.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé pour déterminer les différences entre chaque groupe va changer selon la distribution des échantillons : - Si les échantillons suivent une loi Normale : l’ANOVA de rang suivi d’un post test de Bonferroni sera effectué. - Si les échantillons ne suivent pas une distribution normale : le test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post-test de Dunns de comparaison multiple sera utilisé.

Raffinement

Les plaies seront effectuées sous anesthésie générale xylazine/kétamine et une injection de lidocaine sera effectuée quelques minutes avant la réalisation des plaies. Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être des animaux et pour détecter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux montrent des signes de souffrance (point limite décrit dans la Procédure), de la buprénorphine ou le la Tolfédine pourront être administrées (si score cumulé de 2 atteint) ou ils seront mis à mort (si score cumulé atteint 4 ou si un des scores atteint 2 pour un même critère). Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron ainsi que du Sizzle-Nest en continu dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 ou BALB/c est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Ces souches sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les souris BALB/c offrent une réponse immunitaire exacerbée ce qui permet une meilleure quantification des molécules exprimées lors de cette réponse. De plus nous utiliserons des souris NOD SCID rendues diabétiques car il a été démontré l'impact de ce paramètre sur la cicatrisation dans plusieurs articles. Cette lignée immunodéficiente n'a pas de phénotype dommageable autre que le diabète développé après induction au STZ. Notre modèle est développé à partir de données littéraires permettant de réduire le nombre d'études de mise au point. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation" afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’inflammation et son mécanisme, une souris juvénile ou trop âgée induira un biais dans l’expérimentation. Les animaux de la procédure 1 "Induction du diabète de type 1 chez les souris NOD SCID" pourront être utilisés à partir de 5 semaines pour bénéficier d'animaux qui auront minimum 7 semaines dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation".

396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour être réutilisées dans d'autres enregistrements. Rendues épileptiques, elles sont irradiées par microfaisceaux de rayons X sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, pour tester une alternative à la chirurgie du foyer épileptique. Le porteur indique qu'un animal perdant plus de 20 % de son poids ou présentant une akinésie est mis à mort, et qu'un surdosage d'irradiation entraîne aussi l'euthanasie. Les bénéfices annoncés pour les patients épileptiques restent renvoyés à une éventuelle application chez l'humain.

Objectifs

Le traitement pharmacologique des différents types d’épilepsie est complexe et doit répondre au mieux aux différents types de crises présentées par les patients. Il n’est efficace que chez 70 % des patients. L’épilepsie Mésio-Temporale (MesioTemporal Lobe Epilepsy ou MTLE) est la forme d’épilepsie focale la plus fréquente en clinique parmi celles qui ne répondent pas aux traitements pharmacologiques par les anti-épileptiques de référence. La MTLE est le plus souvent caractérisée sur le plan histologique par une sclérose de l’hippocampe (dispersion des cellules granulaires du gyrus denté et mort des neurones pyramidaux au niveau de la corne d’Ammon, CA1 et CA3). La résection chirurgicale du foyer épileptique ou zone épileptogène (ZE) est l’unique possibilité, à l’heure actuelle, de guérir les patients atteints de MTLE. Cette chirurgie nécessite une craniotomie pour enlever le foyer épileptique. C’est une méthode efficace dans 50 à 70 % des cas, mais qui comporte plusieurs risques (infection, effets secondaires, troubles cognitifs) et représente un coût hospitalier important (plus de 10 jours d’hospitalisation et suivi pendant plusieurs mois). L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013). L’objectif de ce projet est donc de développer sur un modèle de MTLE chez la souris (Riban et al, 2002 ; Heinrich et al, 2011) un protocole de MRT qui permette de rendre moins invasive la prise en charge des patient atteints d’une épilepsie focale.

Bénéfices attendus

L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013).

Procédures

- Pendant l’irradiation les souris seront anesthésiées et, après vérification de l’absence de réflexe du retrait de la patte, elles seront fixées dans un cadre stéréotaxique afin d’éviter tout mouvement de la tête et les précautions suivantes seront prises afin de limiter le stress et la douleur: - Anesthésie générale: Kétamine + Xylazine (voir ci-dessous) d’environ 40 min. - Anesthésie locale: baume à la lidocaïne 2% au niveau des oreilles.

Impact sur les animaux

Comme le développement d’une épilepsie et le traitement par MRT peuvent altérer la prise alimentaire, notre point limite se basera à la fois sur le poids de l’animal et sur son comportement général. Un animal sera immédiatement euthanasié si l’un des signes suivants est observé: perte de poids > 20% du poids mesuré le jour de l’irradiation, akinésie, rotation (voir Annexe 3). La radiothérapie peut être une source de souffrance si la dose délivrée est trop élevée. Les choix concernant les champs d’irradiation et les doses délivrées à la peau ont donc été effectuées en fonction des connaissances actuelles et de notre expertise. En cas d’erreur ou de problème technique au moment de l’irradiation d’un animal et notamment de surdosage, l’animal sera euthanasié immédiatement par surdosage de pentobarbital (150 mg/kg). Après radiothérapie, des effets secondaires invalidants (hyper ou hypo-locomotion, modification de la prise de nourriture, nécrose de la peau, ischémie cérébrale) peuvent apparaitre avec des délais différents selon les animaux

Devenir

L’ensemble des animaux seront gardés en vie à la suite de la manipulation. Ils seront rapatriés dans l’animalerie du GIN afin de réaliser les enregistrements de leurs crises, leur comportement et les contrôles histologiques. Ces procédures font l’objet d’une demande d’autorisation gérée par le comité d’éthique du GIN.

Remplacement

L’utilisation de l’animal dans son intégrité est nécessaire pour répondre à notre question. Il n’existe aucun modèle cellulaire qui permette de mettre en évidence un foyer épileptique dans le cerveau ni de le traiter par irradiation et l’utilisation d’irradiation fractionnée spatialement n’est pas encore possible chez l’homme. Le développement d’une stratégie thérapeutique telle qu’envisagée dans cette étude nécessite d’avoir recours à un modèle animal dans lequel le développement d’un foyer épileptogène a été clairement caractérisé et mis en évidence. Dans cette étude, la souris sera utilisée, malgré sa petite taille, en complément de l’étude effectuée chez le rat en parallèle. En effet, le modèle souris d’épilepsie mésiotemporale présente une plus grande stabilité, une évolution plus rapide de la pathologie, une fréquence de crises plus importante et une plus grande similitude des symptômes avec la clinique humaine. L’utilisation des modèles souris et rat sera ainsi très complémentaire et permettra d’obtenir des résultats plus fiables pour la préparation des essais cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant une exploitation statistique rigoureuse des résultats. Pour cela, en fonction de l’expérience acquise en modélisation animale des épilepsies, nous estimons que 396 animaux au total seront utilisés pendant 5 ans dans les quatre séries d’expériences de ce projet.

Raffinement

Nous veillerons à suivre les animaux quotidiennement de façon à intervenir immédiatement dès qu’un signe évocateur de douleur serait observé. Pour réduire toute douleur, souffrance ou anxiété, ils seront anesthésiés et analgésiés de façon profonde durant toutes les interventions (chirurgie, IRM, irradiation) et les techniques d’imagerie que nous utiliserons dans nos procédures sont sans douleur pour l’animal et permettent de répéter les acquisitions chez le même animal. Les animaux seront maintenus avec de la nourriture et de la boisson à volonté, ainsi que des objets en carton et du coton. Il seront habitués à la manipulation par des expérimentateurs agrémentés. A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés par surdosage de pentobarbital.

Choix des espèces

Le modèle d’épilepsie KA-MTLE chez la souris et chez le rat sont actuellement les modèles de référence les plus proches des conditions observées chez l’homme, aussi bien sur le plan électrophysiologique, histologique que pharmacologique. Malgré sa taille réduite nous souhaitons utiliser l’espèce souris, en complément de l’étude sur le rat, en raison de sa plus grande prédictivité et sa plus grande stabilité dans le temps que le modèle rat. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. Ils auront 8 semaines en début d’expérience et 12 à 15 semaines lorsqu’ils seront irradiés à l’ESRF. Le modèle de souris KA-MTLE a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long de la procédure.