Procédures modérées

Capturés, tenus en main jusqu'à neuf minutes pour des mesures, soumis à une prise de sang puis enfermés dix minutes dans une cage d'exploration, 1 500 oiseaux sauvages, des mésanges charbonnières et des mésanges bleues, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un même oiseau peut être recapturé d'une saison ou d'une année à l'autre et repasser alors par tout le protocole, et la tâche d'apprentissage annoncée n'est pas décrite. Le porteur décrit un stress "important" à la capture, qui peut provoquer hyperthermie, pertes énergétiques "non négligeables" et dégâts au plumage, mais il écrit aussi que ces deux espèces "supportent bien le stress de la capture". Tous doivent être relâchés dans leur milieu, la cage d'essai s'ouvrant pour que l'oiseau sorte de lui-même.

Objectifs

À mesure que les villes s'étendent, les habitats naturels deviennent plus fragmentés et pollués (ex éclairage public, bruit, produits chimiques), et induisent des changements de ressources (ex disponibilité de poubelles, mangeoires pour oiseaux) et de dangers (ex routes à forte circulation, prédateurs) pour les espèces animales. Ces changements créent de nouvelles conditions environnementales auxquelles les individus peuvent s'adapter. Dans ce projet, nous allons nous intéresser aux effets de l’environnement urbain sur les réponses comportementales liés à l’alimentation et à la reproduction et les réponses physiologiques. Nous allons utiliser des modèles clés en écologie urbaine : les mésanges charbonnières et mésanges bleues. Premièrement, nous évaluerons, le long d’un gradient d’urbanisation, les différences entre individus des comportements en fonction des caractéristiques de leur environnement physique et social. Nous émettons l’hypothèses que les facteurs environnementaux physiques vont influencer la personnalité et l’apprentissage individuel, alors que les facteurs environnementaux sociaux vont influencer l’apprentissage social. Deuxièmement, nous étudierons les mécanismes physiologiques potentiels des effets de l’environnement sur la personnalité en mesurant le taux de corticostérone dans le sang et la diversité microbienne dans les fèces. Nous nous attendons à une corrélation négative entre le taux de corticostérone et l’apprentissage et une corrélation positive entre la diversité microbienne et l’apprentissage. Troisièmement, nous analyserons le lien entre caractéristiques comportementales et survie et reproduction. Nous émettons l’hypothèse que les individus qui apprennent plus rapidement à trouver de la nourriture vont avoir un meilleur taux de survie l’hiver, et ceux qui apprennent plus rapidement dans un contexte reproductif vont avoir un meilleur taux de reproduction.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les espèces s’adaptent aux transformations anthropiques de l’environnement via des mécanismes comportementales et physiologiques.

Procédures

Capture, contention en main pour mesures biométriques (max 9 min), prélèvement (max 2 min), tests de comportements (max 11 min, dont 10 min en cage d’exploration). Chaque animal capturé est soumis une fois à chaque intervention. Cependant chaque individu peut être capturé sur plusieurs saison (hiver + printemps) ou années, et dans ce cas la procédure sera recommencée dans son entièreté. Cette prise de données sur des saisons ou années multiples permettra de mesurer la stabilité des traits mesurés.

Impact sur les animaux

La capture et la manipulation des oiseaux peuvent générer un stress important pouvant induire de l’hyperthermie, des pertes énergétiques non négligeables chez une espèce de petite taille et un dérangement des expressions comportementales. Des risques de blessures peuvent également exister mais sont généralement faibles. De même, la manipulation et la contention peuvent induire une altération du plumage (perte de plumes, plumes cassées) pouvant affecter leur thermorégulation, leur capacité de vol et leur ressource énergétique. La prise de sang induit une douleur brève avec un faible risque d’hématome et d’inflammation compte tenue de la méthode utilisée. Les tests comportementaux en main et en cage réduisent l’expression du comportement et peuvent aussi être une source de stress.

Devenir

Les animaux seront relachés dans leur milieu naturel

Remplacement

Le but principal de l’étude est de comprendre les causes et les conséquences de la variation comportementale des mésanges le long d’un gradient d’urbanisation. On ne peut étudier le comportement sans avoir recours à des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’individus participant aux procédures présentes dans ce projet est de 50 par espèce, par site par an, soit 150 oiseaux/an et par espèce. Il s’agit d’un nombre maximal dépendant des captures réalisées sur les sites. Ce nombre tient compte de la forte variabilité interindividuelle des comportements et de la difficulté d’identifier le sexe des individus (identification à postériori via analyse génétique). Ce nombre nous permettra de prendre en compte dans nos modèles statistiques des effets du sexe, de l’âge, de l’espèce et du site. Ce nombre est basé sur plusieurs études déjà publiées.

Raffinement

Tout au long du protocole, différentes méthodes de raffinement seront appliquées : (1) Il y aura une sélection d’entrée de l’oiseau capturé en procédure. Les individus qui rentrent dans la procédure ne seront pas en mue, ne seront pas couveurs (présence de plaques incubatrices) et n’auront pas de parasites externes abondants. (2) Lors de la procédure, une grille de scoring permettra d’évaluer l’état de l’oiseau et de détecter l’apparition des points limites. Si un score supérieur ou égal à 3 est obtenus, la procédure sera arrêtée. Si l’oiseau a un score inferieur a 3 mais : Si l’oiseau montre des signes d’hypothermie : on réchauffera l’animal dans une cage avec bouillote. Si l’oiseau montre des signes d’hyperthermie : on vaporisera de l’eau sur le sac contenant l’oiseau et on utilisera un ventilateur pour favoriser la respiration. Si l’oiseau montre des signes de perte de tonus musculaire/yeux fermés/halètement : on proposera une solution de glucose. Pour une meilleure gestion de la douleur et du stress, les oiseaux, en attente de manipulation, seront maintenus dans des sacs individuels respirants sur un portant dans un endroit calme et bien ventilé. Une table de mesure sera préparée en amont avec un poste de travail par expérimentateur. Cette organisation diminuera le temps de manipulation et les évènements anxiogènes (bruit, déplacement des expérimentateurs, apparition d’ombres). Les tests d’exploration prendront place à l’écart de la table de mesure, pour éviter que les évènements anxiogènes mentionnés ci-dessus aient des impacts lors de ce test. Pour minimiser la durée de capture, on combine la collecte de fèces au test d’exploration. Le relâcher de l’oiseau se fera par l’ouverture de la cage test et sera à son initiative.

Choix des espèces

Les mésanges bleues et charbonnières sont des espèces très étudiées en comportement, en physiologie et en écologie, ce qui nous permet d’établir des protocoles basés sur une bibliographie abondante. Ce sont des modèles phares en écologie urbaine puisqu’elles colonisent les milieux anthropisés tout en étant présentes dans leurs habitats naturels. Elles forment des groupes de fission-fusion hors période de reproduction, ce qui nous permet de mesurer la diffusion d’informations à travers les groupes. Ces deux espèces supportent bien le stress de la capture et utilisent facilement des dispositifs expérimentaux tels que les nichoirs ou mangeoires. Les individus utilisés pour se projet auront plus de 5 mois pour s’assurer de la compréhension de la tâche cognitive.

Accouplées une seule nuit, soumises sans anesthésie à un frottis vaginal pour dater la gestation, puis nourries d'un régime pauvre en protéines jusqu'au terme, 16 rates Sprague Dawley vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce régime doit provoquer un retard de croissance chez leurs fœtus, et le porteur indique qu'il peut entraîner chez les mères inactivité et perte de poids, les rates étant hébergées seules à partir du quinzième jour. Au dix-neuvième jour de gestation, chaque rate est anesthésiée puis opérée sans réveil pour exposer ses fœtus un par un et leur injecter un traceur qui mesure la perméabilité des barrières entre le sang et le cerveau. Toutes sont mises à mort ce jour-là, et les fœtus, jusqu'à six analysés par femelle, ne sont pas comptés dans l'effectif de 16.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin est un facteur de risque d’apparition de troubles du neurodéveloppement chez l’enfant, et des travaux antérieurs montrent que les interfaces sang-cerveau qui protègent le tissu cérébral sont fragilisées à la naissance, avec pour conséquence une exposition augmentées aux stress environnementaux ou inflammatoires. L’objectif de notre projet est de comprendre si le retard de croissance intra-utérin impacte l’intégrité des barrières sang-cerveau avant la naissance, chez le fœtus

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes concernant l’impact du RCIU sur la mise en place des barrières sang-cerveau au cours du développement prénatal, et donc la protection du cerveau en développement. Nos résultats précédents montrent une altération de l'intégrité de ces barrières chez le nouveau-né mais la précocité de cet effet délétère du RCIU n’est pas connue, alors même que la période fœtale tardive est particulièrement impliquée dans l’étiologie des troubles neurodéveloppementaux. Ce projet permettra donc de définir si une vigilance accrue à l’exposition à des stress environnementaux et inflammatoires est nécessaire avant la naissance, voire d’envisager un traitement protecteur des interfaces en fin de grossesse.

Procédures

Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (8 femelles). Enfin au 19ième jour de gestation les animaux sont anesthésiés, une chirurgie expose les fetus un par un et permet d’injecter un traceur pour mesurer la perméabilité des interfaces sang-cerveau (chirurgie sans réveil). Les animaux non injectés sont également utilisés pour collecter des tissus à des fins d’analyses biochimique et moléculaire.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associées à ce régime pourront être observées durant la période de gestation. La seconde procédure est sans réveil.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au 19ième jour de gestation, en raison de l'utilisation des fœtus pour les mesures de perméabilité

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne reflètent pas le fonctionnement spécifique des interfaces fœtales, ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales aussi complexes que le RCIU. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Nous prévoyons, qu’un nombre de 8 rates par lot expérimental (RCIU, Control) est suffisant, afin de remplir les Conditions statistiques de test de significativité. Six foetus peuvent être analysés pour chaque femelle gestante. La valeur de perméabilité fœtale est consolidée par l’analyse de 6 fœtus, mais la variabilité du degré de retard de croissance induit d’une femelle à l’autre, nécessite se nombre d’animaux.

Raffinement

Les rates gestantes soumises au régime pauvre en protéine seront hébergées individuellement à partir du quinzième jour de gestation et leur poids sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction. Les conditions d’hébergement sont règlementaires : enrichissement systématique des cages (bâtonnets à ronger), limitation du bruit, manipulations réalisées par un personnel formé et, autant que possible, par les mêmes expérimentateurs afin de limiter le stress. Pendant l’hébergement individuel, les animaux sont logés dans des cages transparentes et grilles espacées, et la présence systématique d’autres animaux dans l’environnement immédiat de la cage est contrôlé afin de maintenir au maximum un contact visuel, olfactif, auditif et dans une moindre mesure tactile, en plus d'un milieu de vie sur-enrichi par l’ajout d’un objet supplémentaire dans la cage et de matériel de nidification. La méthode de RCIU que nous appliquons est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). La mesure de perméabilité se fait entièrement sous anesthésie sans réveil.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD), espèce utilisée dans nos travaux précédents. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requièrent une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits. Les données déjà acquises sur ce projet l'ont été avec ce modèle. Les animaux seront mis à mort lorsque les fetus auront atteint 19 jours de vie embryonnaire . Le but du projet est d'étudier la permeabilité des interfaces sang-cerveau au cours de la periode fetale tardive.

Pour étudier comment l'absence d'une protéine de surface, l'intégrine alpha v, modifie la contraction des artères, 22 souris âgées de 13 à 15 mois vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections dans le ventre sur trois jours consécutifs pour supprimer cette protéine dans les cellules musculaires de leurs vaisseaux, avec pour effets possibles une baisse d'activité et d'appétit, une perte de poids et un pelage hérissé. Quatre semaines plus tard, toutes sont tuées pour prélever leurs artères fémorales. À court terme, le porteur présente ce projet, mené avec un laboratoire européen, comme une "étape essentielle pour finaliser un article scientifique commun".

Objectifs

Les vaisseaux sanguins doivent rester souples pour permettre au sang de circuler correctement et pour s'adapter aux variations de la pression artérielle. Avec l'âge, ils deviennent progressivement plus rigides, ce qui augmente le risque de maladies cardiovasculaires. Dans nos travaux précédents, nous avons montré qu'un élément présent à la surface des cellules musculaires qui composent la paroi des vaisseaux sanguins, joue un rôle important dans le maintien de leur souplesse. Lorsque cet élément est absente, ces cellules deviennent plus rigides en raison de modifications de leur structure interne ce qui pourrait également modifier la capacité des vaisseaux sanguins à se contracter et à se relâcher normalement. Si cette hypothèse est confirmée, elle permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la perte de souplesse des artères avec le vieillissement et trouver de nouvelles cible pour développer des médicaments. Pour le vérifier, nous étudierons en laboratoire des segments d'artère prélevés chez des souris âgées de 13 à 15 mois, soit normales, soit dépourvues de l'élement à la surface des cellules musculaires des vaisseaux (souris déficientes). Pour générer la déficiences, nous devrons injecter une molécule dans le ventre 3 jours consécutifs et attendre 4 semaines. Les souris seront euthanasiées pour prélever les artères et étudier leur capacité à se contracter et à se dilater

Bénéfices attendus

Il s’agit ici d’un profit humain : la rigidité artérielle augmente avec l'âge, touchant plus de 60 % des personnes de plus de 60 ans, et s'accompagne d'une altération du bon fonctionnement des vaisseaux sanguins. Ce projet permettra de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter ces altérations. Ce projet est mené en collaboration avec un laboratoire européen. A court terme, ce projet constitue également une étape essentielle pour finaliser un article scientifique commun, qui contribuera à diffuser ces résultats au sein de la communauté scientifique et à faire progresser les connaissances sur les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Pour déclencher la modification génétique nécessaire à l'étude, les souris recevront trois injections d'un médicament une fois par jour pendant trois jours consécutifs. Elles seront ensuite laissées au repos pendant 4 semaines afin que cette modification soit pleinement effective. À la fin de cette période, les animaux seront euthanasiés de manière conforme à la réglementation en vigueur. Les principales artères seront ensuite prélevées afin d'étudier, en laboratoire, sa capacité à se contracter et à se relâcher. Ces analyses permettront de mieux comprendre le rôle de la protéine d’intérêt dans le fonctionnement des vaisseaux sanguins et son implication dans le vieillissement des artères.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress léger et temporaire lors de leur manipulation et de leur maintien pendant les injections. Les injections elles-mêmes peuvent provoquer une douleur passagère au point d'administration. Le médicament utilisé dans cette étude, peut entraîner des effets secondaires transitoires, tels qu'une diminution de l'activité, une baisse de l'appétit, une légère perte de poids ou un pelage hérissé. Enfin, la répétition des injections sur trois jours consécutifs peut augmenter légèrement le niveau de stress des animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux sont mis à mort afin de prélever les artères fémorales et réaliser leur étude morphologique.

Remplacement

Nos travaux réalisés en laboratoire sur des cellules musculaires issues de la paroi des artères ont montré que l'absence d'une molécule de surface cellulaire modifie leur organisation interne. Ces changements pourraient influencer la capacité des vaisseaux sanguins à se contracter et à se relâcher, un mécanisme essentiel pour réguler la circulation du sang et la pression artérielle. Cependant, ces expériences réalisées sur des cellules isolées ne permettent pas d'étudier les interactions entre les différents types de cellules qui composent la paroi des artères. Or, le bon fonctionnement des vaisseaux sanguins dépend de la communication entre ces cellules. Il est donc nécessaire d'étudier des artères intactes prélevées chez des souris, afin d'évaluer leur capacité à se contracter et à se dilater dans des conditions proches de celles observées dans l'organisme. À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant de reproduire fidèlement le fonctionnement complet d'une artère en laboratoire.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans cette étude, nous avons réalisé un calcul statistique permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Ce calcul est basé sur des données préliminaires obtenues par nos collaborateurs et sur le principal paramètre étudié dans le projet. De plus, chaque animal permettra d’obtenir plusieurs fragments d’artères qui pourront être étudiés séparément en laboratoire. Cela permettra de réaliser plusieurs tests sur un même animal, notamment en évaluant la réponse des vaisseaux à différentes molécules capables de stimuler ou de bloquer la protéine ciblée. Cette organisation permet d’obtenir un maximum d’informations scientifiques tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées régulièrement après les injections du médicament, en particulier pendant la semaine qui suit le traitement, afin de vérifier leur état de santé et leur bien-être. Le personnel est expérimenté. Des critères précis de surveillance seront définis pour chaque étape de l’étude. Ces critères permettront d’identifier rapidement tout signe d’inconfort ou de souffrance et de prendre les mesures appropriées si nécessaire, conformément aux règles de protection et de bien-être des animaux utilisés en recherche. La mise en place de points limites adaptés à chaque procédure et d'une grille de score ont été établis.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus adapté pour cette étude, car elle permet de reproduire de nombreux mécanismes impliqués dans le fonctionnement des vaisseaux sanguins chez l'être humain. De plus, il est possible de modifier précisément certains gènes chez la souris afin d'étudier le rôle d'une protéine spécifique. Dans ce projet, cette approche permettra de supprimer la protéine ciblée uniquement dans les cellules musculaires des vaisseaux sanguins et uniquement chez des animaux adultes, afin d'étudier son rôle sans perturber le développement normal des artères. Avec l'âge, les vaisseaux sanguins perdent progressivement leur capacité à se dilater et deviennent plus rigides. Cette évolution est liée à des modifications des cellules qui composent la paroi des artères et constitue un facteur important de risque cardiovasculaire. Nous utiliserons donc des souris âgées de 13 à 15 mois, un âge auquel ces changements sont déjà présents et comparables à ceux observés chez les personnes âgées. Ce modèle nous permettra d'étudier le rôle de notre protéine d'intérêt dans un contexte proche du vieillissement naturel et de mieux comprendre son implication dans la perte de souplesse des artères.

Les rats de ce projet ont une maladie chronique du foie provoquée par chirurgie, et certains arrivent déjà opérés de chez un fournisseur spécialisé. 2 010 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, nourris pour certains d'un régime enrichi en protéines ou en ammoniac, et reçoivent une substance impliquée dans les troubles neurologiques de la maladie. S'y ajoutent des prises de sang, des traitements expérimentaux par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, jusqu'à vingt minutes en enceinte thermostatique avant certaines injections, et des tests de mémoire, d'apprentissage et de motricité que le porteur ne nomme pas. Tous sont tués à l'issue, car les dosages prévus exigent un grand volume de sang prélevé en fin de vie et plusieurs tissus.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie peuvent entraîner des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, de coordination des mouvements ou des changements de comportement. Dans les formes les plus sévères, l’état de conscience peut être altéré. L’objectif de ce projet est de développer et caractériser des modèles reproduisant certaines de ces complications chez le rat et d’utiliser ces modèles pour évaluer de futurs traitements. Pour cela, une maladie chronique du foie sera induite par une intervention chirurgicale. Cette intervention sera associée à une alimentation enrichie en protéines ou en ammoniac ainsi qu’à l’administration ponctuelle d’une substance impliquée dans l’apparition des troubles neurologiques observés chez les patients. Ces travaux permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes responsables de la maladie et d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques destinées à prévenir ou à réduire les troubles neurologiques associés aux maladies chroniques du foie. Les conditions expérimentales seront définies afin de reproduire des formes modérées de la maladie compatibles avec le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques du foie peuvent provoquer des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, d’apprentissage ou de coordination des mouvements. Dans certains cas, ces troubles peuvent réduire l’autonomie des patients et avoir un impact important sur leur vie quotidienne et celle de leurs proches. Ce projet vise à développer des modèles permettant de mieux reproduire ces complications et de mieux comprendre les mécanismes responsables de leur apparition. Ces modèles seront également utilisés pour évaluer de nouveaux traitements destinés à prévenir, limiter ou corriger les troubles observés. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies chroniques du foie, à réduire les conséquences neurologiques associées à ces maladies, à préserver leur autonomie et à améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale accompagnée d'un traitement adapté contre la douleur. Cette intervention vise à provoquer une maladie chronique du foie similaire à celle observée chez certains patients. Selon la procédure concernée, les animaux pourront recevoir une injection sous-cutanée d'une substance impliquée dans l'apparition des troubles neurologiques observés chez les patients atteints de maladie du foie. Cette administration dure moins d'une minute. Un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours de l'étude ainsi qu'un prélèvement final. Ces actes sont effectués sous anesthésie gazeuse de courte durée, généralement comprise entre 2 et 5 minutes, et le prélèvement lui-même dure environ une minute. Les animaux pourront également recevoir un traitement expérimental administré par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Chaque administration dure habituellement moins d'une minute. Certaines administrations intraveineuses pourront nécessiter un maintien temporaire dans une enceinte thermostatique pendant une durée maximale de 20 minutes afin de faciliter l'administration. Dans certaines études, un traitement unique pourra être administré selon un principe de dialyse péritonéale sous anesthésie gazeuse de courte durée. L'administration dure environ une à deux minutes et l'anesthésie quelques minutes. Enfin, les animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer l'activité, la mémoire, l'apprentissage ou les capacités motrices. Ces évaluations reposent principalement sur l'observation des animaux et ne nécessitent pas d'acte invasif.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et bénéficieront d'un traitement adapté contre la douleur. Après l'opération, ils pourront présenter une gêne temporaire, une diminution transitoire de l'activité ou une baisse de l'alimentation. Au cours de l'étude, le développement de la maladie pourra entraîner une diminution modérée de la prise de poids, une baisse de l'activité spontanée ainsi que des modifications du comportement, de la mémoire, de l'apprentissage ou de la coordination des mouvements. Certains régimes alimentaires utilisés dans le projet pourront renforcer temporairement ces effets. Une substance impliquée dans les mécanismes de la maladie pourra également être administrée afin de reproduire certains épisodes observés chez les patients. Cette administration pourra entraîner, pendant une courte durée, une diminution de l'activité ou des capacités motrices. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière tout au long du projet. Des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'intervenir rapidement en cas d'aggravation inattendue afin de préserver leur bien-être.

Devenir

À l’issue des procédures, l’ensemble des animaux sera mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements biologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Les analyses prévues nécessitent le recueil d’un volume sanguin terminal important ainsi que la collecte de plusieurs tissus d’intérêt, notamment au niveau cervical. Ces prélèvements permettent la réalisation concomitante de nombreux dosages qui ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. L’utilisation de prélèvements terminaux permet également de maximiser la quantité de données obtenues à partir d’un même animal et contribue ainsi à l’application du principe de réduction en limitant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. En raison de la nature des prélèvements réalisés et de leur caractère invasif, aucun animal ne pourra être réutilisé à l’issue de l’étude.

Remplacement

Avant de réaliser les études chez l'animal, des tests in vitro et des approches de modélisation informatique sont utilisés pour sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs. Ces méthodes permettent notamment d'étudier l'action de composés sur des cellules, des tissus ou certaines bactéries présentes dans l'intestin, ainsi que de prédire certains de leurs effets dans l'organisme. Cependant, les troubles étudiés dans ce projet résultent d'interactions complexes entre plusieurs organes, notamment l'intestin, le foie, les reins et le cerveau. Aucune méthode alternative disponible aujourd'hui ne permet de reproduire simultanément l'ensemble de ces mécanismes dans un organisme vivant. Les méthodes sans animaux ne permettent pas non plus d'évaluer les effets de la maladie sur la mémoire, l'apprentissage, le comportement ou les capacités motrices, ni de mesurer l'efficacité globale d'un traitement dans l'organisme. Elles ne permettent pas davantage de suivre la façon dont un médicament est absorbé, transformé et agit sur différents organes. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet donc d'atteindre les objectifs de ce projet sans recourir à l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Avant les études thérapeutiques, plusieurs phases de caractérisation permettront d'identifier les conditions expérimentales les plus adaptées et de vérifier la reproductibilité des modèles. Les connaissances acquises lors de ces premières étapes seront utilisées pour concevoir les études suivantes et éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Les mêmes animaux seront suivis à plusieurs reprises au cours des études afin de recueillir différentes informations (état général, prélèvements biologiques et évaluations comportementales) sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Les groupes expérimentaux ont également été conçus de façon à permettre la comparaison de plusieurs traitements au sein d'une même étude lorsque cela est possible. Cette stratégie permet d'obtenir un maximum d'informations à partir de chaque animal tout en utilisant le plus petit nombre d'animaux compatible avec la qualité et la fiabilité des résultats scientifiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions favorisant leur bien-être, avec un enrichissement du milieu comprenant notamment des abris, des matériaux permettant la construction de nids et des objets à ronger. Lorsque leur état le permet, ils seront maintenus en groupe. Certains animaux pourront être reçus déjà opérés auprès d'un fournisseur spécialisé. Dans tous les cas, une période d'acclimatation et une surveillance renforcée seront mises en place après leur arrivée ou après l'intervention chirurgicale. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement contre la douleur. Les animaux bénéficieront d'une surveillance adaptée jusqu'à leur rétablissement complet et d'un complément alimentaire favorisant la reprise de l'alimentation. Avant le début des évaluations, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations et aux différents tests afin de limiter le stress. Les conditions expérimentales seront définies de manière à reproduire des formes modérées de la maladie sans rechercher l'apparition de troubles sévères. Une surveillance régulière sera réalisée tout au long du projet afin de détecter rapidement toute dégradation de l'état des animaux. Des mesures adaptées seront mises en place si nécessaire et des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'éviter toute souffrance excessive.

Choix des espèces

Aucun modèle alternatif ne permet aujourd'hui de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les complications neurologiques associées aux maladies chroniques du foie. Le rat a été choisi car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l'Homme concernant le fonctionnement du foie, de l'intestin et du cerveau. Il permet également d'étudier la mémoire, l'apprentissage, l'activité et le comportement à l'aide de méthodes reconnues et largement utilisées en recherche pharmaceutique. Cette espèce est particulièrement adaptée au modèle utilisé dans ce projet, notamment pour la réalisation de l'intervention chirurgicale nécessaire à l'induction de la maladie. De plus, de nombreuses études scientifiques ont déjà été réalisées chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats et contribue à limiter le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. Ce stade de développement a été retenu car il correspond à celui le plus fréquemment utilisé pour l'étude de ces maladies et permet de réaliser les interventions et les évaluations prévues dans des conditions optimales.

1 440 souris nouveau-nées ou juvéniles, âgées de un à vingt-et-un jours, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Pour évaluer des molécules destinées à des épilepsies rares de l'enfant, on leur injecte sous anesthésie gazeuse des candidats médicaments directement dans le cerveau, à travers le crâne encore souple chez les souriceaux de un à trois jours et après incision de la peau chez les plus âgées, avec pour effets possibles un retard de croissance et le rejet par la mère. Les mères et les souriceaux non traités, hors de ce décompte, sont utilisés pour former le personnel à des gestes techniques ou dans un autre projet autorisé. Le porteur qualifie l'incision chez les juvéniles de "nécessaire et justifiée", et l'élargissement à cet âge de "scientifiquement indispensable".

Objectifs

Les DEEs sont des maladies neurodéveloppementales rares, génétiques et syndromiques, caractérisées par une déficience intellectuelle, des troubles du langage, un développement moteur potentiellement altéré et des crises d'épilepsie d'apparition précoce, souvent accompagnées d'une régression du développement. Les traitements actuels (médicaments antiépileptiques) sont peu efficaces pour les formes rares, et les interventions chirurgicales sont lourdes et risquées chez les jeunes enfants. Il est nécessaire d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie et l’apprentissage des patients. L’objectif de ce projet est de définir un modèle permettant d’administrer nos candidats médicaments dans des zones spécifiques du cerveau de souris nouveau nées âgés de 1 à 3 jours par voie intracérébrale (phase développementale cérébrale similaire entre un souriceau de 3 jours et un nourrisson humain de 3 mois). [Afin de couvrir une fenêtre développementale plus large et représentative de l'évolution de ces pathologies durant la petite enfance, ce projet intègre également la réalisation d'injections chez des souris juvéniles âgées de 4 à 21 jours (stade de développement correspondant approximativement à la période allant de 6 mois à 3 ans chez l'enfant humain). Cette extension de la fourchette d'âge est scientifiquement indispensable car les cibles thérapeutiques étudiées peuvent s'exprimer de manière différentielle en fonction de l'âge et de la maturité neuronale.] En effet, les candidats médicaments ne passant pas la Barrière Hémato-Encéphalique, nous sommes obligés de les administrer par voie intra-cérébrale. Il est essentiel d’évaluer l’effet de nos candidats médicaments pendant les stades de développement du cerveau où les crises épileptiques se manifestent le plus dans le cadre des DEEs. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets différents sur un cerveau en développement (nouveau-né) par rapport à un cerveau plus mature (souris sevrée, jeune adulte ou adulte). Les composés étudiés dans ce modèle chez la souris nouveau-née, seront issus de sélection par des tests in silico et in vitro, puis in vivo chez la souris adulte afin d’évaluer leur tolérabilité et leur efficacité sur une cible d’intérêt. L’efficacité des meilleurs candidats ainsi sélectionnés sera évaluée dans le cadre du traitement des maladies épileptiques rares, et dans le but d’être administrés à de jeunes enfants (à partir de 3 mois).

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. [En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares (moins d’une personne atteinte sur 2000) est estimé à 3.5 millions. Plus de 7000 maladies rares, dont 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte pour certaines d’entre elles peut provoquer des signes cliniques pathologiques apparaissant dès la naissance ou durant l’enfance (entre 3 mois et 6 ans), telle que les encéphalopathies épileptiques et/ou développementales (DEEs).] Les traitements de la DEE reposent sur la prescription de médicaments antiépileptiques, qui ne sont pas toujours efficaces pour les formes rares d’épilepsie, et sur des interventions chirurgicales curatives (ablation de la zone épileptogène, radiochirurgie cérébrale ou thermocoagulation) qui peuvent être lourdes et risquées notamment chez les jeunes enfants. Les futurs candidats médicaments évalués dans ce projet sont connus pour ne pas passer la Barrière Hématoencéphalique (barrière naturelle qui sépare le cerveau du reste du corps). Ils seront donc administrés directement dans le système nerveux central (SNC) des patients afin de permettre un ciblage direct de celui-ci, augmentant ainsi l’efficacité des traitements, et diminuant les effets secondaires qui pourraient survenir après une administration orale ou intraveineuse, améliorant ainsi grandement la qualité de vie des patients. Les bénéfices attendus de ce projet sont de caractériser les potentiels candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques infantiles. Chez la souris, afin de mimer au mieux la voie d’administration humaine, les composés seront administrés par voir intracérébrale.

Procédures

- Administration de composés étudiés sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 15 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) - Administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) et administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) avant l’euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : - Des administrations d’anesthésique. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent également générer un léger stress. - De la phase d’anesthésie gazeuse (durée maximale de 20min) et du suivi post-anesthésie qui peuvent générer un stress modéré. - De l’administration de composés sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 30s qui peut générer un stress modéré. - [De l’administration pré et post-opératoire d’un analgésique et administration pré-opératoire d’un anesthésique local selon l’âge au moment de l’injection. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent générer un léger stress.] Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : D’une non prise de poids des souriceaux jusqu’au sevrage pouvant être induite par l’administration du composé ainsi qu’un retard de croissance (nuisance modérée) Du rejet de la mère (nuisance modérée) Les composés administrés peuvent également induire des effets cliniques (par exemple atteinte des mouvements spontanés, retard du comportement de recherche de la tétée) et provoquer une nuisance pour l’animal (durée maximale de l’étude : [4 mois]).

Devenir

Tous les [animaux] inclus dans les procédures sont soit euthanasiés en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiés en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques (effet des composés sur l’expression de la protéine d’intérêt par exemple). De plus, les mères ainsi que les souriceaux non-traités, non inclus dans les procédures de cette demande de projet seront soit utilisés pour de la formation à des gestes techniques, soit utilisés dans des études d’évaluation d’efficacité de composé faisant l’objet d’un autre projet autorisé.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal sain possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant d’évaluer l’activité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Un premier filtre in vivo est effectué via une autre autorisation de projet afin d’identifier les meilleurs candidats médicaments pharmacologiquement intéressants. En effet, des études préalables permettront d’évaluer la tolérabilité des composés sur des souris adultes ainsi que leur efficacité sur une cible d’intérêt, afin de pouvoir sélectionner les candidats médicament les plus puissants. A l’issue de ce premier filtre, les administrations chez la souris nouveau-née pourront être réalisées sur un nombre restreint d’animaux (6 souris maximum par groupe) et sur des animaux des deux sexes (la détermination sexuelle ne pouvant être sûre qu’à partir de 21 jours) dans le cadre de l’évaluation pharmacologique des composés. Une consultation du service de Biostatistique sera effectuée après la réalisation des premières études afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par groupe mais en assurant l’obtention de résultats exploitable et reproductibles. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. Lors des prélèvements effectués à la fin des études après euthanasie des souris, un maximum de tissus seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce processus nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé par projet de recherche

Raffinement

Les souriceaux seront stabulés avec leur mère jusqu’au sevrage (21 jours) puis maintenus en groupes sociaux une fois retirés de leur mère, dans un environnement adapté limitant au maximum les facteurs de stress (bruits, manipulations fréquentes …) et en séparant les mâles des femelles pour les études de plus de 21 jours. Gestion de la douleur, par anesthésies et analgésies adaptées en fonction de l’âge, afin de couvrir les phases d’administration intracérébrale et de prélèvement terminal : - [Souriceaux de 1 à 3 jours] : Aucune incision ne sera nécessaire pour insérer l’aiguille d’injection dans les ventricules – l’os du crâne étant encore souple. - [Juvéniles de 4 à 21 jours : approche chirurgicale avec incision cutanée nécessaire et justifiée par l'évolution physiologique et anatomique inhérente au stade de développement le crâne se renforce, la peau mûrit, la couleur naturelle apparaît et le pelage commence à pousser. Les volumes administrés respecteront strictement les recommandations de la Structure de Bien Etre Animal en fonction de l'âge et du poids.] Après l'administration, les animaux font l'objet d'une surveillance attentive et régulière de leur état général et de leur bien-être tout au long de l'étude ([max 4 mois]). Leur rétablissement, leur comportement, leur croissance et leur développement sont évalués à l'aide d'observations adaptées et de critères standardisés. Ces suivis permettent de détecter rapidement tout signe d'inconfort, de détresse ou d'effet indésirable. Une attention particulière est portée à la bonne évolution des animaux, notamment par comparaison avec des animaux de référence. Si un animal présente des signes indiquant que son bien-être est compromis au-delà des limites prédéfinies, des mesures appropriées sont mises en œuvre conformément aux procédures établies afin d'éviter toute souffrance inutile. Afin de réduire le risque de rejet des souriceaux, plusieurs précautions sont prises : la mère est progressivement familiarisée avec les odeurs associées aux procédures, les perturbations de son environnement sont limitées au maximum après la naissance, les manipulations sont organisées de manière à maintenir un contact permanent avec une partie de la portée, et les souriceaux sont réimprégnés des odeurs du nid avant leur retour auprès de leur mère. L'environnement des animaux est enrichi à l'aide de matériaux de nidification et d'éléments favorisant l'exploration et l'expression de comportements naturels

Choix des espèces

La souris saine présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’évaluer l’efficacité des composés sur les cibles génétiques sans avoir systématiquement recours à des souris génétiquement modifiées. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des DEEs, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau nées. [L'utilisation de souris juvéniles de 4 à 21 jours est, quant à elle, requise pour évaluer l’effet de nos composés à un stade plus avancé de la maturation cérébrale (expression des cibles thérapeutiques différentes en fonction de l’âge). Ce stade pré-sevrage est indispensable pour étudier l'impact des traitements pour évaluer une fenêtre thérapeutique plus tardive. L'utilisation de ces deux stades de développement est donc scientifiquement incontournable pour garantir la pertinence translationnelle des résultats vers la clinique pédiatrique humaine pour la pathologie ciblée.] Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les administrations seront réalisées sur des souriceaux âgés de 1 à 3 jours [et des souris âgées de 4 à 21 jours.]

Selon les groupes, les 1 260 souris de ce projet subissent une ou deux opérations du cerveau, quinze jours d'injections intrapéritonéales quotidiennes, une imagerie hebdomadaire sous anesthésie et jusqu'à huit prises de sang. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance modéré. Des cellules de glioblastome leur sont implantées dans le cerveau pour vérifier si la dopamine libérée pendant un apprentissage modifie la croissance de la tumeur, qui peut entraîner perte d'appétit et de poids, désorientation et déséquilibre. Le porteur prévoit un apprentissage moteur trois fois par jour et un apprentissage de mémoire une fois par jour pendant quinze jours, sans nommer les tâches imposées aux souris.

Objectifs

Le glioblastome (GB) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte, représentant 45 pour cent des tumeurs primaires. Malgré le traitement, la récidive est presque inévitable, avec une survie médiane de 15 mois. Les cellules de GB sont fortement influencées par l’activité des neurones qui, grâce à la libération de plusieurs molécules, modulent la progression de la tumeur. Dans ce cadre, la dopamine est capable de stimuler ou inhiber la croissance tumorale in vitro selon le type de récepteur activé. In vivo, la dopamine est libérée dans un contexte de récompense mais surtout d’apprentissage moteur et cognitif. Notre étude émet l’hypothèse qu’une libération importante de dopamine, à la suite d’un apprentissage de tâche, influence la croissance et le développement du GB in vivo. Afin d’étudier cet aspect, les cellules de glioblastome seront implantées dans le creveau des souris, et la progression tumorale sera évaluée après apprentissage d’une tache motrice. En parallèle, les effets de l’apprentissage d’une tâche de mémoire sur la progression tumorale seront également évalués en implantant les cellules de GB dans le cerveau des souris. Enfin, l’effet de la stimulation directe des neurones dopaminergiques sur la progression des cellules de GB, injectées dans le cerveau, sera investigué.

Bénéfices attendus

L'absence de résultats cliniques significatifs pour le traitement des glioblastomes peut s'expliquer par la complexité et la grande plasticité de ces tumeurs et par le manque de transposabilité aux modèles actuels. La dopamine constitue une thérapie prometteuse, mais des études supplémentaires sont nécessaires afin de comprendre leur mécanisme d'action précis dans les tissus tumoraux. Cette étude, en mettant en évidence les principaux acteurs des effets anti-tumoraux de l’apprentissage et de la dopamine, permettra de concevoir des stratégies thérapeutiques non pharmacologiques potentiellement plus efficaces et possiblement en support des médicaments déjà existants sur le long term. Les résultats de ce projet seront accessibles sur le court terme pour les connaissances de base des mécanismes dopaminergique sur le développement de cancer du cerveau.

Procédures

Chirurgie du cerveau: 1 fois ou 2 fois selon la procedure, environ 14 minutes, animal anesthésié. -Traitements pharmacologiques : 1 injections par jour pendant 15 jours, souris vigile. Imagerie de la tumeur : 1 fois par semaine, environ 10 minutes, souris anesthésiée. - Prélèvements sanguins (8 fois au total, une fois par semaine) : 10 secondes sur animal anesthésié. Protocole d’apprentissage moteur pour évaluer l'état psychomoteur des animaux : 3 fois par jour pendant 15 jours, animal vigile. Protocole d’apprentissage cognitif pour évaluer la mémoire chez les animaux :1 fois par jour pendant 15 jours, animal vigile.

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs cérébrales peut générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit et de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, déséquilibre). Les animaux seront également soumis à des douleurs légères mais répétées liées aux injections intrapéritonéales lors de la stimulation pharmacogénétique. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgie à l’issue des 1 ou 2 chirurgies. Injection intracrânienne de cellules tumorales et/ou virus : 1 fois, environ 14 minutes, sur animal anesthésié, modéré, nuissance pedant 5 jours (voir pointes limites). -Traitements intrapéritonéal 1 injections par jour pendant 15 jours sur animal vigile, légère, nuissance pedant 15 minutes. Imagerie de la tumeur : 1 fois par semaine, environ 10 minutes sur animal anesthésié, légère, nuissances liées a l'anesthésie (hypothermie, depression cardio-respiratoire pedant 10 minutes). - Prélèvements sanguins (8 fois au total) : 10 secondes sur animal anesthésié, légère. Entrainement moteur et cognitive, 1 fois/jour pédant 15 jours sur animal vigile, légère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des toutes les procédures afin de prélever les cerveaux pour analyses.

Remplacement

A ce jour, notre connaissance du comportement et de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations fiables afin d’étudier les changements qui se produisent. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur des animaux vivantes reste nécessaire. Le but du projet est d'étudier un phénomène comportemental qui ne peut pas être reproduit par des études in-vitro (dans des cultures cellulaires) car il s’agit de processus d’apprentissage.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux sera de 15 animaux, c'est à dire le nombre minimum d'échantillons permettant l'application des tests statistiques classiques dans le domaine, et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Ce nombre permet de atteindre la réalisation d’une conclusion statistique solide à partir de cette population et est justifié compte tenu de la grande variabilité des protocoles comportementaux. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation au maximum de souris sur une période de 5 ans. Toutefois, si l’expérience démontre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Nous attendrons au moins 1 semaine (7 jours) afin de permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le R de raffiner, tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux tout au long de cette étude. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général, comportemental et poids des animaux qui ont été définis et bien décrits dans les procédures. Une grille d’évaluation sera utilisée et la décision de soins conservatives ou de mise à mort des animaux sera pris par l’expérimentateur en accord avec le vétérinaire en suivant des critères bien décrit dans la grille. Pour les protocoles comportementaux, les souris seront habituées pendant 1 heure a la piece de comportement avant le début des tests.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés possédant un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale chez la souris. L'implantation de tumeurs chez la souris est donc essentielle pour rendre compte de la structure tridimensionnelle, de la composition chimique et de l'interaction tumorale avec les différents types des circuits neuronaux et aussi les effets de l’apprentissage moteur et cognitif. Le choix de la souche de souris est basé sur des étudies précédents que utilisent ce modelé en cancérologie et neurosciences. Les protocoles que nous avons établis débuteront à l'âge adulte des souris afin d’éviter les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études dans le domaine et d’avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines, donc l’implantation dans des animaux adultes permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés. Les chirurgies seront réalisées à l’âge de 8 semaines, et après une période de convalescence décrite, les protocoles d’apprentissage décrits seront réalisés. Du fait de la nécessité de réaliser ces expériences sur des animaux adultes, les souris utilisées seront âgées de 10 à 16 semaines.

Rendues asthmatiques par exposition à des allergènes, 240 souris âgées de six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous sédation des instillations dans le nez, dont le nombre et le rythme ne sont pas précisés, avec un risque de fausse route et d'étouffement, et certaines subissent des injections dans l'abdomen. Le projet teste une stratégie repérée sur des cellules bronchiques de patients, comparée à un anti-inflammatoire. En fin de protocole, une trachéotomie sous anesthésie sert à mesurer leur respiration pendant une dizaine de minutes, et elles sont tuées sans réveil pour prélever leurs organes.

Objectifs

La mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique dans l’asthme sont méconnus. Pourtant, l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique chez les patients asthmatiques est associé à la sévérité de la maladie. Nos travaux, réalisés in vitro à partir de cellules bronchiques de patients asthmatiques, nous ont permis d’identifier le rôle clé du métabolisme énergétique dans l’hyperprolifération de ces cellules et également de développer une stratégie thérapeutique potentielle. Toutefois, nos travaux chez l’homme ne permettent pas d’analyser complètement les mécanismes de la maladie. Afin d’étudier l’effet de notre stratégie thérapeutique dans le remodelage du muscle lisse bronchique dans l’asthme, nous souhaitons utiliser un modèle murin d’asthme. Ce modèle est particulièrement pertinent, car il permet le développement de l’asthme à partir de l’exposition aux allergènes et il nous permet de venir tester l’efficacité de notre stratégie thérapeutique en comparaison à un traitement anti-inflammatoire, molécule classiquement administrée dans l’asthme. L’objectif de ce nouveau projet est d’étudier l’effet synergique potentiel de cette stratégie thérapeutique en comparaison avec un anti-inflammatoire, traitement classique dans l’asthme, afin à terme de proposer une meilleure prise en charge pour les patients asthmatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier in vivo les mécanismes du blocage de la cible d’intérêt thérapeutique potentiel favorisant la mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique (MLB) et une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires des effets thérapeutiques et leur efficacité in vivo sur le remodelage du MLB. Le bénéfice attendu de l'étude et de la validation de la stratégie thérapeutique en comparaison avec un anti-inflammatoire, traitement classique dans l’asthme et à terme de proposer une meilleure prise en charge pour les patients asthmatiques et le traitement de leur pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des instillations nasales sous sédation (durée de moins de 2 minutes) et certains animaux à des injections intrapéritonéales (quelques secondes). Pour les mesures terminales de mesure des paramètres respiratoires, ces expérimentations seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.

Impact sur les animaux

L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souris pourraient conduire à une fausse route/étouffement. Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale peut être un effet indésirable. L'injectionintrapéritonéale peut engendrer une faible inflammation au site d'injection

Devenir

Chaque animal sera utilisé pour analyser la fonction respiratoire, l’inflammation et le remodelage du muscle lisse bronchique. La procédure est sans réveil en fin de projet et les organes d’intérêt seront prélevés ex vivo pour des analyses.

Remplacement

L’asthme est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Le modèle murin d’asthme permettra d’élucider les mécanismes complexes conduisant au remodelage du MLB et l’efficacité des nouveaux traitements thérapeutiques ciblant le remodelage du MLB.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de souris minimal par groupe pour obtenir des résultats interprétables. Les expérimentations seront planifiées afin d’obtenir un maximum de résultats expérimentaux sur le plus faible nombre d’animaux. Chaque protocole nécessite la comparaison des paramètres de fonction respiratoire entre différents groupes de souris exposées à différents traitements. Notre but est de réduire au maximum le nombre d’animaux par expérience tout en pouvant interpréter les résultats. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes.

Raffinement

Des contrôles quotidien permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées selon l'arbre décisionnel mis en place par l'équipe en charge du projet. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés en fonction de l’évaluation de l’état des animaux par rapport aux points limites. L'anesthésie et l'analgésie sont adaptées à la procédure et prennent en compte l'ensemble des critères d'alerte et d'arrêt des souffrances éventuelles.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus classiquement utilisée pour l’étude de l’asthme. Il n’existe pour l’instant pas de système in vitro permettant de faire coexister les différents types cellulaires dans leur entièreté. Grâce à un modèle de souris asthmatique et l’utilisation de molécules thérapeutiques, nous pouvons envisager une meilleure compréhension des phénomènes qui permettent le remodelage du MLB. Le modèle souris apparaît donc comme un modèle indispensable pour évaluer les mécanismes du remodelage du MLB dans l’asthme et pour tester l’efficacité des nouvelles cibles thérapeutiques. Les animaux utilisés sont des souris âgées de 6 semaines.

Jusqu'à trois prises de sang, un gavage quotidien d'un "composé X" pendant un mois et, pour 360 d'entre elles, seize heures de jeûne suivies d'un gavage de calcium et de huit heures d'isolement pour recueillir l'urine attendent des souris dont certaines lignées portent un gène inactivé dans l'intestin. Au total, 4 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur annonce des diarrhées et des effets sur la croissance chez les lignées modifiées. Étudiées de deux semaines à six mois, elles servent à comprendre le rôle de certains gènes dans le métabolisme du calcium et à tester ce composé, qui n'est jamais nommé. La modification ajoute une lignée et 600 souris, sur la base de "la lecture de publication", sans autre justification de l'effectif.

Objectifs

Notre étude longitudinale vise à caractériser l’incidence de certains facteurs majeurs impliqués dans le métabolisme calcique, en se concentrant spécifiquement sur leurs effets au niveau de l’intestin, des reins et du sang, afin d’évaluer leur impact sur ce métabolisme et sur l’homéostasie phosphocalcique durant différents stades de développement. MODIFICATION : ajout d’une lignée d’étude, suite à la lecture de publication montrant que les gènes de la famille RXR joue un rôle important au niveau de l’intestin pour la régulation du calcium.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre l’impact des gênes étudiés dans le métabolisme du calcium et l’efficacité du composé X sur ces troubles.

Procédures

Afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur les animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement, puis injection de sérum physiologique en sous-cutanée) par souris. 360 souris au total dans la 1ere procédure expérimentale, seront gavées une fois, avec une solution de calcium diluée dans de l'eau de boisson, et, dans la seconde procédure expérimentale, une administration quotidienne par gavage (30 secondes par administration) pendant 1 mois. Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé. Ces gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés et compétents, si malgré tout un animal présente des complications expérimentales (extrêmement rare) des signes de souffrance, il sera sorti du groupe et mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Les animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Concernant les gestes subis par les animaux : Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ce geste est effectué par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Un groupe de 360 souris subiront une mise à jeun de 16h sans restriction hydrique suivie d’un gavage d’une solution riche en calcium, suivi d’un isolement de 8h afin de récolter les urines. Dans une autre procédure expérimentale, les souris recevront un gavage du composé X pendant un mois. Cela peut entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux, grâce à la compétence des expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).

Remplacement

Les gènes étudiés étant exprimés dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (par exemple intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption).

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses statistiques utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques. Ce projet utilisera au maximum 3600 souris au total sur 5 ans. MODIFICATION : ajout d’une lignée d’étude, suite à la lecture de publication montrant que les gènes de la famille RXR joue un rôle important au niveau de l’intestin pour la régulation du calcium. Augmentation de l’effectif de 3600 à 4200, soit ajout de 600 souris.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), ), l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé par une grille de scoring et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées (analgésie), si malgré les mesures d’analgésie l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle murin dans ce protocole est justifiée car les souris ont leur génome bien caractérisé et sont des modèles biologiques utiles qui partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 semaines à 6 mois correspondant à des adultes. Ces stades étudiés correspondent aux stades physiopathologiques connus chez le patient.