Procédures modérées

Jusqu'à cinquante examens IRM de deux heures et cent prélèvements sanguins par animal sur cinq ans, sous anesthésie répétée : 12 macaques, six à longue queue et six rhésus, sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Contrairement à la plupart des projets, ils ne sont pas tués à l'issue mais réutilisés dans de nouveaux projets après avis vétérinaire. Le porteur reconnaît que la contention et les suites de l'anesthésie peuvent nuire aux animaux et entraîner une perte de poids, et que le lithium administré peut endommager la fonction rénale. L'étude vise à développer des méthodes d'imagerie métabolique du cerveau.

Objectifs

De nombreuses pathologies cérébrales, neurodégenératives ou psychiatriques, présentent des altérations précoces du métabolisme énergétique, de la neurotransmission ou de la physiologie cellulaire notamment des gradients ioniques transmembranaires. De nouvelles approches d’imagerie par résonance magnétique à haut champ offrent des perspectives prometteuses pour l’étude non-invasive de ces processus physiologiques et biochimiques. Cette multitude d’informations pourraient aider dans la compréhension des processus physiopathologiques en cours dans de nombreuses maladies cérébrales et pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Notre projet vise à repousser les limites de l’imagerie métabolique par RMN à travers le développement et la validation d’outils dédiés à l’IRM à haut champ, notamment les schémas d’acquisition optimisés pour les différents noyaux d’intéret en recherche biomédicale et observables in vivo. Nous mènerons des expériences chez le primate non-humain anesthésié pour développer et valider de nouveaux outils d’imagerie cérébrale. En particulier, ces outils serviront à détecter et cartographier la distribution cérébrale en lithium, un élément possédant des propriétés neuroprotectrices et régulateur de l’humeur, chez des animaux auxquels auraient été administrées un traitement aigüe ou chronique aux sels de lithium à des doses thérapeutiques. D’autre part, ces méthodes seront mises en œuvre pour étudier l’activation cérébrale chez l’animal.

Bénéfices attendus

Les méthodes validées et données de référence acquises à l’occasion de ce projet seront utiles pour aider dans la compréhension des processus physiologiques et biochimiques en condition normales et préfigurer les études de recherche biomédicale chez l’Homme par IRM à ultra-haut champ magnétique qui pourraient à terme participer à l’évaluation de nouvelles thérapies.

Procédures

Dans certains cas, des prélèvements sanguins (de quelques secondes) pourront être réalisés chez l’animal anesthésié (juste avant ou juste après l’examen IRM). Le projet prévoit des examens IRM chez l’animal anesthésié à une fréquence maximale bimensuelle et une durée typique de 120 minutes. En pratique, nous envisageons moins de 50 examens IRM et moins de 100 prélèvements sur 5 ans pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Par contre, le stress de la contention et les contrecoups de l’anesthésie peuvent être délétères entrainant une possible perte de poids. A long terme ou en cas de surdosage, les sels de lithium peuvent etre délèteres à la fonction rénale.

Devenir

Après avis favorable du vétérinaire, les animaux pourront être réutilisés dans de nouveaux projets.

Remplacement

Nos tests préliminaires seront systématiquement menés sur des objet-tests aux dimensions et caractéristiques électromagnétiques comparables à celles d’un cerveau de macaque adulte. Toutefois, aucun objet-test ne reproduit la complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique du cerveau. Le passage par l’expérimentation animale demeure donc une nécessité.

Réduction

Nous comptons utiliser une douzaine de macaques (mâles et femelles), nombre suffisant à la mise au point de nos méthodes et à l’acquisition de données de référence. Les analyses statistiques nécessaires à la validation de nos méthodes, notamment pour l’évaluation de leur reproductibilité et l’établissement de valeurs/images de référence seront déployées. Dans la mesure du possible, nous comptons utiliser des macaques ayant déjà participé à d’autres projets de recherche afin de limiter globalement le nombre de PNH nécessaires en recherche biomédicale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables. Les animaux seront anesthésiés lors des examens RMN et leurs paramètres physiologiques (température corporelle, nombre de respirations par minute) seront suivis en continu afin d’éviter tout effet négatif ou inconfort pour les animaux. Le réveil après les anesthésies est également surveillé de près pour s’assurer que l’animal récupère bien et se nourrit. Les animaux sont suivis régulièrement afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les points-limites et la structure chargée du bien-être animal et les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

Phylogénétiquement très proche de l'homme (développement cortical et sous-cortical), le macaque permet de poursuivre le développement des méthodes préalablement mises au point chez les rongeurs dans des conditions plus proches de l'examen chez l'humain notamment en matière de résolution et d'équipement. Il s'agit d'une étape nécessaire à la validation de nos approches avant l'application chez l’Homme. Pour des raisons pratiques (équipements IRM et autres appareillages) de mise en œuvre, des animaux adultes seront examinés. Pour le macaque, dans le souci de réduire le nombre global d’animaux utilisés dans des protocoles de recherche, nous souhaitons réutiliser dans la mesure du possible des macaques adultes sains âgés de moins de 15 ans au début du projet.

Pour valider un système d'imagerie censé suivre les tumeurs sans les injections de substrat qu'exigent les appareils commerciaux, 120 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, puis passe sous imagerie sous anesthésie deux fois par semaine pendant six semaines au maximum. Le porteur met en avant l'intérêt technique et le "coût d'achat élevé" des systèmes existants. Les tumeurs et les ganglions sont prélevés après la mise à mort, au plus tard quarante-deux jours après la greffe.

Objectifs

L’imagerie par bioluminescence in vivo est un outil utilisé en cancérologie préclinique permettant le suivi longitudinal non invasif de la croissance tumorale, de la dissémination métastatique et de la réponse thérapeutique. Les systèmes commerciaux actuels reposent sur des luciférases nécessitant des injections répétées de substrats exogènes, générant des problèmes d'utilisation et un coût d'achat élevé. Notre nouveau système de bioluminescence est optimisé pour être autonome permettant un suivi continu de la croissance tumorale sans injection de substrat. Cette technologie a déjà été validée in vitro dans des lignées cellulaires humaines et murines. Le projet vise à développer et valider, chez la souris, ce nouveau système de bioluminescence autonome. L’objectif de ce projet est de démontrer que ce nouveau système de bioluminescence produit un signal lumineux suffisamment intense pour permettre la détection fiable des tumeurs in vivo en sous-cutané, tout en vérifiant que les tumeurs rendues luminescentes conservent les mêmes caractéristiques biologiques que les tumeurs d’origine (croissance, agressivité).

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une preuve de concept démontrant qu'un système de bioluminescence autonome permet un suivi tumoral in vivo continu, sensible et reproductible, sans administration répétée de substrat exogène. Il établira une corrélation robuste entre l'intensité/dynamique du signal luminescent et la cinétique tumorale, tout en confirmant l'absence d'altération des caractéristiques biologiques essentielles des tumeurs (croissance, morphologie). Sur le plan méthodologique, le projet vise à établir un nouveau standard d’imagerie préclinique en oncologie, en réduisant le recours aux injections répétées de substrat et à certaines procédures invasives tout en améliorant la qualité des données longitudinales (mesures fréquentes sur un même individu).

Procédures

- Injection de cellules tumorales 1 fois, 30 sec - Mesure de la taille de la tumeur : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum, 1 min - Anesthésie et imagerie de la tumeur (5 min maximum) : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum - Pesée des souris : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum, 30 sec

Impact sur les animaux

- Douleur de courte durée lors de l'injection par voie sous-cutanée sous anesthésie isoflurane de cellules tumorales - Gène potentielle lors du développement de la tumeur. - stress lié aux anesthésies lors de l'imagerie, et aux contentions lors de la mesure du volume tumoral et pesées. - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d'injection atteint le point limite.

Devenir

En fin de procédure, soit au maximum 42 jours post-implantation si aucun point limite n'a été atteint avant, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse des tumeurs et ganglions drainants.

Remplacement

Avant toute expérimentation animale, un travail approfondi de sélection et de caractérisation a été effectué in vitro et en bio-impression 3D pour mieux mimer la croissance tumorale et limiter le passage à l’animal aux seuls clones répondant à des critères stricts. L’utilisation de l’animal n’intervient qu’après épuisement des possibilités d’optimisation in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par condition est défini sur la base d’un compromis entre puissance statistique et minimisation des effectifs. Le recours à l’imagerie bioluminescente non invasive, répétée chez les mêmes animaux, augmente la quantité de données recueillies par individu, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux. De plus, l’utilisation d’un logiciel de statistiques nous permet de calculer le nombre de souris strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général, le comportement (activité, isolement …), les critères physiques (poils hérissés, dos vouté) ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi, et comparé à la grille de score de référence pour prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être animal soit respecté. Un anti-douleur sera injecté lors de la détection des signes de douleur selon la grille de scoring. Chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux) régulièrement renouvelés. Les copeaux de litière seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l'étude des tumeurs. La petite taille des souris est adaptée à l'imager utilisé pour le suivi du signal de bioluminescence. Nous utiliserons de jeunes adultes pour favoriser la prise tumorale soit 6 à 8 semaines.

Ponctionnées chaque semaine à la jugulaire sous anesthésie pendant dix à quatorze semaines, 440 souris humanisées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un vecteur viral, des cellules immunitaires humaines, puis des injections répétées de lipopolysaccharide et d'interleukine pour moduler la réponse immunitaire. Le résumé ne décrit comme atteinte qu'une "légère douleur" au point de piqûre, sans mention des effets des produits inflammatoires injectés. Les animaux sont tués à la fin pour des analyses post-mortem.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire anti-AAV semble être dépendante de nombreux facteurs et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. Le profil immunologique du patient peut également être un facteur déterminant dans l’initiation de la réponse immune anti-AAVr. Le modèle ainsi développé va nous permettre de déterminer une signature immunologique pouvant déclencher un rejet du traitement et de développer des stratégies d’immunomodulation ciblée. Ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, différentes signatures immunitaires identifiées chez des donneurs sains et de développer une stratégie pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de mieux comprendre les réponses immunitaires responsables du rejet du traitement et de développer une stratégie pour moduler cette réponse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les cellules immunitaires responsables du rejet du transgène et de développer une stratégie dans le but de prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur. In fine, ce projet permettra de développer des traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr, plus sûrs et plus efficaces.

Procédures

Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 10 semaines pour les animaux inclus dans la caractérisation de la réponse immunitaire et 14 semaines pour ceux inclus dans la stratégie d’immunomodulation. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale en vigile. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 3 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide à J+1, J+2, J+3 après l’injection en intraveineuse du vecteur. Une injection en intra-péritonéale se fait en moins d’une minute. Des injections en intra-péritonéale d’interleukine-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 10 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la stratégie d’immunomodulation anti-CD45RC, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse (isoflurane : induction 5% puis 2%)

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins, les animaux seront sous anesthésies gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin due à la pénétration de l’aiguille. Pour les injections en intraveineuse et en Intra péritonéale, les souris seront maintenues en contention pour effectuer l’administration. Les animaux ressentiront une légère douleur au point d’administration due à la pénétration de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de développer un modèle pertinent mimant cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.

Réduction

Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains par stratégie . Au maximum, 440 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.

Raffinement

Le bien-être animal passera par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autres alternatives). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Dans les études de thérapie génique et d’immunologie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, en particulier des mammifères, afin d’obtenir des résultats pertinents pour l’humain. La souris est très utilisée, notamment parce qu’il existe des modèles dits « humanisés » qui reproduisent en partie le système immunitaire humain. De plus, il est facile de constituer des groupes suffisamment nombreux pour réaliser des analyses statistiques fiables. Ce modèle est particulièrement adapté au transfert de cellules humaines (appelé transfert adoptif), car ces cellules peuvent survivre et fonctionner correctement chez la souris. Cependant, pour que ces cellules reconnaissent correctement leur environnement, il est indispensable que la souris exprime une molécule spécifique du système immunitaire humain : HLA-A2.1. En effet, les cellules humaines utilisées sont capables de reconnaître uniquement cet allèle. Enfin, comme une réponse immunitaire préexistante contre les vecteurs AAV a déjà été démontrée dans ce modèle de souris NSG HLA-A2, celui-ci est particulièrement pertinent pour tester et développer de nouvelles stratégies visant à moduler ou contrôler la réponse immunitaire. Les souris seront injectées entre 8 et 14 semaines d’âge. A ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie des cellules adoptives transférées sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.

Injectées avec des molécules de chimiothérapie, jusqu'à une administration quotidienne pendant cinq jours, 3 840 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie des traitements est infligée à des souriceaux, du cinquième au dixième jour après la naissance. Le résumé annonce une perte de poids "légère et temporaire" de deux à trois jours comme principal effet, sans autre détail sur les atteintes. Les organes sont prélevés après la mise à mort, pour analyser les effets de l'invalidation d'un gène sur la fertilité.

Objectifs

L'objectif est d’étudier le rôle de la protéine PAXBP1 dans la physiologie des cellules germinales des gonades et son rôle dans la reprotoxicité induite par des traitement de chimiothérapie afin d’analyser la survenue des troubles de la fertilité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : * De mettre en évidence le rôle clé de PAXBP1 dans la physiologie des cellules germinales et leur sensibilité aux traitements anti-cancéreux de chimiothérapies. * Mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’infertilité * Décrypter les mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans les effets secondaires à long terme des médicaments sur la fertilité. * Ouvrir des pistes de traitements pour minimiser les effets reprotoxiques des chimiothérapies

Procédures

Les nuisances pour les animaux seront la préhension par l’expérimentateur et les injections des molécules de chimiothérapie. Au maximum, les souris subiront une injection quotidienne pendant 5 jours. Ces interventions seront réalisées du 5ième jour postnatal jusqu'au 10ième jour pour les traitements en période néonatale, ou bien pendant 5 jours consécutifs à 3 mois pour les traitements à l'âge adulte.

Impact sur les animaux

Les traitements par chimiothérapie chez la souris adulte pourraient conduire à une perte légère et temporaire perte de poids à partir du troisième jour du traitement. Ces effets ont une durée de 2 à 3 jours.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélévement des organes afin d'analyser les impacts de l'invalidation du gène PAXBP1 lors de traitement de chimiothérapie sur la fonction de reproduction.

Remplacement

Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permet à l'heure actuelle d'analyser les mécanismes des interactions cellulaires intra et inter-organes pouvant contrôler le développement et le maintien de la spermatogenèse sur le long terme (plusieurs semaines/mois) et d’analyser les impacts sur la santé de la descendance.

Réduction

L’analyse en temps réel des données recueillies à chaque expérience nous permettra, si nécessaire, d’ajuster le protocole : certains timings d’étude pourront être supprimés sur les répétitions prévues, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Notre stratégie de repose sur différents éléments reprenant les points clés : Nous minimiserons les animaux pouvant présenter des phénotypes dommageables grâce à la génération d’animaux présentant une invalidation ciblée de la protéine d’intérêt dans un seul type cellulaire. Afin de limiter le stress, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum); Les animaux seront hébergés en présence d’environnement contrôlé et enrichi (tunnel, coton…) avec un accès illimité à la nourriture et la boisson. Nous veillerons au bien- être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Pour les transferts des souris d'une cage à l'autre nous utiliserons des méthodes low stress (Cupping). Pour les observations, les souris seront manipulées à la suite de leur entrée dans un petit tube afin d’être déposé sur la grille puis manipulées. Le suivi régulier des animaux nous permettra au mieux d’identifier les signes d’alerte afin de réaliser des mesures visant à minimiser la douleur, souffrance ou angoisse induite par les contraintes liées aux procédures expérimentales. Ce rythme de surveillance sera accru si un animal devait présenter des signes importants de souffrance, douleur. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré. En ce sens, nous avons défini des points limites spécifiques et adaptés pour les expériences menées.

Choix des espèces

Choix des espèces. Nous utiliserons des souris car les modèles génétiquement modifiés pour PAXBP1 sont disponibles permettant ainsi l'analyse de l'impact de la perte du gène PAXBP1 lors de traitement anti-cancéreux sur la fertilité et la physiologie des gonades. La souris présente une physiologie testiculaire proche de l’espèce humaine et elle est un modèle mammifère de choix pour réaliser des études au cours du développement de la gonade et pour l'analyse de la fertilité. Ainsi, ce travail se base sur les points communs de la physiologie des cellules germinales entre les espèces : dans la mise en place des cellules souches dans la période prépubère, l’entrée en méiose à la puberté et la production des spermatozoïdes de la puberté à la mort de l’individu. De plus, le gène étudié ainsi que la fonction de la protéine qui en découle sont très proches entre différentes espèces notamment l’homme et la souris. Choix des stades: Pour l'analyse de l'impact des chimiothérapies, nous travaillerons sur des souris mâles traités aux chimiothérapies lors de la période néonatale (traitement de 5 à 10 jours). Pour l'analyse des impacts sur la physiologie testiculaire, nous suivrons les souris mâles à différents âges. Cela aura pour but d'analyser la mise en place des cellules germinales (de P5 à P15 post-natal), leur maintien de la puberté à l'âge adulte (de 20 jours à 365 jours), dans le but de définir l'impact sur la fertilité. Pour cela, nous mettrons à mort des souris à P6, P10, P15, P20, P40, P60, P90, P180. Pour l’analyse chez les souris adultes, ces dernières seront mises à mort à différents temps après traitement afin de définir l'impact de PAXBP1 dans la réponse aux molécules de chimiothérapie sur la perte des cellules germinales et de la fertilité puis pour l'analyse des capacités régénératives de cellules germinales et le retour de la fertilité. AInsi, nous mettrons à mort des souris 1jour, 4 jours, 7 jours, 10 jours, 20 jours, 60 jours, 90 jours et 180 jours après le début du traitement.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, certaines recevant jusqu'à soixante-huit injections sur un mois. Elles servent à tester deux substances censées bloquer une molécule impliquée dans la mémoire, contre la maladie d'Alzheimer. Les tests comportementaux mesurent la mémoire et l'anxiété, l'un d'eux pouvant provoquer une douleur modérée de quelques secondes. La mise à mort permet de prélever des tissus, dont certains à l'état frais pour des analyses ex vivo.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester des substances pouvant agir comme traitement dans le cerveau de la souris, afin de lutter contre la maladie d’Alzheimer, en particulier contre les troubles de la mémoire. Deux substances ont été choisies car elles sont capables de bloquer l’action d’une petite molécule naturellement produite par le cerveau. Cette molécule peut modifier l’activité des neurones (les cellules du cerveau) ainsi que la structure des connexions entre ces cellules. Elle agit en se fixant sur un type particulier de “récepteur” (une sorte de capteur situé sur les neurones), qui joue un rôle important dans la transmission des informations et la mémoire. On a observé que cette molécule est présente en plus grande quantité chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer, et qu’elle contribue à certains symptômes, comme les pertes de mémoire et les perturbations de l’activité du cerveau. Le but de ce projet est donc de vérifier si les deux substances sélectionnées peuvent devenir des traitements efficaces contre la maladie d’Alzheimer, en les testant sur trois modèles de souris reproduisant cette maladie.

Bénéfices attendus

Dans le monde, environ 50 millions de personnes sont touchées par des troubles importants de la mémoire et du raisonnement, dont la maladie d’Alzheimer est la forme la plus fréquente. Cette maladie concerne environ une personne sur trois après 80 ans, et le nombre de personnes touchées augmente avec le vieillissement de la population. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de traitement permettant de guérir cette maladie. Trouver de nouvelles solutions est donc une priorité majeure pour la santé publique. Notre équipe de recherche s’intéresse à une petite molécule présente dans le cerveau qui semble jouer un rôle important dans la communication entre les cellules du cerveau. Cette molécule est retrouvée en plus grande quantité chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer. Dans ce projet, nous allons tester deux substances pour voir si elles peuvent corriger les problèmes de communication entre les cellules du cerveau et améliorer les troubles de la mémoire liés à cette maladie. Les résultats obtenus seront très importants pour savoir si ces substances pourraient, à l’avenir, être développées comme traitements chez l’être humain.

Procédures

Certaines souris seront entrainées pour des analyses de comportement afin de comprendre leurs capacités de mémorisation et leurs niveaux d'anxiété. Ces analyses de comportement dureront quelques minutes par jour par souris sur une durée d'un mois. D'autres souris seront traitées avec un composé thérapeutique dans le but de développer un traitement pour la maladie d’Alzheimer. Certaines souris traitées le seront pendant toute la durée du comportement (1 mois donc 68 injections) et certaines souris seront traitées uniquement 4 jours (8 injections). Chaque injection ne durera que quelques secondes par jour. Les injections seront faite 2 fois par jour et peuvent aussi induire une nuisance.

Impact sur les animaux

Le projet s’intéresse à la mémoire. Par conséquent les effets indésirables principaux pourront se manifester par des troubles de la mémoire. Les tests comportementaux seront majoritairement sans douleur (un seul test peut entrainer une douleur modérée transitoire de quelques secondes). Il pourrait y avoir une douleur transitoire lors de l'injections des composés.

Devenir

Après les tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés pour prélever des tissus et réaliser des études post-mortem. Certains animaux seront euthanasiés pour prélever des tissus afin de maintenir les circuits neuronaux actifs mais aussi pour effectuer certaines analyses ex-vivo qui nécessitent des préparations à partir de tissus frais.

Remplacement

Pour comprendre comment fonctionne le cerveau et comment la maladie d’Alzheimer affecte la mémoire et le comportement, il est nécessaire d’étudier un cerveau complet, comme celui des mammifères. En effet, les modèles plus simples (comme des cellules en laboratoire, des simulations informatiques ou des animaux très simples) ne permettent pas de reproduire toute la complexité du cerveau et de ses connexions. Nous utilisons donc des souris, car ce sont aujourd’hui les modèles les plus adaptés pour étudier cette maladie.

Réduction

Le nombre de souris utilisé est soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables tout en évitant d’en utiliser plus que nécessaire. De plus, chaque souris participe à plusieurs étapes de l’étude lorsque cela est possible, afin de limiter le nombre total d’animaux. L’organisation des groupes est aussi optimisée pour utiliser au maximum les animaux élevés dans ce projet. Avant de faire ces tests sur les animaux, nous avons d’abord réalisé des expériences en laboratoire (sur des cellules) pour sélectionner les substances les plus prometteuses. Cela nous a permis de réduire le nombre de substances testées sur les animaux, en ne gardant que deux substances actives et une substance de comparaison.

Raffinement

Tout au long de l’étude, le bien-être des animaux est une priorité. Les chercheurs surveillent attentivement tout signe de souffrance (comme une perte de poids, un manque d’activité ou un mauvais état du pelage). Si un problème apparaît, l’expérience est arrêtée immédiatement et l’animal est pris en charge, voir euthanasié si les moyens mis en oeuvre pour diminuer sa souffrance sont insuffisants. Avant les tests, les souris sont habituées progressivement à être manipulées par les chercheurs afin de réduire leur stress. Elles sont également placées dans un environnement calme avant chaque test pour qu’elles s’y acclimatent. Les expériences sont organisées de manière à augmenter progressivement le niveau d’inconfort, afin de ne pas perturber les résultats.

Choix des espèces

Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologiques des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. L’élevage selon les mêmes conditions assure la reproductibilité des expérimentations. Pour comprendre comment fonctionne le cerveau et comment la maladie d’Alzheimer affecte la mémoire et le comportement, il est nécessaire d’étudier un cerveau complet, comme celui des mammifères. En effet, les modèles plus simples (comme des cellules en laboratoire, des simulations informatiques ou des animaux très simples) ne permettent pas de reproduire toute la complexité du cerveau et de ses connexions. Nous utilisons donc des souris, car ce sont aujourd’hui les modèles les plus adaptés pour étudier la maladie d'Alzheimer. Cette étude permettra de développer une approche thérapeutique de la maladie d'Alzheimer. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, où les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer peuvent être observés dans les lignées murines.

Menée par une société qui a mis au point sa propre technologie de vectorisation, l'étude soumet 600 souris à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de tumeur sous la peau, puis deux à quatre administrations des molécules à tester et jusqu'à quatre prélèvements sanguins. Les souris qui atteignent un point limite sont mises à mort en urgence, les autres à la fin du protocole. L'objectif est d'évaluer l'efficacité et la distribution de molécules conjuguées destinées à cibler les cellules cancéreuses.

Objectifs

Les cancers demeurent la première cause de mortalité en France et nécessitent le développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées et plus efficaces. L’identification de récepteurs ou transporteurs surexprimés à la surface des cellules tumorales constitue une approche prometteuse pour améliorer la spécificité des agents thérapeutiques et diagnostiques. Notre société a mis au point une technologie qui associe des vecteurs biologiques à différentes molécules d’intérêt. Cette approche exploite les mécanismes naturels de passage des cellules pour permettre aux molécules de franchir certaines barrières biologiques et d’atteindre les tissus ciblés. Le projet vise à évaluer l’efficacité et la distribution dans l’organisme de ces molécules conjuguées (molécules-C) en oncologie, en ciblant des récepteurs ou transporteurs surexprimés par les cellules cancéreuses. Les résultats attendus permettront d’apprécier le potentiel de cette approche de vectorisation pour le développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’évaluer l’efficacité de molécules vectorisées pour délivrer de manière ciblée des agents thérapeutiques et diagnostiques vers des tumeurs. Les résultats attendus incluent une meilleure compréhension de la distribution et des effets biologiques de ces molécules, ainsi que la validation de modèles précliniques pertinents pour l’oncologie. Ces connaissances pourront contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques et potentiellement moins toxiques, et orienter la conception de futures approches ciblées en oncologie.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La mise en contention (avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 2 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires peuvent être réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50μl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances ou effets indésirables sont liés au stress physique et à l’inconfort des animaux : - Lors des manipulations expérimentales : stress lié à la mise en contention, aux différentes administrations (induction tumorale par injection sous-cutanée (100µl), administration des molécules-C par voie intraveineuse ou sous-cutanée (une à trois maximum par individu), administration intrapéritonéale lors de la mise à mort (dose unique de 0.1 ml de mélange d’anesthésiques/10g de souris) et aux prélèvements sanguins intermédiaires (maximum 4 prélèvements ≤50 µl par individu, ne dépassant pas 10 % de la volémie sur 14 jours). - Lors de l’implantation et croissance tumorale : inconfort ou gêne locale liée à l’implantation des cellules tumorales et au développement des tumeurs. Les souris athymiques, en raison de leur phénotype immunodéprimé, peuvent présenter une sensibilité aux infections et une altération de l’état général ; ces nuisances potentielles sont toutefois limitées par les conditions d’hébergement (cages individuellement ventilées) et la surveillance régulière appliquées à l’ensemble des souris.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Si, au cours de l’expérimentation, un animal atteint un point limite, il sera euthanasié en urgence après validation par le vétérinaire et le porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont une première série de tests in vitro afin de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires (SPR, mesure d’affinité cellulaire). Cependant, ces tests ne permettent pas de prendre en compte l’ensemble des paramètres physiologiques (mécaniques, immunitaires, métaboliques et d’élimination) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour évaluer ces paramètres complexes, il est nécessaire de recourir à un modèle vivant, ici la souris, premier modèle animal disponible proche de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Aucun modèle informatique ou in vitro n’est actuellement capable d’intégrer toutes les interactions physiologiques requises pour étudier la pharmacocinétique et l’efficacité pharmacologique de nos vecteurs. La souris reste donc, à ce jour, le système le plus pertinent pour étudier de manière complète la pharmacologie des molécules conjuguées chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs permet d’utiliser des doses réduites, limitant ainsi les effets secondaires indésirables (Raffinement) et le nombre d’animaux nécessaires (Réduction). Le nombre d’animaux par groupe (15) a été défini pour garantir une puissance statistique suffisante, en tenant compte de l’effet biologique attendu, de la variabilité individuelle. Chaque étude comporte 2 groupes expérimentaux (1 contrôle et 1 traité), permettant de tester chaque molécule avec un minimum d’animaux. La planification annuelle et quinquennale a été optimisée pour que le nombre total sur 5 ans ne dépasse pas 600, tout en assurant des données fiables. Enfin, une sélection ciblée des tissus à prélever permet d’éviter des prélèvements inutiles et d’optimiser l’utilisation des animaux pour plusieurs analyses.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 5 individus maximum par cage et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. De plus, une observation quotidienne des animaux porteurs de tumeurs, avec mesure régulière des volumes tumoraux, permettra d’établir quotidiennement un score prenant en considération la perte de poids, la présence de signes de douleur ou de souffrance notable (cardiaque, respiratoire). Toutes les administrations (iv, ip et sc) sont réalisées par un personnel formé, expérimenté pratiquant en routine ce type d’études chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Lorsqu’ils ont lieu, les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : un volume tumoral supérieur à 1000 mm³, une perte de poids supérieure ou égale à 20 % par rapport au poids corporel maximal, ou un score de souffrance supérieur à 10 avec analgésie inefficace après 2 h. A la fin du projet tous les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Des essais in vitro sont réalisés en amont pour vérifier l’interaction des vecteurs avec leurs récepteurs cellulaires. Ces approches ne permettent cependant pas d’évaluer l’ensemble des paramètres physiologiques complexes impliqués in vivo, tels que la distribution dans l’organisme, la pharmacocinétique ou l’efficacité tumorale. À ce jour, aucun modèle alternatif (in vitro ou in silico) ne permet de prédire de manière fiable ces paramètres. Le recours à des modèles murins est donc indispensable pour l’évaluation de vecteurs à visée thérapeutique ou diagnostique dans un contexte tumoral. La souris constitue un modèle mammifère pertinent, intégrant l’ensemble des mécanismes physiologiques nécessaires à l’étude de l’efficacité pharmacologique. Pour cette procédure, des animaux dits « jeunes adultes » seront utilisés, âgés d’environ 6 semaines et pesant en moyenne 24g à 28g, ce qui permet d’optimiser les posologies et la standardisation des expérimentations. Deux souches seront employées selon les besoins expérimentaux : - Une souche déficiente en système immunitaire, permettant l’implantation et la croissance reproductible de tumeurs solides humaines sous-cutanées, facilitant la prise tumorale et le suivi de la croissance tumorale. - Une souche sauvage présentant un système immunitaire fonctionnel, permettant l’évaluation des vecteurs dans un environnement tumoral incluant la réponse immunitaire.

Pour évaluer si une lumière rouge ou infrarouge réduit les lésions de la peau et de la bouche causées par la radiothérapie, 3 320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des séances d'irradiation sous anesthésie générale et, pour certains groupes, des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant trois semaines. Les atteintes attendues, perte de poids, irritations de la peau et de la muqueuse buccale, viennent surtout de l'irradiation et de la tumeur. La mise à mort permet des examens sur tissus, et l'effectif de plus de trois mille animaux n'est pas justifié dans le résumé.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer la capacité de la photobiomodulation, utilisant une lumière rouge ou proche infrarouge, à réduire les toxicités induites par la radiothérapie et/ou la chimiothérapie au niveau de la muqueuse buccale et de la peau. La photobiomodulation est déjà largement utilisée en clinique pour la prise en charge des effets secondaires liés aux traitements anticancéreux, ainsi que dans d’autres indications telles que l’alopécie ou la cicatrisation post-chirurgicale. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la sécurité et l’efficacité de la photobiomodulation dans des modèles murins de toxicités radio-induites, en particulier la radiodermite et la mucite orale, tout en s’assurant de l’absence de toxicité cutanée et muqueuse induite par la photobiomodulation elle-même. Un objectif secondaire est de vérifier que la photobiomodulation n’induit pas de protection tumorale vis-à-vis de la radiothérapie. À ce titre, le projet vise également à évaluer l’impact de la photobiomodulation sur la réponse tumorale à la radiothérapie, et à explorer la possibilité d’un effet radiosensibilisant de la photobiomodulation.

Bénéfices attendus

Bien que l’efficacité clinique de la photobiomodulation soit aujourd’hui bien établie dans la prévention et le traitement de la mucite orale, l’analyse de son effet sur les toxicités cutanées et muqueuses radio-induites permettra de mieux comprendre comment la photobiomodulation agit au niveau cellulaire et moléculaire pour limiter l’inflammation et favoriser la réparation des tissus sains exposés aux irradiations. Certaines études précliniques ont déjà démontré une réduction de la mucite orale par l’utilisation de lasers de faible intensité chez l’animal. Toutefois, ce projet vise à confirmer ces résultats à l’aide de techniques complémentaires, permettant d’étudier précisément les mécanismes biologiques impliqués dans la réduction des effets secondaires, et surtout à étendre cette démonstration au contexte de la radiodermite, dont la diminution n’a pas encore été démontrée de manière robuste en préclinique, tout en s’assurant de l’absence de toxicité cutanée et muqueuse propre à la photobiomodulation. Par ailleurs, les paramètres d’utilisation de la photobiomodulation (doses, longueurs d’onde, durée d’exposition) étant actuellement très hétérogènes en préclinique et en clinique, ce projet contribuera à leur optimisation et standardisation dans le cadre des soins de support en oncologie. Dans la littérature préclinique, l’impact de la photobiomodulation associée à la radiothérapie sur la tumeur reste controversé. Ce projet vise à clarifier ces effets en explorant de manière rigoureuse l’influence de la photobiomodulation sur la réponse tumorale à la radiothérapie, dans différents modèles tumoraux. La mise en évidence, à l’aide de preuves précliniques solides et de techniques d’analyse avancées, d’un effet radiosensibilisant, d’une modulation du microenvironnement tumoral, ou d’un ralentissement de la croissance tumorale constituerait une avancée majeure dans la compréhension des interactions entre la photobiomodulation et les traitements anticancéreux. Ces données permettront de mieux caractériser les mécanismes biologiques impliqués, notamment en termes de vascularisation tumorale, d’inflammation et de réponse immunitaire, et de trancher les divergences actuelles de la littérature.

Procédures

Il y aura une injection des cellules tumorales sous anesthésie locale (durée 10 secondes). Pour chaque procédure, la photobiomodulation sera délivrée pendant au maximum 10 min sans contact direct à une distance de 40 mm. Elle sera délivré pour chaque groupe sous anesthésie générale après une séance de radiothérapie pour les groupes irradiés ou pour les groupes témoins. Pour chaque procédure, les souris seront également irradiées sous anesthésie générale (durée: 15 minutes max) . Dans certains groupes, elles seront traitées 3 fois par semaine avec un anticorps en injection durant trois semaines (durée de l'injection 10 secondes). Cette injection se fera sous anesthésie locale. Certains groupes recevront un produit de contraste pour voir la vascularisation sous micro-CT juste avant le prélèvement final sous anesthésie générale (une injection, durée 10 secondes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les nuisances qui surviennent à l’animal sont principalement dues à l’irradiation et à la tumeur. Les effets indésirables attendues liés à l’implantation de la tumeur, le développement progressif de la tumeur pouvant entraîner une gêne légère à modérée et une perte de poids. Les nuisances que l’animal peut également rencontrer sont les irritations cutanée ou muqueuse légère et transitoire et la perte de poids modérée, liée à l’irradiation dans les modèles de radiodermites et de mucite orale radio-induites. L’association de la photobiomodulation à la radiothérapie ne génère pas de nuisance supplémentaire pour l’animal. Aucun effet indésirable spécifiquement lié à la photobiomodulation n’est attendu sachant qu’elle non ionisante, non invasive et appliquée en surface à des doses ne causant aucune élévation thermique mesurable. Dans ce contexte, la photobiomodulation est susceptible de réduire certaines toxicités radio-induites, telles que la radiodermite et la mucite orale, et pourrait ainsi contribuer à une amélioration du bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour des études et examens sur tissus post-mortem.

Remplacement

Le recours à l’animal est justifié par l’impossibilité de reproduire in vitro l’ensemble des phénomènes biologiques étudiés dans ce projet. Les effets de la photobiomodulation sur les toxicités radio-induites et sur la réponse tumorale impliquent des interactions complexes entre plusieurs compartiments cellulaires, microenvironnement tissulaire de la tumeur , et la dynamique tumorale avec certains types de cellules ou médiateurs chimiques est très important, qui ne peuvent être modélisées de manière pertinente par des systèmes cellulaires isolés. D’autant plus que les données issues de la littérature basée majoritairement sur des études in vitro sont très limitées dans l’analyses sur les mécanismes d’actions de la photobiomodulation sur la réparation tissulaire ou sur la réponse tumorale, manquant d’aller plus loins dans la recherche ou dans les conclusions. Ils démontrent par ailleurs que les effets de la photobiomodulation diffèrent significativement entre les modèles in vitro et in vivo. Ainsi, l’utilisation de modèles murins reste indispensable si on veut étudier de manière intègre les effets de la photobiomodulation sur les tissus développant la mucite orale et la radiodermite proche de celui des patients et sur la tumeur, dans un contexte de radiothérapie, et pour produire des résultats transposables à la clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet sera strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les effectifs ont été définis sur la base : d’une analyse statistique à priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant dans chaque procédure pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. Sur des données précliniques existantes, les modèles de radiodermite et de mucite orale utilisés dans ce projet sont très développés dans le laboratoire et décrits dans la littérature. Mais également la création de modèle avec des tumeurs ou il y a un contrôle tumoral par la radiothérapie est également très développé dans le laboratoire. Du fait de ce recul important, nous n’avons pas besoin de mettre en place nos modèles d'irradiations et de tumeurs. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales et donc le nombre de souris.

Raffinement

La photobiomodulation constitue une approche non invasive, non ionisante, appliquée à des paramètres n’induisant aucune élévation thermique mesurable, et ne générant pas de douleur directe chez l’animal. Toutefois, un appareil d'imagerie thermique (Ti20 thermal imager) peut être utilisé pour vérification. Les animaux seront pesés trois fois par semaine, et un examen clinique biquotidien sera réalisé afin d’évaluer l’état général, le développement des effets radio-induits cutanés et/ou muqueuses. Le scoring de ces effets se fera avec le score de Parkins ou CTCAE. Le développement tumoral sera suivi trois fois par semaine par la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse, ou par une imagerie IVIS (Système d’imagerie in vivo basé sur la luminescence), permettant un suivi longitudinal non invasif. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués, conduisant si nécessaire à une euthanasie immédiate, réalisée conformément aux recommandations réglementaires en vigueur. Les souris seront hébergées en groupe afin de limiter le stress lié à l’isolement. Leur environnement sera enrichi (coton, nids en carton, papier) pour favoriser les comportements naturels et réduire l’anxiété. En cas de besoin, des compléments alimentaires riches en énergie et facilement accessibles seront mis à disposition, et des traitements analgésiques pourront être administrés conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, en raison de la bonne caractérisation de ses réponses tissulaires et immunitaires aux rayonnements ionisants. Les lignées choisies ont été sélectionnées car ce sont des modèles largement utilisés et validés pour l’étude du développement tumoral et des effets secondaires de la radiothérapie. Leur homogénéité génétique (souris congéniques) garantit une bonne reproductibilité des résultats. Par ailleurs, ces lignées ont déjà été utilisées dans le laboratoire pour l’étude des mucites buccales et de la radiodermite, assurant ainsi une continuité scientifique avec les travaux similaires. Les souris jeunes seront âgées de 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature. Elles représenteront les souris jeunes. Sur la base des résultats obtenus, certains résultats clés peuvent être confirmés sur des souris âgées de 15 à 18 mois pour voir si l’âge joue dans les résultats.

Pour reproduire chez le rat la neuropathie douloureuse provoquée par les chimiothérapies anticancéreuses, 192 rats reçoivent huit injections intraveineuses d'anticancéreux sur vingt-cinq jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils développent au fil des injections une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, évaluée chaque semaine par des tests tactiles et thermiques. Le porteur qualifie cette induction de nuisance "indispensable à la conduite de l'étude". Un prélèvement sanguin final précède la mise à mort, destinée à des analyses sanguines et tissulaires.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques utilisés dans le cancer du sein, le cancer colorectal, le cancer du poumon. Cette neuropathie se manifeste par des désordres sensitifs dans les mains et les pieds (fourmillements, picotements et douleur), altérant la qualité de vie des patients et pouvant persister longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique reste très limitée, avec notamment aucun traitement préventif, et des traitements peu efficaces pour traiter les douleurs associées. Des travaux récents menés au sein de notre équipe de recherche ont mis en évidence l’activation de processus inflammatoires dans nos modèles animaux de neuropathie chimio-induite, et l’identification de potentielles cibles thérapeutiques pour atténuer les douleurs associées à cette neuropathie. Néanmoins, il reste difficile à ce stade d’identifier des anomalies inflammatoires communes à l’ensemble de ces modèles de neuropathie (différents types d’anticancéreux neurotoxiques), ce qui limite l’identification de cibles thérapeutiques robustes. L’objectif général de ce projet sera donc d’approfondir ces résultats préliminaires en explorant la neuroinflammation dans le contexte des neuropathies périphériques chimio-induites, à l’aide de modèles animaux harmonisés (en particulier en termes de durée de traitement) et validés, dans la perspective d’identifier et d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier la neuroinflammation dans les neuropathies périphériques chimio-induites chez l'animal dans la perspective d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques permettant de prévenir oui traiter les neuropathies périphériques chimio-induites. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des neuropathies périphériques chimio-induites est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et seule un médicament avec un niveau de recommandation modérée pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathies périphériques chimio-induites.

Procédures

Tous les animaux des modèles de neuropathie périphérique chimio-induite recevront des injections intraveineuses (anticancéreux ou véhicule de l’anticancéreux) sous sédation légère. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, et pour une durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront en moyenne 5 à 10 min par animal. Il n’y aura aucun prélèvement sanguin durant les procédures. Un seul prélèvement sanguin total sera réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde (isoflurane à 4%) et avec analgésie, à la suite de quoi les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie périphérique chimio-induite chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Les injections intraveineuses d’anticancéreux seront réalisées avec une sédation légère. La neuropathie périphérique chimio-induite sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (test mesurant l’allodynie tactile et thermique) et qui se développeront au fur et à mesure des injections d’anticancéreux. L’allodynie est une réponse douloureuse à un stimulus qui ne l’est pas en condition normale. L’allodynie est mesurée grâce à un stimulus non douloureux tactile (von frey électronique) ou thermique (immersion de la patte à 10°C) et qui sera perçu comme douloureux. La mesure de l’allodynie offre un critère de jugement plus éthique que l’hyperalgésie (application d’un stimulus douloureux, ex : pression de la patte ou application de température nociceptive à 0 ou 4°C). De plus, l’allodynie est caractéristique de la douleur neuropathique en clinique chez l’homme. Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une réduction du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bi-hebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux aux anticancéreux. Comme la douleur neuropathique est étudiée dans ce projet, il ne sera pas possible de mettre en place une analgésie continue chez l’animal. Les réponses nociceptives sont objectivables chez l’animal lors des tests nociceptifs (ici de l’allodynie), mais les animaux ne présentent habituellement pas de réponses douloureuses spontanées ou lors de la manipulation des animaux. Il est important de rappeler que, pour ce type d’étude avec des tests comportementaux, les animaux doivent conserver un très bon état général (activité spontanée, comportement), car des altérations sévères de l’état général biaiseraient la qualité des résultats obtenues avec les tests comportementaux.

Devenir

Les expérimentations conduiront à la mise à mort des animaux pour permettre des analyses biologiques sanguines et tissulaires afin d'optimiser l'emploi des animaux à des fins de recherche

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie des neuropathie périphérique chimio-induite, qui n'est-elle-même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par l’intermédiaire de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité à 12 par groupe et par sexe, afin de respecter le principe de réduction tout en garantissant la robustesse scientifique de l’étude. Dans ce type d’étude exploratoire, une diminution plus importante du nombre d’animaux ferait courir un risque élevé de ne pas pouvoir conclure, ce qui entraînerait une perte de valeur scientifique et une utilisation inutile des animaux. Le nombre retenu permet de réaliser des analyses statistiques fiables, fondées sur des tailles d’effet attendues suffisamment larges pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes.

Raffinement

Les tests comportementaux ont été choisis car d’une part ils sont les moins douloureux pour les animaux, et d’autre part, ils sont plus proches de la clinique humaine. Ensuite une surveillance renforcée et des points limites précis, ont été établis sur la base d’une solide expérience sur de nos modèles animaux, dans l’objectif de maintenir leur bien-être animal tout au long de l’étude.

Choix des espèces

Le choix du rat plutôt que la souris se justifie d’abord par sa taille, qui permet de prélever une quantité plus importante de matériel biologique par individu et donc de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en répondant aux objectifs scientifiques. La souche Sprague-Dawley, connue pour son comportement calme et sa bonne maniabilité, est particulièrement adaptée aux tests comportementaux de la douleur, contrairement à des souches plus actives comme Lou ou Wistar qui peuvent introduire davantage de variabilité dans les mesures. L’utilisation de cette souche s’appuie également sur l’expertise existante et des données antérieures au sein du laboratoire, ce qui renforce la robustesse et la comparabilité des résultats. Les animaux seront utilisés à un âge correspondant à de jeunes adultes (environ 9 semaines), ce qui est cohérent avec la plupart des études publiées et facilite la comparaison avec la littérature ainsi qu’avec les données internes. Des mâles et des femelles seront inclus afin de refléter la réalité clinique des traitements par paclitaxel, administrés aussi bien chez les hommes que chez les femmes, et de prendre en compte d’éventuelles différences liées au sexe dans les réponses aux traitements.

Pour tester une protéine présentée comme "anti-âge" et son "potentiel thérapeutique" contre la maladie d'Alzheimer, 24 prosimiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal subit une injection de la molécule directement dans le cerveau par chirurgie, puis des tests de mémoire répétés. Le sang et les tissus sont prélevés après la mise à mort, pour des analyses moléculaires. Les bénéfices annoncés visent une "utilisation future chez l'être humain", quand l'atteinte portée à ces petits primates est immédiate.

Objectifs

Le projet vise à étudier le rôle d'un complexe de protéines anti‑âge dans le système nerveux central de petits primates et son potentiel thérapeutique pour le traitement des pathologies associées au vieillissement et à la neurodégénérescence chez l’être humain. Ce complexe protéique additionne les actions anti-sénescentes et neuroprotectrices, anti-inflammatoires et favorise un environnement neurovasculaire plus sain afin de cibler trois aspects essentiels du vieillissement physiologique et de la maladie d’Alzheimer. Nous souhaitons vérifier si l’augmentation de la production de ce complexe protéique dans le cerveau a des effets bénéfiques chez des animaux âgés, afin de confirmer son potentiel thérapeutique en vue d’une utilisation future chez l’être humain. Les animaux seront soumis à plusieurs tests de mémoire qui nous permettront de quantifier l’évolution des performances mnésiques au cours du projet et d’évaluer l’efficacité du traitement au niveau cognitif et cérébral. Les tissus seront prélevés pour analyse moléculaire ultérieure.

Bénéfices attendus

Il est reconnu que les modèles murins présentent des limites importantes lorsqu’il s’agit d’étudier le vieillissement cérébral et les fonctions cognitives. Ainsi, les effets observés sur la protéine d'intérêt chez la souris (un vieillissement plus sain et une augmentation de l’espérance de vie) ne permettent pas, à eux seuls, de procéder à une extrapolation fiable à l'être humain. Conformément aux directives réglementaires, une validation sur un modèle plus proche de l'homme est nécessaire avant toute application clinique. Cette étape est essentielle pour réduire le risque d'échec lors des essais cliniques ultérieurs, pour caractériser plus précisément les effets indésirables potentiels dans un système plus comparable à celui de l'être humain, et pour confirmer la reproductibilité et la robustesse des résultats observés. Cette étude permettra de confirmer le potentiel thérapeutique de la protéine d'intérêt en vue d’une utilisation future chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests comportementaux qui durent de 25 à 50 minutes maximum. Les tests seront espacés de 2 jours au moins. Les animaux auront 1 injection ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l analgésie suivie d'une chirurgie cérébrale (durée 20 à 30 minutes) pour l'injection de la molécule d'intéret dans le cerveau. En fin de procédure le sang sera prélevé sous anesthésie et analgésie et après mise à mort, les tissus seront prélevés.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent engendrer un stress mais les animaux étant observés en libre circulation dans l'arène et étant habitués à être manipulés, le stress est très faible. Les injections peuvent être responsables d'un stress léger lors de la contention. La chirurgie cérébrale sous anesthésie et analgésie peut engendrer des gènes post-opératoires ou un stress de l'animal.

Devenir

les animaux seront euthanasiés pour récupération de sang et tissus pour analyse moléculaire ultérieure

Remplacement

Aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du vieillissement cérébral in vivo. L'effet du traitement sur la mémoire nécessite un suivi comportemental longitudinal chez des animaux vivants. Cette espèce présente une variabilité individuelle proche de celle de l'homme, facilitant la comparaison des effets du vieillissement.

Réduction

Sur la base de l’expérience acquise, une stratégie de réduction a été mise en œuvre en privilégiant un suivi expérimental longitudinal avec mesures répétées. Chaque animal est évalué avant et après administration des deux vecteurs viraux, permettant ainsi à chaque individu de constituer son propre contrôle. Ce choix méthodologique permet de prendre en compte la variabilité interindividuelle, d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre total d’animaux nécessaires, sans compromettre la validité scientifique du projet. Pour chaque groupe (vecteur vide et vecteur exprimant la protéine d'intérêt), le caractère et le profil cognitif des animaux sont précisément caractérisés avant traitement, puis suivis au cours du temps afin d’évaluer leur évolution. Cette approche maximise l’information obtenue par animal tout en limitant l’effectif utilisé.

Raffinement

Les animaux en élevage évoluent en volière enrichie avec des branches et des nichoirs et des tubes pour se cacher. L’observation des signes cliniques relatifs au bien-être des animaux sera réalisée quotidiennement. Les indicateurs privilégiés sont l’absence de variation anormale du poids corporel et l’état de forme générale (prostration, réactivité, agressivité). Les animaux ont 1 séance d'habituation avant de commencer les tests de comportement et sont récompensés par des friandises après chaque test. Pour la chirurgie cérébrale, les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie. Les effets post opératoires seront traités par analgésique. Lors de l’euthanasie, pour éviter toute douleur avant la prise de sang intracardiaque et prélèvement de tissus, une analgésie et anesthésie sont réalisées.

Choix des espèces

Bien que les résultats obtenus chez la souris soient prometteurs, les modèles murins présentent des limites majeures pour l’étude du vieillissement cérébral et des fonctions cognitives complexes. En effet, des différences importantes existent entre rongeurs et primates en termes d’organisation et de complexité cérébrale, de dynamique du vieillissement, et mécanismes impliqués dans les fonctions cognitives supérieures. Le recours à un modèle de primate non humain, plus proche de l’Homme, est indispensable avant toute application clinique. Ce primate de petite taille présente des similarités structurelles et fonctionnelles avec les primates supérieurs. Par ailleurs, son vieillissement relativement rapide permet d’accéder à des individus âgés (5-6 ans, stade adulte avancé) dans des délais compatibles avec les objectifs expérimentaux, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté à l’étude du vieillissement cérébral. De plus ce petit primate peut présenter des lésions cérébrales de type Alzheimer. En captivité l'espérance de vie des animaux est de 7-8 ans en moyenne et sa longévité maximale 12 ans.