Procédures modérées

Les souris qui montrent les premiers signes moteurs, une démarche saccadée, sont mises à mort avant que la paralysie ne les empêche de se nourrir. 312 souris génétiquement modifiées sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit dans le cerveau, par chirurgie sous anesthésie, une inoculation d'agrégats d'alpha-synucléine humaine qui reproduit une forme de maladie de Parkinson ou d'atrophie multisystématisée et conduit à la paralysie. Le porteur indique comparer douze formes de la protéine agrégée pour relier leur structure à la sévérité de la maladie, la mise à mort servant à prélever et analyser le cerveau.

Objectifs

L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions du cerveau des patients atteints de maladie de Parkinson ou d’atrophie multisystématisée, où elle se présente sous une forme agrégée. De structures différentes selon les maladies, ces agrégats sont associés à une gravité particulière dans le cas de l’atrophie multisystématisée, rendant les patients rapidement dépendants d’un fauteuil roulant et avec une survie inférieure à 10 ans. Le projet vise à disposer d’échantillons cérébraux de souris modifiées génétiquement, avec des lésions bien identifiées et caractérisées, afin de pouvoir analyser à très haute résolution la structure spatiale de la protéine alpha-synucléine formée lors de l’apparition de la maladie induite par un panel de différents agrégats d’alpha-synucléine inoculés à la souris. Le but est de mieux comprendre les relations entre structures moléculaires de la protéine et sévérité de la maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires pathologiques de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et de la structure à l’échelle atomique de la protéine pathologique. Il s‘agit en particulier de mieux comprendre pourquoi l’atrophie multisystématisée présente, parmi les différentes maladies associées à cette même protéine, une gravité particulière aboutissant en quelques années seulement à la mort des patients.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris modifiées génétiquement à l'âge de 6-8 semaines, réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 312 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes. Aucun prélèvement n’est réalisé du vivant de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux font l’objet d’une inoculation réalisée sous anesthésie générale et locale. Ces inoculations peuvent induire de faibles pertes de poids et un faible risque d’infection au site d’incision chez les souris. Réalisées afin de reproduire la maladie humaine, ceci entraîne l’apparition précoce des premiers signes cliniques moteurs qui se manifestent par une démarche saccadée de l’animal. La confirmation de ces premiers signes cliniques détermine la décision de mise à mort des animaux selon une grille de scoring, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur qui empêcherait l’animal de se nourrir et boire à volonté.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’expression d’une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine chez les souris modifiées génétiquement utilisées dans ce projet conduit irrémédiablement à une paralysie, survenant plus précocément suite à l’inoculation d’alpha-synucléine sous forme agrégée. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers signes cliniques, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et la pathologie cérébrale, ainsi que la structure de la protéine qui s’accumule dans le cerveau lors de la maladie. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les 12 groupes expérimentaux, correspondant à 12 formes d’alpha-synucléine agrégée différentes, sont constitués chacun de 26 souris adultes, mâles et femelles. Dans chaque groupe expérimental 14 souris sont prévues afin de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d’incubation, des lésions et des caractéristiques biochimiques de la protéine présente dans le cerveau. Les 12 autres souris sont prévues pour extraire et purifier cette protéine afin d’étudier sa structure spatiale à très haute résolution.

Raffinement

Les inoculations dans le cerveau sont réalisées sous anesthésies générale et locale, après administration d’un antalgique, afin de limiter la douleur. Les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie. Les animaux sont hébergés en cages ventilées par groupes de 5 mâles ou 5 femelles, suivis quotidiennement, et les enrichissements présents dans la cage, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de conflits dans la cage. L’expérience des zootechniciens permet de repérer rapidement les souris qui présentent les premiers signes de déficits moteurs, se traduisant par une démarche saccadée et un déséquilibre, selon une grille de score adaptée à ce modèle de souris. Ceci permet d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6-8 semaines, dans lesquelles l’expression d’alpha-synucléine humaine permet les comparaisons des durées de survie et des caractéristiques de la maladie. Seule cette lignée de souris particulière permet aujourd’hui à la fois la reproduction d‘une diversité des pathologies et de leurs sévérités, telle qu’elle existe chez l’homme, et une analyse structurale de la protéine en cause.

Pour étudier une région du tronc cérébral impliquée dans la douleur chronique, 528 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit une chirurgie qui induit une douleur neuropathique, une autre des injections provoquant un modèle de fibromyalgie, et une chirurgie stéréotaxique d'environ une heure trente cible des neurones précis. Le résumé insiste sur l'analgésie et le suivi mis en place, tout en décrivant des modèles conçus pour maintenir une hypersensibilité douloureuse. Les tissus cérébraux sont prélevés après la mise à mort, une étape que le porteur juge "indispensable" pour vérifier le ciblage.

Objectifs

La douleur chronique touche des millions de personnes dans le monde et altère profondément la qualité de vie. Elle s'accompagne fréquemment de comorbidités invalidantes tels qu’une fatigue excessive et des troubles de l’humeur (anxiété, dépression) contribuant à une aggravation du tableau clinique. Malgré son impact considérable, les mécanismes cérébraux impliqués dans l'installation et le maintien de ces états douloureux persistants restent insuffisamment compris, et les traitements disponibles demeurent souvent inefficaces. Ce projet s'intéresse à une région du tronc cérébral impliquées dans le traitement des expériences aversives et la régulation de l'humeur via un contrôle inhibiteur sur les circuits dopaminergiques du cerveau. Des travaux récents suggèrent que cette région s'active en réponse à la douleur et que réduire son activité pourrait atténuer certaines réponses douloureuses. Cependant, son rôle dans la douleur chronique reste peu étudié. Afin de mieux comprendre le rôle de cette région, nous avons choisi d'explorer deux grandes formes de douleur chronique aux mécanismes distincts : la douleur neuropathique, causée par une lésion du système nerveux (comme dans certaines douleurs post-traumatiques ou post-chirurgicales), et la fibromyalgie, une maladie caractérisée par une douleur diffuse et persistante sans lésion identifiable, pour laquelle les options thérapeutiques sont aujourd'hui particulièrement limitées. Nous cherchons à déterminer si diminuer l'activité de cette région peut atténuer certaines manifestations de ces douleurs chroniques, telles que l'hypersensibilité à la douleur et les altérations émotionnelles associées. Pour cela, nous utilisons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler et de réduire temporairement l'activité des neurones de cette région, puis nous évaluons l'impact de cette manipulation à l'aide de différents tests comportementaux utilisés pour étudier les symptômes liés à la douleur chronique. Ces travaux apporteront des données inédites sur l'implication de cette structure cérébrale dans différentes formes de douleur chronique. Si son implication dans ces processus est confirmée, cette région pourrait représenter une cible thérapeutique nouvelle et prometteuse pour des pathologies encore trop souvent insuffisamment soulagées.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des données causales et spécifiques sur le rôle d'une région du tronc cérébral dans la douleur chronique. En combinant des modèles de douleur neuropathique et de fibromyalgie avec une approche permettant d'agir de façon ciblée sur les neurones de cette région, ces travaux permettront de déterminer si inactiver cette structure contribue à réduire l'hypersensibilité à la douleur, la fatigue et les troubles émotionnels associés. Sur le plan translationnel, si l'implication de cette région est confirmée, elle pourrait représenter une cible thérapeutique nouvelle pour des pathologies encore insuffisamment traitées.

Procédures

Une partie des animaux subira une courte intervention chirurgicale sous anesthésie générale (environ 30 minutes) permettant d'induire un modèle de douleur neuropathique. Une autre partie recevra des injections (durée :

Impact sur les animaux

Les interventions chirurgicales peuvent entraîner une gêne passagère et une légère perte de poids, généralement résorbées en quelques jours. Les animaux bénéficient d'une analgésie adaptée et d'un suivi attentif jusqu'à récupération complète. Les modèles utilisés induisent une hypersensibilité à certaines stimulations, reflétant les symptômes étudiés. Les animaux conservent leur mobilité et leur accès libre à la nourriture et à l'eau. Les manipulations peuvent générer un léger stress, limité par une habituation progressive des animaux à l'expérimentateur et à l'environnement de test avant le début des expériences. Les effets liés aux manipulations et aux chirurgies sont modérés et transitoires. Les phénotypes douloureux induits, bien que persistants par nature, restent d'intensité modérée et font l'objet d'une surveillance quotidienne.

Devenir

À l'issue des expériences, les animaux sont euthanasiés sous anesthésie profonde afin de permettre le prélèvement et l'analyse des tissus cérébraux. Cette étape est indispensable pour vérifier que la région du tronc cérébral ciblée a bien été atteinte lors de la chirurgie stéréotaxique.

Remplacement

Les objectifs de ce projet nécessitent d'étudier simultanément la sensibilité à la douleur, les performances motrices, la fatigue et les comportements émotionnels dans un organisme vivant et vigile. Ces dimensions ne peuvent pas être reproduites par des approches in vitro ou in silico, qui ne permettent pas de rendre compte de l'intégration de ces différentes composantes par un système nerveux central intact. Par ailleurs, la région cérébrale étudiée n'a été identifiée et caractérisée que chez les mammifères, ce qui ne permet pas d'utiliser des organismes non-mammifères. L'utilisation de la souris est en outre indispensable car elle permet, grâce à une lignée transgénique spécifique, de cibler sélectivement les neurones de cette région (ce qui n'est pas réalisable avec d'autres espèces à ce jour).

Réduction

Les expériences sont conçues de façon à utiliser le nombre minimal d'animaux nécessaire. Ce nombre a été calculé au plus juste en s'appuyant sur les données disponibles dans la littérature scientifique et sur des méthodes statistiques reconnues, tout en tenant compte des variations naturelles entre individus. Afin d'éviter toute expérience inutile, une phase préliminaire permet d'identifier les tests et les moments les plus pertinents avant de réaliser les expériences principales, limitant ainsi le nombre total de manipulations. Enfin, les expériences sont réalisées par petites séries successives, avec des bilans réguliers permettant d'arrêter dès que les résultats obtenus sont suffisants (sans nécessairement utiliser le nombre maximal d'animaux prévu.

Raffinement

Les souris sont hébergées en petits groupes dans des cages enrichies, contenant des tunnels, du coton, des bâtonnets à ronger et du matériel de nidification, afin qu'elles puissent se reposer, explorer et exprimer des comportements naturels. Avant toute expérience, les animaux sont habitués progressivement à l'expérimentateur, aux salles et aux dispositifs de test, afin de réduire le stress pouvant être associé à un environnement nouveau ou aux manipulations. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie et analgésie, et l'état de chaque animal est surveillé attentivement après l'intervention pour vérifier sa bonne récupération. Une alimentation enrichie est mise à disposition durant cette période. Les sessions expérimentales sont courtes et espacées de périodes de repos afin d'éviter la fatigue. Des seuils limites stricts sont appliqués lors des tests impliquant des stimulations afin d'éviter toute exposition excessive. Des points limites sont définis pour chaque procédure afin de garantir le bien-être des animaux : tout animal les atteignant ou présentant des signes de détresse fait l'objet d'une interruption immédiate des expériences et d'une prise en charge vétérinaire. L'état général de chaque animal est surveillé quotidiennement tout au long du projet. Toute nouvelle méthode validée permettant d'améliorer le confort des animaux ou de réduire la douleur sera intégrée au projet dès qu'elle sera disponible.

Choix des espèces

Le protocole requiert des souris génétiquement modifiées permettant de cibler spécifiquement les neurones de la zone étudiée ; cette ressource n’existe pas de façon équivalente dans d’autres espèces utilisables. Les études exigent des systèmes nerveux matures : les animaux seront adultes (en général ≥ 8 semaines en début de procédure, et ≤ 12 mois en fin de procédure), afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.

Soumises à une extraction puis à une réimplantation dentaire sous anesthésie, 40 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Après l'intervention, elles peuvent souffrir d'une infection ou d'un saignement du site opératoire et éprouver des difficultés à se nourrir. Le maxillaire est prélevé quatre semaines plus tard, la mise à mort étant nécessaire à ces prélèvements. L'étude porte sur le rôle d'une protéine dans la régénération du ligament qui fixe la dent à l'os.

Objectifs

Le ligament parodontal est un tissu souple qui relie la dent à l’os de la mâchoire. Très fin (environ un quart de millimètre), il agit comme un véritable amortisseur et permet à la dent de résister aux forces exercées lors de la mastication. Grâce à un réseau de fibres et de cellules spécialisées, il joue un rôle essentiel dans le maintien de la dent et dans le renouvellement des tissus environnants, comme l’os et la surface de la racine dentaire. Il s’agit d’un tissu vivant, riche en nerfs et en vaisseaux sanguins, capable de s’adapter en permanence. Avec l’âge, les infections bactériennes ou certaines maladies chroniques inflammatoires, ce ligament s’amincit, se fragilise et perd progressivement ses fonctions. Cela peut conduire au déchaussement des dents. Dans certaines situations cliniques, notamment lors de la pose d’implants dentaires, ce ligament est totalement absent. Si les fibres et les cellules responsables de l’attachement de la dent et du renouvellement des tissus ont déjà été largement étudiées, les vaisseaux sanguins du ligament restent en revanche mal connus. Pourtant, ils sont indispensables à la vitalité du tissu : ils assurent l’apport de nutriments, le bon fonctionnement des nerfs, le renouvellement des cellules et le maintien de la structure du ligament. Il existe des molécules naturellement présentes dans ce tissu, qui jouent un rôle clé dans la formation et le maintien des vaisseaux sanguins. Lorsque ces molécules sont altérées, le ligament perd sa structure et sa capacité à fonctionner correctement. À partir de ces découvertes, nous avons développé une nouvelle molécule capable de stimuler la réparation des vaisseaux et de favoriser la régénération du tissu. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet réparateur de cette molécule sur la régénération du ligament parodontal. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, basé sur l’extraction puis la réimplantation d’une dent. Les résultats obtenus avec cette nouvelle approche seront comparés à ceux d’un traitement de référence déjà utilisé en dentisterie, ainsi qu’à un support neutre servant de contrôle. Nous analyserons différents paramètres, tels que l’épaisseur du ligament, la dégradation de la racine dentaire ou la fusion anormale entre la dent et l’os. Des analyses microscopiques permettront également de suivre l’évolution du tissu pendant un mois et d’évaluer la qualité de sa régénération.

Bénéfices attendus

L’ambition du projet est d’exploiter des propriétés nouvelles mise en évidence pour une molécule recombinante pour améliorer les performances du ligament parodontal. Cela pourrait permettre une meilleure prise en charge des traumatismes dentaires, le développement d’implants dentaires bio-intégrés, l’optimisation des traitements orthodontiques et le traitement des maladies du ligament parodontal. De plus, le traitement utilisé actuellement est un produit d’origine animale dont le mode d’action est peu connu. Notre molécule recombinante pourrait remplacer ce produit pour réduire l’utilisation de produits d’origine animal.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie avec extraction dentaire puis réimplantation avec ou sans la molécule d'intérêt. Cette intervention durera quelques minutes. Les analyses se feront 4 semaines après l'intervention chirurgicale.

Impact sur les animaux

Des douleurs d'intensités légères pourront être ressenties sur une durée limitée (quelques heures) lors des injections et après la chirurgie. Il y a également des risques d'infection ou de saignement du site opératoire au moment de l'extraction. Les souris pourront ensuite avoir des difficultés à se nourrir correctement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par du personnel formé afin que les prélèvements du maxillaire en vue des études histologiques prévues puissent être faits.

Remplacement

Ces expériences doivent être réalisées sur un modèle animal, car il n’est pas possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un tissu vivant. Seules des études menées chez l’animal permettent d’observer des phénomènes essentiels comme la formation des vaisseaux sanguins et la cicatrisation, dans des conditions proches de celles du corps humain. Des tests en laboratoire ont déjà été réalisés pour mettre au point la molécule utilisée et définir la meilleure façon de l’employer. Toutefois, avant toute application chez l’humain, il est indispensable de passer par des études précliniques sur l’animal. Dans le cadre de ce projet, ces travaux seront menés chez le rongeur. Ces études permettent de vérifier si la molécule est efficace, si elle fonctionne correctement dans un organisme vivant et si elle favorise réellement la régénération du ligament qui maintient la dent. Les résultats obtenus chez l’animal constituent une étape clé avant toute évolution vers une application clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique a priori. Des expérimentations in vitro ont déjà été menées sur cette nouvelle molécule pour déterminer la formulation optimale

Raffinement

Afin de limiter leur stress, une période d’adaptation est prévue pour les habituer progressivement aux déplacements vers la salle de chirurgie. Pendant l’intervention, les animaux seront endormis puis maintenus sous anesthésie de façon adaptée à la chirurgie réalisée dans la bouche. Des traitements contre la douleur seront administrés avant et après l’opération afin d’assurer leur confort. Un gel protecteur sera appliqué sur les yeux pendant l’intervention pour éviter toute sécheresse. À la fin de la chirurgie, une solution hydratante tiède sera administrée afin de prévenir la déshydratation. Le réveil se fera dans des conditions contrôlées, sur un support chauffant, et chaque animal sera placé temporairement dans une cage individuelle pour éviter tout risque lié au contact avec d’autres animaux encore éveillés. Une fois complètement réveillé, l’animal sera replacé dans sa cage habituelle. Après l’intervention, une alimentation molle sera proposée pour faciliter la prise de nourriture et éviter tout déplacement de la dent traitée. Une attention particulière sera également portée à une bonne hydratation. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour veiller à ce que les points limites définis ne soient pas atteints. Une procédure précise de décisions sera mise en place par l'expérimentateur en collaboration avec le personnel de l'animalerie.

Choix des espèces

Le projet utilise un modèle murin déjà décrit. La molécule que nous voulons tester a déjà été utilisée dans le modèle de rétine postnatale de souris et s’est avéré fonctionnelle et sans effet délétère dans cette espèce. Les souris utilisées seront âgées de 4 semaines qui correspond à un âge ou le ligament parodontal est bien établi et fonctionnel.

Jusqu'à soixante prises de sang sur un même animal : 9 bovins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils ne sont pas tués à l'issue mais destinés à être réutilisés dans un second projet d'immunisation ou d'infection, encore en attente de financement. Les prélèvements peuvent provoquer des hématomes ou des phlébites. L'étude cherche à savoir si l'âge à la vaccination modifie la protection contre les infections de la mamelle.

Objectifs

Les infections intramammaires causées par des bactéries sont la maladie la plus fréquente en vaches laitières. En plus de leur impact économique et sur le bien-être animal, elles sont la première cause d'utilisation d'antibiotiques dans l'élevage laitier. Bien que des vaccins soient disponibles, leur efficacité sur le terrain demeure limitée. De nombreux efforts ont été consacrés à l’amélioration des formulations vaccinales mais un facteur potentiellement déterminant, l’âge à la vaccination, a jusqu’à présent été peu exploré. Des études menées chez des rongeurs montrent que l’exposition précoce à certaines bactéries du microbiote peut conduire à l’acquisition d’une empreinte immunologique favorisant la tolérance à ces microorganismes et réduisant l’efficacité des vaccins dirigés contre ces pathogènes. Mieux comprendre les mécanismes d’acquisition de cette empreinte immunologique permettrait d’identifier la fenêtre optimale de vaccination contre les mammites, afin de stimuler une réponse immunitaire protectrice avant l’installation de mécanismes de tolérance induits par ces bactéries. Cette approche s’inscrit dans une logique déjà éprouvée en santé humaine comme l’illustre la vaccination contre le papillomavirus humain, administrée dès l’enfance avant l’exposition au virus, stratégie qui a démontré une grande efficacité. À ce jour, aucune étude n’a évalué chez les bovins le moment idéal de vaccination contre les agents responsables des mammites ni l’âge à partir duquel les animaux développent une immunité naturelle vis-à-vis de ces bactéries. Face à ce constat, ce projet vise à faire une cartographie de l’immunité de jeunes bovins contre les principaux agents responsables des mammites avec un suivi sérologique sur des femelles Prim’holstein et des prélèvements sanguins réguliers de la naissance de l’animal jusqu’à sa première mise-bas. Il s’inscrit dans la continuité des projets menés recemment dans nos installations pour le développment de nouveaux vaccins contre les mammites. Il permettra d’établir la meilleure période pour ces immunisations, tenant compte de l’évolution de l’immunité de génisses en croissance, à la puberté, en gestation et en lactation. Ces animaux devraient être utilisés à leur maturité lors de futurs protocoles d’immunisation contre les mammites. Ce suivi nous permettra de disposer de données indispensables pour une meilleure compréhension de la réponse des animaux à la vaccination

Bénéfices attendus

Une étude récente estime à 224 € par vache le coût du traitement des mammites en France. De plus, ces infections compromettent la qualité du lait, entrainant des conséquences importantes sur sa commercialisation et sa transformation. Compte tenu d’un cheptel de 20 millions de vaches laitières en Europe, dont 3,2 millions en France, ainsi que d’une prévalence de mammites cliniques estimée à environ 30% en France et dans d’autres pays européens, le contrôle des mammites représente un enjeu de taille pour l’industrie du médicament vétérinaire et pour la filière laitière. Les résultats de ce projet pourront ainsi bénéficier directement à l'industrie laitière, tant en France qu'à l'international. Ils pourront également contribuer à la protection de la santé publique en apportant des connaissances sur les mécanismes de l’immunité des bovins contre les agents responsables des mammites. Ces données faciliteront la mise en place de nouvelles stratégies de prévention des mammites au niveau des troupeaux et, par conséquent, la réduction de l'utilisation des antibiotiques dans l'élevage laitier. In fine, nous avons l’ambition de proposer aux parties prenantes de l’industrie du médicament vétérinaire un vaccin prototype répondant à un besoin largement souligné par la filière laitière : un vaccin polyvalent contre les mammites qui soit sûr, bon marché et facile à utiliser. Dans la continuité des projets déjà réalisés dans nos installations, les données issues du projet pourront contribuer 1/par les connaissances apportées et 2/par les projets expérimentaux qui en découleront, à l’élaboration de ce vaccin. En Europe, un vaccin polyvalent contre les mammites est commercialisé. Ce vaccin, visant l’induction des anticorps protecteurs et présentant une efficacité faible sur le terrain, laisse une large marge d'amélioration car la stimulation de la réponse cellulaire dans la mamelle n’a pas été ciblée lors de sa conception. Pourtant, la littérature scientifique montre que la réponse cellulaire représente la principale barrière contre les infections intramammaires par les bactéries. Le développement de nouvelles plateformes vaccinales pourrait représenter une alternative prometteuse pour la prévention et le traitement des mammites.

Procédures

Prélèvements sanguins (5 minutes par animal, 45 minutes pour le lot). Un nombre maximum de 60 prises de sang seront réalisées sur un animal.

Impact sur les animaux

Hématome ou phlébite suite aux prélèvements sanguins. Stress lors des différentes interventions.

Devenir

Il est prévu par la suite de réutiliser ces animaux dans le cadre d'un second projet d'immunisation et/ou d'infection expérimentale. Nous sommes encore en attente de financement pour ce projet.

Remplacement

L’étude des réponses immunitaire n’est pas possible in vitro. L’étude sur animaux vivants est donc nécessaire.

Réduction

Pour mener à bien ce projet, nous estimons qu’il nous faut au minimum 5 animaux. En dessous de ce nombre, le projet ne pourra pas être réalisé. Selon les recommandations des services vétérinaires, les femelles issues des mères immunisées seront alors euthanasiées selon les dispositions prévues dans le paragraphe 3.3.3 et les femelles issues de mères non immunisées pourront être commercialées. Le nombre maximum de 9 animaux représente le collectif maximal de femelles que nous pourrons obtenir à partir des 12 vêlages (tenant compte d’un sex ratio estimé de 50-50 / 60-40). Cela s’approche également de notre capacité d’accueil maximale de 10 animaux, sans impact majeur sur notre capacité à assurer des futurs protocoles sur vaches adultes. En plus, cette DAP concerne seulement un suivi de l’immunité de base des animaux contre les mammites, en amont des expérimentations pour l’évaluation de nouveaux vaccins contre les mammites. Avoir cet historique des animaux en amont n’est qu’une première étape dans l’utilisation de ces animaux. Une fois les animaux en lactation, l’idée est de réutiliser ces animaux dans le cadre d’un second projet (une autre DAP) avec une immunisation / infection des animaux, toujours dans l’objectif de développer un vaccin contre les mammites. Ce second projet serait d’autant plus pertinent que nous aurons tout l’historique de l’immunité de nos animaux depuis leur plus jeune âge. Ces données serviront à obtenir un premier aperçu de l’âge auquel les animaux commencent à développer une réponse immunitaire contre les pathogènes causant des mammites. Cette étude pilote servira de base pour le suivi d’un collectif plus important d’animaux, tout en réduisant la fréquence des prises d’échantillons grâce à une première approche avec un effectif limité et des mesures plus rapprochées. Selon les résultats de cette étude, le suivi d’une cohorte avec plus d’animaux se limitera aux périodes les plus pertinentes. À moyen terme, ces études nous permettront de concevoir des protocoles d’immunisation contre les mammites plus performants et mieux ajustés au développement d’une réponse protectrice, afin d’identifier le moment optimal de vaccination en amont de l’exposition, à l’instar des stratégies vaccinales mises en œuvre chez l’Homme (ex. HPV), tout en permettant de raffiner les futurs protocoles expérimentaux et de réduire le nombre global de prélèvements.

Raffinement

Les prises de sang ne nécessiteront qu’une contention minimale (au cornadis ou par un agent dans l’aire paillée). Les prélèvements de sang seront réalisés à l’une puis à l’autre des deux veines jugulaires. Si necessaire, une autre voie de prélèvement sera utilisée pour ne pas solliciter les veines jugulaires. 2 à 4 tubes de 10 ml seront utilisés à chaque prélèvement. Un maximum de deux prises de sang par mois sera réalisé chez un même animal. Une période de repos d’au moins une semaine sera instituée avant un nouveau prélèvement. Occasionnellement, une poche de sang pourra être prélevée, le volume n’accèdera pas 10% du poids de l’animal comme prévu par la règlementation avec une fréquence limitée à une poche par animal tous les 2 mois. Enrichissement du milieu : brosses de grattage et aire paillée pour le couchage. Enrichissement social : hébergement en groupes stables et visite régulière des animaliers, 2 fois par jour au minimum. Une récompense alimentaire sera fournie aux animaux après les interventions. Il est prévu d’effectuer un travail de conditionnement et de renforcement positif pour les interventions prévues. Plusieurs agents se sont formés à cette méthode. L’application d’une bombe de froid au niveau de la zone de prélèvement pourra être testée.

Choix des espèces

Les infections mammaires chez la vache sont fréquentes en élevage laitier. Elles sont responsables de pertes économiques qui fragilisent les exploitations agricoles et impactent le bien-être des animaux. Des vaccins plus efficaces contre ces infections doivent être mis au point. Le choix de l’espèce cible pour la mise en place de ce protocole se justifie par le constat que les résultats de protection contre l'infection obtenus avec des modèles murins sont peu transposables aux bovins. De la naissance jusqu’à 2 mois après le vêlage, soit de 0 à 30 mois d’âge

12 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, l'un des plus gros effectifs du lot. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale sous anesthésie, soit pour injecter une substance et implanter du matériel sur la tête, soit pour opérer des embryons chez des femelles gestantes, soit pour coudre une paupière et priver l'animal de la vue d'un œil. Une partie est ensuite entraînée à des tâches pendant des séances d'enregistrement de l'activité cérébrale. Les organes sont prélevés après la mise à mort, l'effectif de plus de douze mille souris restant sans justification dans le résumé.

Objectifs

Le cerveau est composé de nombreux types de neurones, organisés en réseaux qui remplissent différentes fonctions selon leur emplacement. Certaines zones du cerveau traitent les informations sensorielles de base, comme la vue ou le toucher, tandis que d’autres zones interviennent dans des tâches plus complexes, comme la réflexion ou la prise de décision. Cette organisation influence la façon dont le cerveau apprend et s’adapte, notamment pendant certaines périodes clés du développement. Dans notre projet, nous cherchons à comprendre comment différents types de neurones interagissent dans plusieurs régions du cerveau de la souris, en particulier quand l’animal perçoit son environnement ou réalise des tâches. Pour cela, nous utilisons des souris modifiées génétiquement permettant d’étudier différents types de neurones, et différentes techniques, comme l’injection de substances spécifiques, l’observation de l’activité cérébrale ou la manipulation de certains neurones. Ces méthodes nous permettront de voir comment les réseaux du cerveau changent et influencent le comportement. L’objectif final est de mieux comprendre comment la diversité des neurones et de leurs connexions contribue au fonctionnement du cerveau et à l’apparition de certaines maladies.

Bénéfices attendus

Au niveau scientifique ce projet pourrait permettre d’obtenir des connaissances fondamentales sur les fonctions cérébrales et par conséquent aider à comprendre les mécanismes sous-jacents à certains troubles neurologiques et psychiatriques. A plus long terme ce projet pourrait donc contribuer à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces pathologies et par conséquent améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Tous les animaux auront une chirurgie réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée (une fois, durée 1h maximum). Les chirurgies consisteront soit à injecter une substance au niveau du cerveau pour induire des modifications génétiques puis implanter du matériel sur la tête de l’animal, soit à opérer des femelles gestantes pour réaliser ces mêmes injections chez leurs embryons, soit à induire une déprivation sensorielle par la fermeture d’un œil. Une partie des animaux ayant reçu l’injection participeront ensuite à des expériences d’enregistrement de l’activité cérébrale. Pour cela ils seront entrainés à raison de 3 séances par jour pendant 1 semaine en augmentant progressivement le temps de chaque séance (de quelques minutes à 1h). Ils réaliseront ensuite soit 1 séance unique de 2.5h (procédure 4) soit 1 séance d’enregistrement de 45 minutes par jour, avec 4 séances par semaine, pendant 2 mois maximum (procédure 3). Les animaux faisant la séance unique devront être anesthésiés avant les enregistrements pour mettre en place le dispositif d’enregistrement nécessaire pour enregistrer l’activité cérébrale (une fois, sous anesthésie générale, durée inférieure à 15 minutes). Une autre partie des animaux ayant reçu l’injection participera à 4 tests comportementaux vigiles répartis sur 8 semaines maximum. Le premier test permettra d’évaluer l’attrait de la souris pour la nouveauté (1 session de 10 minutes par jour pendant 4 jours). Le deuxième permettra d’évaluer la peur innée (1 session de 30 minutes maximum). Le troisième permettra d’évaluer les capacités visuelles des animaux (3 sessions de 15 minutes maximum, max 3 jours). Le quatrième permettra d’évaluer la perception de la profondeur et les réponses comportementales liées à la peur des hauteurs, un comportement inné chez les rongeurs (1 sessions de 5 minutes maximum, une fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Une partie d’entre eux sera euthanasiée au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

Les chirurgies seront associées à un risque de douleurs post-opératoire. Il existe un risque de légers saignements au cours de la chirurgie. Il est possible que les heures suivant la chirurgie, l'animal présente des signes d'activité spontanée réduite. Les chirurgies réalisées sur les souriceaux impliqueront également un risque de rejet par leur mère. La ligature des paupières générera une gêne et un inconfort pour les animaux en post-opératoire. L’anesthésie générale mise en place pour les chirurgies engendrera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de dépression cardiorespiratoire. L’implantation de matériel sur la tête des animaux pourra générer une gêne et un inconfort dus à l’encombrement spatial qu’il représente. Les tests comportementaux impliqueront un stress pour les animaux en lien avec le changement d’environnement, les tests comportementaux en eux-mêmes et la nécessité d’avoir la tête fixée pour une partie des tests. De manière générale la manipulation des animaux peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience soit pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem pour répondre à notre question scientifique, soit parce qu’il ne sera pas possible de les réutiliser en raison des manipulations génétiques déjà réalisées.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car aucun modèle artificiel ne permet de reproduire fidèlement le fonctionnement réel du cerveau. Notre objectif étant de comprendre comment différents types de neurones interagissent dans plusieurs régions du cerveau, il est essentiel d’observer directement ces circuits dans un cerveau intact. Les cellules cultivées en laboratoire ne reflètent pas avec précision la complexité des connexions entre neurones. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact il est donc nécessaire d’avoir recours à un animal vivant pour les réaliser. De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les propriétés du réseau dans le cerveau entier d’un animal vigile.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (12 700) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Notre choix des effectifs par groupe est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce, avec accès à l’eau et à la nourriture en illimité et un enrichissement environnemental adapté. Ils seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci sera déclarée à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à l’équipe de recherche pour mettre en place une prise en charge adaptée pour l’animal. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. La gestion du risque d’hypothermie est assurée par l’utilisation d’un tapis chauffant thermorégulé et de chambres d’induction et de réveil chauffées. Un gel de protection oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux anesthésiés pour éviter toute sécheresse oculaire. Le réveil des animaux sera surveillé et un suivi post-opératoire renforcé est réalisé pendant 3 jours, tous les animaux seront examinés quotidiennement. Concernant la chirurgie impliquant des souriceaux nous vérifierons de manière spécifique la bonne reprise en charge des petits par leur mère. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pendant les 24h minimums suivants la chirurgie les animaux auront accès à de l’eau gélifiée et de la nourriture directement dans le fond de la cage pour faciliter leur récupération. Les animaux impliqués dans les tests comportementaux ou les enregistrements cérébraux post-chirurgie bénéficieront d’une période de récupération de 4 jours minimum avant tout autre geste. Pour les tests comportementaux et sessions d’enregistrements les animaux auront une période d’habituation aux tests et à l’environnement de test. Ils auront également des périodes de repos entre les différents tests comportementaux. L’euthanasie médicamenteuse s’effectuera après une sédation de l’animal pour réduire le stress et la douleur qu’elle pourrait générer.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de neurones que nous voulons étudier. Le développement du cerveau des souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées facilement (bonne connaissance de leur patrimoine génétique et outils disponibles pour le modifier) révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Ainsi, dans ce projet nous pourrons utiliser plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées nous permettant d’étudier différentes cellules spécifiques et leurs interactions. Une partie des procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes, nous utiliserons donc dans ce cas des animaux de plus de 30 jours, ou de plus de 60 jours pour le cas des femelles devant être gestantes donc sexuellement matures. Nous réaliserons également nos injections pour l’induction de modification génétique sur des embryons ou des souriceaux (3 jours) afin de garantir une large diffusion de la modification dans le cerveau. Cela permet d’assurer une expression uniforme et une couverture optimale des régions cérébrales ciblées pour nos études fonctionnelles et anatomiques.

Greffées chirurgicalement de cellules cancéreuses directement dans le pancréas, 432 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La tumeur peut se disséminer dans l'abdomen et provoquer une ascite ainsi qu'une dégradation de l'état général. Chaque animal reçoit ensuite plusieurs traitements, une chimiothérapie puis jusqu'à six injections d'immunothérapie. Les tumeurs sont prélevées après la mise à mort, l'étude portant sur la fibrose qui bloque l'accès des cellules immunitaires à la tumeur.

Objectifs

Le cancer du pancréas fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Le cancer du pancréas est un cancer typiquement très riche en fibrose qui bloque l’accès des cellules immunitaires à la tumeur, contribuant à la résistance au traitement. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette fibrose. Le but du projet est d’évaluer les effets du blocage de la fibrose sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies, dans un modèle de cancer chez la souris. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du pancréas ces traitements sont totalement inefficaces chez l’Homme. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance dans les tumeurs générées dans le pancréas. Notre travail précédent sur des tumeurs du pancréas générées en sous-cutané montre un réel impact de cette voie sur la réponse à la chimio-immunothérapie. Mais ces résultats doivent être confirmés sur des tumeurs localisées au sein de l’organe, pour être plus proche de la maladie chez l’Homme. Ainsi, comparer ce modèle nous permettra de savoir si nous pouvons continuer à utiliser le modèle sous-cutané (moins invasif pour la souris) ou en cas de discordance de résultats, nous devons utiliser seulement le modèle intra-pancréatique (plus représentatif de la réalité). Cela nous permettrait à l’avenir de ne plus réaliser des expériences inutiles sur le modèle sous-cutané. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules bloquant cette voie chez la souris (futur projet) puis chez l’Homme.

Procédures

3 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - Geste réalisé sous anesthésie - Une seule implantation chirurgicale par animal - Durée : 15 minutes - Nombre de souris : 432 souris - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigile - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Traitements par immunothérapies, agoniste RXR ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Injection des traitements anti-douleurs : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Injection des traitements anti-inflammatoire : - Geste réalisé sur animal vigil - Quatre injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans le pancréas : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale. Possible dissémination de la maladie au niveau du péritoine avec apparition d’ascite. -Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux : les chimiothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, plaie, douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs et réaliser des expériences.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles a déjà été réalisée dans le laboratoire. - Les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. - Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études et quotidiennement par les personnels animaliers. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. L’apparition des points limites sera quotidiennement recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence de souris génétiquement modifiées renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Jusqu'à cinquante examens IRM de deux heures et cent prélèvements sanguins par animal sur cinq ans, sous anesthésie répétée : 12 macaques, six à longue queue et six rhésus, sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Contrairement à la plupart des projets, ils ne sont pas tués à l'issue mais réutilisés dans de nouveaux projets après avis vétérinaire. Le porteur reconnaît que la contention et les suites de l'anesthésie peuvent nuire aux animaux et entraîner une perte de poids, et que le lithium administré peut endommager la fonction rénale. L'étude vise à développer des méthodes d'imagerie métabolique du cerveau.

Objectifs

De nombreuses pathologies cérébrales, neurodégenératives ou psychiatriques, présentent des altérations précoces du métabolisme énergétique, de la neurotransmission ou de la physiologie cellulaire notamment des gradients ioniques transmembranaires. De nouvelles approches d’imagerie par résonance magnétique à haut champ offrent des perspectives prometteuses pour l’étude non-invasive de ces processus physiologiques et biochimiques. Cette multitude d’informations pourraient aider dans la compréhension des processus physiopathologiques en cours dans de nombreuses maladies cérébrales et pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Notre projet vise à repousser les limites de l’imagerie métabolique par RMN à travers le développement et la validation d’outils dédiés à l’IRM à haut champ, notamment les schémas d’acquisition optimisés pour les différents noyaux d’intéret en recherche biomédicale et observables in vivo. Nous mènerons des expériences chez le primate non-humain anesthésié pour développer et valider de nouveaux outils d’imagerie cérébrale. En particulier, ces outils serviront à détecter et cartographier la distribution cérébrale en lithium, un élément possédant des propriétés neuroprotectrices et régulateur de l’humeur, chez des animaux auxquels auraient été administrées un traitement aigüe ou chronique aux sels de lithium à des doses thérapeutiques. D’autre part, ces méthodes seront mises en œuvre pour étudier l’activation cérébrale chez l’animal.

Bénéfices attendus

Les méthodes validées et données de référence acquises à l’occasion de ce projet seront utiles pour aider dans la compréhension des processus physiologiques et biochimiques en condition normales et préfigurer les études de recherche biomédicale chez l’Homme par IRM à ultra-haut champ magnétique qui pourraient à terme participer à l’évaluation de nouvelles thérapies.

Procédures

Dans certains cas, des prélèvements sanguins (de quelques secondes) pourront être réalisés chez l’animal anesthésié (juste avant ou juste après l’examen IRM). Le projet prévoit des examens IRM chez l’animal anesthésié à une fréquence maximale bimensuelle et une durée typique de 120 minutes. En pratique, nous envisageons moins de 50 examens IRM et moins de 100 prélèvements sur 5 ans pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Par contre, le stress de la contention et les contrecoups de l’anesthésie peuvent être délétères entrainant une possible perte de poids. A long terme ou en cas de surdosage, les sels de lithium peuvent etre délèteres à la fonction rénale.

Devenir

Après avis favorable du vétérinaire, les animaux pourront être réutilisés dans de nouveaux projets.

Remplacement

Nos tests préliminaires seront systématiquement menés sur des objet-tests aux dimensions et caractéristiques électromagnétiques comparables à celles d’un cerveau de macaque adulte. Toutefois, aucun objet-test ne reproduit la complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique du cerveau. Le passage par l’expérimentation animale demeure donc une nécessité.

Réduction

Nous comptons utiliser une douzaine de macaques (mâles et femelles), nombre suffisant à la mise au point de nos méthodes et à l’acquisition de données de référence. Les analyses statistiques nécessaires à la validation de nos méthodes, notamment pour l’évaluation de leur reproductibilité et l’établissement de valeurs/images de référence seront déployées. Dans la mesure du possible, nous comptons utiliser des macaques ayant déjà participé à d’autres projets de recherche afin de limiter globalement le nombre de PNH nécessaires en recherche biomédicale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables. Les animaux seront anesthésiés lors des examens RMN et leurs paramètres physiologiques (température corporelle, nombre de respirations par minute) seront suivis en continu afin d’éviter tout effet négatif ou inconfort pour les animaux. Le réveil après les anesthésies est également surveillé de près pour s’assurer que l’animal récupère bien et se nourrit. Les animaux sont suivis régulièrement afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les points-limites et la structure chargée du bien-être animal et les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

Phylogénétiquement très proche de l'homme (développement cortical et sous-cortical), le macaque permet de poursuivre le développement des méthodes préalablement mises au point chez les rongeurs dans des conditions plus proches de l'examen chez l'humain notamment en matière de résolution et d'équipement. Il s'agit d'une étape nécessaire à la validation de nos approches avant l'application chez l’Homme. Pour des raisons pratiques (équipements IRM et autres appareillages) de mise en œuvre, des animaux adultes seront examinés. Pour le macaque, dans le souci de réduire le nombre global d’animaux utilisés dans des protocoles de recherche, nous souhaitons réutiliser dans la mesure du possible des macaques adultes sains âgés de moins de 15 ans au début du projet.

Pour valider un système d'imagerie censé suivre les tumeurs sans les injections de substrat qu'exigent les appareils commerciaux, 120 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, puis passe sous imagerie sous anesthésie deux fois par semaine pendant six semaines au maximum. Le porteur met en avant l'intérêt technique et le "coût d'achat élevé" des systèmes existants. Les tumeurs et les ganglions sont prélevés après la mise à mort, au plus tard quarante-deux jours après la greffe.

Objectifs

L’imagerie par bioluminescence in vivo est un outil utilisé en cancérologie préclinique permettant le suivi longitudinal non invasif de la croissance tumorale, de la dissémination métastatique et de la réponse thérapeutique. Les systèmes commerciaux actuels reposent sur des luciférases nécessitant des injections répétées de substrats exogènes, générant des problèmes d'utilisation et un coût d'achat élevé. Notre nouveau système de bioluminescence est optimisé pour être autonome permettant un suivi continu de la croissance tumorale sans injection de substrat. Cette technologie a déjà été validée in vitro dans des lignées cellulaires humaines et murines. Le projet vise à développer et valider, chez la souris, ce nouveau système de bioluminescence autonome. L’objectif de ce projet est de démontrer que ce nouveau système de bioluminescence produit un signal lumineux suffisamment intense pour permettre la détection fiable des tumeurs in vivo en sous-cutané, tout en vérifiant que les tumeurs rendues luminescentes conservent les mêmes caractéristiques biologiques que les tumeurs d’origine (croissance, agressivité).

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une preuve de concept démontrant qu'un système de bioluminescence autonome permet un suivi tumoral in vivo continu, sensible et reproductible, sans administration répétée de substrat exogène. Il établira une corrélation robuste entre l'intensité/dynamique du signal luminescent et la cinétique tumorale, tout en confirmant l'absence d'altération des caractéristiques biologiques essentielles des tumeurs (croissance, morphologie). Sur le plan méthodologique, le projet vise à établir un nouveau standard d’imagerie préclinique en oncologie, en réduisant le recours aux injections répétées de substrat et à certaines procédures invasives tout en améliorant la qualité des données longitudinales (mesures fréquentes sur un même individu).

Procédures

- Injection de cellules tumorales 1 fois, 30 sec - Mesure de la taille de la tumeur : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum, 1 min - Anesthésie et imagerie de la tumeur (5 min maximum) : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum - Pesée des souris : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum, 30 sec

Impact sur les animaux

- Douleur de courte durée lors de l'injection par voie sous-cutanée sous anesthésie isoflurane de cellules tumorales - Gène potentielle lors du développement de la tumeur. - stress lié aux anesthésies lors de l'imagerie, et aux contentions lors de la mesure du volume tumoral et pesées. - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d'injection atteint le point limite.

Devenir

En fin de procédure, soit au maximum 42 jours post-implantation si aucun point limite n'a été atteint avant, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse des tumeurs et ganglions drainants.

Remplacement

Avant toute expérimentation animale, un travail approfondi de sélection et de caractérisation a été effectué in vitro et en bio-impression 3D pour mieux mimer la croissance tumorale et limiter le passage à l’animal aux seuls clones répondant à des critères stricts. L’utilisation de l’animal n’intervient qu’après épuisement des possibilités d’optimisation in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par condition est défini sur la base d’un compromis entre puissance statistique et minimisation des effectifs. Le recours à l’imagerie bioluminescente non invasive, répétée chez les mêmes animaux, augmente la quantité de données recueillies par individu, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux. De plus, l’utilisation d’un logiciel de statistiques nous permet de calculer le nombre de souris strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général, le comportement (activité, isolement …), les critères physiques (poils hérissés, dos vouté) ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi, et comparé à la grille de score de référence pour prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être animal soit respecté. Un anti-douleur sera injecté lors de la détection des signes de douleur selon la grille de scoring. Chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux) régulièrement renouvelés. Les copeaux de litière seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l'étude des tumeurs. La petite taille des souris est adaptée à l'imager utilisé pour le suivi du signal de bioluminescence. Nous utiliserons de jeunes adultes pour favoriser la prise tumorale soit 6 à 8 semaines.

Ponctionnées chaque semaine à la jugulaire sous anesthésie pendant dix à quatorze semaines, 440 souris humanisées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un vecteur viral, des cellules immunitaires humaines, puis des injections répétées de lipopolysaccharide et d'interleukine pour moduler la réponse immunitaire. Le résumé ne décrit comme atteinte qu'une "légère douleur" au point de piqûre, sans mention des effets des produits inflammatoires injectés. Les animaux sont tués à la fin pour des analyses post-mortem.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire anti-AAV semble être dépendante de nombreux facteurs et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. Le profil immunologique du patient peut également être un facteur déterminant dans l’initiation de la réponse immune anti-AAVr. Le modèle ainsi développé va nous permettre de déterminer une signature immunologique pouvant déclencher un rejet du traitement et de développer des stratégies d’immunomodulation ciblée. Ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, différentes signatures immunitaires identifiées chez des donneurs sains et de développer une stratégie pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de mieux comprendre les réponses immunitaires responsables du rejet du traitement et de développer une stratégie pour moduler cette réponse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les cellules immunitaires responsables du rejet du transgène et de développer une stratégie dans le but de prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur. In fine, ce projet permettra de développer des traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr, plus sûrs et plus efficaces.

Procédures

Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 10 semaines pour les animaux inclus dans la caractérisation de la réponse immunitaire et 14 semaines pour ceux inclus dans la stratégie d’immunomodulation. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale en vigile. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 3 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide à J+1, J+2, J+3 après l’injection en intraveineuse du vecteur. Une injection en intra-péritonéale se fait en moins d’une minute. Des injections en intra-péritonéale d’interleukine-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 10 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la stratégie d’immunomodulation anti-CD45RC, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse (isoflurane : induction 5% puis 2%)

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins, les animaux seront sous anesthésies gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin due à la pénétration de l’aiguille. Pour les injections en intraveineuse et en Intra péritonéale, les souris seront maintenues en contention pour effectuer l’administration. Les animaux ressentiront une légère douleur au point d’administration due à la pénétration de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de développer un modèle pertinent mimant cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.

Réduction

Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains par stratégie . Au maximum, 440 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.

Raffinement

Le bien-être animal passera par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autres alternatives). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Dans les études de thérapie génique et d’immunologie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, en particulier des mammifères, afin d’obtenir des résultats pertinents pour l’humain. La souris est très utilisée, notamment parce qu’il existe des modèles dits « humanisés » qui reproduisent en partie le système immunitaire humain. De plus, il est facile de constituer des groupes suffisamment nombreux pour réaliser des analyses statistiques fiables. Ce modèle est particulièrement adapté au transfert de cellules humaines (appelé transfert adoptif), car ces cellules peuvent survivre et fonctionner correctement chez la souris. Cependant, pour que ces cellules reconnaissent correctement leur environnement, il est indispensable que la souris exprime une molécule spécifique du système immunitaire humain : HLA-A2.1. En effet, les cellules humaines utilisées sont capables de reconnaître uniquement cet allèle. Enfin, comme une réponse immunitaire préexistante contre les vecteurs AAV a déjà été démontrée dans ce modèle de souris NSG HLA-A2, celui-ci est particulièrement pertinent pour tester et développer de nouvelles stratégies visant à moduler ou contrôler la réponse immunitaire. Les souris seront injectées entre 8 et 14 semaines d’âge. A ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie des cellules adoptives transférées sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.