Procédures modérées

Les souris sont mises à mort dès l'apparition des signes tumoraux, "avant leur mort naturelle", après irradiation, injections répétées et prélèvements sanguins. 828 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever organes et cellules. Le modèle vise à reproduire un lymphome agressif, le lymphome diffus à grandes cellules B, et à tester de nouvelles thérapies. L'effectif de 828 animaux repose sur la gestion externe de l'élevage et des "statistiques prédictives", sans calcul de puissance détaillé dans le résumé.

Objectifs

Le lymphome est le cancer du sang le plus fréquent et le sixième cancer le plus fréquent au monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B repose sur la chimiothérapie ou la greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (rechute) ou n’y répondent pas (maladie réfractaire), ce qui a généralement des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèles expérimentaux reproduisant fidèlement le lymphome diffus à grandes cellules B. L’objectif de ce projet est de générer des lymphomes à l’aide d’un nouveau modèle murin permettant de suivre l’initiation et la progression de la maladie. Ce modèle nous permettra d’étudier les causes du développement du lymphome et sera également utilisé pour des applications précliniques, notamment pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies contre ces lymphomes agressifs.

Bénéfices attendus

Nous allons générer des informations importantes sur les gènes et les voies de signalisation impliquées dans l'apparition et la progression du lymphome diffus à grandes cellules B, actuellement inconnus. De plus, ces modèles nous permettront de réaliser des études précliniques, afin d'identifier de nouvelles façons d'activer et de stimuler le système immunitaire de l'hôte, et de tester de nouvelles thérapies afin d'améliorer les traitements contre les cancers du sang.

Procédures

Les souris qui développeront des lymphomes seront suivies. Elles seront manipulées deux fois par semaine pour être pesées et observer les signes de formation tumorale : perte de poids, diminution de l’activité, posture voûtée, pelage ébouriffé, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Des prélèvements tissulaires seront effectués afin de déterminer les causes de la formation tumorale et de constituer une biobanque. Certaines souris recevront une injection d’une minute pour être immunisées (toutes les 3 semaines, jusqu’à 8 injections). Certaines souris subiront une déplétion de la moelle osseuse par irradiation une seule fois, ce qui peut engendrer une détresse et une agitation. Ils recevront ensuite une injection d'une minute pour transférer des cellules de moelle osseuse, et une prise de sang sera effectuée 3 et 6 semaines plus tard pour vérifier la reconstitution de la moelle osseuse. Et certaines souris recevront le traitement par injection ou par voie orale quotidiennement pendant 4 semaines maximum. Des prélèvements sanguins seront effectués sur les souris au début et à la fin du traitement afin d'analyser leur numération sanguine. Types d’interventions : - Contentions pour pesées et mesures : durée = 5 secondes / nombre = 30 max - Administration par gavage sur animal vigile : durée = 1 minute / nombre = 20 max - Administration par injection sur animal vigile : durée = 30 secondes / nombre = 28 max - Prélèvement sanguin : durée = 1 minute / nombre = 4 - Irradiation : durée 10min / nombre = 1

Impact sur les animaux

Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou mouvements lents. De plus, la manipulation des souris lors de la surveillance, de l’irradiation ou des injections peut induire du stress. Une inflammation peut également survenir au point d’injection. Les injections et les prélèvements sanguins provoquent aussi du stress et une légère douleur passagère.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des cellules pour leur étude ultérieure.

Remplacement

Compte tenu de la complexité du processus impliqué dans la formation des lymphomes, résoudre ce problème uniquement par l’analyse in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est essentielle. Par conséquent, pour l’instant, aucune méthode alternative ne permet de remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expérimentations permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux.

Réduction

L'élevage sera géré en externe, et nous permettra de limiter le nombre de croisements au minimum afin d'obtenir le bon nombre de souris nécessaire à ce projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles puisque le lymphome affecte les deux sexes. Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes. De plus, les cellules tumorales excédentaires récoltées sur des souris mises à mort seront congelées pour créer une banque de tumeurs, afin de minimiser le nombre de souris nécessaires pour fournir du matériel pour de futures expériences.

Raffinement

Nous avons établi une grille d'évaluation avec des seuils précoces adaptés pour détecter les lymphomes suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant une rigueur scientifique. Cela comprend une surveillance accrue lors de l'observation de changements de poids, de mouvements, d'apparence physique et de comportement ; et arrêter l'expérience lorsque les symptômes du lymphome apparaissent. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone. Et si les souris présentent des signes de détresse suite à toute intervention, nous renforcerons la surveillance.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules malignes et pré-malignes dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Pour les expériences de développement du lymphome, les souris seront âgées jusqu'à l'âge de 8 mois, correspondant à la période de latence de cette maladie d'après nos études précédentes. Pour les expériences de transfert cellulaire, des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines sont utilisées comme souris receveuses.

7 moutons vont être utilisés, tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux opérations cardiaques, l'une de quatre heures pour créer un modèle de fibrillation atriale, l'autre jusqu'à six heures pour déclencher le trouble et l'analyser. Les organes sont ensuite prélevés et mis en commun pour d'autres études du laboratoire. Le porteur annonce, si les résultats sont concluants, une première étude clinique au bout de deux ans, bénéfice suspendu à cette condition face aux dix heures de chirurgie subies par chaque mouton.

Objectifs

La fibrillation atriale est un trouble du rythme cardiaque fréquent (battements cardiaques rapides, désorganisés et irréguliers) pouvant entraîner des palpitations, de la fatigue et augmenter le risque de complications (ex : accident vasculaire cérébral). La présente étude animale vise à déterminer si les cellules cardiaques malades (ou zones de conduction anormale) sont associées à une hausse de la fibrillation atriale persistante. Et également, de montrer que l'élimination de ces cellules permet de réduire le risque de développer de la fibrillation atriale. In fine, les zones de conduction anormale pourraient correspondre à des cibles potentielles d’ablation en dehors des veines pulmonaires chez les patients présentant de la fibrillation atriale et ainsi améliorer significativement leur prise en charge et le traitement de la maladie.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de permettre de valider l’importance du traitement des « zones malades » dans le cœur pour permettre à moyen terme un meilleur traitement des problèmes d’arythmie cardiaque chez les patients pris en charge. Si les résultats de l’étude sont concluants, ils pourraient faire l’objet d’une première campagne d’étude clinique à la fin du projet (2 ans).

Procédures

Les animaux inclus auront deux opérations chirurgicales, une première pour la création du modèle de fibrillation atriale d’une durée de 4 heures maximum et une seconde pour induire la fibrillation et faire les analyses, d’une durée de maximale de 6 heures.

Impact sur les animaux

Effets fréquents, de sévérité légère à modérée : Somnolence, confusion ou agitation au réveil, Diminution transitoire de l’activité et de l’appétit, Hypothermie liée à l’opération, Récupération lente ou incoordination, Douleur post-opératoire Effets rares, potentiellement modérés à sévères : Complications respiratoires (trouble respiratoire, hypoventilation, obstruction au réveil), Complications cardiovasculaires (hypotension, arythmies), Régurgitation avec risque d’aspiration, Troubles métaboliques (perturbations de la glycémie), Complications liées à l’intubation ou à la position (lésions de pression, irritation des voies aériennes).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour des analyses post-mortem. Les organes et tissus prélevés seront mis en commun et utilisés pour différentes études internes du laboratoire.

Remplacement

Le but de l’étude étant de démontrer la faisabilité et l’efficacité de ce traitement chez l’homme. le modèle animal est nécessaire pour valider nos hypothèses et en cas de résultat positif nous permettre de lancer une étude clinique. Nous ne pouvons malheureusement pas valider ce concept par une simulation ou des analyses statistiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini à partir des données de la littérature et du design expérimental. Ce protocole permet de maximiser les données obtenues par animal (électrophysiologie, histologie et imagerie), limitant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Dès la phase d’acclimatation, une habituation à l’EU est mise en place avant le début de l’étude, avec des manipulations régulières des animaux afin de les familiariser à la présence humaine et de réduire leur stress. Lors des phases expérimentales, les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie appropriée avec une ventilation mécanique et une surveillance. Si l’état de l’animal le nécessite, les responsables de projet et/ou les vétérinaires pourront intervenir pour adapter les soins analgésiques. Si un point limite est atteint, l’animal fera l’objet d’une évaluation clinique et des mesures correctives adaptées seront mises en place (soins, traitement analgésique,...). Si l’état de l’animal ne s’améliore pas et ne permet pas un retour à son état basal malgré ces mesures ou si une souffrance persistante est observée, une décision d’euthanasie pourra être prise afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Les Ovins sont moins susceptibles de présenter une fibrillation ventriculaire lors des manipulations cardiaques par rapport au modèle porcin. En outre, le modèle ovin se prête parfaitement à la création de lésions chroniques, comme cela a déjà été montré dans des travaux scientifiques publiés. 12 mois d’âge : robustesse des animaux à cet âge, uniformité et contrôle des données, physiologie et anatomie proches de l'Homme notamment en terme de taille et poids des organes, réduction de la variabilité biologique liée à la maturation ce qui facilite les comparaisons et l'interprétation des résultats.

Tuées pour extraire les émetteurs implantés et les renvoyer au fournisseur, 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque souris reçoit un émetteur miniaturisé mesurant l'activité cérébrale, et certaines développent une forme de narcolepsie avant de recevoir des traitements par voie orale. Hébergées seules pour éviter qu'elles n'abîment les implants, elles servent à évaluer de nouveaux candidats médicaments agissant sur le système nerveux. Le porteur annonce ces données comme "indispensables" avant un éventuel passage en clinique, bénéfice renvoyé au long terme.

Objectifs

L'électroencéphalographie (EEG), technique permettant de mesurer l’activité électrique du cerveau, s'est très largement répandue au sein des laboratoires pour différencier précisément les effets des molécules actives sur le système nerveux et aider ainsi à leur classification thérapeutique (hypnotiques, sédatifs, tranquilisants, psychotropes, anti-épileptiques...). Vers les années 2000, la technique a fortement évolué avec l'apparition d’émetteurs miniaturisés implantables (télémétrie), permettant de mesurer, chez la souris et sans contrainte filaire, les activités électriques cérébrales et musculaires, la température corporelle, l’activité motrice ; soit en condition basale, soit en réactivité à des stimulations. Ainsi, en étudiant les modifications des signaux EEG, il est possible d’en déduire l’état de vigilance de l’animal : par exemple, en éveil (actif / passif) ou endormi (sommeils léger / profond / rêves). Ce projet vise à poursuivre nos travaux de recherches en évaluant les effets de nouveaux candidats médicaments sur les enregistrements EEG/Température/Activité, chez la souris normale ou développant des pathologies proches de certaines pathologies humaines rares altérant la vigilance comme la narcolepsie à l'origine d'endormissements anormaux arrivant alors que la personne est active durant sa journée. Bien qu’il soit nécessaire d’individualiser les souris, la télémétrie permet de réaliser ces mesures, à distance, sans présence humaine, sur des animaux non contraints et gardés dans leur environnement d’hébergement, limitant ainsi les facteurs de stress et d’anxiété liés aux manipulations expérimentales.

Bénéfices attendus

En comparaison aux effets connus sur l'activité cérébrale chez la souris de produits déjà commercialisés, ce projet permettra d’évaluer de nouvelles molécules issues de la recherche agissant sur le Système Nerveux Central. Dans le cadre d’une évaluation sur la souris narcoleptique, ce projet permettra d'évaluer la capacité des composés à diminuer la survenue des épisodes de somnolence. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques indispensables au processus de recherche de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de développement d’un candidat pour des tests cliniques réalisés chez l'homme.

Procédures

Jeunes adultes, sous anesthésie générale, les animaux recevront un émetteur miniaturisé pour enregistrer le fonctionnement du cerveau selon les méthodes établies pour l'espèce. Certains animaux développeront en grandissant une pathologie proche de la pathologie humaine – envie de dormir, apparition de rêves pendant leur activité, perte de tonus, parfois obésité - dont les symptômes seront évalués et potentiellement diminués par les traitements (donnés oralement, de façon aigue, à une fréquence d'une administration tous les 3 à 4 jours et une semaine sans traitement chaque mois). L'expérience nous a montré qu'il était préférable que les animaux restent hébergés individuellement pour limiter l'agressivité entre eux.

Impact sur les animaux

A réception dans nos locaux, les nuisances attendues sur les animaux soumis à ce projet seront les nuisances liées au développement spontané de la pathologie pour les souris narcoleptiques, les problèmes potentiels de tolérance aux produits qui seront administrés (amertume, acidité, fréquence et répétition des traitements), le stress lié à l'individualisation de l'hébergement ou encore celui provoqué lors de la manipulation des cages, la contention puis l'administration orale des produits.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour extraire les télémètres et les retourner chez le fournisseur en vue de leur reconditionnemnt pour réutilisation.

Remplacement

L'étude des mécanismes impliqués lors des phases d'éveil/sommeil et les transitions anormales d’un état vers un autre ne peut se faire que sur des animaux vivants et ayant développé la pathologie étudiée. A ce jour, la littérature ne fournit pas de méthode alternative suffisamment développée pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Au départ, une cohorte implantée comprend un effectif maximum de 18 animaux opérés. Environ 4-5 semaines après la chirurgie, les effets de nombreux composés à différentes doses pourront être étudiés sur une durée maximale de 12 mois. Ce nombre d'animaux permet par ailleurs d'obtenir des tests statistiques robustes. Les produits testés seront comparés entre eux et aux mêmes références pour limiter le nombre d’expériences. La détection des vigilances est entièrement automatisée pour gagner en rapidité d’analyse et supprimer toute subjectivité de l’opérateur quant aux résultats obtenus.

Raffinement

Les animaux sont hébergés individuellement en cage ouverte dans une pièce qui leur est dédiée (avec température et hygrométrie contrôlées). Hors période d’acquisition et pour réduire le stress de l’individualisation, les cages sont rapprochées les unes des autres sur le portoir afin de favoriser les contacts olfactifs et visuels entre individus. Après livraison dans nos locaux, une période de quelques semaines d'acclimatation est prévue pour s’assurer de la reprise d’un cycle éveil/sommeil régulier avant toute expérimentation ; durant cette phase, les souris sont aussi habituées à être manipulées fréquemment par l’expérimentateur chargé des traitements. Tout au long de l’étude, les animaux disposent d'un milieu fortement enrichi (tunnel suspendu ou pas, igloo surmonté d’une roue d’activité, bûchette en bois, lambeaux de papier absorbant, croquettes au sol avec quelques graines de tournesol, papier ciselé pour constituer leur nid) avec accès libre à l'eau et à la nourriture. Cet environnement n’est renouvelé en totalité qu’une fois tous les 15 jours pour limiter le stress lié aux changements trop répétés. Les animaux sont observés tous les jours (week-end compris) et leur poids est suivi au moins une fois par semaine. Une fiche de contrôle du bien-être animal est renseignée de façon hebdomadaire. Les membres de la structure bien-être animal effectuent de leur côté une observation mensuelle de tous les animaux sur site et leur avis quant au statut sanitaire et le devenir d’un animal sera considéré comme prioritaire au choix scientifique de l’expérimentateur. En cas de nécessité d'une administration de deux composés, ils seront d’abord mélangés entre eux pour n’être donnés qu’une seule fois, tout en conservant un même volume d’administration.

Choix des espèces

Il est scientifiquement reconnu que les effets des molécules agissant sur l’activité cérébrale recueillis chez la souris sont pertinents par rapport à ceux décrits chez l’homme et que les enregistrements des paramètres dans cette espèce sont robustes et fiables. D’autre part, les modèles transgéniques développés chez la souris sont particulièrement proches de la pathologie humaine. La pertinence de l’espèce souris s’applique aussi quant à la quantité de produit nécessaire à synthétiser. Les animaux sont utilisés au stade de jeunes adultes.

Pour mettre au point une imagerie de longue durée des tumeurs chez le poisson zèbre adulte, 70 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Porteurs de mélanomes sur la tête, le dos ou le flanc, ils sont anesthésiés, immobilisés dans l'agarose et intubés jusqu'à 24 heures d'affilée pour l'observation au microscope. Le porteur indique surveiller des signes de mal-être liés aux tumeurs, nage modifiée, respiration accélérée ou apathie, et appliquer des points limites précoces. Tous sont tués à l'issue, le résumé précisant que des animaux susceptibles de développer des tumeurs "ne peuvent être replacés ou adoptés".

Objectifs

Le cancer est la première cause de mortalité en France. Malgré des progrès thérapeutiques importants au cours des 20 dernières années, le taux de survie à 5 ans des patients atteints de tumeurs solides agressives, comme le mélanome, demeure faible. Une compréhension approfondie des mécanismes de progression tumorale est nécessaire pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'implication du microenvironnement tumoral, c’est-à-dire tout ce qui entoure les cellules cancéreuses au sein de la tumeur, est de plus en plus reconnu comme un acteur essentiel de la progression. L'interaction dynamique entre les cellules tumorales et des cellules saines voisines comme les cellules des vaisseaux sanguins, est très importante pour la croissance, l'invasion locale et la dissémination des cellules tumorales. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle qui reproduise suffisamment fidèlement les vaisseaux sanguins en 3D pour visualiser leurs interactions avec les cellules tumorales en dehors d’un animal. Le poisson zèbre est un modèle vertébré fiable pour étudier le développement du mélanome car il reproduit l'environnement des tumeurs humaines. De plus, des lignées fluorescentes permettent de marquer certaines cellules saines présentes dans les tumeurs, comme les vaisseaux sanguins. Cependant, à l’heure actuelle, peu de laboratoires dans le monde ont développé des protocoles d’imagerie en temps réel dans des poissons zèbres adultes. L’objectif de ce projet est de mettre au point un protocole d’imagerie de longue durée par microscopie dans des tumeurs primaires chez des poissons zèbres adultes possédant des vaisseaux sanguins fluorescents, permettant ainsi l’observation en temps réel des interactions entre cellules tumorales et cellules des vaisseaux dans leur environnement naturel.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre d’établir une base technique robuste pour documenter les interactions dynamiques entre les cellules tumorales et les cellules saines voisines, en temps réel et dans un organisme vivant, révélant ainsi des informations uniques sur les mécanismes de développement des cancers. Une meilleure compréhension de ces interactions pourrait mener à la conception de nouvelles stratégies de lutte contre les cancers et au développement de traitements innovants.

Procédures

Les poissons seront mis à jeun pendant les 4 heures précédant la procédure puis pendant toute la durée de la procédure (24h maximum). Lors de l’optimisation de l’anesthésie de longue durée, les poissons seront anesthésiés, immobilisés avec de l’agarose dans une chambre spécialement conçue et imprimée en 3D et recevront en continu de l’eau contenant de l’anesthésique et de l’oxygène dissous par un tube placé dans leur bouche pendant une période allant jusqu’à 24 heures. Pour l’optimisation de l’imagerie en temps réel dans des mélanomes primaires, des poissons zèbres adultes développant des tumeurs sur la tête, le dos ou le flanc seront sélectionnés un par un, anesthésiés, immobilisés, intubés et imagés pendant une période allant jusqu’à 24 heures. Après optimisation de tous les paramètres, un groupe de poissons portant des tumeurs sur la tête, le dos ou le flanc sera imagé suivant le protocole établi puis réveillé pour s’assurer que la procédure n’entraine pas de dommages aux poissons. Ils seront surveillés pendant une semaine. A l’issue des procédures, les poissons seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les poissons seront mis à jeun pendant les 4 heures précédant la procédure puis pendant toute la durée de la procédure (24h maximum), ce qui pourrait leur causer un léger stress. La manipulation des poissons en vue de leur anesthésie peut induire un stress supplémentaire. La mise en place de la tubulure pourrait causer des dommages au niveau de la bouche du poisson. D’éventuels effets négatifs de l’illumination laser au cours de l’imagerie pourraient se traduire par une dégradation de la morphologie des cellules ou de l’organisation du tissu. Certains animaux peuvent présenter lors des observations hebdomadaires des signes de stress ou de mal-être dus au développement de tumeurs. Les signes les plus précoces et les plus légers comprennent des modifications de la nage, une respiration accélérée passagère ou une apathie. L’anesthésie de longue durée pourrait entrainer une oxygénation insuffisante des organes et une diminution du tonus musculaire. Ces effets indésirables se manifesteraient après le réveil par une respiration accélérée prolongée ou une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d’eau.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, les animaux susceptibles de développer des tumeurs ne peuvent être replacés ou adoptés.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet, car il n’existe actuellement aucun modèle in vitro permettant d’étudier, sur de longues périodes et dans un contexte physiologiquement pertinent, les interactions dynamiques entre les cellules cancéreuses et les cellules de leur microenvironnement tumoral. Des systèmes de culture complexes en 3D tels que des modèles de peau humaine reconstruite, dans lesquels sont co-cultivés cellules cancéreuses et différents types cellulaires du microenvironnement tumoral, pourraient permettre certaines analyses mécanistiques ; cependant, ils ne peuvent à l’heure actuelle reproduire la complexité chimique, biologique et physique d’un organisme vivant pour étudier le comportement des cellules dans un environnement physiologique.

Réduction

L’imagerie en temps réel permet d'observer des phénomènes localisés et furtifs tels que l'interaction entre une cellule tumorale et une cellule des vaisseaux sanguins dont la détection par simple dissection nécessiterait un nombre extrêmement élevé d'animaux. Ainsi, ce projet participe à la réduction du nombre d'animaux à utiliser pour pouvoir répondre à la question biologique du rôle des interactions dynamiques entre cellules dans le développement des cancers. Il est possible que l’optimisation de chaque paramètre nécessite moins de poissons que prévu. De plus, si l’optimisation des paramètres d’imagerie requiert moins de 10 poissons portant des tumeurs, les poissons suivants seront utilisés pour la validation finale du protocole. Afin de réduire le nombre de poissons utilisés, le protocole d’imagerie sera optimisé en utilisant un seul type de mélanome et une seule lignée de poissons présentant des vaisseaux sanguins fluorescents.

Raffinement

Le mal-être éventuel associé au développement de tumeurs peut être prévenu par une surveillance attentive des animaux et l’application de points limites définis suffisamment précoces, facilités par notre connaissance du modèle. L’utilisation de poissons transparents permet de détecter plus tôt l’apparition des tumeurs par inspection visuelle. De plus, la microscopie ne permettant d'observer qu'une minuscule épaisseur de tissu, nous pourrons utiliser des tumeurs de très petite taille, ce qui préviendra toute souffrance éventuelle liée au développement des tumeurs. La mise à jeun pendant les 4 heures précédant l’immobilisation permettra d’éviter les déjections et une éventuelle régurgitation et d’augmenter le confort du poisson. Le stress éventuel de l’immobilisation, du positionnement de la tubulure, puis de l’imagerie sera réduit par le recours à une anesthésie générale ajustée tout au long de la procédure. La solution anesthésique sera oxygénée en permanence à l’aide d’une pierre à air, maintenue à une température de 28 degrés et remplacée toutes les 4 heures pour garder le poisson dans ses conditions de confort. Dans un souci de raffinement, des petits crustacés seront données aux poissons une fois par jour en plus de leur régime alimentaire normal pour préserver leurs instincts prédateurs, enrichir leur milieu et répartir la nourriture dans toute la colonne d’eau.

Choix des espèces

Le poisson zèbre représente un organisme modèle particulièrement adapté aux manipulations génétiques et à l’imagerie pour l’étude du cancer. Les gènes impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'homme et le poisson et il existe de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines dans les poissons adultes. C’est ainsi qu’ont été générés des modèles très fiables de mélanome dans le poisson zèbre. De plus, plusieurs lignées avec différents types cellulaires marqués par fluorescence sont disponibles ce qui rend possible l'imagerie en temps réel. Des espèces d'animaux invertébrés pourraient être envisagées mais leurs organes diffèrent considérablement de ceux de l’homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique et parce qu’il présente des capacités inégalées pour l’imagerie en temps réel. Dans ce projet, les poissons seront utilisés du stade une cellule pour microinjection (hors DAP) jusqu'à l'imagerie sur l'adulte qui sera réalisée entre 12 et 52 semaines en fonction de la vitesse d'apparition des tumeurs.

Une restriction alimentaire maintenant le poids à 90 % de la normale, une immobilisation de la tête et des chirurgies cérébrales de deux à quatre heures avec implant de fibre optique : 288 rats Long Evans vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ces gestes visent à cartographier la "boussole neuronale" qui indique la direction de la tête et à en tester le rôle dans une tâche de navigation. Les retombées médicales évoquées, rééducation ou prothèses vestibulaires pour les personnes âgées, restent hypothétiques et lointaines. Le porteur présente le rat Long Evans comme l'"expert de la navigation" reconnu partout, argument qui tient surtout aux décennies de travaux déjà accumulés sur cette souche.

Objectifs

Pour nous orienter dans l’espace, notre cerveau doit savoir en permanence dans quelle direction notre tête est tournée. De nombreux animaux, et en particulier les mammifères, possèdent ainsi une « boussole neuronale » localisée dans la partie antérieure du cerveau. Cette boussole est tenue informée des changements d’orientation de notre tête grâce aux détecteurs de mouvements de l’oreille interne, appelés organes vestibulaires, et qui sont classiquement associés au contrôle de l’équilibre. Notre objectif est de comprendre comment ces signaux sont utilisés pour synchroniser notre boussole neuronale avec les mouvements de notre tête. Ce projet comporte trois étapes : 1) Cartographier les connexions neuronales au sein du circuit reliant les organes vestibulaires et la boussole neuronale. 2) Observer comment les neurones de ce circuit s'activent en temps réel lorsque l'animal bouge la tête. 3) Tester le rôle de ce circuit en modifiant son activité chez des animaux réalisant une tâche de navigation spatiale.

Bénéfices attendus

En permettant de mieux comprendre comment les informations vestibulaires (relatives aux mouvements de la tête) sont utilisées par le cerveau pour s’orienter dans l’espace, les résultats de ce projet pourraient inspirer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de déficits vestibulaires et de troubles de l’orientation, en particulier chez les personnes âgées. Par exemple, la présbyvestibulopathie, un syndrome vestibulaire lié au vieillissement, affecte 20 à 30 % des plus de 65 ans et plus de 50 % des plus de 80 ans. Elle se caractérise notamment par une altération des capacités cognitives spatiales, entraînant une perte d’autonomie. Une meilleure compréhension des mécanismes neuronaux sous-jacents pourrait conduire à des protocoles de rééducation plus ciblés ou à l’élaboration de prothèses vestibulaires adaptées. Les mécanismes identifiés pourraient également éclairer d’autres pathologies affectant l’orientation spatiale, comme la maladie d’Alzheimer, où les troubles de la navigation sont précoces et invalidants. D’autre part, Les mécanismes neuronaux identifiés dans le cadre de notre étude pourraient servir de modèle pour concevoir des algorithmes neuro-inspirés d’estimation de l’orientation. Ces algorithmes pourraient potentiellement améliorer la précision et la robustesse des systèmes robotiques autonomes ou des dispositifs d’assistance pour les personnes atteintes de troubles vestibulaires.

Procédures

HABITUATION AU CONTACT HUMAIN. Une partie des animaux (nombre : 228) va être habitué au contact humain pendant une semaine (quelques minutes, 2x/jour), préalablement à toute autre manipulation. CHIRURGIE. L’ensemble des animaux du projet (nombre : 288) va subir une intervention chirurgicale de quelques heures (entre 2 et 4 h) visant à injecter un vecteur viral dans le cerveau et, dans certains animaux (nombre: 228), à y implanter une fibre optique de petite taille (diamètre : 0,2 mm). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale avec couverture analgésique péri-opératoire. Au cours de cette procédure chirurgicale, les animaux recevront les injections sous-cutanées suivantes: 1) buprénorphine (analgésie péri-opératoire), 2) lidocaine (analgésie locale du point d'incision) et 3) sérum physiologique (réhydratation). IMMOBILISATION. Une partie des animaux (nombre : 108) subira une contention du corps et une immobilisation de la tête, au cours d’un protocole d’habituation, puis pendant la phase d’acquisition des données. Habituation : contention du corps uniquement (30 s à 2 min, 2x/jour pendant 4 jours), puis contention du corps et immobilisation de la tête (2 à 5 min, 2x/jour pendant 8 jours). Acquisition des données : une session de contention/immobilisation par jour (5 min) pendant 10 jours. Au cours de cette phase d’acquisition des données, 54 animaux subiront des mouvements imposés (rotations, translations) pendant la phase de contention/immobilisation. TÂCHE DE NAVIGATION SPATIALE. Pendant 4 à 5 semaines, une partie des animaux (nombre : 120) réalisera quotidiennement une tâche de navigation spatiale consistant à rechercher de la nourriture sur une table de 1,80 m de diamètre puis à retourner dans un refuge pour la consommer. Pendant cette période, les animaux seront en restriction alimentaire afin de maintenir leur poids à 90% de sa valeur normale.

Impact sur les animaux

NUISANCES ASSOCIÉES À LA CHIRURGIE (288 animaux au maximum) : 1) au réveil, hypothermie, difficulté à se nourrir et à boire, 2) en post-opératoire, douleur modérée. CONTENTION DU CORPS ET IMMOBILISATION DE LA TÊTE (108 animaux au maximum) : la contention du corps (dans un linge) et l'immobilisation de la tête peuvent induire un stress aigu chez les animaux. RESTRICTION ALIMENTAIRE (120 animaux au maximum) : stress métabolique chronique modéré.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser une analyse approfondie de l'anatomie des circuits neuronaux étudiés, ainsi que pour valider le placement d'une fibre optique de tout petit diamètre (0,2 mm), implantée pendant la chirurgie et utilisée pour les expériences de mesures et de perturbations de l'activité neuronale.

Remplacement

Pour comprendre comment un être vivant s'oriente, il faut pouvoir observer son cerveau pendant qu'il agit. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de reproduire cette complexité. IMPORTANCE DU COMPORTEMENT : L'orientation spatiale est un processus qui dépend de ce que l'animal voit et ressent en bougeant. On ne peut pas étudier cette « boussole interne » sur des cellules isolées ou des tissus qui ne sont plus connectés aux sens (comme la vue ou l'équilibre). LIMITES DE L’INFORMATIQUE : Les simulations par ordinateur sont d'excellents outils pour tester des théories ou prédire des résultats. Cependant, elles ne peuvent pas remplacer la réalité biologique : elles servent à accompagner l'expérience, mais ne peuvent pas s'y substituer. DES MODÈLES DE SUBSTITUTION ENCORE TROP SIMPLES : Les cultures de cellules ou les « mini-cerveaux » (organoïdes) sont très utiles pour d'autres recherches, mais ils n'ont pas la structure complexe d'un cerveau adulte. En effet le cerveau d'un rat adulte a été « sculpté » par ses expériences et ses apprentissages. Cette maturité et cette organisation globale sont indispensables pour comprendre comment les signaux de mouvement sont traités, ce que les modèles de laboratoire ne savent pas encore reproduire. En résumé, pour comprendre une fonction aussi complexe que la navigation dans l'espace, l'observation d'un cerveau complet et actif reste actuellement la seule solution viable.

Réduction

Pour obtenir des résultats fiables tout en utilisant le plus petit nombre d'animaux possible, nous appliquons plusieurs stratégies de réduction. 1) Pour optimiser le rendement de la chirurgie, c'est à dire maximiser la proportion d'animaux avec un ciblage correct des structures cérébrales étudiées, un appareil stéréotaxique de haute précision sera utilisé. Les animaux dont le ciblage est erroné serviront de contrôles anatomiques, validant par contraste la spécificité fonctionnelle des noyaux visés. 2) Les cerveaux des procédures 2 et 3, exprimant des marqueurs fluorescents, viendront compléter les observations anatomiques réalisées dans la procédure 1, réduisant ainsi la pression sur le nombre d’animaux dans cette procédure. 3) Nos protocoles d’habituation et d’apprentissage sont optimisés pour obtenir un taux de réussite de 100 % pour les objectifs des procédure 2 et 3. 4) Si le rendement chirurgical est au-dessus des attendus expérimentaux et/ou si la significativité statistique des effets mesurés est atteinte plus tôt (analyse au fil de l’eau), les effectifs seront revus à la baisse.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont prévues à chaque étape des procédures. HABITUATION AU CONTACT HUMAIN. Les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur pour s'habituer au contact humain. Cette étape d'apprivoisement réduit considérablement leur stress lors des futures manipulations. UNE VIE SOCIALE PRÉSERVÉE. Les rats sont des animaux sociaux et supportent mal l’isolement. Pour pouvoir héberger les animaux par deux, nous utilisons des implants crânien ultra-résistants, garantissant leur durabilité malgré les tentatives de grignottage du congénère. Les cages sont également enrichies avec des tunnels, du coton et du carton pour stimuler le jeu et l’exploration. GESTION RIGOUREUSE DE LA DOULEUR. Toutes les interventions chirurgicales se font sous anesthésie avec une prise en charge systématique de la douleur (analgésiques). Un suivi très étroit est assuré durant la récupération, et des doses supplémentaires de médicaments sont prévues au moindre signe d'inconfort. APPRENTISSAGE EN DOUCEUR ET PAR LA RÉCOMPENSE. L'habituation à l’immobilisation se fait de manière très progressive. Pour encourager les animaux, nous utilisons un renforcement positif sous forme d'eau sucrée. La réduction alimentaire est légère et progressive. Elle vise à motiver l'animal à rechercher de la nourriture pendant la tâche de navigation spatiale. Les rats conservent un poids proche de la normale (au moins 90 % de leur poids normal) et reçoivent des briquettes de bois à ronger pour prendre soin de leurs incisives malgré une prise alimentaire réduite.

Choix des espèces

Le rat, et particulièrement la souche Long Evans, est considéré par les scientifiques du monde entier comme l'expert de la navigation. C'est un animal naturellement curieux, explorateur et doté d'excellentes capacités d'apprentissage. En travaillant avec ce modèle, nous pouvons comparer nos découvertes avec des décennies de recherches déjà accumulées sur sa « boussole interne ». Le cerveau du rat est suffisamment grand pour permettre le ciblage des petites structures cérébrales (souvent moins de 1 mm) étudiées dans ce projet. Pour observer le cerveau en action pendant que le rat se déplace, l'animal doit porter un petit dispositif de mesure sur sa tête. Le rat est assez robuste pour porter l'équipement de 10 à 12 g prévu dans ce projet, sans aucune gêne pour ses mouvements ou son confort. Les animaux arrivent à l'animalerie à l'âge de 8 ou 9 semaines, ce qui correspond au stade de jeune adulte. Nous attendons qu'ils atteignent 10 semaines pour l'intervention chirurgicale car, à cet âge, leur crâne a quasiment fini sa croissance. Cela assure une stabilité parfaite des implants sur le long terme et une sécurité maximale pour l'animal.

Toutes tuées pour prélever leur tissu nerveux à plusieurs stades de la maladie, 1 095 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces souris porteuses d'une mutation liée à l'ataxie de Friedreich subissent des chirurgies cérébrales de 45 minutes à 3 heures, pose de fenêtre crânienne ou injections virales, puis des séances d'imagerie tête immobilisée de 30 à 45 minutes et des tests de coordination motrice, de marche et de force. Le projet prolonge un travail antérieur sur le même modèle et vise à explorer les circuits cérébelleux et à tester des thérapies géniques. Le porteur qualifie d'"indispensable" le suivi des protéines d'intérêt à plusieurs temps, ce qui justifie la mise à mort échelonnée des animaux.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative rare et héréditaire qui provoque une perte progressive de la coordination motrice. Elle est causée par une perte de fonction de la frataxine, protéine clé du métabolisme du fer mitochondrial. Récemment, un nouveau modèle murin porteur d’une mutation ponctuelle dans le gène FXN (Fxn G127V KI/KI) a été généré (Fil et al., 2020). Cette mutation ayant été identifiée pour la première fois chez des patients atteints d’AF, ce modèle représente un outil préclinique particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes pathologiques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, nous visons à caractériser de manière approfondie les altérations du circuit cérébelleux aux stades pré-symptomatique et symptomatique, en utilisant l’imagerie in vivo. Cette approche constitue le seul moyen d’évaluer dynamiquement l’activité neuronale en tenant compte des interactions synaptiques, mais également d’explorer la fonction mitochondriale et les interactions neurones–glie au sein du cortex cérébelleux. Sur la base de ces données, nous mettrons en place des stratégies de modulation du circuit cérébelleux par des approches chimiogénétiques et de thérapie génique ciblée, afin d’évaluer leur potentiel pour restaurer les déficits comportementaux. Enfin, l’étude des modifications moléculaires associées permettra d’identifier des mécanismes d’intérêt pour le développement de futures thérapies chez les patients atteints d’AF. Ce projet prolonge et complète le projet déjà approuvé consacré à la première caractérisation du modèle G127V KI/KI, en apportant une analyse plus fine des dysfonctionnements mitochondriaux, des interactions cellulaires et des altérations des circuits cérébelleux. ous chercherons à comprendre comment l’activité et le métabolisme des neurones et des cellules gliales fonctionnent à la fois chez les animaux contrôles et G127V. L’accent sera mis sur les interactions neurones–glie et sur le partage de voies métaboliques essentielles, dont la perturbation pourrait contribuer aux dysfonctionnements observés dans l’AF. Les approches de modulation et de protéomique offriront l’opportunité d’identifier les voies clés nécessaires au maintien de l’activité neuronale, de l’homéostasie gliale et d’un état métabolique correct, et permettront de mieux comprendre les altérations propres à l’AF.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à caractériser l’activité neuronale et gliale ainsi que la dynamique mitochondriale au sein du circuit cérébelleux dans un modèle préclinique de l’ataxie de Friedreich. Il fournira de nouvelles connaissances sur le rôle de la frataxine et les conséquences de sa perte de fonction, tout en permettant d’évaluer, d’un point de vue comportemental et moléculaire, la réintroduction de la frataxine dans des populations neuronales spécifiques affectées par la maladie. De plus, les voies ciblées identifiées mettront en évidence de nouvelles voies potentielles pour le développement d’interventions thérapeutiques chez les patients.

Procédures

Des tests comportementaux non invasifs seront réalisés afin d’évaluer la coordination motrice, la marche et la force musculaire. Chaque test dure entre 30 secondes et 5 minutes, pour un maximum de 15 minutes par session et par animal. Avant le début des tests, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant 7 jours (10 à 20 minutes par jour et par animal) par des manipulations douces et progressives, afin de réduire le stress et d’assurer la fiabilité des observations. Au total, 120 animaux seront concernés par ces tests. Des interventions chirurgicales seront réalisées afin d’implanter des fenêtres ou des lentilles permettant l’observation directe du cerveau, ou pour injecter des vecteurs rendant certaines cellules visibles. Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur pendant et après l’intervention. La durée des interventions varie de 45 minutes (injections dans le cerveau) à 3 heures (implantation de fenêtre crânienne). Après la chirurgie, une période de récupération avec surveillance rapprochée et soins adaptés est prévue. Lorsque nécessaire pour garantir la sécurité des animaux et une récupération optimale, ceux-ci pourront être hébergés individuellement pendant la phase postopératoire. Après la phase de récupération, certains animaux participeront à des séances d’imagerie afin d’enregistrer l’activité cérébrale à l’état éveillé, au repos ou lors de tâches comportementales. Lors de ces sessions, la tête de l’animal est maintenue stable pendant 30 à 45 minutes. Une habituation progressive de 7 à 10 jours est mise en place, avec une augmentation graduelle de la durée, afin de limiter le stress et l’inconfort. Ces procédures concernent 720 animaux. Des injections ciblées dans le cerveau seront également réalisées pour moduler l’activité des cellules nerveuses ou de soutien, parfois en combinaison avec l’imagerie. Ces interventions concernent 160 animaux. Enfin, des analyses après le décès des animaux seront effectuées pour des études moléculaires et protéomiques, concernant 45 animaux. L’ensemble de ces interventions est conçu pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, tout en assurant un suivi attentif et continu de leur bien-être.

Impact sur les animaux

Les données recueillies par notre laboratoire et par nos collaborateurs montrent que le modèle de souris utilisé pour l’ataxie de Friedreich ne présente pas de troubles moteurs marqués avant l’âge de 9 mois. Des signes légers de manque de coordination peuvent toutefois apparaître dès l’âge de 4 à 5 mois. Les tests de comportement réalisés chez les animaux sont non invasifs et n’entraînent pas de douleur. Ils peuvent cependant provoquer un stress léger et de courte durée, lié à la manipulation des animaux et à leur exposition à un environnement nouveau. Les séances d’imagerie nécessitent une immobilisation temporaire de l’animal, ce qui peut également générer un inconfort ou un stress transitoire, sans effet durable attendu. La chirurgie d’injection dans le cerveau et la pose d’une fenêtre crânienne constituent une intervention importante. Elles peuvent provoquer une douleur au moment de l’intervention ainsi qu’une gêne dans les jours suivants. Comme pour toute chirurgie, des complications post-opératoires telles qu’un saignement, une infection ou un gonflement peuvent survenir, mais elles restent rares et font l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter l’inconfort des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs mesures ont été mises en place. Tout d’abord, les mêmes animaux sont utilisés pour différentes expériences lorsqu’il est possible, en combinant des analyses comportementales, de microscopie in vivo, et des études histologiques ou moléculaires. Cela permet de réduire le nombre total de sujets nécessaires tout en conservant la pertinence scientifique des données. Les effectifs ont été calculés pour garantir une puissance statistique adéquate, en tenant compte de la variabilité attendue entre individus. Pour chaque groupe expérimental, des mâles et des femelles sont utilisés afin de tenir compte des différences sexuelles potentielles dans les phénotypes et les réponses aux interventions, avec un équilibre idéal de 50 % de chaque sexe. De plus, les animaux non utilisés pour certaines analyses sont réservés pour des expériences complémentaires ou des validations ultérieures, évitant ainsi la répétition inutile d’expériences. Les tissus collectés lors des interventions chirurgicales ou des euthanasies sont également exploités de manière optimale pour plusieurs types d’analyses (histologie, biologie moléculaire, protéomique), réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. Enfin, des stratégies alternatives, telles que l’utilisation d’animaux transgéniques combinées à des injections virales ciblées, permettent de limiter le recours à des croisements complexes ou à de grandes cohortes d’animaux, tout en obtenant des résultats comparables. Ces approches contribuent à une utilisation plus efficace des animaux et à une réduction significative du nombre total de sujets nécessaires pour ce projet, tout en garantissant la représentativité des deux sexes.

Raffinement

Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations afin de réduire leur stress. Des méthodes de manipulation douces et peu stressantes seront utilisées, comme l’utilisation de tunnels ou la prise des souris dans la main, plutôt que par la queue. La prise en charge de la douleur pendant et après l’intervention chirurgicale repose sur un protocole antidouleur complet, mis en place en collaboration avec la vétérinaire référente de la structure. Après la chirurgie, les animaux pourront être hébergés individuellement lorsque cela est nécessaire pour assurer leur sécurité et une surveillance adaptée durant la période de récupération. Pendant cette période, un enrichissement supplémentaire de l’environnement sera fourni (matériel de nidification, éléments à explorer) afin de limiter le stress et de prévenir l’apparition de comportements anormaux. Un suivi vétérinaire quotidien sera réalisé pendant 10 jours à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de douleur. Plusieurs traitements antidouleur sont disponibles et pourront être ajustés si nécessaire. Des critères d’arrêt adaptés à cette chirurgie ont été définis afin de prévenir toute souffrance inutile. Ils incluent notamment l’observation de la prise de nourriture et d’eau, de l’état général, du toilettage et des déplacements de chaque animal. Les traitements seront administrés via l’eau de boisson, légèrement sucrée pour en faciliter la prise, ce qui permet d’éviter toute manipulation supplémentaire et limite le stress des animaux.

Choix des espèces

Le projet utilise exclusivement des souris-modèles génétiquement altérées présentant une diminution de la frataxine, ainsi que des animaux témoins de type naturel. Ce modèle reproduit de manière fidèle les déficits cellulaires et comportementaux observés chez les patients atteints d’ataxie de Friedreich, tout en permettant l’étude in vivo de l’activité cérébrale et de la progression de la maladie. Les stades de développement ont été choisis en fonction des objectifs expérimentaux : 40 à 50 jours post-natal (jeunes adultes pré-symptomatiques) : étude des altérations précoces de l’activité cérébelleuse, avant l’apparition des symptômes moteurs. 70 à 150 jours post-natal (stades précoce à symptomatique) : suivi de la progression de la maladie à travers l’analyse de l’activité cérébrale et des premiers signes d’incoordination. 180 à 270 jours post-natal (adultes symptomatiques) : évaluation de l’effet des approches thérapeutiques et étude des circuits cérébraux à un stade avancé de la maladie. L’utilisation de ces différents stades permet une couverture complète de l’évolution de la pathologie, de la phase présymptomatique à la phase symptomatique, tout en optimisant le nombre d’animaux grâce à la réalisation de plusieurs analyses sur les mêmes individus.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties sur cinq ans, elles subissent jusqu'à trois prélèvements sanguins, une mise à jeun de seize heures puis un gavage quotidien de calcium pendant un mois, pour étudier le rôle de plusieurs gènes dans le métabolisme phosphocalcique et l'effet d'un composé. Les retombées annoncées pour les patients restent limitées à la compréhension des mécanismes, sans application clinique décrite. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas la complexité de l'homéostasie calcique dans un "organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris.

Objectifs

Notre étude longitudinale vise à caractériser l’incidence de certains facteurs majeurs impliqués dans le métabolisme calcique, en se concentrant spécifiquement sur leurs effets au niveau de l’intestin, des reins et du sang, afin d’évaluer leur impact sur ce métabolisme et sur l’homéostasie phosphocalcique durant différents stades de développement.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre l’impact des gênes étudiés dans le métabolisme du calcium et l’efficacité du composé X sur ces troubles.

Procédures

Afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur les animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement, puis injection de sérum physiologique en sous-cutanée) par souris. 360 souris au total dans la 1ere procédure expérimentale, seront gavées une fois, avec une solution de calcium diluée dans de l'eau de boisson, et, dans la seconde procédure expérimentale, une administration quotidienne par gavage (30 secondes par administration) pendant 1 mois. Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé. Ces gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés et compétents, si malgré tout un animal présente des complications expérimentales (extrêmement rare) des signes de souffrance, il sera sorti du groupe et mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Les animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Concernant les gestes subis par les animaux : Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ce geste est effectué par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Un groupe de 360 souris subiront une mise à jeun de 16h sans restriction hydrique suivie d’un gavage d’une solution riche en calcium, suivi d’un isolement de 8h afin de récolter les urines. Dans une autre procédure expérimentale, les souris recevront un gavage du composé X pendant un mois. Cela peut entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux, grâce à la compétence des expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).

Remplacement

Les gènes étudiés étant exprimés dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (par exemple intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption).

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses statistiques utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques. Ce projet utilisera au maximum 3600 souris au total sur 5 ans.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), ), l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé par une grille de scoring et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées (analgésie), si malgré les mesures d’analgésie l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle murin dans ce protocole est justifiée car les souris ont leur génome bien caractérisé et sont des modèles biologiques utiles qui partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 semaines à 6 mois correspondant à des adultes. Ces stades étudiés correspondent aux stades physiopathologiques connus chez le patient.

Pour étudier l'effet de la rigidité des tissus sur des cellules immunitaires liées au cancer, 432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une matrice de collagène implantée par chirurgie, refermée par des agrafes, puis un prélèvement de sang terminal. Le porteur minimise l'inconfort, qu'il attribue à l'incision et aux agrafes plutôt qu'au collagène. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le comportement des macrophages dans un organisme entier et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de discerner, dans un modèle murin, l'impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages constituent une population abondante de cellules immunitaires dans le cancer, associée à un mauvais pronostic pour les patients ; cependant, les facteurs précis qui régulent la fonction des macrophages dans le cancer sont mal compris. De nombreuses études ont identifié que le cancer induit une fibrose générale dans le microenvironnement tumoral, ce qui augmente la rigidité des tissus. L'impact de la rigidité tissulaire sur la fonction des macrophages est un aspect fondamental de la compréhension de l'immunologie tumorale. Pour mieux comprendre cet aspect, nous visons à : 1) établir un modèle murin de fibrose. 2) contourner la différenciation des macrophages pro-fibrotiques. 3) Appliquer nos observations obtenues sur les macrophages pro-fibrotiques et sur la fibrose associée au cancer. L’objectif 3 sera atteint en traduisant nos résultats en données générées précédemment à partir des modèles de cancer en laboratoire.

Bénéfices attendus

Les objectifs de ce projet sont de déterminer, dans un modèle murin, l’impact de la pression mécanique sur la transition des monocytes en macrophages. Les macrophages représentent une population abondante de cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral et sont souvent associés à un pronostic défavorable chez les patients atteints de cancer. Cependant, les facteurs précis qui régulent leur fonction dans ce contexte restent mal compris. De nombreuses études ont mis en évidence que les tumeurs induisent une fibrose marquée dans leur microenvironnement, augmentant ainsi la rigidité des tissus. L’influence de cette rigidité tissulaire sur la fonction et la polarisation des macrophages constitue un aspect fondamental de la compréhension de l’immunologie tumorale. Afin d’explorer ce mécanisme, nous poursuivons les objectifs suivants : 1. Établir un modèle de fibrose afin de reproduire les conditions de rigidité mécanique observées dans les tissus tumoraux. 2. Identifier les voies de signalisation impliquées dans la différenciation des macrophages pro-fibrotiques et explorer les moyens de contourner cette polarisation. 3. Appliquer les observations obtenues sur la différenciation macrophagique et la fibrose à des modèles tumoraux déjà établis au laboratoire. L’objectif final est de mieux comprendre la diversité fonctionnelle (hétérogénéité) des macrophages et les mécanismes biomécaniques qui influencent leur phénotype et leur rôle dans des environnements rigides, tels que les tissus tumoraux. Ces connaissances pourraient, à terme, ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques, en ciblant la signalisation mécanique pour moduler la fonction macrophagique dans le cancer.

Procédures

Implantation chirurgicale d’une matrice de collagène sous anesthésie générale avec analgésie, durée 10 minutes, une fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale terminale, durée 5 minutes, une fois.

Impact sur les animaux

À la suite de la procédure chirurgicale, les souris pourront ressentir une douleur modérée et transitoire. Tout inconfort proviendra de la chirurgie elle-même et des agrafes utilisées pour refermer l’incision cutanée, et non du collagène injecté. Le collagène est de petite taille et très fin, et n’affectera pas la santé des souris.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en œuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans un microenvironnement rigide dans toute sa complexité. En particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le comportement des macrophages dans un microenvironnement rigide soumis à différentes conditions en interaction avec le microenvironnement. Enfin, notre projet offre des perspectives thérapeutiques qui justifient aussi la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme. Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables.

Réduction

Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées, il a été déterminé par calcul de puissance. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes qui maximisent les connaissances acquises à partir de chaque animal. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière à de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d’acclimatation suffisante avant le début des procédures, incluant une familiarisation avec les expérimentateurs. Afin de réduire le stress lié à la manipulation, des méthodes raffinées seront employées . Des examens cliniques quotidiens seront effectués par l'équipe de recherche, et la fréquence des observations sera augmentée en cas de signes d’inconfort. Les procédures seront réalisées dans un environnement propre ou stérile, avec des mesures adaptées pour prévenir les infections post-opératoires. Une anesthésie et/ou une analgésie appropriée sera administrée chaque fois que nécessaire afin de minimiser la douleur et la détresse. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de différentiation des cellules, le cancer et la fibrose. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des publications précédentes. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines du fait de la population de patients..