Procédures modérées

Les souris dont la tumeur atteint un volume jugé hors éthique sont mises à mort avant le terme. 94 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur. Chaque animal subit deux chirurgies, l'une pour implanter des cellules cancéreuses dans le pancréas, l'autre pour exposer la tumeur à une lumière infrarouge, puis des séances d'imagerie répétées. Le projet teste si ce traitement couplé à la lumière améliore l'efficacité d'une chimiothérapie déjà approuvée dans le cancer du pancréas.

Objectifs

Le cancer du pancréas reste une problématique majeure de santé publique car il est particulièrement agressif et mortel. En France, près de 16 000 nouveaux cas ont été diagnostiqués en 2023, avec une incidence en hausse chaque année. À l’échelle mondiale, on estime qu’il y a environ 510 000 nouveaux cas par an, et il figure parmi les causes principales de décès par cancer. Ce qui rend ce cancer si problématique, c’est son diagnostic tardif : les symptômes sont souvent discrets ou non spécifiques, ce qui fait qu’une grande majorité des patients sont diagnostiqués à un stade avancé où la chirurgie - la seule option potentiellement curative - n’est plus possible. Cela se traduit par un pronostic très défavorable : le taux de survie à 5 ans est d’environ 10-11 %, bien inférieur à la plupart des autres cancers. En conséquence, il est aujourd’hui considéré comme l’un des cancers les plus meurtriers, et pourrait devenir la deuxième cause de mortalité par cancer d’ici 2030 si les progrès dans le dépistage et le traitement ne suivent pas. L’évaluation de nouvelles thérapies dans des modèles précliniques orthotopiques — c'est-à-dire des modèles animaux dans lesquels la tumeur est implantée dans l’organe d’origine (et non sous la peau) — est crucial car ces modèles mimétisent beaucoup mieux les tumeurs humaines : cela augmente la pertinence et la prédictivité des résultats avant de passer aux essais cliniques. Ce projet vise à caractériser l’efficacité d'une nouvelle thérapie dans un modèle de cancer du pancreas. Cette étude investiguera si la thérapie couplée à la lumière infrarouge améliore l'efficacité anticancéreuse du traitement standard approuvé dans le cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra potentiellement de faire émerger une nouvelle solution thérapeutique pour les patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie, ouverture et fermeture de la couche cutanée et abdominale - 5 minutes, à raison de deux fois dans la procédure. Une injection pancréatique - 30 secondes maximum, 1 injection intrapéritonéale - 30 secondes ou 1 injection intraveineuse – 1 minute. 2 pesées par semaine seront réalisées. Une anesthésie gazeuse d'une durée de 5min pour les séances d'imagerie à raison de 2 par semaine.

Impact sur les animaux

Tous les animaux subiront une première intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie gazeuse afin d’implanter des cellules cancéreuses dans le tissu d’origine, puis une seconde intervention chirurgicale afin d’exposer le pancréas et la tumeur à la lumière infrarouge, ces procédures pouvant provoquer un stress. Après la prise tumorale, les souris pourront présenter une perte de poids ainsi qu’une augmentation progressive du volume tumoral, pouvant entraîner une gêne. Les animaux recevront des injections intrapéritonéales et/ou intraveineuses pour les traitements, ce qui peut entrainer un stress. Les animaux seront régulièrement pesés et la prise tumorale sera mesurée par imagerie. La contention nécessaire à ces manipulations pourra générer un stress répété sur plusieurs semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure pour le prélèvement de la tumeur dans le cadre d’une analyse ultérieure. Les animaux seront également mis à mort si le volume tumoral atteint un volume hors éthique ou si un point limite a été atteint.

Remplacement

Ce projet vise à caractériser l’efficacité d’un traitement contre le cancer du pancréas. L’implantation dans l'organe cible permet aux cellules tumorales de se développer au sein de leur environnement d’origine, reproduisant ainsi de manière fidèle de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. À l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire les interactions complexes entre la tumeur et son environnement. En conséquence, aucune méthode alternative ne permet de remplacer l’utilisation de modèles in vivo pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Les procédures seront faites sur un nombre minimal d’animaux nécessaires afin d’avoir une prise tumorale correcte. Pour la procédure expérimentale, nous utiliserons un test statistique adéquat pour pouvoir conclure sur les résultats de l'étude. Nous avons déterminé qu'il nous faudra 94 animaux au total.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel zootechnique, qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, maisonnette). Les procédures de greffe tumorale seront réalisées selon les bonnes pratiques de chirurgie expérimentale avec : • Des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie • Une anesthésie et une analgésie adaptées à la procédure • Le maintien de conditions d’asepsie pendant toute la durée de la chirurgie

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est acceptée pour la recherche pré-clinique comme étant un modèle relativement prédictif de la pathologie humaine. De plus, utiliser la souris dans notre projet permet de recréer un microenvironnement tumoral similaire à celui présent chez l’Homme. Ainsi, la souris est le modèle de choix pour ce projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 - 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Neuf séances d'imagerie sous anesthésie et une chirurgie stéréotaxique d'environ une heure trente : 5 088 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'étude injecte des vecteurs viraux dans le cerveau ou la veine pour cartographier leur diffusion selon la voie d'administration, en vue de futures thérapies géniques. Chaque animal subit aussi des prélèvements sanguins toutes les deux semaines pendant huit semaines. Leur mise à mort sert à collecter les tissus cérébraux pour analyse.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de définir de nouveaux vecteurs médicaments pouvant atteindre différentes structures du cerveau, selon différentes voies d’injection. La thérapie génique par vecteur viral a démontré durant la dernière décennie son efficacité pour le traitement des maladies d’origine génétique. Ainsi, de nouveaux médicaments ont reçu leur autorisation de mise sur le marché. Néanmoins, de nombreux défis restent à relever. Premièrement, selon la maladie ciblée il est important de redessiner une stratégie. En effet, les essais cliniques nous montrent qu’une même stratégie par vecteur viral peut avoir des effets opposés et cela même si les maladies sont proches. Deuxièmement, concernant le traitement de maladies du cerveau, le type d’injection (dans le cerveau ou dans le sang) affecte la dispersion du produit et donc, les cibles atteintes. Des études préliminaires ayant démontré l’amélioration de la distribution d’un vecteur viral modifié pour les structures cérébrales en injection locale chez la souris, nous évaluerons l’efficacité de nos candidats selon différentes voies d’injections. Ces résultats permettront d’utiliser les meilleurs vecteurs dans les meilleures conditions d’injection lors des études de preuves de concept pour le traitement de différentes maladies neurodégénératives, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes. (MODIFICATION) De plus, nous effectuons une demande de modification de projet, afin d’ajouter de l’imagerie par bioluminescence et quelques modifications mineures ne modifiant pas le nombe total d’animaux impliqués (MODIFICATION).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les nouveaux vecteurs médicaments. Ainsi, lors des études de preuve de concept dans des modèles de maladies neurodégénératives, seuls les vecteurs médicaments atteignant les cibles d’intérêt de manière adéquate (temps et quantitativement) seront injectés via la route d’injection la plus pertinente, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la définition des conditions thérapeutiques. Ce projet permettra in fine le développement de médicaments innovants pour les maladies neurologiques.

Procédures

L’injection locale dans le cerveau est réalisée sur animal préalablement anesthésié et analgésié et maintenu sous anesthésie. La tête de l’animal est maintenue en position fixe par un dispositif permettant d’établir des coordonnées précises du cerveau. Cette chirurgie est réalisée, une seule fois par animal. La durée totale de la procédure est d’environ 1h30 pour les phases de pré-chirurgie et chirurgie, puis jusqu’au réveil de l’animal. L’injection par la voie intraveineuse est réalisée sur un animal vigile sous contention après dilatation préalable des veines de la queue (chauffage). Ce geste est réalisé, une seule fois par animal. La durée maximale est de 5 minutes sous contention. Tous les animaux auront des prélèvements sanguins permettant de mesurer la réponse immunitaire à une fréquence de 1 fois toutes les 2 semaines pendant 8 semaines. (MODIFICATION) Chaque prélèvement durera 5 minutes sous contention si l’animal est vigile ou sous anesthésie s’il est effectué lors d’une session d’imagerie. L’imagerie in vivo est réalisée sur animal anesthésié a raison de 2 sessions la première semaine puis hebdomadairement jusqu’à la 8ème semaine soit 9 sessions de 30 minutes chacune (MODIFICATION) Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera associée à un risque saignement pendant la chirurgie puis de douleur et d’inconfort post-opératoire pendant quelques jours. (MODIFICATION) Les anesthésies générales nécessaires pour cette chirurgie et pour les imageries seront associées à un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de détresse cardio-respiratoire (MODIFICATION). Les prélèvements sanguins génèreront une brève douleur et un inconfort au point de prélèvement, il existe également des risques de saignement et d’hématome. (MODIFICATION) Les trois types d’injections périphériques seront associées à un stress lors de la contention et une légère et brève douleur au point d’injection (MODIFICATION).

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses.

Remplacement

Le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation d’un virus médicament pour véhiculer un gène médicament jusqu’aux cellules à traiter. Les interactions entre le virus médicament et les différentes composantes de l’organisme (système immunitaire par exemple) ne peuvent pas être toutes reproduites simultanément dans les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, le système nerveux est un système complexe ayant une structure tridimensionnelle particulière, ne pouvant être reproduite. Parallèlement à l’utilisation d’animaux, nous mettons en place des cultures de tissus qui nous permettront de réaliser une première sélection de nos virus médicaments, limitant ainsi le nombre d’animaux injectés.

Réduction

La stratégie choisie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés (5088). Seuls les virus médicament ayant été décrits comme efficaces dans le cerveau seront testés, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. Par ailleurs, des mâles et des femelles seront inclus dans les études afin d’obtenir la meilleure représentativité des réponses biologiques et de réduire le nombre d’animaux sans introduire de biais et permettant ainsi d’optimiser l’élevage des animaux achetés chez les éleveurs agréés. Ces résultats seront ensuite utilisés pour alimenter les programmes d’essais de thérapie génique dans les modèles de maladies neurodégénératives. Ainsi le nombre d’animaux présentant un phénotype délétère dans les prochaines études pourra être réduit. Approche statistique : Basé sur les connaissances actuelles dans le domaine de la thérapie génique, nous avons alors utilisé un test statistique définissant un nombre de 6 souris par groupe.

Raffinement

Des études pilotes permettront de déterminer la dose optimale de virus médicament, la vitesse d’injection, le pic d’expression de nos vecteurs et le nombre de points d’injection nécessaires et suffisant pour assurer le meilleur traitement. Condition de vie des animaux : les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec du matériel de nidification et un abri dans chaque cage afin de limiter le stress. Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée. Les souris seront pesées avant injection puis toutes les semaines afin de suivre les variations de poids. Les souris sont manipulées régulièrement pour s’habituer à l’utilisateur Procédure d’injection locale : les animaux seront traités avec des anesthésiques et analgésiques avant et jusqu’à 3 jours après la chirurgie. Toute suspicion de souffrance animale sera soumise à un examen du vétérinaire présent à l’animalerie qui validera la nécessité de mise à mort ou non de l’animal. Procédure d’injection systémique : les animaux seront placés dans un appareil de contention, sous lampe chauffante afin de maximiser la dilatation des veines de la queue et de réduire le temps de contention. (MODIFICATION) Imagerie in vivo : l’appareil qui sera utilisé intègre un système chauffant permettant de maintenir les animaux à 37-38 degrés Celsius tout au long de la session d’imagerie limitant ainsi le risque d’hypothermie lié à l’anesthésie (MODIFICATION).

Choix des espèces

Il a été démontré précédemment que la souris est un modèle prédictif du potentiel thérapeutique chez l’homme. De plus, les différents modèles de maladies neurodégénératives étants principalement murins, il est nécessaire de valider les différents paramètres dans cette espèce afin de réaliser de façon efficace et optimale le développement de nouveaux traitements. Des animaux de 8 à (MODIFICATION) 16 (MODIFICATION) semaines seront utilisés. Ce stade correspond à un plateau dans le développement du cerveau de la souris couplé à un système immunitaire mature. De plus, la taille des animaux à cet âge est adequate avec un taux de récupération post-chirurgie plus élevé (moins de surcharge pondérale et de maladies métaboliques réduisant ainsi les risques liés à l’anesthésie et à l’analgésie)

8 028 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'opiacés, d'opioïdes ou de cocaïne, jusqu'à vingt administrations, puis un candidat médicament, pour mesurer l'effet de récompense de ces drogues dans un test de préférence de place. Le porteur affirme qu'aucun test sans animal ne permet d'évaluer le caractère renforçant d'une substance. Il indique aussi qu'aucun analgésique opiacé ne sera administré, car il fausserait le protocole, les animaux traversant donc ces procédures sans cette prise en charge de la douleur.

Objectifs

Les opiacés constituent une famille de substances dérivées de l'opium, lui-même tiré de la culture du pavot (Papaver somniferum). Leur produit de référence est la morphine, à partir de laquelle est produite l'héroïne (ou diacétylmorphine). Par rapport aux opiacés, le terme "opioïde" inclut également des molécules qui ont un effet de type morphinique, mais qui sont produites par synthèse. Les opiacés et les opioïdes possèdent le même mécanisme d'action. Ces médicaments agissent sur les récepteurs opioïdes du système nerveux central pour soulager la douleur, mais ils présentent également un risque élevé de dépendance, de sensibilisation (les doses doivent être augmentées pour en ressentir les effets) et d'effets secondaires graves, notamment la dépression respiratoire pouvant aller jusqu’à la mort. Ils sont à l’origine des dizaines de milliers de morts par an dans le monde. La polyconsommation (opiacés ou opioïdes avec la cocaïne) est observée chez environ 10% des usagers de drogues par voie intraveineuse ou usagers réguliers d’opioïdes, cocaïne ou amphétamines (observatoire français des drogues et des tendances addictives). Elle permet à l’usager de gérer ou de potentialiser les effets des produits psychoactifs. Cette pratique est d’autant plus risquée que le consommateur s’expose à des dangers souvent méconnus. La mise en place expérimentale d’une dépendance par ce type de molécules se fait par l’induction d’effets gratifiants (appelé aussi mécanismes de récompenses) que l’on peut mettre en évidence chez le rongeur dans un test comportemental appelé le test de préférence de place. Dans un premier temps, nous souhaitons mettre en place le modèle chez la souris afin de mesurer l’effet gratifiant des opiacés et opioïdes. Puis de nouveaux candidats médicaments seront testés afin de permettre de développer de nouvelles molécules pour lutter contre l’addiction aux opiacés et opioïdes. Afin d’étudier l’effet de candidats médicaments sur la dépendance induite par polyconsommation de drogues, nous développerons le modèle de préférence de place en co-administrant les opiacés (ou opioïdes) et la cocaïne.

Bénéfices attendus

L'augmentation de la prescription d'opioïdes ou opiacés pour gérer la douleur chronique s'est accompagnée d'une hausse spectaculaire de leur abus, ce qui constitue aujourd'hui un problème majeur de santé publique. Des dizaines de milliers de personnes meurent chaque année dans le monde suite à la prise abusive d’opiacés ou d’opioïdes. De plus, la polyconsommation de ces substances avec la cocaïne augmente significativement le risque de mort pour les consommateurs. Ce projet est destiné à découvrir de nouveaux candidats médicaments visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d’addiction aux opiacés et à la cocaïne.

Procédures

Un prélèvement de sang sera réalisé en fin d'étude sur animal anesthésié en submandibulaire ou intracardiaque juste avant la mise à mort (volume maximum 1 ml/souris). Les animaux recevront selon les différentes procédures plusieurs administrations de substances addictives (Opiacé ou Opioïde et/ou Cocaïne) par voies intrapéritonéale ou sous-cutanée (2/jour de test maximum soit au total 20 d’une durée inférieure à 30 seconde) et l’administration de candidat médicament par voies orale, voies intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse (1/jour de test maximum soit un total de 11).

Impact sur les animaux

L’administration répétée d’opiacés aux doses utilisées dans la préférence de place peut induire une augmentation de l’activité locomotrice transitoire après l’injection ou à l’inverse, une sédation transitoire. Une diminution temporaire de la prise alimentaire peut également être observée. De plus, l'administration répétée de telles molécules peut induire également une sensibilisation. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. Les tests de comportement de courte durée 30 min par jour ne provoquent pas de contrainte physique particulière.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, des prélèvements de sang et d’organes sont possiblement prévus sur les animaux pour compléter l’étude comportementale avec des études sérologique, histologique, cellulaire ou moléculaire.

Remplacement

Le développement de candidats médicaments, en amont de l’utilisation de l’animal, est réalisé en plusieurs étapes : l’identification de la cible thérapeutique (pathologie), la compréhension des voies neurobiologiques de cette pathologie (la dépendance), la découverte de composés modulant la cible thérapeutique (Hits), l’optimisation de ces composés pour améliorer leur spécificité, leur profil pharmacocinétique et leur sécurité (Hit-to-Lead), leur validation fonctionnelle in vitro (cultures de neurones, organoïdes) et leur évaluation pharmacocinétique et toxicologique in vitro. Suite à cette étape et en amont du présent projet, des études in vivo pourront également être réalisées ou sous-traitées par le donneur d’ordre afin de déterminer plus précisément leur pharmacocinétique et leur toxicité. L’ensemble de ces études permet de choisir les doses dénuées de toxicité, ainsi que la voie et le temps d’administration qui seront optimales pour le projet objet de cette DAP, la préférence de place. Si une dose du candidat médicament montre une quelconque toxicité, les doses seront revues et donc diminuées à des doses non toxiques. Le test de préférence de place permet d’évaluer un des aspects de l’addiction : le caractère renforçant positif, c’est-à-dire le plaisir induit par la prise d’un composé, et par conséquent d’évaluer la potentialité d’un produit à réduire le caractère renforçant positif du composé addictif. Il n’existe à ce jour aucun test n’utilisant pas l’animal pour évaluer cette potentialité. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. Aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Le test utilisé dans ce projet ne peut donc pas être remplacé par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Etant donné la variabilité des réponses aux candidats médicaments, 12 animaux par groupe sont prévus afin d'assurer un nombre minimum d'animaux nécessaires pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront pesés tous les jours de passage en test (c'est à dire tous les jours sauf le week-end) et leur état général sera quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance spécifique à l’étude pour détecter des signes éventuels de douleurs. Si un animal démontre un état physique dégradé (ex : perte de poids entre 11 et 15 %) mais n’atteint pas un des points limites, des procédures particulières seront mises en place (alimentation hydratée, hydrogel et Administration de Ringer Lactate). L’utilisation d’analgésique de type opiacé ne pourra pas avoir lieu dans ce projet au regard des substances psychoactives déjà utilisées. L’effet de ces analgésiques interviendrait dans le principe même du projet et pourrait créer un biais expérimental important quand à l’exploitation des résultats. Il pourrait également y avoir un risque d’overdose pour les animaux. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et l’humain fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur la dépendance aux opiacés dans toute sa complexité. Et ils sont donc nécessaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. La souche C57Bl/6 a été choisie dans ce projet car ces souris développent facilement une réponse de renforcement nette et reproductible et comparées à d'autres souches (DBA/2 et autres...) elles présentent une grande sensibilité à la récompense opioïde. Elle est la plus utilisée dans la littérature scientifique. Au minimum 6 à 8 semaines au début de l’analyse comportementale. Dans ce projet, seuls les animaux adultes sont utilisés car il n'a pas pour objectif d'étudier les effets des candidats médicaments sur l'animal à d'autres stades de développement.

36 rattes vont être utilisées, toutes tuées par inhalation de CO2 pour prélever leur utérus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ovariectomie sous anesthésie puis des injections quotidiennes de stéroïdes pendant six jours. Ces actes servent des travaux pratiques de licence, les gestes sur l'animal vivant étant réalisés par l'enseignant tandis que les étudiants ne manipulent que l'organe isolé. Le porteur justifie l'ensemble par les exigences du Programme Pédagogique National et affirme qu'aucune méthode ne reproduit les effets de l'ovariectomie sur l'"organisme entier".

Objectifs

Dans le contexte d’une formation de Licence de Sciences, Technologies, Santé, le présent projet s’inscrit dans une démarche globale d’initiation à l’expérimentation animale et aux règles éthiques en vigueur dans ce domaine, selon une organisation en 2 ans : - En deuxième année, les étudiants sont sensibilisés à l’acquisition numérique de signaux biologiques à partir de paramètres enregistrables chez l’homme. Ils sont également initiés à la manipulation des animaux dans le cadre d’enregistrements non invasifs de paramètres biologiques chez l’animal vigile. - En troisième année sont réalisés des travaux pratiques sur le rat anesthésié dans le cadre du projet faisant l’objet de la présente demande. L'utilisation d'animaux, ainsi que la chirurgie pratiquée par des personnels formés et habilités, constituent un apprentissage concret de la démarche scientifique et, surtout, des conditions et limites d'utilisation des animaux en expérimentation. Les aspects essentiels de la physiologie et de la pharmacologie seront mis en pratique par les étudiants grâce à la technique de l'organe isolé, permettant l’intégration de leurs connaissances théoriques. Le contexte scientifique du projet porte sur l'impact des hormones stéroïdes sexuelles sur les conséquences physiologiques au niveau de l'utérus, notamment en termes de contractilité et de sensibilité à des agents contracturants ou relaxants. La thématique générale vise ainsi à comprendre le contrôle hormonal de la gestation et de la parturition, ainsi que les mécanismes cellulaires associés au sein d’un système intégré. Ce projet constitue donc la première sensibilisation des étudiants à l'expérimentation animale.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intègre dans une démarche de formation technique et scientifique fondamentale pour l’obtention d'une Licence scientifique dans le domaine de la biologie-santé. Il vise à familiariser les étudiants avec les approches précliniques et l’analyse de signaux biologiques. Dans ce cadre, les gestes sur l’animal vivant sont réalisés exclusivement par du personnel formé et habilité. Les étudiants interviennent uniquement sur des préparations ex vivo (organe isolé), ce qui leur permet d’acquérir les bases méthodologiques de l’analyse physiologique et pharmacologique sans manipulation directe de l’animal vivant. La procédure est organisée sous forme d’un mini-projet intégrant les différentes étapes d’une démarche de recherche préclinique, jusqu’à la rédaction d’un compte rendu des données analysées et la présentation des résultats sous forme d’un exposé scientifique. Ce projet contribue ainsi à la formation des étudiants en vue de leur future activité professionnelle et notamment l’éducation aux 3R.

Procédures

En préopératoire, chaque ratte recevra un antalgique. La durée totale pour chaque contention et injection sera inférieure à 10 secondes. Sous anesthésie générale gazeuse, chaque ratte sera l’objet d’une ovariectomie qui n’excédera pas 60 min. En post-opératoire, les rattes auront une injection d'un antalgique (après 24h) puis des injections journalières sous-cutanées de stéroïdes pendant 6 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les effets connus du stress ainsi qu'une douleur transitoire au moment de la contention, des injections d’analgésique et de l’induction de l'anesthésie lors de la phase d'endormissement. Par la suite, les animaux ont une injection sous-cutanée journalière de stéroïdes qui n'est pas décrite comme irritante, ce qui a été constaté lors des deux précédentes autorisations de projet et publié dans des revues internationales. Un stress lié à la pesée individuelle des animaux et aux injections est possible.

Devenir

La procédure expérimentale n’autorise pas la réutilisation des animaux car nécessite un prélèvement de l'utérus pour la mesure en cuve à organe isolé. Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience par inhalation de CO2 en caisson automatisé selon la réglementation en vigueur.

Remplacement

Ce projet vise à répondre aux exigences du Programme Pédagogique National prévoyant des travaux pratiques d’initiation à l’évaluation de fonctions physiologiques et de l’activité biologique de molécules médicamenteuses dans un contexte préclinique sur des modèles animaux in vivo. Il constitue un apprentissage concret de la démarche scientifique ainsi que des conditions et limites d’utilisation des animaux dans un cadre expérimental adapté à la formation. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de reproduire de manière intégrée les conséquences physiologiques de l'ovariectomie suivie d’une imprégnation hormonale sur l'organisme entier.

Réduction

La mutualisation des utérus et des résultats entre plusieurs groupes de travaux pratiques permet d’atteindre un nombre minimal d'animaux compatible avec le maintien de la qualité pédagogique et scientifique de la formation. Ainsi, le nombre d'animaux est réduit de moitié, passant de 4 animaux par groupe de TP dans la configuration précédente à 2 animaux par groupe de TP dans la nouvelle organisation. Pour un effectif maximal de 6 groupes de TP, le besoin annuel est de 12 rattes. Sur la durée totale du projet (3 ans), le nombre total d’animaux s’élève donc à 36 rattes, soit une réduction globale de 36 animaux par rapport au projet antérieur.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par groupe de 2 dans des cages ventilées et adaptées au nombre et à l’espèce, avec enrichissement du milieu et accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Ils bénéficient d’une période d’acclimatation de 14 jours à compter de leur arrivée dans l’animalerie. À l’issue de cette période, une habituation progressive aux manipulations et à l’environnement expérimental sera réalisée 24 h avant la chirurgie afin de permettre leur adaptation à cet environnement spécifique. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse dans des conditions de température contrôlée (tapis chauffant) avec utilisation d’Ocrygel. Une analgésie locale est assurée avant toute incision. Les animaux reçoivent une analgésie préemptive, au moins 30 min avant l’induction de l’anesthésie. À l’issue de la chirurgie, une analgésie efficace durant la phase douloureuse aiguë post-ovariectomie est pratiquée dans une stratégie d’analgésie multimodale visant à prévenir la sensibilisation centrale et à optimiser le bien-être animal ainsi que la récupération post-chirurgicale. Des analgésiques de type AINS sont également utilisés dans les 24h suivant la chirurgie. Les animaux opérés seront maintenus dans une zone chauffée jusqu’à leur réveil complet, puis remis dans leur cage d’origine selon les modalités décrites ci-dessus. L’ensemble des actes de contention, d’injections, de chirurgie et de mise à mort est effectué par l’enseignant qualifié et formé à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et à la chirurgie. Les étudiants assurent la surveillance per- et post-opératoire sous supervision directe de l’enseignant, en suivant une grille d’évaluation individualisée des signes cliniques pour chaque animal. Des seuils d’alerte ont été définis pour chaque phase expérimentale.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de référence largement utilisée en recherche biomédicale pour l’étude de la physiopathologie et la pharmacologie. Son organisation anatomique et fonctionnelle, notamment au niveau des systèmes neuroendocriniens et reproducteurs, présente des similitudes pertinentes avec celles de l’Homme. La taille importante des deux cornes utérines chez la ratte permettra une mutualisation des utérus entre différents groupes de TP. Les animaux utilisés sont des rattes adultes matures sexuellement, pesant entre 250 g et 350g. Le recours à des animaux adultes est nécessaire afin de disposer d’un appareil reproducteur pleinement développé et fonctionnel, condition indispensable à la réalisation d’une ovariectomie et à l’étude des effets des traitements hormonaux. Par ailleurs, ce poids garantit une taille corporelle adaptée à la réalisation des gestes chirurgicaux dans des conditions optimales de sécurité et de précision technique.

Pour valider une méthode mesurant si des œufs d'Echinococcus prélevés sur des aliments restent infectieux, 90 souris reçoivent ces œufs en injection sous la peau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une masse parasitaire se développe au point d'injection sur une période allant jusqu'à quatorze semaines, avec possibles lésions ou abcès. La mise à mort est requise pour observer le développement du parasite par identification moléculaire. Le porteur signale qu'une méthode in vitro est en cours de développement au laboratoire, mais qu'elle n'est pas encore comparable.

Objectifs

Contexte : Les échinococcoses sont des maladies parasitaires transmises par les aliments d’importance majeures au niveau européen et mondial. Deux formes de ce parasite sont décrites en France, l'échinococcose alvéolaire (EA) et l'échinococcose kystique (EK). Chez l’Homme, les deux maladies ont une localisation principalement au niveau du foie mais également des poumons pour l’EK. Elles se caractérisent toutes deux par une longue période asymptomatique pouvant atteindre 15 ans, rendant presque impossible l’identification précise des sources individuelles de contamination. L'Homme se contamine par ingestion accidentelle d’œufs microscopiques du parasite disséminés dans l’environnement (aliments non cuits, sol, eau, etc…) via des selles de carnivores (essentiellement renards et chiens contaminés). En Europe, dans les salades et les baies, les taux de contamination de ces parasites sont estimés entre 0 et 7%, avec une moyenne de 1 à 5 œufs détectés. La viabilité d’œufs provenant d’aliments de consommation humaine n’a jamais pu être démontrée directement faute de méthode adaptée. Une seule étude, datant de 2015, a démontré un développement dans 100% des souris (4/4) après une inoculation en sous-cutanée de 20 œufs de parasites. Ainsi, aucune donnée n’est existante pour une quantité inférieure à 20 œufs, ni avec des œufs isolés à partir d’aliments de consommation humaine. L’objectif de l’étude : Valider la méthode de viabilité chez des souris, utilisée dans une publication de 2015, pour deux espèces principales d’échinocoques. Les œufs seront inoculés en sous-cutanée avec et sans débris d’aliments afin de reproduire les conditions de la publication et d’adapter la méthode pour répondre aux enjeux. Perspectives et enjeux globaux : L’étape suivante sera donc d’évaluer la sensibilité de cette même méthode pour de faibles quantités de parasites (5 à 1 œuf), représentatives des taux moyens retrouvés sur des aliments contaminés (salades, baies, etc…). Ainsi, cette méthode de viabilité pourrait être utilisée à partir d’aliments collectées sur le terrain pour contribuer à l’évaluation du risque de contamination alimentaire pour l’Homme.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra d’évaluer pour la première fois la sensibilité de l’approche in vivo en sous-cutanée sur deux espèces d’échinocoque en présence et absence de matrice alimentaire. Les données produites serviront ensuite à mettre en place des études visant à évaluer la pertinence de l’approche in vivo pour prouver la contamination de matrices alimentaires par des œufs viables d’échinocoques pour la première fois et d’en estimer la proportion. En effet, la viabilité d’œufs d’échinocoques sur des matrices alimentaires n’a encore jamais été démontrée alors que pourtant admise d’où la classification comme parasites transmis par les aliments. Disposer de données sur la proportion d’échantillons de type salades, fraises ou myrtilles contaminés par des œufs infectieux d’échinocoques permettrait de préciser la contribution relative des aliments parmi les sources de contamination humaine et de fournir des valeurs chiffrées pour l’évaluation du risque pour l’échinococcose alvéolaire (EA) et kystique (EK).

Procédures

Identification par puce électronique et injection d'œufs de parasites pour voie sous-cutanée - anesthésie générale légère - 1 seule fois - durée =1 minute. Prise de sang totale intracardiaque par voie intercostale - anesthésie générale par voie intrapéritonéale - 1 seule fois - 5 minutes

Impact sur les animaux

Le développement d’une petite masse parasitaire sous-cutanée (au site d’injection) est attendu avec une possible faible prise de poids sur une période maximale de 14 semaines. Des lésions ou abcès transitoires peuvent être observés au site d’injection durant les semaines suivant l’injection.

Devenir

L’objectivation du développement du parasite nécessite une observation macroscopique combinée à une identification moléculaire nécessitant la mise à mort de l’animal au préalable. De plus, les animaux témoins, bien que non infectés, seront trop âgés pour être réutilisés dans d’autres procédures.

Remplacement

Une méthode alternative via la culture de cellules (in vitro) est en cours de développement au sein de notre laboratoire afin d’essayer de pallier à l’utilisation d’animaux (in vivo). Toutefois, comme il n’existe pas de bibliographie permettant de comparer les deux méthodes de viabilité (in vitro et in vivo) pour de faible quantité d’œufs d’échinocoques sur matrice alimentaire, il est nécessaire de tester parallèlement la sensibilité de la méthode de viabilité in vivo. Ainsi, nous pourrons statuer sur la méthode la plus adaptée pour répondre à nos problématiques afin d’améliorer les connaissances et la prévention.

Réduction

Le projet utilisera 90 souris sur 3 ans. En raison du manque de données dans la littérature et en se basant sur un test statistique, des hypothèses formulées et des efficacités fixées, 8 souris seront utilisées par groupe pour les modalités tests et 5 souris pour les modalités témoins. Ces effectifs ont été réfléchis pour que les résultats obtenus soient recevables statistiquement tout en utilisant un minimum de souris.

Raffinement

Afin de limiter les anesthésies, les souris subiront le même jour l’injection sous cutanée décrite dans les procédures, ainsi que la pose du transpondeur. Le transpondeur permet d’identifier l’animal mais également la prise de température simplifiée en limitant le stress. Selon les résultats de la première étape, un antibiotique dans l’eau de boisson sera utilisé dans la procédure suivante afin d’éviter une infection de type abcès suite à l’injection de matrice alimentaire. En plus de limiter la gêne de l’animal cela améliorerait les chances de développement parasitaire puisqu’un abcès pourrait nuire ou éliminer les parasites injectés. Afin d’améliorer leur bien-être, les souris seront hébergées par groupe (8 pour les tests et 5 pour les témoins) et bénéficieront d’un enrichissement (carton, abris, cellulose et bâton de bois) dans les cages. L’utilisation d’anesthésique et d’un antidouleur seront employés afin de limiter la douleur et le stress des souris lors des actes opératoires. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraînera la mise à mort compassionnelle de l'animal.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires du parasite responsable de l’échinococcoses alvéolaire (EA) sont les rongeurs sauvages mais plusieurs études ont déjà utilisé des souris comme modèle de viabilité. S’agissant du parasite responsable de l’échinococcose kystique (EK), le mouton est l’hôte intermédiaire principal. Toutefois des rongeurs, dont les souris, ont déjà été utilisés pour étudier la viabilité des œufs de ce parasite. Ainsi, pour ces deux espèces parasitaires, la souris est sensible au développement parasitaire et constitue donc le modèle de choix. De plus, pour des raisons de reproductibilité de la seule publication ayant injecté un faible nombre d’œufs d’échinocoques, les souris utilisées seront des femelles et auront entre 6 à 8 semaines. Le stade de développement des animaux n'aurait pas d'influence sur la sensibilité au parasite et le développement de la forme larvaire. Toutefois, pour des raisons de reproductibilité de la seule publication avec un faible nombre d’œufs, les souris utilisées auront 6 à 8 semaines.

Maintenus en vie à l'issue, 30 lamas sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cas rare où les animaux ne sont pas tués. Chacun reçoit quatre à six injections d'antigènes avec adjuvant, des contentions au couloir et des prises de sang, pour produire des anticorps de petite taille recherchés en biotechnologie. Les réactions attendues vont de l'inflammation locale à une fièvre et une fatigue passagères. Un même lama peut enchaîner trois séries d'immunisation au cours de sa vie, avec six mois de repos entre chacune.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de produire des petites molécules naturelles de défense très précises, appelées anticorps, en vaccinant des lamas avec des cibles, appelées antigènes, liées à la maladie d’intérêt. Les lamas fabriquent un type particulier d’anticorps, plus petits et plus stables que ceux des autres animaux. Grâce à leur taille réduite, ils peuvent atteindre des zones difficiles d’accès dans l’organisme tel que le système nerveux central. Ils sont déjà utilisés dans le domaine de la biotechnologie et constituent une avancée importante pour la médecine. Ce travail permettra de développer de nouveaux outils pour le diagnostic et le traitement de certaines maladies, avec des retombées potentielles pour la santé publique. Les lamas recevront des injections contenant les cibles afin d’activer leur système immunitaire. Des prises de sang seront réalisées régulièrement pour suivre la réaction de l’organisme et récupérer les anticorps produits.

Bénéfices attendus

Les Camélidés, espèce à laquelle appartiennent les lamas, ont une caractéristique unique qui consiste à produire des anticorps spéciaux beaucoup plus petits que les anticorps classiques. Leur taille et leur stabilité leur permettent d’atteindre des zones difficiles, de résister à des conditions extrêmes et d’être faciles à produire. Grâce à ces qualités, ils sont utilisés en thérapie, diagnostic et biotechnologie, ouvrant la voie à des avancées majeures en médecine et en recherche.

Procédures

La vaccination consiste en 4 à 6 injections de la cible espacées de 7 à 14 jours. Une prise de sang est réalisée en début et milieu de vaccination afin d’évaluer l’activation du système immunitaire des lamas. En fin de vaccination, un prélèvement final est réalisé afin de récolter les anticorps produits. Tous les gestes sont réalisés sur animal vigile et immobilisé dans un couloir de contention à l’aide d’un licol par du personnel compétant. La durée totale d’une vaccination est de 40 ou 43 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les lamas suite à des injections d’antigènes avec adjuvant sont principalement des réactions locales au site d’injection (légère inflammation, induration, douleur transitoire), plus rarement des effets systémiques légers tels qu’une légère fièvre (n’excédant pas 40°C) ou une fatigue passagère (activité et/ou réactivité ralenties par rapport au reste du troupeau). Lors des prélèvements sanguins, les animaux peuvent ressentir une douleur brève au moment de l’insertion de l’aiguille. Bien qu’un travail d’habituation et de conditionnement soit réalisé avec les lamas, le stress lié à la contention est également possible. Pour réduire ces nuisances, la procédure prévoit une manipulation douce par du personnel expérimenté, l’utilisation d’aiguilles adaptées et la surveillance clinique régulière.

Devenir

À l’issue du projet, tous les animaux seront maintenus en vie. En fin de programme d’immunisation un examen vétérinaire est réalisé pour vérifier l’état de santé complet de l’animal après l’enchaînement des injections et s’assurer qu’aucune nuisance ou complication anormale n’est survenue.

Remplacement

Les lamas ont la particularité de produire des molécules de défenses, appelées anticorps, de très petite taille. On peut fabriquer des anticorps en laboratoire, mais ces méthodes ne reproduisent pas la variété et la qualité obtenues naturellement. Pour avoir des anticorps très spécifiques et efficaces, il faut vacciner l’animal, car cela déclenche une vraie activation du système immunitaire. C’est pourquoi l’utilisation des animaux reste nécessaire : il n’existe pas d’alternative équivalente pour obtenir des résultats fiables et utiles en recherche et en médecine.

Réduction

Le nombre de séries de vaccination est estimé à 8 par an soit 40 sur 5 ans. Deux lamas sont utilisés par série. Au cours de sa vie, un même animal peut intégrer 3 séries d’immunisation en respectant un repos de 6 mois minimum entre 2 séries, de ce fait 30 lamas seront nécessaires.

Raffinement

Le projet intègre plusieurs mesures pour réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout en garantissant la qualité scientifique des résultats. Les animaux seront choisis pour leur docilité et leur aptitude à la manipulation, afin de réduire le stress lors des procédures. Un contrôle de l’état de santé des animaux est réalisé avant immunisation afin de s’assurer qu’ils sont aptes à subir des injections et des prélèvements sanguins. Un examen vétérinaire en fin de programme d’immunisation est réalisé pour vérifier l’état de santé complet de l’animal après l’enchaînement des injections et s’assurer qu’aucune nuisance ou complication anormale n’est survenue. Les lamas sont identifiés individuellement et seront suivis tout au long du projet pour assurer leur bien-être et la traçabilité des données. Les injections et les prélèvements seront réalisés par du personnel compétent, auquel les animaux sont habitués afin d’assurer une contention douce et rapide et un geste précis et efficace. Les volumes d’injection et de prélèvement seront strictement conformes aux recommandations pour limiter les réactions indésirables. Des aiguilles adaptées seront utilisées pour réduire la douleur, les antigènes seront injectés en alternant les côtés. A l’issue des injections ou prélèvements, les animaux concernés seront gardés tous ensemble en observation dans le box « Infirmerie » ou dans l’enclos contigu à l’infirmerie pendant une trentaine d’heures pour s’assurer de l’absence de réaction anormale (le lama étant un animal grégaire, aucun animal ne restera isolé de ses congénères). Ils regagneront ensuite le reste du troupeau. L’isolement ne dépassera pas 4 jours pour éviter tout problème comportemental lors de la réintégration. Une surveillance clinique quotidienne permettra d’intervenir rapidement en cas de signe d’inconfort.

Choix des espèces

Le recours aux lamas est essentiel pour ce projet, car ils appartiennent à la famille des Camélidés, seule espèce capable de produire des anticorps de très petite taille leur permettant ainsi d’atteindre des cibles inaccessibles par les anticorps classiques. Les lamas utilisés pour les séries de vaccination doivent être des adultes jeunes, généralement âgés de 2 à 11 ans, car cet intervalle correspond à une maturité optimale du système immunitaire garantissant le succès du projet. Les animaux trop jeunes (moins de 2 ans) présentent un système immunitaire encore en développement, ce qui pourrait compromettre la qualité des anticorps produits. À l’inverse, les animaux âgés peuvent avoir un système immunitaire affaibli ou des comorbidités, augmentant les risques de réactions indésirables. Le choix d’animaux adultes en bonne santé assure donc la fiabilité scientifique des résultats tout en limitant les risques pour leur bien-être.