Procédures sévères

280 souris mâles et femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie de lésion nerveuse, un test de douleur quotidien pendant quatorze jours, des injections de morphine et des prises de sang répétées toutes les dix minutes pendant trois heures. Le porteur indique que la lésion peut provoquer une perte de poids, de l'anxiété et des œdèmes, et que les injections chroniques peuvent entraîner une inflammation ou une infection locale. Il affirme que le modèle murin est "indispensable" et qu'il lui est "impossible d'utiliser un autre modèle" pour comparer l'effet de la morphine entre mâles et femelles, les retombées cliniques restant suspendues à une étude ultérieure chez l'être humain.

Objectifs

La douleur neuropathique (atteinte des nerfs conduisant à une douleur persistante) affecte 10% de la population et est traitée par des antidépresseurs qui sont peu ou pas efficaces. Les morphiniques sont alors utilisés pour soulager ce type de douleurs. Une fois administrée chez la souris, la morphine est transformée (ou métabolisée) en morphine-3-glucuronide (M3G). Alors que la morphine soulage la douleur, la M3G provoque de la douleur. Des différences de sensibilités face à la douleur et aux traitements analgésiques sont décrits chez l’homme et la femme, et chez les rongeurs. Ainsi, les rongeurs femelles sont plus sensibles à la douleur et les médicaments analgésiques sont moins efficaces. Nous avons récemment montré que le métabolisme de la morphine est diffèrent en fonction du sexe. Ainsi, nous avons observé une diminution des effets analgésiques de la morphine chez la souris femelle et une apparition plus rapide de ses effets secondaires. Cette découverte pose la question de la bonne prise en charge de la douleur chez les femmes par les opiacés. La plupart des études portant sur la morphine ont été réalisées sur des souris non douloureuses. Or, les douleurs neuropathiques induisent une inflammation du système nerveux qui a des répercussions sur l’analgésie. Par ailleurs, lors d’une neuropathie, des molécules sont produites en plus grande quantités dans le cerveau et influencent la dégradation de la morphine. Notre but est de déterminer s’il existe une différence d’analgésie et de métabolisation de la morphine entre les souris mâles et femelles rendues neuropathiques. Nous voulons définir s’il existe une altération de l’expression des enzymes de dégradation de la morphine et des facteurs liés à l’inflammation cérébrale. Ces résultats permettraient de développer par la suite des prises en charge de la neuropathie chez l’être Humain différentes en fonction du sexe, avec des posologies adaptées aux sexes.

Bénéfices attendus

Il existe des différences entre les effets analgésiques de la morphine entre les hommes et les femmes. Chez la souris, Les femelles nécessitent 30% de morphine en plus comparé aux mâles pour avoir une analgésie identique. Notre équipe a démontré que les souris femelles dégradent la morphine 2 fois plus en M3G qui est proalgique que les mâles. Or, une neuropathie produit une neuroinflammation et module l’analgésie à la morphine. L’étude proposée vise à définir s’il existe des différences sexe-spécifiques d’analgésie à la morphine dans le cas d’un modèle de neuropathie. Si des différences existent, cela signifierait qu’il existe potentiellement une mauvaise prise en charge de la douleur des femmes neuropathiques du fait d’une posologie non adaptée. Si des différences sont observées lors de notre étude, une étude clinique sera mise en place pour vérifier si c’est également le cas chez l’être humain.

Procédures

Un groupe de souris subira une intervention chirurgicale de 10 minutes et un test de douleur par jour (durée 30min) sera réalisé durant 14 jours, puis une injection de morphine sera réalisée. Un groupe de souris subira une intervention chirurgicale de 10 minutes et un test de douleur par jour (durée 30min) sera réalisé durant 14 jours, puis une injection de morphine (30s) et des prises de sang répétées seront réalisées durant 3h toutes les 10min . Un groupe de souris subiront des interventions chirurgicales de 10 minutes et un test de douleur par jour (durée 30min) sera réalisé durant 14 jours. Ces souris recevront 7 injections i.p. de stemregenin (30 sec ; total de 210 sec) post SNI. Une injection de morphine sera réalisée le 14ème jour.

Impact sur les animaux

Les animaux des groupes Sham et SNI peuvent faire l'objet d'une perte de poids ou d'anxiété. Il est également possible que ces animaux développent des œdèmes importants. De plus, une hypersensibilité mécanique sera observée sur les animaux du groupe SNI. Concernant les injections de morphine, celle-ci possède un effet analgésique qui apaisera la douleur neuropathique. Concernant les injections i.p. chroniques (1/j Durant 7 jours) peut conduire à une inflammation et à une infection localisée

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus.

Remplacement

L'utilisation d'un modèle murin est indispensable pour mener à bien ce projet. Le modèle de la souris permet à la fois d'étudier de façon très précise la nociception et la pharmacocinétique de la morphine. Pour ces raisons, il nous est impossible d'utiliser un autre modèle.

Réduction

Réduire : Un minimum de 140 souris C57BL6/J mâles et 140 femelles est nécessaire à la réalisation des études statistiques (total de 280 animaux). L’effet attendu étant inconnu, une analyse de puissance n’est pas possible. Toutefois, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 8-12 animaux par groupe étaient généralement suffisants pour obtenir la significativité statistique de l’effet d’un traitement antiallodynique en conditions neuropathiques. Les effectifs de 10 animaux tiennent également compte de la possibilité de devoir écarter un animal en cours de procédure (par exemple suite à des blessures consécutives à des bagarres) ou de la possibilité d’un problème technique (décès pendant la chirurgie). Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle cohorte avec tous les groupes contrôles devra être ajoutée ce qui va à l’encontre de la réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots successifs avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions à tester dans chaque lot.

Raffinement

Les animaux sont hébergés par groupe sociaux (même sexe/âge) pour respecter leurs besoins d'interactions sociales et leur cage enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunnels pour éviter la prise par la queue et réduire le stress des animaux. Pour aider à la reprise de poids, des aliments sous forme de gel sont déposés dans la cage. Les blessures superficielles sont désinfectées avec une solution de chlorhexidine. Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au contexte du test (i.e. boites du test) est réalisée. Dans les tests comportementaux où on évalue la sensibilité à un stimulus nociceptif, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) même en absence de réaction de l'animal. Par ailleurs des points-limites ont été établies pour pour chacune des procédures réalisées. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et sous analgésie et du gel oculaire est appliqué durant la procédure. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris reste la référence dans les études pré-cliniques pour réaliser des expériences en condition de douleur neuropathique. De plus, en plus d'avoir la possibilité de tester la sensibilité nociceptive chez la souris, dans le cadre de notre étude métabolique, la physiologie de cette espèce s'apparente facilement à celle de l'homme (biotransformation majoritaire de la morphine en M3G). Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines. En effet, les prises de morphine en tant qu’analgésique concernent principalement les populations adultes. D’autre part, la mise en place du système opioïdergique est uniquement mature chez l’adulte (i.e., expression des récepteurs Mu à la morphine).

1 110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une implantation de tumeur cérébrale suivie d'une résection, d'une irradiation et d'une chimiothérapie, la tumeur pouvant provoquer perte de poids, désorientation et déséquilibre. Le porteur reproduit sur la souris le protocole clinique des patients pour tester le ciblage de l'autophagie dans le glioblastome. Il affirme que l'implantation chez la souris est "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant le microenvironnement tumoral.

Objectifs

Les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales caractérisées par l’existence de différentes zones tumorales dans lesquelles les cellules cancéreuses interagissent avec un microenvironnement spécifique. L'autophagie est un moyen de dégrader les composants intracellulaires afin de de recycler des éléments nécessaires au fonctionnement cellulaire ou d’éliminer des composants toxiques ou non fonctionnels. Il existe des formes non spécifiques d’autophagie et des formes spécifiques de certains composants intracellulaires comme les mitochondries ou les zones de stockage des lipides : les gouttelettes lipidiques. L’autophagie est le plus souvent activée par les conditions de stress retrouvées dans les tumeurs. Elle est majoritairement associée à la survie des cellules cancéreuses mais le rôle des différentes formes d’autophagie dans les glioblastomes reste peu connu. Le projet vise à élucider le rôle de l’autophagie sélective et non sélective sur la progression des glioblastomes et en particulier son rôle dans le microenvironnement tumoral. Nous souhaitons valider notre hypothèse de l’implication de l’autophagie dans la progression des glioblastomes sur un minimum d’animaux pour tenir compte du contexte physiologique et du microenvironnement tumoral. Nous avons pour objectifs de (1) mesurer l’activité de l’autophagie sélective et non-sélective dans les différents compartiments des glioblastomes, (2) comprendre le rôle de l’autophagie sélective et non-sélective dans les cellules de glioblastomes, (3) étudier le rôle de l’autophagie dans la réponse aux traitements anticancéreux et (4) tester des modulateurs d’autophagie comme nouvelle stratégie thérapeutique.

Bénéfices attendus

L'absence de résultats cliniques significatifs pour le traitement des glioblastomes peut s'expliquer par la complexité, la grande capacité d’adaptation de ces tumeurs et le manque de modèles reproduisant cette complexité. L'autophagie est un des acteurs majeurs dans les interactions entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement tumoral. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l'autophagie dans les différents compartiments de la tumeur et d’apporter de nouvelles connaissances sur l'hétérogénéité des tumeurs cérébrales. Nous élargirons nos résultats à des conditions plus proches de ce qui est observé en clinique chez les patients, ce qui constitue un bénéfice pour l'étude du rôle de l’autophagie dans l’agressivité des glioblastomes. Pour cela, nous allons appliquer le protocole thérapeutique des patients aux modèles murins. Ce protocole consiste en la résection de la tumeur primaire puis traitement par radio et chimiothérapie. Grace à cette étude, nous pourrons tester le ciblage de l’autophagie comme une nouvelle stratégie thérapeutique afin d'améliorer le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales : une implantation de tumeur (10 min), une résection tumorale (10 min). Irradiation (10min). Injection d'un agent chimiothérapeutique (2 par jour pendant 8 jours non consécutifs). Suivi par bioluminescence: 6-25 min, une à deux fois par semaine. Injections de traitement ciblant l’autophagie (moins d'une minute par souris).

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs cérébrales peut générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, déséquilibre). Douleur légère mais répétée d’injections intrapéritonéales lors des injections de traitement ciblant l’autophagie. L'irradiation et la chimiothérapie peuvent induire des symptômes ressemblant à l'anxiété, des troubles de la mémoire spatiale et d'apprentissage chez la souris. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgie à l’issue des 2 interventions. De manière générale, chaque manipulation est génératrice de stress. Toutes les douleurs liées au protocole seront prises en charge en amont et en aval de la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés car tous les animaux sont utilisés pour l'implantation tumorale qui conduit aux points limites décrits précédemment.

Remplacement

Nous avons déjà mis en évidence par des tests fonctionnels in vitro que l’autophagie est impliquée dans les caractéristiques oncogéniques de cellules de glioblastome humaines. Or, nous savons que le microenvironnement tumoral est une composante essentielle à la régulation de l’autophagie dans les tumeurs. Bien que des tests in vitro existent pour mimer ce microenvironnement, aucun n'est capable de récapituler précisément ce qu'il se passe in vivo. L'implantation de tumeur chez la souris est donc indispensable pour tenir compte de la structure 3D, de la composition chimique, de l'interaction avec d'autres types cellulaires, avec la matrice extracellulaire, avec le flux sanguin. De plus, les conditions thérapeutiques des patients sont impossibles à mimer in vitro.

Réduction

Les études statistiques seront réalisées grâce aux tests statistiques adaptés à ce type d'expérience. Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre de bons résultats qui est de 8 souris. Nous prévoyons donc 10 souris par groupe pour éviter de finir une expérience avec moins de 8 souris par groupe en cas de problème pendant la procédure. Enfin, femelles et mâles seront utilisés. Par ailleurs, nos modèles murins de tumeurs se développent de manière très reproductible, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences.

Raffinement

Durant les expériences, nous assurons un confort des animaux (gel sur les yeux pour éviter de dessèchement durant l'anesthésie, tapis chauffant pour réguler la température corporelle). Des enrichissements (cocons et maisons rouges) sont placés dans les cages en tout temps et les hébergements sont collectifs. Nous assurons un suivi des animaux tout au long du projet, quotidiennement. Ceci nous permet de prendre en charge toutes les douleurs par une médication adaptée. Pour cela, nous utilisons des points limites spécifiques et adaptés à notre modèle (tumeur cérébrale). Nous procédons selon un arbre décisionnel évitant des souffrances inutiles grâce à des critères d’arrêt de l'expérimentation suffisamment précoces.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle immunodéfient car il permet d'implanter des tumeurs humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. La greffe récapitule la tumeur observée chez des patients. Les autres lignées murines sont immunocompétentes, elles possèdent toutes les cellules immunitaires. Elles permettent d'étudier le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Dans tous les cas, nous utilisons des souris de 7 à 9 semaines (adultes). Les expériences peuvent durer longtemps et nous voulons que le vieillissement n'intervienne pas dans le développement de la tumeur et le maintien en forme des souris. Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris mâles immunodéprimées reçoivent une greffe de tumeur prostatique, une chirurgie sous anesthésie et des séances répétées d'imagerie avec injection de radiotraceurs, pour évaluer de nouveaux agents d'imagerie et de thérapie du cancer de la prostate. Le porteur indique que les souris développeront un cancer et des métastases osseuses et hépatiques, et que les retombées cliniques restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que l'évaluation in vivo des radiotraceurs ne peut se faire que sur des animaux.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est aujourd'hui un problème de santé public majeur aux Etats- Unis et en Europe. Il représente le cancer le plus diagnostiqué chez l'homme de plus de 50 ans, et occupe la troisième place en terme de mortalité par cancer chez l’homme. Les radiothérapies vectorisées utilisées ces dernières années et combinées à l’utilisation de l’imagerie nucléaire diagnostique ont permis de faire évoluer de façon très positive la prise en charge des patients et en particulier dans le cas des cancers de la prostate métastatiques et résistants aux thérapies classiques. La plupart des produits utilisés sont basés sur un motif simple ciblant des récepteurs des cellules tumorales. La modulation de ces produits pour améliorer leurs efficacités reste toutefois délicate en l’absence de synthèse simple et l’exploration de nouvelles structures requière des temps de développement longs. Les méthodes de chimie modernes permettent de contourner une grande partie de ces difficultés en utilisant un motif de base simple et constant (comprenant un atome radioactif pour l’imagerie et/ou la thérapie) qui peut être greffé sur différentes structures qui modifieront la distribution et l’efficacité des molécules. L’évaluation des nouveaux agents d’imagerie pour le cancer de la prostate est réalisée le plus souvent sur des modèles tumoraux par injection de cellules tumorales en sous cutané ou directement dans la prostate. Dans ce projet, nous utiliserons le modèle intra-prostatique car il est plus représentatif du cancer humain (rôle du micro environnement tumoral, localisation) et des métastases (osseuse, pulmonaire et hépatique) peuvent être observées.

Bénéfices attendus

Le projet à pour objectif le développement de nouveaux ligands de récepteurs exprimés par les cellules tumorales des cancers de la prostate et leurs évaluations en tant qu’agents d’imagerie. Idéalement les composés qui seront validés pourront être utilisés à plus long terme pour des thérapies vectorisées. L’utilisation de modèles intra-prostatique est un point important pour une approche translationnelle si un des composés testés devait s’avérer suffisamment efficace pour des tests cliniques. Cette approche couplée à des études non invasives par imagerie permet en outre de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisé car chaque animal devient son propre témoin durant l’intégralité du protocole. A plus long terme, les molécules obtenues (et validées) pourront être utilisées pour d’autres modèles de cancer exprimant le même récepteur cible

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale d'une durée de 25 minutes, 1 par animal sur la durée du projet. Ils seront soumis à des examens d'imagerie répétés sous anesthésie générale, 10 examens par souris pour la phase de mise ne place du projet d'une durée de 120 secondes, maximum 8 examens d'une durée allant de 10 à 90 minutes espacés de 24 h minimum pour la phase d'imagerie. Ils recevront également une injection du radiotraceur sous anesthésie ( de 1 à 8 injections maximum sur la durée du projet, d'une durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : - perte de poids et de mobilité progressive à partir de la 10 ème semaine post injection de cellules cancéreuses, - apparition possible de métastases (osseuse, hépatique) à partir de la 10 ème semaine, -e) possible hématome temporaire au niveau du site d'injection du radiotraceur

Devenir

Cette étude portant sur un modèle de cancer murin induit par injection de cellules cancéreuses, les souris developperont un cancer ainsi que des métastases à la fin de l'étude. Il n'est donc pas éthique de les maintenir en vie.

Remplacement

L'objectif de ce travail étant d’évaluer in vivo différents radiotraceurs et en particulier leur captation dans des tumeurs ainsi que les voies d’élimination associées, elle ne peut se faire que sur des animaux.

Réduction

L’imagerie TEP est non invasive, les quantités de produits injectées sont extrêmement faibles et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Nous utiliserons 8-14 souris par groupe à l'inclusion pour pouvoir faire des statistiques sur les résultats obtenus. Ce nombre d'animaux par groupe est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité. Une étude pilote préalable a permis de déterminer les effectifs et les temps d'imagerie et de prélèvement.

Raffinement

Les souris immunodéficientes sont placées dans des cages ventilées pour les protéger des pathogènes de l'environnement. Elles sont maintenues à plusieurs par cage (interactions sociales) et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) leur permettant d'exprimer certains comportements naturels. Les séances d'imagerie sont réalisées sous anesthésie générale. Les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir leur température corporelle. Leurs paramètres vitaux sont monitorés et un gel hydratant ophtalmique est appliqué sur la rétine pour éviter le dessèchement oculaire. Les animaux sont hydratés par injection sous cutané de serum physiologique. La chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie. La température corporelle des animaux est maintenue grace à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. A la fin de la chirurgie les animaux sont réhydratés et reçoivent un traitement analgésique post-opératoire pendant 48h et leur état de santé est suivi pendant plusieurs jours à l'aide d'une grille de score. Afin de limiter la souffrance animale, des points limites ont été mis en place permettant d'interrompre la procédure.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est l'espèce couramment utilisée dans la littérature pour l'étude du cancer. Malgré sa petite taille pour la réalisation de xénogreffe intra prostatique, elle est parfaitement adaptée aux appareils d'imagerie que nous utiliserons dans ce protocole. L’étude portant sur des tumeurs prostatiques, seuls des souris mâles seront utilisées. Des souris mâles adultes agées de 7 semaines seront utilisées. C'est l'âge utilisé dans la littérature pour ce modèle de cancer.

12 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent un cathéter par chirurgie, sont immunodéprimés, puis infectés aux poumons par une bactérie résistante aux antibiotiques, une infection que le porteur décrit comme pouvant provoquer une détresse respiratoire et la mort avant la mise à mort programmée. Les poumons et la rate sont ensuite prélevés pour analyse. Le porteur indique que cette étude prolonge des travaux déjà menés sur la souris et affirme qu'un "second modèle animal est nécessaire" pour confirmer les résultats, le lapin permettant selon lui d'humaniser le traitement antibiotique.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer l’efficacité de la rifampicine dans un modèle d’infection pulmonaire à CRAb (Acinetobacter baumannii résistants au carbapénèmes) chez le lapin immunodéprimé. En effet les carbapénèmes constituaient la dernière ligne de traitement antibiotique efficace contre ce pathogène fréquemment associé aux infections nosocomiales (acquises en milieu hospitalier), telles que les pneumonies sévères acquises sous ventilation chez les patients de réanimation ou immunodéprimés. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude réalisée par le laboratoire ayant donnée de bons résultats avec la rifampicine chez le modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude déjà réalisée par notre équipe chez la souris où la rifampicine a entrainé une forte réduction bactérienne pulmonaire après l’infection par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes. La combinaison de la rifampicine avec un carbapénème (le méropénème) pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique contre les infections à A. baumannii résistant aux carbapénèmes.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de pose de cathéter veineux (30-45 min de l’anesthésie générale jusqu’au retour de l’animal dans sa cage). Ils subiront également une immunodépression via 3 injections d’un immunodepresseur par ce cathéter (1 min/ injection) puis une infection pulmonaire par inoculation intrabronchique de bactéries sous anesthésie générale (5-10 min de l’anesthésie jusqu’au retour de l’animal dans sa cage). Des traitements antibiotiques seront aussi réalisés par le cathéter (médié par une pompe pour le méropénème et effectué toutes les 8h pour la rifampicine)

Impact sur les animaux

1) Pose de cathéter : les animaux de ce projet devront subir un acte chirurgical pour la pose d’un cathéter veineux central. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale et accompagnée d’une analgésie adaptée, reste un acte invasif susceptible d’entrainer une gêne ou une douleur chez l’animal. La pose de cathéter permettra de limiter l’impact (stress et douleur) des traitements répétés. 2) Immunodépression : elle peut entrainer des effets secondaires tels qu’une baisse d’activité et une diminution de la prise alimentaire témoignant d’un l’affaiblissement général de l’animal. 3) Infection : réalisée elle aussi sous anesthésie générale, l’infection par voie intra-trachéale entrainera chez les animaux témoins, une infection sévère impliquant parfois une détresse respiratoire pouvant aboutir à la mort. : Des points limites spécifiques à ces nuisances ont été mis en place afin de limiter au maximum la souffrance des animaux

Devenir

Les poumons et la rate des animaux de la procédure seront collectés pour réaliser des analyses histologiques et microbiologiques. Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure.

Remplacement

Des analyses in vitro ont déjà été réalisées sur l’efficacité de la rifampicine sur certaines souches d’Acinetobacter baumannii. Toutefois réussir à retranscrire la complexité d’une infection bactérienne pulmonaire ainsi que sa diffusion tissulaire et systémique n’est aujourd’hui possible qu’à travers les modèles in vivo. Le modèle murin a déjà apporté de précieux résultats mais un second modèle animal est nécessaire pour les confirmer. « L’humanisation » du traitement au méropénème, plus facilement réalisable chez le lapin, offrira une meilleure appréhension de ce qu’il pourrait se passer chez l’homme.

Réduction

Ce projet a pour but de compléter les effectifs de l’étude de l’efficacité de deux antibiotiques (en association ou non) dans un modèle d’infection pulmonaire chez le lapin. Les 12 lapins de ce projet nous permettrons d’augmenter nos effectifs à 6 animaux par groupe ce qui est, au vu de la variabilité déjà observée, le nombre minimum d’animaux nécessaire pour une comparaison statistique solide entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés individuellement dans un environnement adapté, enrichi et seront surveillés au moins 2 fois par jour. Lors des pesées hebdomadaires précédent le projet, les animaux seront habitués à leur préhension et à leur contention. La pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie avec une analgésie. L’infection sera également réalisée sous anesthésie générale. Des critères d’arrêts de l’étude, supportés par une grille de score clinique, ont été définis afin d’assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La mesure de l’efficacité de la rifampicine (antibiotique) ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal, ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique. Le lapin, de par ses similarités physiologiques et immunitaires avec l’homme, représente classiquement un des modèles de choix pour la réalisation d’infections bactériennes pulmonaires. Il est également particulièrement approprié à l’humanisation de la pharmacocinétique de traitement antibiotique. En effet, son grand volume sanguin permet de réaliser des études pharmacocinétiques précises, sur de longues périodes. Le système d’administration par des pompes contrôlées par ordinateur est difficilement adaptable à des animaux de petite taille comme la souris. L’étude débutera lorsque les lapins auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent trois chirurgies, dont l'induction d'un accident vasculaire cérébral sur animal éveillé, seulement sous analgésie et anesthésie locale, puis des séances de contention, d'imagerie et de tests de récupération fonctionnelle. Le porteur reconnaît le stress lié à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée et les déficits fonctionnels qui en résultent, et fixe des points limites déclenchant la mise à mort. Il affirme que les approches in vitro ne reproduisent pas l'AVC et teste une molécule déjà employée chez l'humain, la chondroïtine sulfate.

Objectifs

L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Chaque année environ 17 millions de personnes dans le monde connaitront un épisode d’AVC pouvant entrainer des séquelles plus ou moins sévères voir la mort de l’individu. Actuellement, la prise en charge des patients repose sur l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) recombinant (lyse du caillot sanguin) associée ou non à la thrombectomie (intervention mécanique). Toutefois, seule une faible proportion des patients (inférieur à 10%) y sont éligibles. L’AVC est donc un problème de santé publique et nécessite le développement de nouvelles approches thérapeutiques afin d’élargir la prise en charge des patients. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la capacité de la Chondroïtine Sulfate (CS) à améliorer la lyse des caillots en synergie avec le tPA et de regarder l’impact sur les lésions cérébrale, les variations hémodynaliques ainsi que la récupération fonctionnelle suite à un AVC ischémique. Dans l'optique d’adopter une démarche translationnelle dans ce projet de recherche nous ferons usage d’un modèle davantage en adéquation avec la clinique notamment le modèle murin d’AVC ischémique chez l’animal vigile qui a été précédemment mis en place dans notre laboratoire. Ce modèle permet d’exclure tout impact de l’anesthésie sur les évènements associés à cette pathologie. En effet, les agents anesthésiants peuvent modifier le fonctionnement cérébral et notamment au niveau de la dynamique du réseau vasculaire ce qui peut interférer avec le décours de l’AVC mais également biaiser les résultats obtenus quant à l’efficacité de certaines molécules.

Bénéfices attendus

Grâce à la démarche translationnelle que nous adopterons lors de ce projet, les résultats de nos travaux permettront de démontrer l'intérêt de la Chondroïtine Sulfate, une molécule déjà utilisée chez l’Homme, notamment dans le traitement de l’arthrose. Ce traitement visera à améliorer la prise en charge des AVC ischémiques en favorisant la lyse des caillots en synergie avec le tPA.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - 3 chirurgies : Une chirurgie de pose de prothèse crânienne de 20 minutes sous anesthésie générale avec une couverture analgésique. Une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 30 à 45 minutes. Une chirurgie d'induction de l'ischémie sans anesthésie générale, sous couverture analgésique et sous anesthésie locale d’une durée de 40 minutes. - 2 protocoles comportementaux : Un protocole d'habituation à la contention et à l'IRM vigile par jour pendant 4 jours consécutifs, avec des sessions augmentant progressivement de 15 min jusqu'à 1h15 au total. Un protocole de récupération fonctionnelle à 24 heures post-AVC avec des sessions durant moins de 5 minutes par souris au total pour le premier test de comportement et une session de 1 minute par souris pour le second test de comportement. - 2 protocoles d'imagerie vigile : 5 acquisitions par échographie ultrasonore, où chaque acquisition dure 5 minutes (15min avant AVC, 10 min, 20min 60 min et 24h post-AVC). Une acquisition à l'IRM de 15 minutes, 24 heures après l’AVC.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d'apparaître chez les animaux lors de la procédure incluent le stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, les douleurs postopératoires après la pose de la prothèse, la perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC, les douleurs post-opératoires après la chirurgie d'accès à l'ACM, le stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, et les déficits fonctionnels à la suite de l'AVC.

Devenir

Le caractère sévère des procédures suivies par tous les animaux ce projet rends impossible toute réutilisation ou proposition à une adoption. A la fin de chaque procédure les animaux seront donc mis à mort.

Remplacement

Les expériences in vitro ou ex vivo ne parviennent pas à reproduire parfaitement l'AVC en raison des multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux central. Par conséquent, les procédures expérimentales de ce projet ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes ne faisant pas appel à l'utilisation d'animaux vivants. Les techniques de substitution ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information pour évaluer une récupération fonctionnelle.

Réduction

Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur l'expertise acquise dans la réalisation des gestes techniques, ainsi que sur les données d'études antérieures utilisant le modèle d’AVC ischémique chez l’animal vigile. Ces études ont démontré des résultats significatifs tout en réduisant au maximum les effectifs. Nous avons pris soin de déterminer un nombre minimal d’animaux, respectant ainsi le principe de réduction, tout en garantissant la bonne acquisition des gestes techniques et chirurgicaux, ainsi que la reproductibilité des résultats. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes employées, ainsi que de l'expertise nécessaire à la réalisation précise des gestes techniques. L'utilisation d'outils d'imagerie non invasive tels que l'IRM et l'échographie contribue significativement à réduire le nombre d'animaux nécessaires dans le projet. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total de 120) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α égal à 0.05 ; β égal à 0.8). Les échantillons sont suffisamment importants pour pouvoir utiliser des tests paramétriques de type ANOVA à deux facteurs puis le test post-hock de Dunette. Nous pourrons également utiliser des tests de Mann-Whitney et de Wilcoxon.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Les cages seront enrichies (coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que des paillettes). Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux seront gardés en acclimatation avant expérimentation pendant une semaine. Puis ils seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Le protocole d'habituation progressif à la contention permet de réduire le stress des souris lors de l'induction de l'AVC et de l'imagerie vigile. Durant l'induction de l'AVC, les souris sont sous analgésie et sous anesthésie locale au niveau de l'ACM. Les yeux de la souris sont couverts afin de ne pas l'éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et des bouchons d'oreilles sont prévus pour l'IRM vigile afin de réduire le bruit ambiant. Après la chirurgie d'induction de l'AVC, une période de récupération de 3 jours est prévue : les souris disposent de croquettes humides dans une coupelle placée au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort dans l'une des situations suivantes : - signes de douleur extérieure indexés sur le grimace-scale souris (NC3Rs) (Score supérieur à 5 plus de 48h) ; - absence de réaction ; - animal inactif dans sa cage ; - complications chirurgicales inattendues (hémorragie impossible à stopper, détresse cadio-respiratoire, échec) ; - perte de poids supérieur à 20%. - décollement de la prothèse crânienne.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. C’est également l’espèce de référence pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les évènements précoces au cours de l’AVC ischémique. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. De plus, un travail préliminaire de développement du modèle d’AVC ischémique chez l’animal vigile au laboratoire a été mené chez le souris et permet d’avoir une expertise pour l’application de ce protocole chez la souris.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié porte des mutations qui provoquent un cancer du pancréas mortel, et toutes reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux semaines avant d'être tuées, une partie par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie, pour prélever le pancréas. Le porteur indique utiliser les animaux avant l'apparition des symptômes terminaux, perte de poids, baisse d'activité et douleur, et administrer le composé BAPN à un âge où il ne provoquerait pas de dissections aortiques. Les retombées thérapeutiques évoquées, cibler l'innervation tumorale, restent renvoyées au long terme, l'objectif immédiat étant d'accroître les connaissances fondamentales.

Objectifs

Récemment, il a été montré que système nerveux périphérique régule le développement tumoral. Cette fonction repose sur la capacité des neurones à infiltrer les tumeurs et à y libérer des substances qui influencent la croissance de la tumeur. Les mécanismes impliqués dans l’innervation tumorale sont encore mal connus. Notre équipe s’intéresse à l’adénocarcinome canalaire du pancréas (ADKP) qui est abondamment innervé par le système nerveux sensoriel. Ce projet explorera le rôle des propriétés mécaniques des tissus (ex : rigidité) dans l’innervation tumorale. Nos objectifs scientifiques sont de moduler la rigidité du tissu tumoral afin d’évaluer l’impact sur l’innervation des tumeurs par le système nerveux sensoriel.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer et l'amélioration de la qualité de vie des patients. En effet, la découverte d'un rôle direct du système nerveux dans la régulation de la tumorigenèse a ouvert l'espoir de nouvelles approches thérapeutiques contre le cancer ciblant l'activité neuronale. Les stratégies cliniques actuellement en cours d'évaluation utilisent des inhibiteurs de la signalisation synaptique ou postsynaptique (par exemple, les bêta-bloquants, le botox). Cependant, une inactivation générale de l'activité neuronale chez les patients pourrait avoir des effets secondaires importants et délétères. Perturber l’innervation tumorale pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique plus cibler pour le traitement de l’ADKP.

Procédures

Les procédures de ce projet impliquent des injections intrapéritonéales journalières sur une durée de 2 semaines, à partir de 6 semaines, sur 48 souris (24 souris tumorales et 24 souris contrôles). Une procédure de ce projet implique également une mise à mort de 24 de ces animaux (12 KIC et 12 contrôles) par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde 4% sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Ce projet utilise des animaux transgéniques modèles de l’ADKP. Les souris développent des tumeurs malignes vers l’âge de 6.5 semaines dont la progression est fatale (survie médiane 9.5 semaines). En phase terminale, les souris présentent une perte de poids et une baisse d’activité et de la douleur liée à la progression du cancer. Dans nos procédures, les individus sont utilisés avant l’apparition de ces symptômes (entre 6 et 8 semaines). Ce projet utilise également du bêta-aminopropionitrile (BAPN) afin de diminuer la rigidité tissulaire/tumorale in vivo. L’utilisation de BAPN sur de jeunes individus (3-4 semaines) est connu pour entrainer des dissections aortiques douloureuses. Cependant, le traitement au BAPN seul n’est pas suffisant pour induire des dissections aortiques chez des individus âgés de 6 semaines ou plus. Notre étude utilise le BAPN sur des individus âgés de 6 à 8 semaines, ne laissant pas présager de nuisance supplémentaires à celles induites par l’injection intrapéritonéale elle-même (mode d’administration).

Devenir

Le prélèvement des tissus pancréatiques est nécessaire au projet. Toutes les souris seront donc mises à mort afin de prélever le pancréas.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternative non-animale permettant d’étudier les interactions physiologiques entre deux organes (système nerveux et tumeur pancréatique ici).

Réduction

Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, en l’absence de données préliminaires, nous utilisons la méthode de « resource equation » qui estime qu’un n=6 individus/groupe est une taille de cohorte suffisante pour comparer deux conditions expérimentales.

Raffinement

Dans la mesure du possible, les individus sont maintenus dans les en groupes sociaux de même sexe (5 individus maximum). Le bien-être des animaux est amélioré par un enrichissement des cages qui est maintenu en permanence. Des pièces de coton, de bois ou des nids sont ajoutés dans les cages en alternance toutes les 3 semaines. Nous utiliserons un modèle de souris transgéniques KIC développant des tumeurs pancréatiques après 6.5 semaines. Plusieurs mutations génétiques sont nécessaires à l’apparition des tumeurs pancréatiques. Deux lignées de souris portant uniquement certaines de ces mutations, et ne développant donc pas de tumeurs, seront conservées. Le croisement entre les deux lignées ne sera effectué que pour générer les individus KIC nécessaires aux expérimentations. Les souris KIC, qui développent des tumeurs, ne seront donc générées que pour les besoins de l’expérimentation et nous utiliserons les souris entre 6 et 8 semaines, c’est à-dire avant l’apparition des symptômes liés à la phase terminale (perte de poids, réduction d’activité et douleur importante).

Choix des espèces

Ce projet utilise des animaux transgéniques KIC modèles de l’ADKP. Les souris développent des tumeurs malignes vers l’âge de 6.5 semaines dont la progression est fatale (survie médiane 9.5 semaines). Notre projet s'intéresse au stade tumoral. Dans nos procédures, les individus sont utilisés au stade tumoral, mais avant l’apparition de des symptômes de la phase terminale (perte de poids, baisse d’activité et douleur manifeste qui apparaissent après 8 semaines généralement). Le prélèvement des tissus pour analyse sera réalisé sur des individus de 8 semaines.

526 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection intraveineuse de siRNA déclenche une thrombose que le porteur qualifie lui-même de "douleur sévère", pouvant provoquer perte de poids, léthargie, hypothermie et hémorragies oculaires et sous-cutanées. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou atteignent un score limite sont mises à mort, les autres étant tuées pour prélever sang et tissus. Le porteur affirme qu'il n'existe "aucune méthode alternative" et revendique le modèle murin comme référence, tout en reconnaissant des différences entre immunité murine et humaine.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre quels sont les conséquences du rôle inflammatoire plaquettaire et le thrombin dans la maladie thromboembolique veineuse (MTEV).

Bénéfices attendus

Les plaquettes et le thrombin semblent pouvoir jouer un rôle clé dans cette situation : plaquettes sont connues comme impliquées à la fois dans la survenue d’un épisode thrombotique, et aussi comme facteurs intervenant dans la réponse inflammatoire. Les plaquettes régulent directement la réponse immunitaire par l’expression et la sécrétion de molécules inflammatoires. De plus, elles sont capables de fixer des micro-organismes. Enfin, les plaquettes interagissent avec les cellules immunitaires, notamment les neutrophiles et les macrophages. On pense maintenant que les plaquettes pourraient agir comme des cellules sentinelles du système immunitaire. La thrombine est un acteur clé de la coagulation et un activateur plaquettaire, et une meilleure compréhension du rôle de cette molécule est cruciale pour améliorer nos connaissances sur la MTEV

Procédures

Les souris vont subir de 1 à 2 injections intrvaveineuses d'une durée de 4 secondes chacune, sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La thrombose induite pas ces approches expérimentales ne met pas la vie des souris en danger. La thrombose spontanée, induite par injection intraveineuse des siRNA, est considérées comme "douleur sévère" infligée aux animaux. Suite à l’induction de la thrombose après l’injection des siRNA contre les protéines (antithrombine/protéine C), on peut observer une perte de poids, une léthargie, une absence de réponse aux stimuli et une hypothermie. Des lésions unilatérales impliquant l'œil (exophtalmie) ainsi que des hémorragies intraoculaires et périoculaires peuvent être observées, tout comme des gonflements des régions maxillaires, mandibulaires et submandibulaires ; hémorragies sous-cutanées et intramusculaires. Aucune anomalie visible, aucun effet secondaire connu sont reportés pour les déplétions plaquettaires, des neutrophiles et des macrophages. Concernant les infections bactériennes, les souris peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une perte de poids. Les souris peuvent apparaître léthargiques et insensibles aux stimuli. Les souris seront observées quotidiennement notamment pour la recherche des possibles phénotypes ci-dessus inclus dans les calculs des points limites. Les effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Le traitement des souris avec des inhibiteurs de la thrombine (dabigatran, ACD-10, hirudine) ne coïncide avec aucune forme d'anomalie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupération de sang et de tissus biologiques

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’exploration du rôle inflammatoire plaquettaire dans la maladie thromboembolique veineuse (MTEV) nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme et dans le but de cibler des thérapeutiques modulant la physiologie des plaquettes sanguines.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons évalué in vitro le rôle inflammatoire des plaquettes sanguines en lien avec l’immunothrombose que ce soit dans des contextes infectieux ou non. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche. Afin de réduire le protocole, une étude pilote de 10 animaux permettra la mise au point et la maîtrise des gestes opérationnels. Un groupe « mise au point de la procédure » ainsi que 2 groupes « expérimentaux » de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail.

Raffinement

Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permette d'avoir un enrichissement (avec paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Afin de réduire la souffrance occasionnée par l’expérience, les souris seront observées quotidiennement et seront mises à mort lorsqu’une perte de poids de plus de 20% sera constatée ou lorsque qu’un pointage limite de 5 sera atteint dans la grille de suivi du bien-être animal. Ce seuil correspond à un niveau de souffrance ne pouvant être prolongé chez l’animal. Les souris vont subir de 1 à 2 injections intraveineuses d'une durée de 4 secondes chacune, sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Une ponction cardiaque lors du prélèvement sanguin sera réalisée sur les animaux sous anesthésie.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de la physiopathologie des phénomènes thrombotiques. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations immunologiques humaines. Nous étudions les séquelles de la thrombose veineuse chez la souris. Pour notre étude, nous utiliserons des souris consanguines de plus de 20 grammes, âgées de 6 à 10 semaines. Les mâles et les femelles seront inclus dans nos expériences, sauf si la formation de thrombus s'avère absente/moins reproductible chez l'un des deux sexes lors de la mise en place du modèle animal, ce qui à ce jour n’est pas démontré dans les études de prévalences homme/femme dans cette pathologie.