Procédures sévères

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris reçoit une greffe de peau humaine sur le dos sous anesthésie, puis une injection de méningocoques qui déclenche une septicémie, évoluant selon le porteur d'une baisse d'activité vers la prostration puis la mort. Elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées car greffées et infectées, et sont tuées à la fin de chaque procédure. Le porteur décrit son modèle humanisé comme "le seul et unique" reproduisant ces infections chez la souris, pour étudier la résistance de la bactérie aux antibiotiques.

Objectifs

Les infections invasives à méningocoques sont causées par le méningocoque, une bactérie pathogène à Gram-négatif responsable de méningites et de chocs septiques. Ces infections restent malheureusement encore trop souvent létales malgré l’existence d’un traitement antibiotique. En effet, in vitro dans une boite de pétri, la bactérie est très sensible aux antibiotiques. Cependant, in vivo dans le corps humain, cette bactérie résiste aux traitements antibiotiques efficaces in vitro pour des raisons encore inconnues. L’objectif de ce projet est d’étudier les causes de cette antibiorésistance et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la contrer.

Bénéfices attendus

Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoques observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins entrainant le déclenchement d’une septicémie. A court et moyen terme, ce projet nous permettra : • D’étudier les déterminants impliqués dans la mise en place du phénomène de résistance aux antibiotiques • De tester et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrer la résistance aux antibiotiques A long terme nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme.

Procédures

Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 2 types d’expériences : 1. Des expériences où les animaux seront infectés par l’injection intraveineuse de bactéries. Les injections se feront via la veine caudale sur des animaux vigiles placé dans un tube de contention pendant 2min. Les animaux seront infectés pendant 3, 6 ou 16 heures puis seront mis à mort. 2. Des expériences d’imagerie intravitale pour l’étude de l’infection via des observations en microscopie réalisée in vivo, chez l’animal anesthésié. À la suite de l’infection des animaux par l'injection intraveineuse de bactéries, les observations seront réalisées pendant une période maximale de 6h00.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : • L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection intraveineuse de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.

Remplacement

Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilisent des cultures in vitro de cellules humaines infectées, notamment des cultures de cellules endothéliales ou épithéliales, les deux types cellulaires sur lesquels la bactérie peut se fixer. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoques.

Réduction

Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude où nous avons pu identifier plusieurs causes potentielles de perte d’animaux lors de nos expériences : 1. Une mort prématurée lors de la chirurgie de greffe de peau : hémorragie, non réveil de l’animal… 2. Une mauvaise évolution du greffon au cours du temps conduisant à l’exclusion de l’animal : lésions de grattage, diminution importante de la taille… 3. Une mauvaise qualité du greffon : présence de peu de vaisseaux humains 4. Une mort prématurée de l’animal lors des infections

Raffinement

Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ceux-ci seront hébergés dans une animalerie au statut SPF (specific pathogen free). Une inspection quotidienne permettra de vérifier qu’il n’y a aucune détérioration de leur état due à une potentielle infection. 30 minutes avant le début de la chirurgie, les animaux sont prémédiqués avec l’injection sous cutanée d’un antalgique et d’un anti-inflammatoire non stéroïdien. La chirurgie (~30 min) est réalisée sur des animaux anesthésiés,. Avant de placer les animaux greffés dans leur cage de réveil, ceux-ci sont réhydratés par une injection sous-cutanée de sérum physiologique. Les animaux sont ensuite placés dans une cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie pendant le port de leur bandage afin de détecter des signes éventuels de souffrance et vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l’évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Les animaux sont placés après infection dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichi en sucres et dont la moitié du sol de la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux infectés. Lors des expériences d’exploration par microscopie optique confocale, les animaux reçoivent un traitement préopératoire analgésique 30 min avant le début de l’anesthésie et la chirurgie permettant d’exposer le greffon pour l’observation des vaisseaux humains. Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 3 par cage dans des cages contenant du coton et un igloo. Des points limites sont établis pour chacune des procédures expérimentales et associés à des interventions pour réduire leur impact sur le bien-être animal.

Choix des espèces

Cette étude utilise des souris car le système vasculaire et immunitaire de la souris est proche du système vasculaire et immunitaire humain. De plus les modèles immunodéficients disponibles chez cette espèce en font le modèle le choix pour la xénogreffe de peau humaine. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentions sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.

896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour un modèle génétique de malformations de la face et de l'intestin. Le porteur indique que les souriceaux les plus atteints meurent après la naissance de malformations qui les empêchent de se nourrir, et qu'une analgésie n'est pas possible pour ces animaux trop fragiles pour survivre au sevrage. La survie d'une partie est suivie pendant trois semaines au maximum avant mise à mort, tandis que des femelles et des mâles reproducteurs sont gardés et réutilisés pour d'autres portées. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour ces maladies rares et qu'il est "nécessaire" de faire naître des animaux.

Objectifs

Il existe dans la cellule des processus de régulation de la production d'energie. Nous avons montré que l'inactivation de l'une de ces voies dans les cellules à l'origine de la formation des os de la face et du système nerveux de l'intestin aboutissait à la naissance de souriceaux présentants de graves malformations de la face et de motricité digestive. Dans notre modèle génétiquement modifié dans lequel une voie de production d'ernergie est inactivée,nous inactivons un second gène. Il est décrit dans le littérature scientifique que cela avait des effets bénéfiques dans d'autres pathologies de la même famille.

Bénéfices attendus

Les malformations associées aux defauts de développement que nous étudions sont à l'origine de maladies congénitales chez l'enfant qui se traduisent comme dans notre modèle par des malformations de la face et du système nerveux de l'intestin. Ce groupe de maladies s'appelle des neurocristopathies. Parmi les plus connues il y a le syndrome de Hirschsprung et celui de Waardenburg. D'autres malformations sont aussi concernées comme celles qui surviennent suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse ou la prise de médicaments dit tératogènes, c'est à dire qui peuvent induire des malformations du foetus lorsqu'ils sont pris en période de grossesse. Ce sont des maladies orphelines, pour lesquelles presque aucun traitement n'est disponible à ce jour. Les bénéfices attendus sont notamment une amélioration de nos connaissances sur le rôle des processus cellulaires de production d'ernergie et du métabolisme en général dans l'apparation de ces syndromes.

Procédures

Bien que le phénotype attendu soit sévère nous utilisons 42 % des animaux produit à la naissance ou avant. Pour ces animaux il n'y aura aucune souffrance. Pour 7% nous étudierons leur survie après inactivation d'un gène, pour une période de 3 semaines maximum. Les animaux seront observés et monitorés selon les points limites décrits dans le projet. Enfin 59% sont des animaux d'élevage pour lesquel il n'y aura aucune souffrance. Pour suivre les animaux reproducteur nous effectuerons avant leur 15jours un tatouage aux phalanges en conformité avec les recommandations de la CNEEA et sous la supervision de notre SBEA. En outre pour le génotypage de nos animaux, nous effectuerons 1 biopsie de moins d'un millimètre de large à l'oreille.

Impact sur les animaux

Les animaux les plus sévèrement atteint meurent après la naissance à cause de multiples malformations qui les empêches de se nourrir et de digérer normalement. La gravité de ces malformations est variable d'un individu à l'autre et les points limites nous permettrons de minimiser la souffrance de ces animaux. Une analgésie n'est pas possible pour ces animaux fragiles qui ne survivront pas jusqu'au sevrage. La biopsie pour le génotypage des individus pourra produire douleur légère de courte durée au moment du prélèvement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure car leur maladie est sévère et incurable. L'euthanasie sera suivi de prélèvement post mortem pour des études de biologie moléculaire et d'histologie.

Remplacement

Nous travaillons sur des syndromes liés à des défauts de développement embryonnaire. Ces pathologies génétiques rares au tableau clinique complexe n'ont pas de modèle in vitro. En parallèle d'études des mécanismes moléculaires in vitro sur une lignée de cellule de crêtes neurales, il est nécessaire d'étudier le devenir de ces cellules in vivo, dans leur microenvironnement. Pour étudier l'impact réel des modifications génétiques sur l'évolution de ces pathologies, nous devons faire naitre des animaux.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux à faire naitre, nous obtimisons nos croisements pour maximiser les chances d'obtenir. Pour la réalisation d'une coube de survie, la dispersion le long de l'axe temporel nécéssite que nous utilisions 10 individus pour nos statistiques. hormis cette expérimentation, toutes nos analyses sont réalisés sur des tissus post-mortem. La pénétrance du phénotype étant variable d'un individu à l'autres 10 individus permet de nous assurer que nos conclusions sont robustes.

Raffinement

Les femelles seront regroupées et réutilisées après l'expérimentation pour générer d'autres portées. Les points limites prédictifs et précoces sont en place pour éviter toute souffrance aux animaux. (mise à mort si perte de poids, euthanasie des animaux avant l'apparition des tumeurs chez nos animaux reproducteurs. Les mâles reproducteurs devront être isolés après les accouplements car il n'est plus possible de les mettre entre mâles et les laisser avec des femelles engendrerrait trop de portées inutiles. Les cages font déjà l'objet d'un enrichissement important dans toutes les cages. Les cages ouvertes dans notre animalerie permet des échanges olfactifs et visuels. Les mâles pouvant reservir pour de nombreux accouplement nous les gardons pour les réutiliser.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré dont de developpement de l'embryon est très proche de celui de l'Homme, En outre, nous avons déjà beaucoup de donnée dans nos modèles animaux. Nous travaillons à la compréhension du famille de maladie du developpement induisant des malformations graves chez les enfants. Nous travaillons donc à un stade embryonnaire E15,5 et avec des animaux nouveaux-nés. Nous travaillons aussi avec quelques animaux en période de lactation pour évaluer l'évolution de la pathologie les jours suivants la naissance après des traitements correcteurs.

318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris subit une chirurgie de pose de sonde, l'induction d'un accident vasculaire cérébral par obstruction d'une artère cérébrale sous anesthésie, puis la pose d'une pompe sous la peau, avant d'être tuée dans les 24 heures pour analyse. Le porteur indique un risque de saignement à chaque chirurgie et une réduction de la mobilité liée à l'AVC pouvant gêner l'alimentation. Le projet, mené avec une start-up qui développe la molécule testée, vise à comprendre son mécanisme d'action, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro n'est assez sophistiqué pour reproduire l'AVC ischémique.

Objectifs

Les plaquettes jouent un rôle central dans l’arrêt du saignement qu’on appelle hémostase. Elles s’accumulent au niveau d’une lésion vasculaire, pour former un caillot qui stoppe les saignements. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies ischémiques graves comme l’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Dans le cadre du traitement de l’AVCi, le caillot obstruant la circulation est soit dissous par par l’administration d’un médicament, soit retiré mécaniquement, ce qui permet de rétablir le flux sanguin des artères cérébrales. Cependant, ces traitements ont une efficacité modérée, due notamment à la formation de microcaillot et à l’inflammation ayant lieu à la suite au rétablissement du flux sanguin cérébral. Ce projet, se focalisant principalement sur la formation de microcaillot et l’inflammation, est mené en collaboration avec la start-up qui développe un candidat médicament ciblant et inhibant la glycoprotéine plaquettaire VI. Une étude clinique récente montre que ce traitement divise par 3 la mortalité de patients qui présentent un AVC ischémique lorsqu’il est associé aux traitements de références. L’essai clinique indique également que ce traitement réduit de façon importante la survenue d’hémorragies cérébrale liées à l’AVC. Le mécanisme du médicament conduisant à ces effets bénéfiques reste cependant peu compris à ce jour mais l’hypothèse émise impliquerait une inhibition de la formation des microcaillot et de l’inflammation lors du rétablissement du flux sanguin cérébral. Ce projet vise alors à déterminer le mécanisme d’action du traitement anti-GPVI lorsqu’il est utilisé pour traiter l’AVC ischémique chez la souris.

Bénéfices attendus

Un candidat médicament ciblant et inhibant la glycoprotéine plaquettaire VI a déjà montré un effet protecteur dans le traitement de l’AVC lors d’un essai clinique. Nous souhaitons ici comprendre le mécanisme d’action de ce médicament sur la transformation hemorragique et l’aggravation de l’AVC, ce qui pourrait conduire à une mise sur le marché du produit si les mécanismes sont identifiés et que les essais cliniques chez l’Homme sont concluants. Ce projet pourrait ouvrir, à long terme, des perspectives de nouvelles indications cliniques chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux subiront : • Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale permettant la pose de la sonde permettant de visualiser le flux sanguin de l’artére cérébrale qui sera obstruée. Procédure : 10 minutes • Une induction d’un accident vasculaire cérébral (AVC) par obstruction transitoire d’une artère cérébrale sous anesthésie générale ainsi qu’une injection par voie intraveineuse du traitement. Procédure : 25 minutes • Une pose d’un dispositif sous la peau du dos pour diffusion continue du traitement. Procédure : 5 minutes • Mise à mort pour analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Lors de l’expérimentation, nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence réspiratoire et une baisse de la température corporelle provoquée par l’anesthésie. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la pose de la sonde de mesure du flux sanguin ainsi qu’un inconfort au niveau de l’incision. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la pose de la pompe permettant la diffusion continue du traitement, ainsi qu’un impact sur la mobilité et un inconfort au niveau de l’incision. Nous ne nous attendons pas à un impact du traitement sur les risques de saignements. Nous pouvons nous attendre à un risque de saignement lors de la chirurgie permettant d’induire l’AVC. A une réduction de la mobilité causée par l’AVC, pouvant rendre difficile l’alimentation. Egalement, à un inconfort postopératoire au niveau de l’incision.

Devenir

Le projet s’intéresse à l’étude de l’effet d’un traitement anti-GPVI dans la formation de microcaillot et l’inflammation lors d’un AVC ischémique. A l’issue de la procédure expérimentale qui concernent la mise en place du modèle l’ensemble des animaux seront maintenues en vie durant 24h maximum. 24h après la réalisation de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de procéder à des analyses post mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’une nouvelle molécule, inhibitrice de la glycoprotéine VI des plaquettes, dans un processus complexe est intégré qu’est l’AVC ischémique. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo. De plus, les plaquettes sont des cellules sans noyau qui ne peuvent être cultivées dans des boites, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire qui aurait pu être envisagé pour étudier une partie du processus.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 16 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par une habituation au gel nutritif 1 jour avant l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’injection d’un analgésique pendant et après chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo y sont largement répandus et maitrisés. La souris est un modèle couramment utilisé et bien caractériser pour évaluer la formation de thrombus et l’AVC ischémique. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement

150 oiseaux de volaille vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une souche infectieuse puis subissent plusieurs prélèvements sanguins avant un prélèvement total et terminal, afin de produire du sérum servant aux contrôles qualité de lots de vaccins. Le porteur indique que certains animaux développent prostration, décubitus, déshydratation sévère, voire une mortalité subite. Il présente cette production comme sans alternative in vitro, tout en la reliant à des tests qui limiteraient par ailleurs le nombre d'animaux utilisés.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de produire des réactifs nécessaires aux laboratoires pour effectuer et valider des tests in vitro, tout en satisfaisant aux exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM). Ces tests permettent de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la mise sur le marché d’un lot de vaccins. Ils sont effectués sur espèce cible. Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif.

Bénéfices attendus

Ces tests permettent la réalisation des contrôles in vitro réalisés dans les laboratoires. Ceci permet la mise sur le marché de vaccins qui protègent efficacement les animaux contre les maladies infectieuses, améliorent directement la qualité sanitaire des élevages et assurent un meilleur bien-être animal en favorisant les méthodes alternatives.

Procédures

Administration de la souche à tous les animaux en vigile. 1 à 2 fois selon le protocole. Acte très rapide inférieur à 30 secondes. Prélèvements sanguins 2 à 5 fois pendant la durée du protocole. Sur tous les animaux en vigile. Acte très rapide inférieur à 1 minute. Prélèvement sanguin total et terminal sur tous les animaux à la fin du protocole sous anesthésie e. Euthanasie de tous les animaux.

Impact sur les animaux

Stress liés aux manipulations et aux injections. Certains animaux développent la maladie : prostration, décubitus, déshydratation sévère, dans certains cas mortalité subite. Des points limites spécifiques sont déterminés et appliqués dans ce cas.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issu du protocole dans le but de récolter du sérum.

Remplacement

La production de sérums hyper immuns n’est possible qu’in vivo, il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour produire ces sérums.

Réduction

Le nombre d’animaux est directement lié à la quantité de réactifs nécessaires à la réalisation de tests in vitro qui ont été développés afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les procédures de contrôles qualité ayant pour but la libération d’un lot vaccins. Les process de prélèvement ont été optimisés pour garantir de récolter le maximum de sang est ainsi limiter au strict nécessaire le nombre d’animaux.

Raffinement

Des points limites spécifiques à la pathologie sont déterminés et appliqués. Lorsque la pathologie le nécessite, 2 ou 3 observations cliniques quotidiennes permettent d’identifier les cas pour lesquels l’animal doit avoir une prise en charge spécifique ou le déclenchement d’une euthanasie précoce. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Les réactifs produits sont spécifiques et liés à l’espèce. Animaux âgés d’un jour à six semaines

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent deux chirurgies destinées à provoquer une insuffisance rénale chronique, accompagnée de désordres cardiovasculaires et osseux, les mâles étant isolés quinze semaines pour éviter les bagarres. Le porteur anticipe une prise de poids réduite et, dans de rares cas, une mortalité de l'ordre de 10 %, intégrée au calcul des effectifs. Les tibias et fémurs sont prélevés après la mise à mort pour étudier la fragilité osseuse.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une fragilité osseuse multipliant par 4 l’incidence des fractures et doublant le risque de mortalité chez les patients dialysés. A ce jour, les mécanismes responsables de la fragilité osseuse liée à l’IRC restent mal connus. Aucun des traitements testés jusqu’ici n’a montré de réelle efficacité dans ce contexte. L’identification de nouveaux traitements est d’autant plus difficile que la plupart des molécules actuellement disponibles sont contre-indiquées en cas d’IRC. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette fragilité osseuse apparaît donc nécessaire afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Des observations cliniques récentes suggèrent que les patients souffrant d’IRC ont un niveau de graisse dans la moelle osseuse (adiposité médullaire) significativement plus élevé que les sujets ayant une fonction rénale normale. L’adiposité médullaire (AM) correspond à une accumulation de cellules graisseuses, appelées adipocytes médullaires (AdMed), au niveau de la moelle osseuse. Les études menées ces dix dernières années montrent que l’élévation de l’AM est associée à des altérations de la structure osseuse qui favorise le risque de fracture. Les études menées in vitro montrent que les AdMed sécrètent des facteurs modulant la fonction des ostéoblastes (formant l’os) et des ostéoclastes (résorbant l’os). Ils pourraient donc avoir un rôle clé dans la régulation du remodelage osseux. Nous avons émis l’hypothèse que l’élévation d’AM pourrait être à l’origine de la fragilité osseuse observée dans l’IRC. Ce projet présente deux objectifs principaux : 1- identifier les mécanismes par lesquels l’IRC amplifie l’AM, 2- évaluer l’influence des AdMed issus de conditions IRC sur l’activité des ostéoblastes, des ostéoclastes, et sur la qualité osseuse.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette étude nous permettra de conclure quant à l’existence ou non d’un lien de causalité entre AM et fragilité osseuse dans l’IRC. Les résultats que nous obtiendrons offriront une source très importante de pistes mécanistiques à explorer afin d’identifier les voies impliquées dans le développement des altérations osseuses observées chez les souris IRC. Cela pourrait conduire à l’identification de cibles thérapeutiques/diagnostiques prometteuses pour le développement de nouvelles stratégies de prise en charge de la fragilité osseuse chez ces patients.

Procédures

Tous les animaux subiront deux procédures chirurgicales, d'une durée inférieure à 15 minutes, et réalisées sur animaux anesthésiés, à deux semines d'intervalle. Pour la motitié de l'effectif, ces chirurgies auront pour but d'induire une insuffisance rénale chronique. L'autre moitié des animaux subira une chirurgie blanche, n'altérant pas la fonction des reins (souris contrôles). Certains animaux recevront des injections qui permettront d'étudier l'os post-mortem. Ces injections seront réalisées sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les souris des groupes IRC développeront une insuffisance rénale chronique associée à des désordres cardiovasculaires et osseux. Elles devraient donc prendre moins de poids que les souris contrôles sur toute la durée du protocole. Les animaux mâles seront hébergés seuls durant les 15 semaines de l'étude pour éviter le stress et les blessures liées aux bagarres. Cet isolement social pourrait générer un stress. L'état d'IRC peut être associée dans de très rares cas à une mortalité de 10% dont nous avons tenu compte dans le calcul l'effectif afin de s'assurer de pouvoir conclure fermement.

Devenir

Tous les animaux arrivant en fin de procédure seront euthanasiés. Une partie des tibias et fémur des animaux sera utilisée pour étudier l’impact de l’insuffisance rénale chronique sur l’AM, la microarchitecture et la fragilité osseuse. L’autre partie des tibias et des fémurs des animaux sera utilisée pour récupérer les précurseurs d’adipocytes présents dans la moelle osseuse des souris afin de comparer in vitro leur capacité de différenciation en adipocytes et leur impact sur l’activité des cellules formant (osteoblastes) et résorbant (osteoblastes) l’os.

Remplacement

La complexité des désordres métaboliques liés à l’IRC (désordres minéraux, inflammation, stress oxydant et accumulation de toxines urémiques (déchets non excrétés par le rein malade)) est partiellement modélisable in vitro. Ainsi, des études préliminaires menées par notre équipe ont permis de démontrer que l’exposition à du sérum provenant de patients IRC amplifie la différenciation adipogénique des cellules de la moelle osseuse. Cependant, aucun système n’existe à notre connaissance permettant d’étudier l’impact de cet environnement pathologique sur le remodelage, la microarchitecture, la qualité et la fragilité osseuse. La complexité de ce système ne peut actuellement être appréhendée que par l'usage de modèles animaux.

Réduction

Le design de notre étude permettra d’obtenir un niveau élevé d’informations à partir d’un seul animal. Les données relatives à l'analyse des gènes seront déposées sur un site d’archive ouverte afin d'être accessibles au plus grand nombre. Ceci permettra à l’avenir à d’autres chercheurs du domaine de profiter de cette base de donnée sans avoir à reproduire le protocole d’expérimentation animal. Les cœurs et les aortes des animaux de toutes les procédures seront récupérés post-mortem pour alimenter la bio-banque d’organes du laboratoire servant aux mises au point des protocoles d’extraction et d’histologie.

Raffinement

Une période d'acclimatation de 7 jours sera mise en place à l'arrivée des souris, avant leur entrée dans le protocole. Les conditions d'élevages seront optimisées afin d'offrir aux animaux un maximum d'éléments environnementaux leur permettant de reproduire la majorité de leurs comportements naturels qu'ils soient hébergés seuls ou en groupe (enrichissement du milieu de stabulation avec des frisettes pour la confection de nids, des cylindres en cartons pour se cacher, et des bûchettes). Les chirurgies seront réalisées sur des souris anesthésiées. Suite aux chirurgies, les souris recevront une analgésie adaptée. Cette analgésie sera maintenue aussi longtemps que nécessaire. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement, afin de s'assurer de leur bien-être et d'identifier les animaux susceptibles d'avoir atteint le point limite. Pour cela, un score bien-être, basé sur une pesée et la recherche de signes de souffrance, sera réalisé de manière journalière dans la semaine post-chirurgie puis de façon semi-hebdomadaire. Les animaux montrant des signes de souffrance recevront une analgésie et des soins adaptés. Les seront animaux ayant atteint le point limite seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle murin d’IRC que nous utiliserons a été validé sur des souris C57BL6J mâles et femelles agées de 8 semaines au moment de la première chirurgie. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle invertébré permettant de reproduire le syndrome cardio-rénal. La compléxité des désordres minéraux, métaboliques, endocriniens, vasculaires et osseux liés à l'induction de la maladie réanle chronique ne peut être reproduite par des systèmes de culture in vitro.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour extraction du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une à deux chirurgies crâniennes pour fixer une barre d'acier, implanter une fenêtre de verre ou insérer des fibres optiques et des sondes, puis un entraînement d'un à cinq mois sous restriction hydrique à 85 % de leur poids, la tête fixée pendant les tests. Le porteur reconnaît l'isolement, la restriction d'eau, les risques d'hémorragie ou d'infection et la gêne des implants. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou informatique ne remplace le modèle et écarte la drosophile, ces techniques invasives ne pouvant être menées sur des humains sains.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment notre cerveau est capable de changer nos actions rapidement. Nous pensons que le cerveau peut imaginer et préparer différentes décisions en même temps, ce qui facilite le changement de décision lorsque la situation évolue. Pour étudier cela, nous utiliserons des tâches comportementales avec des souris dans un environnement virtuel. Nous allons également utiliser des techniques spéciales pour enregistrer et manipuler l'activité des cellules cérébrales, combinant l'électrophysiologie, l'imagerie et la stimulation lumineuse. Notre objectif est d'observer comment des centaines de neurones travaillent ensemble dans le cerveau pour contrôler nos actions et prendre des décisions. Nous nous concentrerons sur un comportement important, la recherche de ressources alimentaires ou en eau, appelée "foraging".

Bénéfices attendus

Ce projet va générer une grande quantité de données précieuses pour différentes études scientifiques. Une fois les résultats publiés, ces données seront partagées avec la communauté scientifique, pouvant ainsi être utilisées pour répondre à diverses questions scientifiques. En particulier, les découvertes de ce projet pourraient apporter une nouvelle perspective sur la façon dont nous pensons et prenons des décisions. De plus, le projet nous aidera à comprendre pourquoi les gens prennent des décisions différemment, ouvrant la voie à une meilleure compréhension de la diversité des comportements et ses dysfonctionnements cognitifs.

Procédures

Pour enregistrer les cellules du cerveau pendant une tache de comportement, des méthodes invasives sont nécessaires. Une première procédure chirurgicale s’effectuera sur tous les animaux (250 au total) sous anesthésie générale pour poser une barre en acier sur la tête des animaux. Cet implant est nécessaire pour stabiliser les enregistrements de cellules. Pour observer l’activité du cerveau au microscope dans un groupe de 50 animaux, les cellules seront rendues fluorescentes grâce a une injection de virus. Une petite fenêtre en verre sera ensuite implantée pour visualiser la fluorescence. Pour activer les cellules du cerveau avec de la lumière dans un autre groupe de 100 animaux, de fines fibres optiques seront délicatement insérées dans leur cerveau. Chaque opération dure entre 1 et 3 heures par animal. Les animaux sont ensuite soumis à des entrainements quotidiens dans une plateforme expérimentale et ils sont récompensés par des gouttes d’eau sucrées. Cette phase dure entre 1 et 5 mois, en fonction de la performance de l'animal. Environ 225 animaux déjà entraînés subissent une seconde opération sous anesthésie générale pour réaliser de petites ouvertures dans le crâne ce qui permet d’insérer des petites sondes d’enregistrement. Cette intervention est rapide, d'environ 20 à 30 minutes. Les enregistrements sont alors répétés quotidiennement pendant plusieurs jours (maximum 15) pendant 1h. Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets plus ou moins nuisibles à la santé des animaux peuvent être attendus. 1) Isolement : pour leur protection, les animaux devront être hébergés individuellement dans leur cage 2) Restriction hydrique : les animaux seront maintenus à 85% de leur poids originel 3) Interventions chirurgicales sous anesthésie : les conséquences de ces interventions sont parfois néfastes (hémorragie, infection, détresse respiratoire, douleurs post-opératoires) 4) Implants : potentielle gêne occasionnée par un corp étranger 5) Stress lié à la manipulation : les animaux seront manipulés durant les phases de tests 6) Restriction des mouvements : les animaux auront la tête fixée durant les périodes de tests

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure dans le but de procéder à l'extraction du cerveau à des fins histologiques.

Remplacement

Pour évaluer la complexité des comportements adaptatifs, comme proposé dans ce projet, il est fondamental d'utiliser un modèle animal approprié qui ne peut être facilement remplacé par des expériences in vitro ou des modèles informatiques. D’autre part, l'étude des bases neuronales de la prise de décision par l’enregistrement et la manipulation sélective de l’activité des neurones nécessitent des techniques invasives qui ne peuvent pas être réalisées chez des sujets humains sains et extrêmement rarement chez des sujets malades. Certaines espèces d'invertébrés, telles que la mouche des fruits (drosophile), pourrait sembler adaptées à l’étude du comportement de foraging et aux manipulations génétiques des systèmes cérébraux. Cependant, l'anatomie du circuit neuronal de la drosophile est considérablement différente de celle des mammifères. Ainsi, les résultats scientifiques obtenus chez ces espèces ne sont pas facilement généralisables aux questions abordées dans ce projet. En l'absence de méthode de remplacement possible, il s’avère donc nécessaire d'avoir recours au modèle animal murin dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des résultats statistiques fiables et significatifs. L'utilisation de méthode d’enregistrement a grande échelle réduira aussi considérablement le nombre de sessions d'enregistrement et d'animaux nécessaires pour obtenir des statistiques fiables. Par ailleurs, les données comportementales et neuronales seront extraites des mêmes individus pour réduire encore d’avantage le nombre d’animaux. D’après nos études précédentes, nous estimons que 45 souris par groupe sont nécessaires (5 groupes, soit 125 animaux au total). Etant donné la difficulté technique qu’implique la réalisation des enregistrements et la bonne performance des animaux dans la tâche, un pourcentage de perte de l’ordre de 10% ou plus est à prévoir, ce qui augmente l’estimation finale à 250 animaux pour les 5 ans.

Raffinement

Des méthodes de raffinement seront mises en place dans le but d’atténuer les nuisances provoquées par les procédures expérimentales. Le poids des animaux sera surveillé quotidiennement et la poursuite du protocole de restriction hydrique sera décidée en fonction du bien-être des animaux. L’eau naturelle ad-libitum sera remise à disposition pour assurer la récupération totale du poids si la perte de poids est supérieure à 20%. Afin de réduire le stress, les animaux seront habitués, par étapes, à la présence et aux interactions avec l’expérimentateur plusieurs jours avant le début des tests. L’angoisse éventuellement ressenti par l’animal due à la contention sera atténuée par une habituation renforcée positivement via des récompenses (eau sucrée).  Pour prévenir la douleur et les inflammations, nous administrerons à chaque chirurgie des médicaments aux propriétés antalgiques, antipyrétiques et anti-inflammatoires.En cas de sècheresse ou rougeur légère de la peau autour de l’implant, l’animal sera traité localement par une solution dermatologique. Dès l’apparition de comportements anormaux (ex : absence de toilettage, perte de plus de 20% du poids) ou autres signes de souffrance (évalués sur une grille d’évaluation de la douleur) survenant après l’implantation, l’animal recevra un traitement analgésique en sous cutané. Si des signes de souffrances persistent plus de 72h l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est le modèle animal le plus approprié pour ce projet et il n'existe pas d'alternative méthodologique. Tout d’abord, l'organisation du néocortex chez la souris comporte des similitudes avec d'autres espèces de mammifères, y compris les humains, et peut donc être utilisée pour révéler des principes généraux de prise de décision. Les souris peuvent aussi être entraînées à effectuer des tâches assez complexes dans des environnements expérimentaux contrôles. Les outils génétiques pour cibler et moduler des populations spécifiques de neurones sont également très bien développés chez la souris et relativement faciles à utiliser. Comme les souris ont un cerveau relativement petit, il est aussi possible d’enregistrer plusieurs régions cérébrales simultanément. Le fait que toutes ces procédures soient devenues l'état de l'art chez la souris facilitera et accélèrera donc grandement l'avancement du projet. Nous utiliserons de jeunes adultes au moment de l’implantation (âgées de 8 à 12 semaines). Il est important que les animaux soient relativement jeunes pour un apprentissage plus rapide et une meilleure performance dans la tâche. Cependant, les animaux doivent avoir terminé leur croissance pour éviter que la taille de la boite crânienne ne change au cours de l’expérience.

Pour vérifier si des souris porteuses d'une ou de deux mutations liées à la maladie de Moyamoya, une atteinte rare des artères du cerveau, en reproduisent les lésions, 476 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Entre un et six mois, elles subissent jusqu'à trois prises de sang à la veine faciale sans anesthésie, et un petit groupe reçoit en fin de protocole, sous anesthésie, une injection de marqueur fluorescent dans le sinus veineux près de l'œil, avant la surdose d'anesthésique. Si la maladie se développe, les souris peuvent perdre du poids, trembler ou avoir du mal à se déplacer, et des croisements entre lignées sont prévus si aucune anomalie n'apparaît avec une seule mutation. Une souris dont les signes de souffrance persistent plus de deux jours malgré les antalgiques est mise à mort.

Objectifs

L’angiopathie de Moyamoya (MMA) est une maladie rare des vaisseaux du cerveau. Cette maladie se définit par : 1/une diminution progressive du diamètre des gros vaisseaux qui apportent le sang au cerveau (artères localisées à la base du cerveau) qui peut atteindre l’occlusion (c'est-à-dire que le vaisseau est totalement obstrué) et qui provoque un manque d’oxygène dans le cerveau, 2/la présence d’un réseau de petits vaisseaux fins et anormaux à la base du cerveau, qui se sont probablement formés pour compenser le manque d’oxygène cérébral entrainé par l’occlusion des artères cérébrales atteintes d’anomalie de MMA. Les patients MMA peuvent avoir des accidents vasculaires cérébraux. Les mécanismes de développement de la maladie sont encore largement inconnus aujourd’hui et aucun modèle animal n’existe. Une vingtaine de gènes ont déjà été identifiés comme responsables du MMA chez l’homme. L’objectif de ce projet est de définir si des souris porteuses d’une ou de deux mutations dans un ou deux gènes déjà identifiés chez des patients MMA pourraient être un modèle animal pertinent de la maladie, c'est-à-dire que les animaux reproduiraient les anomalies vasculaires de MMA. Nous caractériserons les vaisseaux du cerveau et de la rétine chez les souris mutées dans un gène responsable du MMA chez l’homme. Cette analyse sera réalisée au cours du temps chez les animaux de 1 à 6 mois afin de déceler une anomalie vasculaire de manière précoce et de suivre son évolution dans le temps. Dans le cas où aucune anomalie vasculaire cérébrale ne serait décelée chez ces souris, elles seront croisées avec les souris mutées dans un autre gène responsable du Moyamoya chez l’homme. Cette expérience permettra alors de tester l’hypothèse de l’implication de deux gènes mutés co-responsables du développement de la maladie. La définition de ce qui serait alors le premier modèle animal de MMA permettrait de faire avancer la compréhension des mécanismes responsables du développement de cette maladie et d’envisager de nouvelles approches pour stopper l’évolution de la maladie chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les mécanismes responsables du développement de la maladie sont largement inconnus aujourd’hui. Il n’existe aucun modèle animal de MMA. L’obtention d’un modèle de MMA chez la souris permettrait : -d’étudier comment se développent des lésions MMA au niveau des vaisseaux du cerveau en suivant leur évolution au cours du temps -de mieux comprendre les mécanismes responsables du développement de la maladie. Il est par exemple important de comprendre si une mutation dans un gène suffit à déclencher la maladie ou si deux gènes mutés sont nécessaires pour entrainer le développement du Moyamoya. A plus long terme, comprendre comment se développent les lésions des artères du cerveau chez les patients MMA permettra d’envisager des approches médicamenteuses pour limiter voire stopper le développement de la maladie chez les patients.

Procédures

Les animaux du projet seront analysés à 1, 2, 4 et 6 mois. Un à 3 prélèvements sanguins sur animal vigile (c’est-à-dire conscient, en éveil) seront réalisés entre l’âge de 1 et 6 mois, au niveau de la veine faciale. Ce prélèvement est rapide (manipulation totale de 3 minutes maximum/animal). A la fin de l’expérimentation, l’ensemble des animaux sera soumis à une analgésie et à une anesthésie générale. Un petit groupe de souris recevra après l’anesthésie une injection dans le sinus veineux situé à côté de l’œil, d’un marqueur fluorescent de l’intérieur des vaisseaux. Puis une surdose d’anesthésie sera administrée pour euthanasier l’animal. Le sang sera récupéré au niveau du cœur en post-mortem.

Impact sur les animaux

Si la maladie de moyamoya se développe, une perte de poids est possible chez les animaux atteints, qui pourraient aussi présenter des troubles du comportement tels que des tremblements ou des problèmes de locomotion. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale pourront induire un stress entrainé par une manipulation de courte durée. La répétition de ces prélèvements (3 prélèvements maximum par animal à 1 mois d’intervalle) est sans risque supplémentaire pour les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux est euthanasié à l’issu de la procédure et des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés en post-mortem.

Remplacement

Ce projet consiste à étudier les liens potentiels existants entre la présence de mutations dans certains gènes et le développement de la maladie cérébro-vasculaire de MMA. Il requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet et des vaisseaux sanguins dans le cerveau dans un environnement physiologique normal. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo, c’est à dire chez des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux total nécessaire a été prévu pour être limité au maximum. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par des calculs statistiques appelés tests de puissance, issus des résultats déjà connus d’études précédentes. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le projet, la caractérisation des vaisseaux du cerveau et de la rétine sera réalisée en priorité dans les groupes d'animaux âgés de 1 mois et 6 mois. Si aucune anomalie vasculaire n’est observée, les autres groupes ne seront pas réalisés.

Raffinement

Les mères gestantes sont isolées avant la mise-bas (3 jours maximum), des mouchoirs en papier sont mis à leur disposition pour la confection du nid. Si une manipulation des petits est nécessaire, les gants des expérimentateurs seront passés au préalable dans la litière sale pour atténuer leur odeur. Le nid confectionné par la mère ne sera pas détruit. Le sevrage est effectué après 21 jours de vie, avec un maximum de 6 animaux du même sexe par cage. L’enrichissement de chaque cage est systématique avec du papier absorbant et la présence de petites maisons. Tous les animaux sont observés quotidiennement. Ils feront également l’objet d’un examen détaillé hebdomadaire par une personne responsable du projet. L’aspect général (par exemple qualité du pelage, propreté des yeux), le comportement de l’animal (par exemple déplacement, convulsions, agressivité) et le poids seront analysés, afin de déceler au plus tôt un éventuel état de souffrance (suivi défini en fonction de l’âge). En cas de signes de souffrance décelés, un traitement antalgique sera administré. Dans le cas d’une persistance au-delà de 2 jours, l’animal sera euthanasié selon une méthode réglementaire

Choix des espèces

Les vaisseaux du cerveau chez la souris sont très proches de ceux trouvés dans le cerveau humain. Par ailleurs, différentes lignées de souris mutées dans l’un des gènes responsables du moyamoya chez l’homme sont disponibles. Les animaux seront utilisés à différents âges, à 1 mois, 2, 4 et 6 mois pour caractériser les vaisseaux cérébraux/rétiniens de façon précoce et suivre leur évolution au cours du temps. Nous couvrons ainsi la période d’apparition du Moyamoya chez l’homme.

Soumises sans anesthésie à une injection dite hydrodynamique, porteuses de tumeurs du foie qui peuvent devenir douloureuses au-delà d'une certaine taille, 760 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever tumeurs et foies. Chaque semaine, elles reçoivent une injection suivie d'une mesure sous anesthésie, jusqu'à dix injections au total, et certaines un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines. L'équipe teste un anticorps qu'elle développe depuis une dizaine d'années, seul ou associé aux immunothérapies du cancer du foie, et indique qu'il est déjà entré en essai clinique pour d'autres maladies du foie. Le porteur affirme que les procédures "invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie", et écrit que l'injection hydrodynamique, faite sur souris éveillées, "peut entrainer du stress et peut-être de la douleur".

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique, réalisée sur animaux vigile qui durera moins d’une minute. Puis une fois par semaine, les animaux recevront une injection sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Puis les animaux seront anesthésiés afin de réaliser une mesure, qui dure moins de 5 minutes. Le nombre d’injection totale sera de 10 au maximum. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animal vigile. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

La procédure « injection hydrodynamique » peut entrainer du stress et peut-être de la douleur à court terme mais l’animal récupère en général rapidement (5 à 10 minutes) et complètement au bout d’une heure. Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer de l’inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 6 à 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature