Procédures sévères

1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur retire un rein par une chirurgie décrite comme invasive et douloureuse, avant des traitements répétés par gavage ou injection, des tests de sensibilité de la voûte plantaire, des mesures de filtration glomérulaire et un hébergement en cage métabolique, pour constituer un modèle des complications du diabète. Le porteur reconnaît que l'ablation d'un rein aggrave la maladie, que des oedèmes peuvent apparaître et que les gestes répétés génèrent un "stress chronique". Il présente ce modèle comme une offre destinée à un "client" pour "implémenter le marché" de nouveaux traitements, et affirme que la neuropathie diabétique n'est pas reproductible in vitro.

Objectifs

Le diabète de type 2, associé à l’obesité, est associé à de nombreuses commorbidités telle que la neuropathie et la néphropathie diabétique. La neuropathie diabétique est une conséquence invalidante du diabète entraînant des conséquences sur la santé et la qualité de vie des patients. Elle se traduit par de l’incontinence fécale et urinaire, des désordres gastrointestinaux, des douleurs chroniques, entre autres. La conséquence la plus grave étant les altérations nerveuses au niveau cardiaque pouvant entrainer des arythmies. La néphropathie diabétique touche 20 à 40% des patients atteints de diabète (type 1 ou type 2). On observe dans d’abord un stade d’hyperfiltration rénale. Des lésions rénales précoces vont se mettre en place afin de normaliser le stade d’hyperfiltration rénale. Ces processus finissent par s’aggraver avec le temps et entrainent à terme une albuminurie et une protéinurie. La filtration glomérulaire finit par atteindre un stade d’insuffisance rénale entrainant une dialyse à vie. L’altération de la fonction rénale a des conséquences très importantes sur les fonctions cardiovasculaires augmentant le risque de maladies cardiovasculaires. La maladie du foie gras, ou NASH (non-alcoolic steatohepatitis), touche 25 à 30% de la population générale et ce chiffre va augmenter dans les prochaines années. Cette maladie a pour conséquences principales une évolution vers la fibrose hépatique puis la cirrhose voire le cancer du foie. Cette atteinte augmente également le risque cardiovasculaire. Aujourd’hui, aucune stratégie thérapeutique efficace n’est envisagée ou prescrite dans le cadre de ses commorbidités. Les seules stratégies envisagées sont le contrôle de la glycémie par les anti-diabétiques classiques et des recommandations diététiques et/ou le traitement par anti-dépresseurs dans le cas de la neuropathie. Ainsi, la mise en place d’un modèle animal présentant ces différents aspects de la maladie permettra au client de tester des molécules anti-diabétiques sur ces comorbidités ou bien de tester des molécules hépatoprotectrices, néphroprotectrices ou neuroprotectrices afin d’implémenter le marché de nouveaux traitements. L’objectif de ce projet est de proposer un modèle préclinique présentant les caractéristiques de la NASH, de la neuropathie et de la néphropathie. L'amélioration du risque cardiovasculaire est également évalué pour démontrer l'efficacité des traitements. Un seul traitement ou une combinaison de deux traitements sera testé.

Bénéfices attendus

En proposant un modèle de rat d’étude préclinique de neuropathie, de néphropathie diabétiques et de NASH, nous ouvrons notre catalogue de modèle préclinique à ces comorbidités du diabète qui aujourd’hui ne disposent pas de traitements efficaces et qui ont pourtant des conséquences dramatiques sur la vie du patient. Également par la mise en place de modèle, nous permettrons d’éclaircir les mécanismes mis en place pour le développement de la pathologie et nous permettrons ainsi un gain de connaissance.

Procédures

La chirurgie consistant à retirer un rein se déroule en plusieurs étapes et dure environ 30 minutes. Elle n'est réalisée qu'une seule fois, au cours de la phase précoce du diabète de type 2, elle débute la phase expérimentale. Les animaux subiront différents prélèvements de sang au cours de la procédure en respectant la fréquence et le volume par prélèvement fixés par la réglementation. Un prélèvement de sang dure moins d'une minute. Les animaux seront traités avec des molécules à viser therapeutiques par gavage, injections sous cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuses régulières, par le régime ou par mini-pompe osmotique sous cutanée. Une administration dure moins de 30 secondes. Les animaux subiront également un électrocardiogramme ou une échocardiographie (une seule fois) pour évaluer les paramètre cardiaque. Ils subiront un test de tolérance au glucose oral d'une durée de 2,5 heures une seule fois. L’analyse de la sensibilité mécanique et thermique au niveau de la voûte plantaire sera réalisée 5 fois maximum avec un temps de 5 minutes entre chaque mesure. La mesure de débit de filtration glomérulaire sera réalisée deux fois, en début et en fin de procédure, sur une durée de 3 heures. La récolte d'urine ou de fecès par l'utilisation de cage métabolique se fera une seule fois, en fin de procédure, sur 18 heures.

Impact sur les animaux

1 – l’induction de la néphropathie diabétique : La chirurgie est invasive et douloureuse pour l’animal. La cicatrisation est plus difficile chez un animal diabétique et nécessite un suivi particulier. Le système rénal et urinaire est déjà modifié par le diabète, retirer un rein accélère et aggrave la maladie. Des oedèmes peuvent apparaître au niveau des pattes suite à la retention d'eau qui peut être observée chez ce modèle de rats présentant une néphropathie diabétique. 2 - Les mesures réalisées : aucun effet indésirable est attendu après le test de tolérance au glucose et les prélèvements de sang associés, l’électrocardiogramme, la pléthysmographie caudale ou l'échocardiographie. L’analyse de la sensibilité mécanique au niveau de la voûte plantaire peut induire un inconfort ou possiblement une douleur. La mesure de débit de filtration glomérulaire nécessitant une anesthésie gazeuse et une injection intraveineuse à la veine caudale entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. 3 – Les traitements : le geste de traitement, i.e. gavage, injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, réalisé à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, ce qui permettra de collecter le sang et les organes et faire des analyses biochimiques plus poussées afin d'évaluer l'efficacité des traitements réalisés

Remplacement

Le diabète est une pathologie touchant de nombreux organes et la neuropathie, la néphropathie et la NASH sont des conséquences de ce dérèglement multi organique. La neuropathie diabétique n’est pas mimable in vitro. La néphropathie diabétique peut être étudiée à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. La NASH associée au diabète peut être étudiée in vitro à partir de système sphéroïdes ou organoïdes et sont actuellement mis en place au sein de la société.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses commorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclus dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe de rats sains, non diabétiques. Compte tenu de l'hétérogénéité des paramètres mesurés et pour pouvoir conclure sur l'efficacité d'un traitement en terme de puissance statistique, un nombre de 10 points mesurés et donc un nombre de 10 animaux par groupe au minimum est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront, en première phase expérimentale, au cours des stades précoces du diabète, hébergés par deux pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque le rat est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin de répondre aux différents besoin des rats. Une double litière sera déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. La chirurgie sera réalisée selon un protocole d'anesthésie et d'analgésie adaptée. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisées la procédure et faisant parties de la structure chargée de la santé et du bien-être animal (SBEA). Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites suivants sur plusieurs jours: hypothermie, prostration, perte de poids supérieurs à 20%, ce dernier serait euthanasié sous un protocole d'anésthésie associée à de l'analgésie. En raison de l’évolution rapide de la pathologie, avec une apparition de cécité sur les stades avancés, les animaux seront visités de façon quotidienne et des mesures d’approches et de préhension seront adaptées pour ne suprendre et stresser l'animal. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution hydratante est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectué en cours d’étude comme cela est le cas au cours du test de tolérance au glucose se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage à métabolisme, la mesure de sensibilité thermique et mécanique (sans stimulation) pour limiter le stress de l'animal. En cas d'apparition d'oedème, la patte concernée sera massée et mobilisée quotidiennement jusqu'à disparition de l'oedème comme préconisé par notre vétérinaire.

Choix des espèces

La souche de rats utilisés au cours de ce projet sont des rats qui développent rapidement un obesité et un diabète de type 2. Comme la maladie se développe relativement vite, les animaux seront commandés à 4 semaines d’âges car à cet âge, ils n'ont pas encore de signes associés au diabète et peuvent voyager sans crainte. Ils seront étudiés jusqu’à 10-15 semaines d’âges c’est-à-dire les stades les plus avancés de la maladie.

900 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ablation des deux ovaires sous anesthésie pour modéliser la ménopause, puis reçoivent des composés à tester pendant parfois six mois, avec cystométrie de quatre heures après pose d'un cathéter intravésical et prélèvements de sang et d'urine. Le porteur indique un inconfort possible après chirurgie et administration, et précise que les interventions varient selon les recommandations d'un partenariat avec une entreprise pharmaceutique. Il affirme que la rate ovariectomisée est le "modèle de choix" et qu'aucun modèle in vitro pertinent ne rend l'usage d'animaux vivants évitable, qualifié d'"indispensable".

Objectifs

La ménopause est un événement physiologique qui survient entre 45 et 55 ans chez la femme, et qui correspond à l’arrêt du fonctionnement ovarien entraînant un arrêt de la production de progestérone puis des œstrogènes, marquant ainsi la fin des menstruations et donc de la fertilité. Cette carence en œstrogènes peut se manifester par des symptômes pouvant affecter la qualité de vie des patientes tels que des bouffées de chaleur, des modifications génitales, des dysfonctions sexuelles et urinaires. C’est aussi une période où, des pathologies potentiellement graves peuvent survenir du fait des changements hormonaux et de l’avancée en âge (fractures ostéoporotiques, maladies cardiovasculaires, cancer). Un traitement hormonal de la ménopause (THM) destiné à remplacer les œstrogènes et la progestérone qui ne sont plus produites par l’organisme, constitue le traitement le plus couramment prescrit aux femmes ménopausées. Cependant, depuis 2002, plusieurs études ont rapporté des effets indésirables graves dont un risque accru de cancer du sein et de l'utérus, et de maladie cardiovasculaire. Ainsi depuis 2003, il n’est plus recommandé d’utiliser un THM de façon systématique ou à titre préventif. Afin de soulager leurs symptômes, certaines femmes sont aussi tentées de se tourner vers des solutions alternatives, dont les potentiels risques ne sont pas encore connus. Dans ce contexte, il est donc nécessaire de conduire une recherche préclinique intensive visant à mettre en évidence et/ou à développer un traitement des symptômes de la ménopause efficace et offrant une sécurité d’emploi optimale. À ce titre, la rate ovariectomisée s’avère être un modèle préclinique de choix pour la compréhension des événements physiopathologiques associés à la ménopause et pour le développement de nouvelles thérapies efficaces. Des études préalables ont d’ailleurs montré, une diminution du taux d'œstrogènes circulants chez la rate ovariectomisée, imitant les modifications physiologiques post-ménopausiques humaines.

Bénéfices attendus

Depuis la parution de l’étude montrant les risques des traitements THM, moins de 6% des femmes ménopausées prennent actuellement ces traitements. Certaines femmes se tournent donc vers des solutions alternatives dont on ne connaît pas toujours les risques. Il est donc nécessaire d’identifier ou de développer des traitements efficaces qui offrent une sécurité d’emploi optimale. Cette étude vise à évaluer l’efficacité, et dans certains cas les effets indésirables, des nouveaux candidats médicaments dans la prise en charge des symptômes chez les femmes ménopausées, dans un modèle animal validé.

Procédures

Les animaux vont avoir une ovariectomie bilatérale sous anesthésie afin de modéliser la ménopause chez la femme. Cette opération est faite une seule fois au début de l'étude dure au maximum une demi-heure. Ensuite, les animaux seront traités par le composé à analyser ou ses contrôles, la fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (généralement moins de 6 mois). Tout type d’administration dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min si l'administration nécessite une anesthésie. Une cystométrie peut être faite pour évaluer l'effet du composé administré, l’expérience dure 4 h au maximum, précédée de l’implantation d’un cathéter intravésical. Enfin, des prélèvements de sang, d’urines ou d'organes après sacrifice pourront être envisagés. Chaque prélèvement de sang durera moins de 3 minutes. Une collecte d’urine se fait en cage à métabolisme et en moins de 24h. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

L’ovariectomie et l’implantation de cathéter sont réalisées sur des animaux anesthésiés, sous antalgiques et avec une antibiothérapie prophylactique. Toutefois, une sensation d’inconfort peut apparaître chez l’animal après ces procédures. De même, l’administration des composés ou les prélèvements sanguins et ou d’urine peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront ovariectomisés afin de mimer la ménopause et vont être traité avant ou après par les composés à évaluer. L’efficacité des nouveaux traitements vont être évalués par cystométrie, et ou par l’analyse des différents prélèvements de sang, d’organe ou d’urine. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude.

Remplacement

La rate ovariectomisée est le modèle préclinique de choix pour la compréhension des événements physiopathologiques associés à la ménopause et pour le développement de nouvelles thérapies efficaces. Une diminution du taux d'œstrogènes circulants est observée chez la rate ovariectomisée, imitant les modifications physiologiques post-ménopausiques humaines. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro pertinent rendant ainsi indispensable l’utilisation d’un modèle intégré faisant appel à des animaux vivants.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. De plus, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : les rats sont hébergés par 2 animaux par cage quand cela est possible, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Ensuite,des points limites sont fixés afin que les zootechniciens puissent signaler aux responsables des soins et du projet l’apparition des critères nécessitant les traitements nécessaires pour arrêter les souffrances. Tous les actes chirurgicaux se font sous analgésie et anesthésie générale, et un traitement antibiotique est aussi mis en place pour éviter toute complication infectieuse. A noter que toutes les procédures expérimentales ne seront pas forcément appliquées aux animaux. Les procédures expérimentales appliquées à chaque groupe de rats seront attribuées en fonction de leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude de modifications physiologiques multi-symptomatiques consécutives à la diminution des hormones féminines à la ménopause. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitent l’utilisation de gros animaux tels que le chien. De plus ces derniers présentent comme chez la femme une ovulation spontanée contrairement au lapin qui a une ovulation provoquée suite à un accouplement. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Des rates adultes de plus de 6 semaines sont employées, âge auquel les organes sexuels sont à maturité. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

1 035 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré sévère. Cette lignée transgénique brevetée exprime un gène rapporteur luminescent servant à visualiser l'activation d'une voie de signalisation selon le régime alimentaire, au moyen de prises de sang sur animal vigile, d'injections de luciférine, d'imagerie sous anesthésie, d'un jeûne jusqu'à seize heures et d'un hébergement individuel. Le porteur affirme pourtant que les souris "ne présentent pas de phénotype dommageable" et décrit des atteintes qu'il qualifie de limitées, en contraste avec la gravité sévère annoncée pour la totalité des animaux. Parmi elles, 105 souris sans transgène fonctionnel sont tuées d'emblée et 930 après deux procédures, le porteur jugeant "indispensable" d'expérimenter sur l'animal pour tenir compte du métabolisme entier.

Objectifs

Afin de pouvoir étudier le rôle joué par la voie de signalisation eIF2α/ATF4 au niveau de l’animal entier, nous avons généré une lignée de souris transgénique qui exprime le gène rapporteur luciférase sous le contrôle de séquences de fixation du facteur de transcription ATF4. Cette lignée de souris a été breveté et constitue un outil de choix pour visualiser le stress nutritionnel ou pharmacologique au niveau de l'animal entier. Notre objectif avec cet outil murin transgénique est de mieux caractériser les conditions d’activation de cette voie de signalisation dans l’espace et dans le temps en fonction du régime nutritionnel ou du traitement pharmacologique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre chez les mammifères les effets de la consommation d’un régime déséquilibré en acides aminés ou d’un traitement avec un inducteur pharmacologique. Dans ce but, les souris transgéniques bioluminescentes sont un outil de choix pour situer dans l’espace (identification des tissus et cellules cibles) et dans le temps (chronologie d’activation en fonction des sites) l’activation de la voie eIF2α-ATF4 dans des conditions de carences nutritionnelles en acides aminés ou lors d’un traitement pharmacologique par la mesure de la bioluminescence au niveau du corps entier de l’animal vigile, de l’expression (immuno-histochimie) et/ou de l’activité de l’enzyme codée par le gène rapporteur luciférase dans les tissus cibles.

Procédures

Des prises de sang pourront aussi être réalisées sur animal vigile au niveau de la veine submandibulaire (1 min par souris) à l'aide de microlancettes spécifiques. Elles seront réalisées avant et après le protocole nutritionnel en alternant le côté du prélèvement. Pour visualiser l’activité luciférase en utilisant un appareil d’imagerie bioluminescente (10 min par souris), les animaux seront injectés avec de la luciférine (10 sec par souris), anesthésiés sans effets indésirables (15 min par souris). Pendant toute la durée d'adaptation au régime contrôle (7 jours) et d'expérimentation (96h maximum), les souris seront hébergées individuellement avec un accès libre à l’eau et à la nourriture.

Impact sur les animaux

Les 2 lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Les expériences réalisées ne vont pas engendrer d’effets indésirables sévères : piqûre d’aiguille, transport des souris, anesthésie gazeuse, jeûne de 16h maximum et isolement de courte durée. Pour la majorité des experiences réalisées, les souris doivent être hébergées en cages individuelles pour éviter les interactions afin de pouvoir mesurer précisément la prise alimentaire.

Devenir

Les animaux dont le transgène n’est pas fonctionnel seront mis à mort dans la procédure 1 (105 souris). Les autres animaux dont le transgène est fonctionnel sont gardés en vie pour rentrer dans les procédures 2 et 3 (930 souris) puis mis à mort à la fin de ces 2 procédures.

Remplacement

De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro sur des lignées de cellules en culture permettent d'abord de tester l'efficacité de carence en un acide aminé ou d’inducteurs pharmacologiques sur l’activation de la voie eIF2α-ATF4. Ces expériences permettent dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris. Il est ensuite indispensable d'expérimenter sur des souris pour tenir compte du métabolisme et des échanges inter-organes pour pouvoir évaluer l'effet de ces inducteurs in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal de l’induction de la bioluminescence, il s'avère indispensable de répéter les expériences. Etant donné que les procédures sont légères, une même souris pourra être réutilisée pour tester l’effet de plusieurs régimes après une période de récupération d’une semaine.

Raffinement

Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition (tube plastique rouge et/ou bille métallique). Par ailleurs, l'utilisation d’un transgène exprimant la luciférase nous permettra de suivre l’activation de la voie eIF2α-ATF4 à l'aide d'une méthode non invasive (bioluminescence).

Choix des espèces

Les deux lignées homozygotes de souris transgéniques bioluminescentes (fond génétique C57 Bl/6), ont été générées par notre équipe. Les croisements pour amplifier ces deux lignées seront réalisés avec des souris âgées de 4 à 6 mois, âge où le taux de fécondité est optimum. Pour toutes les procédures, les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 2 à 24 mois. L'âge pourra dépendre de l'objectif de l'expérience réalisée.

1 128 souris immunodéficientes vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un modèle d'inflammation intestinale leur est induit, avec "perte de poids, diarrhée, douleur intestinales caractérisées par une prostration, un poil hérissé et des spasmes abdominaux", puis des prélèvements de sang et une imagerie sous anesthésie. Le matériel biologique est prélevé après mise à mort. Le porteur affirme que démontrer chez l'animal l'efficacité et l'innocuité du produit est "nécessaire" avant tout essai humain, faute de méthode reproduisant la complexité physiologique.

Objectifs

Les objectifs du projet sont 1) de vérifier la distribution du produit dans des modèles murins relevants 2) vérifier l'activation des cellules constituants le produit thérapeutique au site d'inflammation après reconnaissance de leur antigène cible et 3) de vérifier l'absence de toxicité du produit

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de : 1) obtenir des données précliniques préliminaires de distribution du produit 2) d'obtenir des données de sécurité/d'absence de toxicité du produit thérapeutique 3) d'obtenir des données d'efficacité thérapeutique du produit dans un modèle d'inflammation du colon avant les premiers tests chez l'humain

Procédures

Les prélèvements de sang se font par voie submandibulaire. Nous prélèverons 100uL de sang une fois avant le début de l’expérience, au moment où l'efficacité de nos cellules est maximum et une fois en fin d’expérience soit 3 prélèvements. L'injection des cellules prend entre 30 secondes et 1 min par souris selon la voie d'injection, deux injections par animal à plusieurs jours d'intervalle selon la procédure. Pour l'analyse par bioluminescence (production et émission de lumière par les cellules via une réaction chimique au cours de laquelle l'énergie chimique est convertie en énergie lumineuse), les souris seront injectées avec un produit permettant la bioluminescence. L'injection prend environ 1 min par animal sous contention à chaque analyse hebdomadaire, 2 analyses maximum. Pour cette analyse par bioluminescence, les souris seront anesthésiées avec de l'isoflurane (4% (induction), maintenance 1-2% en air) pendant le temps de l'imagerie (4 anesthésies et 4 injections maximum pour une analyse par bioluminescence sur 2 semaines maximum). L'analyse dans le bio-imager (instrument de mesure qui permet de capter l'énergie lumineuse produite par les cellules) prend environ 5 à 10 min pour 5 souris à la fois.

Impact sur les animaux

Perte de poids, diarrhée, douleur intestinales caractérisées par une prostration, un poil hérissé et des spasmes abdominaux

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de l'expérience pour le prélèvement de materiel biologique et l'analyse ex-vivo

Remplacement

Avant toute administration de produit à visée thérapeutique chez l'homme, la mise en évidence de l'efficacité et de l'innocuité du produit doit être démontrée chez l'animal. En effet, l'emploi des modèles animaux est nécessaire au projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthodes alternatives permettant de reproduire in vitro la complexité physiologique pouvant influer la distribution, la stabilité et la persistance (longévité) des cellules.

Réduction

De nombreux tests in vitro permettant une sélection importante de nos cellules seront effectués afin de valider leur qualité et leur efficacité avant les tests in vivo. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l'obtention de résultats statistiquement pertinents. Un logiciel d'analyse statistique a été utilisé pour déterminer le nombre nécessaire d’animaux dans chaque groupe pour obtenir le nombre minimum d'animaux par groupe. Cependant il ne tient pas compte de la variabilité inter-donneur qui est non contrôlable. Nous voudrions donc avoir la possibilité de répéter l'expérience par lot si la variabilité inter-donneur est très importante en utilisant 3 donneurs.

Raffinement

Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d'animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) et un enrichissement qui favorise l'expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification...). Un apport de gel hydrique dans la cage est réalisé pour simplifier l'accès des animaux à une source hydrique et sera mis à disposition des animaux dès le début de leur hébergement pour les habituer à cette source hydrique. Des bâtons à ronger seront mis à leur disposition. Les souris sont hébergées en portoir ventilé par groupe de 5 souris maximum par cage dans la zone stérile de l'animalerie pour maintenir leur statut sanitaire . Pour la préhension des animaux et éviter le stress nous utiliserons un tunnel auquel nous les habituerons lors de leur phase d'acclimatation. Pour l'anayse par bioluminescence, les souris seront anesthésiées avec de l'isoflurane (4% (induction), maintenance 1-2% en air) pendant le temps de l'imagerie (Environ 5 à 10 min pour 5 souris à la fois). Les traitements anti-inflammatoires inhiberaient l'induction de la maladie. Nous mettrons en place une analgésie non médicamenteuse basée sur le raffinement des conditions expérimentales : précocité des points limites, fréquence accrue des observations.

Choix des espèces

Seules les souris immunodéficientes acceptent les greffes de cellules humaines. Il n'existe pas d'autre modèle animal immuno-déficient pour pouvoir développer un modèle humanisé de maladie inflammatoire. L'injection de cellules humaines dans une souris immuno-compétente ne serait pas possible car les cellules et les tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire murin. Souris adultes de 8 à 12 semaines pour leur poids relativement stable en fin de croissance, pour la facilité de manipulation, de prélèvement et d'analyses d'échantillons, d'évaluation physique (bien-être)

5 268 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un stress de contention de deux heures par jour pendant dix jours, répété à deux âges de leur vie, des chirurgies d'injection intracrânienne et un test de peur acquise par stimulations électriques de 0,7 mA, pour étudier l'anxiété et la dépression induites par le stress. Le cerveau est prélevé après mise à mort. Le porteur affirme que ces connaissances "serviront à la société humaine mais aussi à améliorer le bien-être animal en général", une justification qui dépasse largement le contenu du projet.

Objectifs

Ce projet vise à étudier les origines des maladies psychiatriques, particulièrement les troubles anxieux et la dépression induites par le stress. Ces types de maladies psychiatriques sont un enjeu de santé majeur. Il n'y à pas à l'heure actuelle de connaissance des causes neurologiques qui sont à la base de ces maladies et nous n'avons pas de biomarqueurs comme moyen de les dépister, ni même de les diagnostiquer correctement. Le ministère de la santé ainsi que l'OMS ont envoyé des messages forts, rappelant l'urgence d'agir face à ces maladies dévastatrices. Ce projet à trois objectifs majeurs. Le premier vise à découvrir les modifications au niveau du cerveau induites par le stress, et comment cela se traduit au niveau comportemental. Le deuxième, vise à perturber la fonction de circuits neuronaux spécifiques pour prouver leur implication dans les effets du stress. En parallèle, urines et selles seront collectés. Ces excrétats contiennent des milliers de molécules qui reflètent fidèlement l'état dans lequel se trouve l'organisme, que l'état soit normal ou dysfonctionnel. Un troisième objectif sera de lire dans ces molécules des signatures de l'état dans lequel se trouvent les souris et détecter ainsi celles qui sont plus susceptibles de devenir malades. Ici l'emploi du mot susceptibilité est important car il s'agit bien d'animaux qui ne sont pas encore malades mais qui ont une plus forte tendance à le devenir s'ils subissent à nouveau des évènements stressants dans leur vie. Grâce aux signatures nous pourrons donc prédire qui tombera malade si de nouveaux stress sont vécus. Ceci ouvre donc la voie à des méthodes de prévention et de traitement. Les molécules que l'on retrouve dans les excrétats sont très similaires entre les souris et les hommes, donnant la possibilité d'utiliser les découvertes faites dans ce projet en santé humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet est une étape clé pour permettre de mieux comprendre les circuits neuronaux impliqués dans le contrôle de l'anxiété liée au stress et de comprendre l'impact des gènes de susceptibilité aux maladies psychiatriques sur les processus pathologiques en découlant. Ces connaissances pourraient aboutir à des méthodes de prédiction et de traitements des maladies psychiatriques qui serviront à la société humaine mais aussi à améliorer le bien-être animal en général.

Procédures

Un lot d'animaux va subir un protocole de stress consistant en des stress psychologiques par contention d'une durée maximale de 2h pendant 10 jours et cela deux fois dans leur vie, pendant l'enfance et au stade de jeune adulte. A la fin de chaque période de stress des prélèvements d'urine et de selles seront réalisés en laissant l'animal produire naturellement ces excrétats qui seront collectés. Des prélèvements de sang seront aussi effectués avant le deuxième stress chez le jeune adulte. Un autre lot d'animaux subira les mêmes procédures que citées ci-dessus mais avec en plus une chirurgie consistant en une injection intracranienne avant ou après le premier stress de l'enfance. Un autre lot subira toujours le même protocole de stress mais sera génétiquement modifié c'est à dire qu'une des molécules nécessaires à l'activité normale d'une sous-population de neurones qui contrôlent la réponse au stress sera enlevé. La plupart des animaux auront leur comportement testé à travers divers tests de comportement. Ces tests durent chacun une dizaine de minutes et seront espacés sur quatre semaines, ne dépassant jamais 1 test par jour et 3 tests par semaine.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables seront principalement liés au stress provoqué par des restreintes physiques. Ce type de stress n'entraine pas de douleur mais provoque un stress psychologique. Les chirurgies provoqueront des douleurs au niveau du site d'incision cutanée et d'injection. Les tests de comportement seront pour la plupart sans douleur et basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone anxiogène sans contrainte. Les tests d'abandon pour mesurer des symptômes dépressifs seront des contraintes physiques générant du stress de courte durée (6 minutes au maximum). Le test de la peur acquise sera légèrement douloureux car de légères stimulations électriques (5 au total de 1 seconde chacun de 0.7mA chacun) seront subis. Les perfusions intracardiaques entraineront des douleurs lors de l'ouverture du de la cage thoraxique pour accèder au coeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre des études moléculaires et histologiques post-morten du cerveau.

Remplacement

Notre projet repose sur différentes approches telles que l’étude du comportement et l’étude du développement et de la plasticité du système nerveux. Nous voulons comprendre le développement et les fonctions des systèmes de contrôle des émotions. Actuellement, il n’y a pas de méthodes substitutives qui pourraient remplacer le recours a l’animal dans nos travaux. La souris est le modèle de choix car ressemblant à l'homme concernant les mécanismes à l’oeuvre dans le développement et les fonctions des systèmes de contrôle des émotions. Enfin, il existe des tests du comportement chez la souris permettant d'identifier des symptômes pyschiatriques se manifestant de la même manière chez l'homme. Tout ceci permet d'appliquer à l'homme ce qui est trouvé chez la souris.

Réduction

Notre plan expérimental est conçu de telle manière que les premières expériences réalisées permettront d’optimiser les conditions des expériences suivantes et de réduire, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur mise en œuvre. Le nombre d'animaux par groupe a été évalué en utilisant un logiciel de statistique, ce qui permet d'avoir une bonne estimation des effectifs suffisants pour l'obtention de données statistiquement fiables tout en s'assurant d'une utilisation des animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu comprenant des dômes, des briques en bois à ronger et du matériel de nidification. Les animaux sont observés quotidiennement. Des signes potentiels de souffrance sont recherchés et des points limites adaptés aux différentes phases des procédures ont été fixés. Quatre phases vont être à distinguer. Phase 1, Le suivi quotidien avec recherche de signes de souffrance décrits dans les procédures; phase 2, le suivi de trois jours selon une grille de score si certains signes de souffrance sont relevés pendant la phase 1 de suivi quotidien; phase 3, le suivi pendant les périodes de contentions imposées pendant 10 jours consécutifs ; phase 4 les périodes pré et post-opératoire de chirurgie stéréotaxique, elles-mêmes obligatoirement suivies de trois jours de surveillance selon la même grille de score mentionnée ci-dessus. La douleur générée par la chirurgie sera limitée grâce à des anesthésiques et anti-inflammatoires. L’injection d’un anti-inflammatoire non stéroïdien pendant 2 jours après la chirurgie permettra de prévenir la douleur de l’animal. La perfusion intracardiaque se fera sous anesthésie profonde.

Choix des espèces

Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologique des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. L'élevage selon les mêmes conditions assure la reproductibilité des expérimentations. Le temps de génération rapide et la taille des portées permettent de développer un élevage rapidement et en nombre conséquent. La souris constitue un excellent modèle pour l’étude du fonctionnement du cerveau surtout concernant les circuits neuronaux qui contrôlent les émotions car ils sont similaires à ceux du cerveau humain. De plus, nous disposons de techniques adaptées à cette espèce. Pour toutes ces raisons, ce choix d’espèce constitue un excellent modèle pour nos études. Le stress précoce de 10 jours consécutifs commencera entre P10 et P40 (P=postnatal). Les stades d'études moléculaires et histologiques de P20 à P60 sont justifiés par le fait que nous étudions les effets du stress pendant la période ou le cerveau continue de maturer concernant le contrôle des émotions. Nous essayons de déterminer les périodes les plus sensibles car elles sont aussi les périodes au cours desquelles des environnements stressants peuvent provoquer des dysfonctionnements du cerveau provoquant des susceptibilités aux maladies psychiatriques. Les paramètres biologiques seront donc étudiés après le premier stress entre P20 et P60 mais aussi entre P70 et P240, après une seconde période de stress de P60 à P70 qui elle provoquera l’apparition de symptômes d’anxiété chez les animaux ayant subis le premier stress. Les tests de comportement seront réalisés entre P50 et P240 car nous voulons vérifier qu'il n'y a pas de symptômes avant le deuxième stress mais que consécutif au deuxième stress des symptômes apparaissent.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, reçoivent un inhibiteur en injection quotidienne, puis sont tuées 24 heures après pour analyse des lésions. Le porteur décrit une paralysie latérale, une perte de sociabilité et de vitalité, qu'il présente comme non douloureuse par transposition de l'observation humaine. Il affirme que le recours au modèle murin est "irremplaçable" en raison de la complexité des mécanismes de l'AVC.

Objectifs

Les accidents vasculaires ischémiques cérébraux (AVC) sont la deuxième cause de mortalité dans le monde. Ils sont causés par l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot sanguin. La restauration de la circulation sanguine le plus rapidement possible dans l’artère occluse est le seul traitement des infarctus cérébraux. Toutefois, dans environ 30% des cas, cette restauration du flux sanguin dans l’artère cérébrale occluse, bien qu’indispensable, entraine l’apparition de nouvelles lésions appelées « lésions de reperfusion ». Les mécanismes sont complexes et impliquent un dysfonctionnement du vaisseau et une réponse inflammatoire importante conduisant à une perméabilité vasculaire et à la mort neuronale. Notre équipe étudie le rôle d’une famille de protéines dans différents contextes physiopathologiques. Alors que les souris exprimant une forme inactive de cette protéine sont normales, nous venons de mettre en évidence son rôle dans le contexte pathologique de l’AVC. Ces souris sont protégées de la perméabilité vasculaire, de l’œdème, et présentent des lésions cérébrales réduites. Ces résultats identifient la protéine d’intérêt comme une cible thérapeutique intéressante dans le contexte de l’AVC. Nous avons établi un partenariat pour générer un inhibiteur (bloqueur) de cette protéine que nous allons tester sur le modèle murin d'AVC. A terme, ce projet a pour but d’améliorer la prise en charge des patients en protégeant le vaisseau au moment de la reperfusion de l’artère bouchée, afin de diminuer les lésions cérébrales post-AVC et donc les séquelles chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider l’efficacité de molécules candidates les plus prometteuses sur la protection des lésions post-AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 injection/jour d’un inhibiteur pour induire l’inhibition de la protéine d'intérêt. Une procédure chirurgicale sera réalisée pour induire un AVC (intervention qui dure environ 15 min sous anesthésie et analgésie). Les animaux seront ensuite euthanasiés (24h après la chirurgie) pour être analysés. Pour l'évaluation de la perméabilité des vaisseaux sanguin : 1 seule injection (veine de la queue) de colorant sera réalisée (animal anesthésié) suivie de l'euthanasie de la souris 30min apres l'injection pour analyse.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises une chirurgie pour induire un AVC (chirurgie réalisée sous anesthésie générale en présence d’analgésique en prè-opératoire et post-opératoire). Les souris seront euthanasiées 24h après la chirurgie et l’ischémie cérébrale sera analysée. L’ischémie cérébrale entraine une paralysie latérale (patte avant rétractée, œil fermé, animal tourne sur lui-même toujours dans le même sens ou dans certains cas vrille sur lui-même), une perte de sociabilité et de vitalité. Chez l’Homme, cette paralysie latérale due à l’ischémie, bien qu’impressionnante, n’est pas douloureuse. Nous pouvons donc penser qu’il en est de même chez l’animal. Les animaux ne seront pas impliqués dans plusieurs procédures.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin d'analyser les lésions d'ischémie cérébrale.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) le test d’inhibiteurs sélectifs pour la protéine d'intérêt que nous souhaitons valider in vivo.

Réduction

Les doses d’inhibiteurs à injecter ainsi que la voie d’administration (intraveineuse ou orale) seront déterminés en fonction des tests ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme, et Excrétion) et de pharmacocinétiques (concentration maximale, demi-vie, volume de distribution, clairance et biodisponibilité) qui sont en cours de réalisation par notre collaborateur. Le nombre de souris sera diminué en fonction des résultats obtenus au cours de la procédure. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 6 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes (traité / non traité). Si ces différences existent, elles seront statistiquement affinées avec des groupes de 10 souris si besoin. Le traitement « antiplaquettaire + inhibiteur » sera réalisé uniquement si des résultats concluants sont obtenus avec l’inhibiteur seul.

Raffinement

Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson. Si besoin de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Une observation quotidienne (plusieurs fois par jour) des souris sera réalisée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Expérimentation réalisée sur souris anesthésiées et analgésiées. L’injection de l’analgésique sera également réalisée en post-opératoire (6 à 8h après la chirurgie puis après 8 à 12h). Un anesthésique local en injection intradermique sera également administré avant l’incision (chirurgie). La procédure sera réalisée sur plaque chauffante à 37°C pour le confort de l'animal au réveil. Expérience en manipulation des animaux et en chirurgie des expérimentateurs (formation en chirurgie validée). Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par jour par les zootechniciens (matin) et l’expérimentateur (midi et soir) tout au long de la procédure. La vitalité et les expressions faciales seront évaluées (ouverture des yeux, nez et joues « froncées », position des oreilles et des moustaches). Les points limites seront basés sur la perte de poids (maximum 20% du poids initial) et sur l’examen visuel des signes suivant : léthargie, inconscience.

Choix des espèces

Ce projet a pour but de tester l’impact d’inhibiteurs nouvellement synthétisés spécifiques de la protéine d’intérêt (aucun inhibiteur n’est actuellement disponible sur le marché) dans la progression des lésions cérébrale post-AVC afin de voir si nous reproduisons l’effet protecteur obtenu avec des souris exprimant une forme inactive de la protéine d’intérêt. A terme, cette étude a pour but d’améliorer la prise en charge des patients en protégeant l’endothélium au moment de la reperfusion. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Le recours à l'expérimentation animale est donc l'unique approche permettant de tester ces molécules dans ce contexte physiopathologique de l’AVC. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte).