Procédures sévères
Rôle du peptide Aeta dans le comportement social et anxieux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 264 étant tuées pour analyses histologiques et 132 souris dites "visiteurs" gardées vivantes pour d'autres projets. Elles subissent une chirurgie, un isolement social pouvant durer jusqu'à douze semaines et une série de tests comportementaux dont le RNT donne le nombre sans les nommer précisément, pour étudier le rôle d'un peptide dans le comportement social et anxieux. Le porteur cite l'isolement comme la nuisance principale et l'implantation de minipompes ou de ciment dentaire comme gênes possibles. Il affirme que le comportement social ne peut être reproduit ni par ordinateur ni par cultures de neurones.
Objectifs
Ce projet de recherche porte sur le rôle physiologique du peptide Aeta et son impact sur la fonction cérébrale et le comportement social et anxieux chez la souris. Ce peptide est fortement impliqué dans la modulation d'un récepteur au glutamate impliqué dans la plasticité cérébrale mais également dans le comportement social. Grâce à des animaux transgéniques sur-exprimant ou sous-exprimant ce peptide, nous réaliserons une caractérisation de son rôle dans le comportement social, anxieux et d'anhédonie (manque de plaisir). En fonction des déficits observés chez les animaux sous exprimant, ou surexprimant le peptide, des stratégies de sauvetage , permettront de confirmer son rôle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre l'impact de la modulation de ce peptide sur les comportements sociaux et anxieux. En effet, ce peptide modulant un récepteur qui est très impliqué dans les comportements sociaux, il est très interessant de voir les effets de sa modulation. De plus, nous saurons également si le rôle de ce peptide et plus important lors du developpement ou lors de l'âge adulte. ce projet nous donnera donc potentiellement un nouveau peptide naturel qui pourrait être utilisé comme un nouveau modulateur de ces récepteurs dans certaines pathologies comme la Schizophrénie par exemple mais également dans des troubles sociaux.
Procédures
Les animaux expérimentaux (264) seront soumis à une procédure chirurgicale de 5 minutes. Parmi eux, 72 animaux expérimentaux subirons une procédure chirurgicale de 1h. Des tests comportementaux sont réalisés à l’adolescence et l’âge adulte grâce à 7 ou 9 tâches ( 4 tâches durant 30 min, trois tâches durant 10min environs et une tâche de 3 jours et une de 7 jours). Uniquement à l'âge adulte, un isolement de 12 semaines maximum sera réalisé. Les animaux visiteurs, qui sont un renforcement social dans nos comportements, seront soumis à trois tâches de 10 min avec au maximum deux restriction dans une zone de 20 x 10 cm.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet la majeure nuisance sera un isolement à l'âge adulte .L'anesthésie est également une nuisance , ainsi que la présence de chapeau en ciment dentaire ou l'implantation de minipompes qui pourrait gêner certain animaux par rapport à des éléments dans la cage de vie (Tube ou maison trop étroite).
Devenir
Dans les trois procédures, les animaux expérimentaux seront euthanasiés pour nous permettre de réaliser des analyses histologiques. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets.
Remplacement
Ce projet de recherche porte sur le rôle physiologique du peptide Aeta et l'impact sur le comportement social et anxieux chez la souris qui à l'interêt d'être un mammifère social. Ce peptide est fortement impliqué dans la modulation d'un récepteur au glutamate impliqué dans la plasticité cérébrale ainsi que dans le comportement social. le comportement social ne peut pas encore être remplacé par des modélisations informatiques, ni par des études de neurones en culture. Ce projet ne peux pas non plus être conduit chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
La réduction des animaux est faite par le suivit des mêmes animaux de l'adolescence à l'âge adulte pour eviter d'avoir trop d'animaux. Nous passons également deux fois les animaux "visiteurs" en tests sociaux pour éviter d'avoir le double d'animaux. le nombre d'animaux est choisi en lien avec nos expérimentations précédente et le fait que les comportements sociaux sont très variables. Les tests statistiques spécifiques seront utilisés en fonction de la normalité ou non des distributions.
Raffinement
Pour les chirurgies d’implantation de puces RFID (en anglais Radio Frequency Identification, c'est à dire identification par radiofréquence), ou les mini-pompes, ou les canules intracérébrales, les animaux recoivent l'anesthésie et l'analgésie adéquate. Lors du suivi post opératoire, une grille de score, avec des points limites adaptés et précoce, est utilisé pour réduire la souffrance et réaliser des traitements de la douleur si nécessaire. Si le chapeau en ciment dentaire, ou les minipompes sont une gène par rapport a ce qui est dans la cage, nous adapterons l'enrichissement pour éviter que les animaux se frottent contre un tube trop étroit ou une maison trop petite. Afin de réduire les effets anxiogènes de l'isolement social, des objets permettant de faire un nid, ainsi qu'une cachette (maison ou tube) seront disposés dans les cages de vie. A l’âge adulte, Après ces deux tâches qui nécessitent une mise temporaire en cage individuelle à l’âge adulte, les souris sont replacées en cages collectives pour les manipulations suivantes. Nous avons déjà réalisé ces regroupements qui se passent généralement sans problème. Les animaux seront évalués dans les 3 premiers jours après le regroupement grâce à la grille de score comprenant des points limites.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Notre projet consistant à étudier le comportement des animaux à différents stades de développement, nous utiliserons donc les animaux à l’adolescence (entre 30 et 60 jours) puis à l’âge adulte (à partir de 70 jours).
Évaluation pharmacologique de différentes approches thérapeutiques dans un modèle de tumeurs pulmonaires chez le rongeurs (rat/souris)
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 400
800 souris et 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte des cellules tumorales dans la veine de la queue, puis on administre des traitements et de la radiothérapie, avec imagerie et prélèvements sanguins sous anesthésie, pour évaluer des candidats médicaments contre le cancer du poumon. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent provoquer nécrose, cachexie et perte de poids et que la radiothérapie entraîne diarrhées et saignements, les animaux étant euthanasiés pour prélèvement d'organes. Il décrit objectifs et bénéfices en une phrase chacun et affirme que l'animal constitue un "passage obligatoire" faute de méthode de substitution.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer les effets anti-tumoraux de différentes nouveaux traitements dans des modèles de cancer du poumon.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du poumons.
Procédures
Les animaux recevront 1 injection de cellules tumorales par injection intraveineuse au niveau de la queue (durée estimé à 1 min). Application / Administrations des traitements (moins de 2min pour les injections et environ 5 min pour la radiothérapie). En cas de prélèvement de sang (moins de 2min) ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésies par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales dans la veine caudale et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la nécrose, cachexie, perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris ou le rat car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les cancers pulmonaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rats sont les espèces les plus adaptées à ce type d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (test de comparaison entre les différents traitements).
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.
Choix des espèces
Les rats et les souris font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes (à partir de 6 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. En effet le cancer du poumon atteint le plus souvent les personnes de 50 ans et plus; en 2007, 95,5 % des nouveaux cas ont été diagnostiqués chez les personnes de ce groupe d'âge.
Reconstruction trachéale étendue par lambeau thoraco-chondro-costal pédiculé sur les vaisseaux thoraciques internes chez le mouton
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
20 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une reconstruction de la trachée par lambeau d'environ quatre heures, puis des bronchoscopies avec biopsies, pour tester la faisabilité d'une nouvelle technique chirurgicale. Le porteur liste parmi les effets attendus la douleur, les infections pulmonaires, la détresse respiratoire et la mort, et précise que tous les moutons sont mis à mort en fin d'étude pour récupérer la trachée. Il décrit cette étude comme pilote et affirme qu'aucune méthode alternative n'est envisageable pour évaluer la cicatrisation d'un organe transplanté.
Objectifs
La reconstruction trachéale est l’un des plus grands défis de la chirurgie thoracique. Elle est indiquée pour certaines pathologies malignes comme les cancers de la trachée ou de la thyroïde envahissant la trachée ; et bénignes comme les sténoses trachéales post-intubation longues (par ex. COVID-19), malformations trachéales. Quand la résection est étendue (>50% de la longueur trachéale), il est nécessaire de remplacer la partie manquante par un substitut trachéal. Le parfait substitut trachéal devrait respecter plusieurs critères : autologue, flexible en longueur, résistant à la dépression respiratoire, comportant un épithélium ciliaire, ne nécessitant pas de traitement immunosuppresseur et facile à réaliser techniquement. De nombreuses techniques ont déjà été utilisées : allogreffes trachéale et aortique, matériel synthétique, transplantation trachéale, lambeau antébrachial avec anneaux cartilagineux, bio engineering ; aucune technique actuelle ne remplit tous ces critères et cela engendre des conséquences graves chez ces patients. Nous proposons un nouveau modèle original de lambeau thoraco-chondro-costal pédiculé sur les vaisseaux thoraciques internes chez le mouton. Notre étude chez l’animal a pour objectifs principaux d’établir la faisabilité de ce modèle chez le mouton, dans le cadre de remplacements trachéaux étendus (partiels et circonférentiels) ; et d’étudier la régénération épithéliale au sein du transplant à partir des extrémités trachéales natives anastomosées. L’objectif secondaire est de comparer des techniques de renforcement interne ou externe afin de limiter l’utilisation de stents.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote doit permettre de valider la faisabilité de la reconstruction trachéale étendue par un lambeau thoraco-chondro-costal et d’en déterminer l’évolution cicatricielle. Ce projet s’inscrit dans une thématique exceptionnelle de recherche en remplacement trachéal et constitue une approche thérapeutique intéressante qui pourra devenir la technique de référence chez l’humain.
Procédures
Procédure n°1: remplacement trachéal étendu par lambeau thoraco-chondro-costal pédiculé sur les vaisseaux thoraciques internes, 1 procédure par animal, durée de la procédure environ 4 heures. Procédure n°2: Bronchoscopie avec biopsies trachéales étagèes, 1-3 interventions par animal, durée 30 minutes environ.
Impact sur les animaux
Douleurs, Stress, Infections pulmonaire, Infection de site opératoire, Désunion de cicatrice, Détresse réspiratoire, Décès.
Devenir
Tous les moutons inclus dans ce protocole seront mis à mort à la fin de l’étude dans l’objectif de récupérer la trachée pour effectuer des analyses fonctionnelles, et structurelles, ainsi que pour limiter l'éventuelle présence de souffrance aussi minime soit-elle
Remplacement
Compte tenu de la complexité tissulaire de la trachée et de la nécessité d’évaluation de la cicatrisation d’un organe transplanté, il n’est pas possible d’envisager de méthode alternative ou substitutive à un modèle animal. Compte tenu des besoins de transfert de modèle sur l’Homme, l’anatomie ainsi que la taille du modèle animal doit être cohérente et adaptée aux nécessités techniques (endoprothèses, suivi endoscopique), ce qui ne permet pas d’envisager de réaliser l’étude sur de petits mammifères. Grâce à ce nouveau modèle chez le mouton, nous nous rapprochons au maximum des critères du substitut trachéal parfait. Il est facile à prélever et ne requiert pas de microchirurgie. Les néo cartilages resteront vascularisés grâce à leurs périchondres, et donc en théorie moins de risque de calcification et de fracture à moyen terme. La plèvre va se retrouver à l’intérieur de la trachée. Plusieurs études ont démontré que la plèvre pouvait se transformer en épithélium respiratoire, ce qui devrait faciliter la clairance bronchique.
Réduction
Dans le cadre de l’objectif de réduction du nombre d’animaux, l’étude pourra être arrêtée si les 5 observations positives sont obtenues sans que l’utilisation des 10 animaux soit nécessaire. De même, en l’absence d’observation positive après le 6e animal, la technique sera considérée comme un échec et l’étude sera arrêtée.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en box individuels au sein de l’animalerie. Les conditions de stabulation répondent aux normes spécifiques de températures et d’éclairage propres aux moutons avec une zone paillée d’1,5 m2 par animal, et une durée d’exposition lumineuse de 12 heures par jour. Ils sont nourris avec un aliment de base pour mouton, rationné au poids de l’animal et eau ad-libitum. Chaque mouton aura une période d'acclimatation de 10 jours avant de réaliser la chirurgie. Chaque mouton sera observé quotidiennement avant et après la chirurgie d’une part par les animaliers lors des soins d’hygiène et d’alimentation mais aussi par les expérimentateurs ayant validé le niveau 1 d’expérimentation animale. Après la chirurgie, ils viendront évaluer les animaux et administrer les antalgiques tout au long des expérimentations. Le mouton sera évalué dans son box de stabulation. A chaque visite de l’animal (soit au moins une fois par jour à partir de la chirurgie), les différents signes d’inconfort seront relevés. En cas de signes de détresse constatés, une surveillance accrue du mouton sera réalisée. On réalisera également l’administration des analgésiques et, si nécessaire, le vétérinaire responsable de l’animalerie sera appelé pour un examen clinique plus approfondi du mouton. En cas d’atteinte de points limites, un sacrifice du mouton sera réalisé.
Choix des espèces
Présence d’une trachée longue dont la partie cervicale est facilement accessible avec une anatomie proche de l’humain. Au stade adulte, car la trachée est bien développée et que les proportions anatomiques sont proches de l’homme.
Etude de l’implication des interneurones parvalbumine et des réseaux périneuronaux dans la douleur chronique et ses comorbidités anxiodépressives.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie de 45 minutes, une deuxième trois semaines plus tard, une troisième de 10 minutes après trois autres semaines, puis quatre tests comportementaux espacés de 24 heures et une restriction alimentaire de 24 heures : un lot de souris franchit toutes ces étapes. Les 396 souris du projet, toutes soumises à une douleur chronique et à des troubles anxio-dépressifs, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, un autre lot ne subissant qu'une chirurgie de 10 minutes sur la patte droite avant les mêmes tests, et d'autres deux chirurgies espacées d'une semaine. Le porteur écrit que la douleur "ne peut être soulagée car c'est l'objet d'étude", et ne précise ni la nature des chirurgies de 45 minutes ni les quatre tests comportementaux. À la fin des procédures, toutes sont mises à mort pour des prélèvements et des analyses cellulaires.
Objectifs
La douleur neuropathique est une douleur chronique consécutive à une lésion ou une pathologie du système somatosensoriel, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population. De plus, cette maladie s’accompagne dans environ 50% des cas de troubles de l’humeur tel que l’anxiété et la dépression, constituant alors un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle, des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données cliniques chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Il y aurait des modifications cellulaires et moléculaires dans ces structures à la suite de la douleur, qui pourrait expliquer l’apparition des troubles anxiodépressifs. L’objectif du projet est alors d’étudier ces changements dans un modèle de douleur neuropathique développant des symptômes anxiodépressifs.
Bénéfices attendus
A l’issu de ce projet, nous comprendrons plus en détail les modifications cellulaires et moléculaires du cerveau suite à une douleur neuropathique, et l’impact de ces modifications sur les troubles anxieux et dépressifs. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour les troubles de l’humeur induits par la douleur chronique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Un premier lot d'animaux subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 10 min environ, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, avec une restriction alimentaire de 24h. De plus, un autre lot d'animaux subiront une chirurgie de 45 min, puis 3 semaines après, une deuxième chirurgie de 45 min, puis 3 semaines après, une dernière chirurgie de 10 min, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, chacun espacé de 24h, avec une restriction alimentaire de 24h. Enfin, deux autres lots d'animaux subiront une chirurgie de 45min, puis une semaine après, une chirurgie de 10min et deux autres lots subiront d’abord une chirurgie de 10min puis une semaine après, une chirurgie de 45min, puis 4 tests comportementaux d’une durée comprise entre 5 et 30min, chacun espacé de 24h, avec une restriction alimentaire de 24h.
Impact sur les animaux
Il y a présence d’une douleur mais qui ne peut être soulagée car c’est l’objet d’étude. Suite à une chirurgie neuropathique, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparait dans les 48-72h après la chirurgie. Le développement de troubles anxiodépressifs est attendu et ne peut être évité car c’est l’objet d’étude. Les autres chirurgies peuvent induire une douleur aigue mais transitoire qui sera soulagée. La restriction alimentaire de 24h peut provoquer une perte de poids des animaux. Celle-ci sera limitée le plus possible en ne dépassant pas 24h de restriction et en réalimentant les animaux juste après le test. De plus, le poids des animaux sera surveillé tous les jours jusqu’à leur mise à mort pour vérifier que celui-ci ne diminue pas de 80% du poids initial.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort, pour prélevements et analyses cellulaires.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, notre analyse nécessite le développement des troubles anxiodépressifs dans un modèle de douleur neuropathique, nécessitant une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Evaluation préclinique de produits de santé de dialyse péritonéale après implantation dans l’organisme
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun est opéré sous anesthésie pour implanter un cathéter dans l'abdomen, puis soumis à des dialyses péritonéales répétées jusqu'à cinq fois par jour, pour évaluer des produits de dialyse avant leur mise sur le marché. Le porteur signale des risques de douleur, d'infection et d'arrachage du cathéter imposant une nouvelle chirurgie. Il évoque le "donneur d'ordre" commanditaire des tests et conclut à l'impossibilité de maintenir les lapins en vie, leurs organes devant être examinés.
Objectifs
Ce projet vise à développer un modèle de dialyse péritonéale chez l'animal en vue d'étudier l'efficacité des produits à tester, répondant ainsi aux besoins scientifiques et cliniques actuels. Ces études entreront dans la constitution de dossiers précliniques, étape nécessaire à l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché et à l'utilisation clinique de ces produits chez l'humain. La tolérance locale (effet d'un produit étranger sur les tissus vivants avec lesquels il est mis en contact) pourra également être évaluée. La dialyse péritonéale est une technique qui permet de participer à l'évaluation des toxines produites par l'organisme et présentes dans le sang pour compenser une fonction rénale défaillante. Pour cela, un liquide appelé dialysat est injecté dans la cavité abdominale via un catheter. Il se trouve en contact avec le péritoine, membrane semi-perméable qui tapisse cette cavité. Les petites et moyennes molécules déchets de l'organisme présentes dans le sang pourront alors passer à travers cette membrane pour se concentrer progressivement dans le dialysat. Le dialysat ainsi chargé des déchets sera enfin retiré de la cavité abdominale par le catheter. Ces étapes seront répétées jusqu'à plusieurs fois par jour ou la nuit, selon la sévérité de l'insuffisance rénale du patient. De part sa simplicité de mise en place et de réalisation, la dialyse péritonéale représente une alternative intéressante à l'hémodialyse, qui nécessite un important appareillage, des déplacements en centre de dialyse, etc. La dialyse péritonéale peut être gérée à domicile par le patient lui-même de façon autonome ou assistée. Les dialysats doivent donc être évalués pour prouver leur efficacité et sécurité. Du fait du contact étroit entre le dialysat et les organes obdominaux (digestifs, reproducteurs...), il est essentiel de prouver leur absence de toxicité avant leur mise sur le marché, d'autant plus qu'ils seront utilisés chez des patients fragiles atteints d'insuffisance rénale avancée. Afin d'étudier l'efficacité et la sécurité des dialysats, le recours à des modèles animaux de taille suffisante (ex : lapin) sont nécessaires. Ces modèles animaux permettent d'évaluer l'efficacité de la filtration du dialysat par le péritoine, en comparant les quantités de dialysat injectées et récupérées par exemple. La sécurité peut également être évaluée dans ces modèles par analyses des tissus qui ont été au contact avec le dialysat.
Bénéfices attendus
Grace à l'élaboration d'un modèle animal fiable et reproductible, les données de sécurité et de performance obtenues au cours des études permettront de répondre aux exigences réglementaires et de qualité attendues des prouits de santé pour dialyse péritonéale mis sur le marché. Un tel modèle animal pourra permettre par exemple de sélectionner parmi un panel de produits en développement celui présentant le plus de bénéfices, en comparant leurs données de performance et de sécurité. De tels essais sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre d'animaux utilisés, en poussant seulement le développement des produits les plus intéressants et en écartant rapidement des recherches les produits ne présentant pas des qualités de sécurité ou de performance suffisamment satisfaisantes. Une fois le produit le plus intéressant sélectionné, ce modèle animal permet aussi de comparer ce produit en développement à d'autres déjà commercialisés, pour s'assurer qu'il représente un bénéfice au moins égal ou supérieur.
Procédures
L’ensemble des animaux sera opéré sous anesthésie générale et traitement analgésique pour placer le cathéter au niveau de la cavité abdominale de façon stérile. L'intervention est estimée à environ 30 minutes par lapin. Le dispositif sera ensuite protégé à l’aide d’un pansement, afin de permettre à l’animal de conserver une liberté de mouvement adéquate tout en limitant le risque qu’il n’arrache le cathéter (ce qui nécessiterait de renouveler l’intervention chirurgicale). Une fois le cathéter en place, les dialyses péritonéales consisteront en l’injection du dialysat, à une période de stase puis au drainage du dialysat. En général, la durée de stase va de quelques minutes à plusieurs heures afin d’être représentatif d’une dialyse réalisée chez l’homme (exemple : 60 minutes de stase chez le lapin correspondent à 2h chez l’homme, 120 minutes correspondent à 4h (durée standard de stases courtes, réalisées en journée chez l’homme), et 240 min correspondent à 8h (durée standard des stases longues réalisées la nuit chez l’homme). Les dyalises peuvent être répétées plusieurs fois par jour (en fonction de leur durée) et au maximum 5 fois par jour. Cette procédure n’étant pas douloureuse, elle sera réalisée sans anesthésie, de la même manière que lors des conditions cliniques réelles et afin de réduire le risque potentiellement lié à des anesthésies répétées. Enfin, pour évaluer l’efficacité et l’absence d’effet indésirable, des prises de sang pourront être réalisées sur les animaux en cours d’étude. Celles-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables connus pouvant survenir chez l’animal sont : - une douleur liée à l’implantation du catheter. - le retrait accidentel du catheter et la nécessité de renouveler l'intervention chirurgicale. - la perte de poids ou d’appétit en lien avec l'anesthésie ou la chirurgie. - le risque d'infection. Malgré un environnement de vie controlé, la surveillance du pansement protecteur et les manipulations propres du catheter, le risque infectieux reste à prendre en compte. - le risque de stress pour l'animal. Les différentes manipulations réalisées suite à la chirurgie ne causent pas de douleur, mais peuvent être source de stress chez l'animal (manipulations pour les injections et retrait du dialysat avec massages de l'abdomen, changements du pansement autour du catheter...).
Devenir
Afin de s’assurer de la sécurité des produits de dialyse péritonéale, une observation de la cavité abdominale et des organes abdominaux est nécessaire. Ceci permet d’évaluer la performance et la tolérance locale de ces produits, ce qui est l’objectif des études réalisées sur ce modèle animal. Des prélèvements de tout ou partie de certains organes peuvent éventuellement être nécessaires, en particulier en cas d’anomalie constatée, pour évaluer les effets tissulaires à l’échelle microscopique. L’ensemble de ces facteurs explique l’impossibilité en fin d’étude de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
Les échanges moléculaires s'effectuant à travers la membrane péritonéale sont complexes. Des modèles informatiques ou in vitro permettent d'apporter certaines connaissances sur ce point. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de fournir l'ensemble des réponses nécessaires à l'évaluation de la performance et de la sécurité des produits de dialyse péritonéale en vue de leur utilisation chez l'humain. Pour l'heure, les interactions complexes s'établissant entre le produit infecté et la membrane péritonéale ne peuvent être recrées ex vivo.
Réduction
Grâce à l’apport des méthodes n’ayant pas recours à l’utilisation d’animaux vivants (modèles informatiques ou in vitro tels que des courbes d’osmolarité…), il est possible de déterminer en amont les meilleures concentrations de produit de dialyse péritonéale à injecter chez l’animal. Ainsi, dans la phase in vivo du développement de ces produits de santé, il est possible de tester uniquement les concentrations approuvées par les techniques ex vivo, ce qui réduit drastiquement le nombre d’animaux devant être utilisés. Par ailleurs, le donneur d’ordre demandant la réalisation de ces tests s’engage à ne pas faire renouveler à l’identique un essai déjà mené précédemment. De plus, l’interprétation des résultats nécessite toujours de comparer ceux obtenus chez des animaux qui reçoivent le produit évalué avec ceux obtenus d’animaux qui reçoivent un produit « contrôle », dont l’effet attendu est déjà connu. Pour réduire encore le nombre d’animaux inclus en étude, il est possible d’utiliser un même groupe « contrôle » pour plusieurs groupes « test » recevant des produits à tester différents. Enfin, nous avons déjà mentionné la possibilité de réaliser des études pour sélectionner parmi un panel de produits celui qui présente le plus d’intérêt à être développé, réduisant ainsi le nombre de tests réalisés sur des produits ayant un intérêt moindre. Par ailleurs, si l’effet attendu d’un produit est trop incertain, il est possible de réaliser une étude dite « pilote » sur quelques animaux seulement. Les résultats de cette première étude à petite échelle servent à confirmer ou infirmer les interrogations concernant ce produit. Une étude à plus large échelle, incluant le nombre d’animaux nécessaire sur le plan normatif ou statistique, ne sera alors réalisée qu’une fois les doutes levés.
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie d’implantation du catheter, une période d’habituation aux actes spécifiques (massage abdominal, contention…) peut aussi être réalisée pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcés en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). Les animaux sont suivis de façon quotidienne, 7 jours sur 7. En phase post-opératoire, ces suivis sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements, désinfection des sites chirurgicaux à chaque réfection de pansement…). En cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, l’équipe vétérinaire assure l’examen clinique et le suivi de l’animal, afin de mettre en place une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. - le risque d’infection : un traitement antibiotique peut permettre de contrôler ce risque. - la perte de poids ou d’appétit en lien avec l’anesthésie ou la chirurgie : Un suivi quotidien du transit et de l’alimentation est systématiquement mis en place à la suite des chirurgies chez le lapin, et ce jusqu'à la reprise d'un comportement alimentaire normal. En cas d’apparition de symptômes de ce type, des mesures seront mises en place : distribution d’aliments plus appétants (légumes frais, friandises…), mise à disposition d’un aliment de convalescence, voire distribution à la pipette pour aider à relancer la prise alimentaire spontanée.
Choix des espèces
La réalisation de la chirurgie et l'utilisation des produits de dialyse péritonéale nécessitent que la cavité abdominale soit d'une taille suffisante. Ceci permet une mesure précise des volumes administrés et récupérés, autorisant un calcul fiable de l'efficacité de filtration. Le choix d'un animal de gabarit assez important est également éncessaire pour permettre la réasliation de prises de sang d'un volume suffisant à l'évaluation de l'efficacité de la dialyse, tout en respectant les volumes maximums pouvant être prélevés sans avoir d'impact délétère sur les animaux. Pour cela, le lapin est un modèle reconnu pour la réalisation de ce type de tests, du fait de son gabarit adapté et des similitudes constatées entre la structure de leur péritoine et celle du péritoine humain. L’utilisation d’animaux adultes d’un poids minimum de 2,5 kg lors de la chirurgie est recommandée, afin de limiter les risques liés à l’anesthésie et de permettre la mise en œuvre des techniques chirurgicales et post-opératoires adéquates.
Rôle du microbiote intestinal dans les troubles fonctionnels digestifs associés aux troubles du comportement alimentaire (TRANSMIC-TCA)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Isolées en cage individuelle pendant quinze jours, elles reçoivent par gavage un microbiote intestinal humain, puis sont soumises à un modèle d'anorexie par restriction alimentaire ou à un modèle de boulimie, pour tester le lien entre microbiote et troubles du comportement alimentaire. Le porteur indique que la restriction peut provoquer fatigue, prostration et forte perte de poids, une chute de plus de 20 % sur trois jours déclenchant la mise à mort. Il affirme que le recours aux modèles animaux est "indispensable", faute d'un autre modèle étudiant ces aspects "dans leur globalité".
Objectifs
Les Troubles du Comportement Alimentaire (TCA) constituent des pathologies graves de l’adolescence et des jeunes adultes, avec un impact fort en termes de morbidité et de mortalité à long terme. Les TCA regroupent différentes formes : l’anorexie mentale, la boulimie et l’hyperphagie boulimique. La prévalence mondiale de ces maladies atteint 8,4% chez les femmes et 2,2% chez les hommes, ce qui en fait un enjeu de santé publique très important. Les mécanismes moléculaires à l’origine des TCA sont encore mal compris. Ce sont des maladies complexes et impliquant différents facteurs biologiques, psychologiques et socio-culturels. Le microbiote intestinal, qui correspond à l’ensemble des micro-organismes vivant à l’intérieur de l’intestin, pourrait être un de ces facteurs. En effet, ces micro-organismes interagissent et communiquent de façon très étroite avec l’intestin mais également avec le cerveau. Ce microbiote intestinal joue également un rôle dans la digestion, dans la régulation de la prise de poids et dans le comportement alimentaire. Il a été montré que la composition du microbiote intestinal de patients souffrant de TCA était modifiée par rapport à des individus sains. Ces changements pourraient avoir un impact sur la physiologie intestinale, notamment en favorisant l’apparition de troubles fonctionnels digestifs (une comorbidité fréquemment retrouvée chez les patients avec TCA). Notre projet de recherche propose donc d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans l’apparition et la persistance de ces maladies et de certaines de leurs comorbidités. Notre projet de recherche reposera sur l’utilisation d’approches expérimentales de type « greffes de microbiote intestinal », de l’Homme vers la Souris, ainsi que sur l’utilisation de plusieurs modèles animaux reproduisant différents aspects des TCA étudiés : un modèle de boulimie et d’hyperphagie chez la souris C57Bl/6 (modèle murin « Binge Eating Disorder » ou BED) et un modèle d’Anorexie chez la Souris C57Bl/6 (modèle murin « Activity-Based Anorexia » ou ABA). L’ensemble des connaissances apportées par ces expériences permettra de mieux comprendre les mécanismes d’apparition et de persistance des troubles du comportement alimentaire. Nous espérons en particulier identifier de nouvelles approches thérapeutiques basées sur la manipulation du microbiote intestinal, qui viendront compléter les approches psychologiques et nutritionnelles actuellement utilisées pour lutter contre ces maladies.
Bénéfices attendus
L’ensemble des approches expérimentales présentées dans ce projet nous permettront de déterminer s’il existe un lien de cause à effet direct entre les altérations du microbiote intestinal et l’apparition de troubles du comportement alimentaire. Les résultats obtenus permettront d’améliorer notre connaissance de la physiopathologie des Troubles du Comportement Alimentaire et ouvriront de nouveaux axes de recherche sur le développement de thérapies innovantes contre ces maladies, basées sur la modulation du microbiote des patients.
Procédures
- Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront séparés en cages individuelles après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront pesés quotidiennement (animaux vigiles), soit 16 pesées pour chaque animal. Pour cela, les animaux seront extraits de leurs cages et pesés sur une balance adaptée. - L’ensemble des animaux de la procédure 2 (448 souris) et de la procédure 3 (224 souris) seront gavés oralement à 3 reprises (1 fois pour la première greffe de microbiote à J0, 1 fois pour la deuxième greffe de microbiote à J1 et 1 dernière fois à J16). Pour cela, les animaux (vigiles) seront extraits de leurs cages et maintenus en contention pendant quelques secondes. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront extraits de leurs cages le dernier jour du protocole et maintenus en contention pendant 2 minutes (animaux vigiles) pour effectuer l’analyse de leur composition corporelle. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront extraits de leurs cages le jour de la mise à mort et maintenus en contention pendant quelques secondes pour la réalisation d’une injection intrapéritonéale d’anesthésiques.
Impact sur les animaux
- L’ensemble des expérimentations prévues nécessitent d’héberger les animaux pendant plusieurs jours en cages individuelles (15 jours). Cet isolement est indispensable pour pouvoir suivre la prise alimentaire et hydrique de chaque souris et évaluer leur activité physique. - La réalisation de greffes de microbiote intestinal par gavage oral chez la Souris nécessite de prendre les animaux en contention, ce qui peut engendrer un stress de quelques secondes. La mesure de composition corporelle (par Echo-MRI) nécessite également une contention d’une durée deux minutes. Ces différentes contentions seront réalisées par des expérimentateurs expérimentés afin de réduire au maximum le stress des animaux. - Le modèle murin d’anorexie « Activity-Based Anorexia » est un modèle très utilisé et bien documenté dans la littérature (Schalla et al., Front Nutr, 2019 ; doi: 10.3389/fnut.2019.00069). Suite à la restriction alimentaire imposée, les animaux peuvent présenter une fatigue, une prostration et une perte de poids importante. Tous ces paramètres sont pris en compte dans l’évaluation du bien-être animal. Le poids corporel sera suivi quotidiennement et fera également l’objet d’un point limite. - Le modèle murin de boulimie/hyperphagie boulimique « Binge Eating Disorder » est également bien documenté. L’accès intermittent à une nourriture riche en sucre et riche en graisse peut induire un stress lié au développement d’un comportement de type addictif. Cet aspect sera également pris en compte dans l’évaluation du bien-être animal.
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’information à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée visant à étudier les interactions entre les bactéries du microbiote, l’intestin et le cerveau. Ce projet se concentre notamment sur l’analyse de l’impact du microbiote sur la physiologie intestinale (particulièrement les troubles fonctionnels digestifs) et sur le comportement alimentaire. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour réaliser cette étude et atteindre les objectifs de ce projet car aucun autre modèle « non animal » actuel ne nous permet d’étudier ces aspects dans leur globalité.
Réduction
Pour nos expérimentations, le nombre d’animaux prévu est dimensionné par rapport au nombre de patients et volontaires sains qui seront inclus dans le protocole clinique (validé par le CPP Ile-de-France V). Nous avons limité ce nombre d’animaux de façon à garder une puissance statistique suffisante dans le traitement des résultats et de pouvoir conclure sur le rôle du microbiote dans l’apparition des troubles fonctionnels digestifs. Les différents paramètres physiologiques et comportementaux mesurés pour chaque lot d’animaux seront comparés. Les analyses de composition du microbiote feront l’objet d’un traitement statistique particulier adapté à ce type de données.
Raffinement
La mise en place d’un suivi strict de points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur des animaux au cours des expérimentations. L'ensemble des expériences sera mené par des personnels expérimentés, dans des locaux d'hébergement respectant les standards en vigueur. Pour limiter le stress des animaux, plusieurs points seront mis en place : - Après leur arrivée dans l’animalerie, les souris resteront pendant une semaine en période d’acclimatation avant le début des expérimentations. - Le milieu de la cage sera enrichi de coton pour permettre aux animaux de réaliser des nids. - Les animaux seront observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Deux points limites seront évalués : - Au cours du modèle ABA (modèle de dénutrition), une attention particulière sera portée à la perte de poids. Un suivi quotidien sera réalisé et permettra d'évaluer le pourcentage de perte de poids des différents animaux. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial sur 3 jours consécutifs entrainera la mise à mort de l'animal. - Une évaluation de la souffrance animale sera réalisée à l’aide de l’échelle « Mouse Grimace Scale » composée de 5 items faciaux. Lorsque la somme des scores de ce critère sera supérieure à 5, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique. Si la douleur persiste plus de deux jours, les animaux seront mis à mort. Lorsque la somme des scores de chaque critère sera supérieure à 7, les animaux seront mis à mort. - Au cours du modèle murin de boulimie/hyperphagie boulimique « Binge Eating Disorder », une attention particulière sera portée au développement d’un comportement de type addictif ou de sevrage chez les animaux lié à l’accès intermittent à la diète riche en sucre et riche en graisse Ces différentes manifestations seront prises en compte lors de nos observations quotidiennes des animaux et lors des tests comportementaux réalisés au cours de notre protocole.
Choix des espèces
La lignée C57Bl/6 a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiotiques (Tirelle et al., BMC Microbiol, 2020, DOI: 10.1186/s12866-020-02018-9). Cette lignée C57Bl/6 a d’autre part été utilisée à de nombreuses reprises par notre laboratoire pour l’étude du modèle ABA (Jésus et al., Clin Nutr, 2014, DOI : 10.1016/j.clnu.2013.11.006 ; Breton et al., Clin Nutr, 2021, DOI : 10.1016/j.clnu.2020.05.002). Il est donc pertinent de développer le modèle BED et d’effectuer l’ensemble des greffes de microbiote intestinal dans cette même lignée. Les souris seront livrées à l’animalerie à l'âge de huit semaines et utilisées pour les expérimentations à l'âge de neuf semaines (après 1 semaine d’acclimatation). Cet âge correspond un stade de jeune adulte chez les souris, ce qui correspond au pic d’incidence retrouvé chez l’Homme pour les troubles du comportement alimentaire (Galmiche et al., Am J Clin Nutr 2019 ; DOI : 10.1093/ajcn/nqy342).
Rôle des connexions LC-Raphé dans la résilience au stress chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une injection stéréotaxique de virus dans le cerveau et l'implantation de fibres optiques sous anesthésie, et cent d'entre elles sont exposées cinq minutes par jour pendant dix jours à une souris agressive, avec des blessures possibles. Le porteur indique que l'anhédonie, l'anxiété et l'apathie provoquées "ne peuvent être soulagées" car elles sont l'objet de l'étude. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne peut apporter le même niveau d'information.
Objectifs
La dépression touche plus de 350 millions de personnes dans le monde et représente la première cause d'invalidité dans le monde. La dépression est précipitée par des évènements stressants. Cependant, certains individus ne développent pas de profil pathologique après exposition au stress, une qualité définie comme la résilience. Une région du cerveau appelée « locus coeruleus » (LC) et libérant de la noradrénaline (NE) a un rôle majeur dans le circuit de la résilience. Comment ce système contrôle l’activité du système sérotoninergique (impliqué dans la réponse aux antidépresseurs) dans le contexte d’un évènement stressant reste à être étudié. L’objectif de ce projet est d’étudier i) la régulation fonctionnelle du système sérotoninergique par le LC et ii) le rôle de ce circuit dans la résilience au stress chronique. Le modèle de stress utilisé dans ce projet permettra d'identifer des animaux résilients dans un contexte d'aggression sociale et constitue un modèle de résilience à la dépression. Seule l’expérimentation in vivo, permettant d’étudier les conséquences neurobiologiques du stress et mettre en évidence des comportements anxio-dépressif, nous permettra de répondre à cette question.
Bénéfices attendus
Environ 30% des patients dépressifs ne répondent pas aux traitements antidépresseurs conventionnelles. Ce projet a un intérêt majeur puisqu'il permettra d'améliorer la compréhension de la neurobiologie de dépression et de la résilience afin de concevoir de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces pour ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 procédures chirurgicales: une première procédure d'injection stereotaxique de virus AAV sera réalisée chez 320 souris et une deuxième procédure d'implantation de fibres optique sera réalisées chez 280 souris, 3 semaines suite à l'injection de virus AAV. Chaque procédure aura lieu sous anesthésie pour une durée de 1 ou 2 heures chacune. Parmi les animaux, 100 souris seront également soumises à un protocole de stress chronique de défaite sociale pendant 10 jours.
Impact sur les animaux
La nature de cette expérience aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée étant donné que l’objectif de ce projet qui est d’étudier les effets du stress et de la dépression sur le cerveau. Lors de la procédure de stress chronique de défaite sociale, les animaux (100 DBHcre) sont mis en contact avec une souris CD1 aggressives 5 minutes par jour pendant 10 jours. Des blessures ou lésions induites par les agressions physique lors de cette procédure peuvent être observées. Les souris CD1 agressives seront isolées à leur arrivé à l’animalerie pour éviter les combats entre elles.
Devenir
A l'issue des 3 procédures, les animaux seront mis à mort et les cerveaux utilisés pour des analyses immunohistologique.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’étudier l’émergence de troubles psychiatriques en réponse au stress, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet nécessite l’emploi de plusieurs techniques expérimentales. Compte tenu de la littérature et de notre expérience, nous utiliserons les tests statistiques pour analyser nos données. Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées. Plusieurs paramètres peuvent induire de la variabilité ou la perte d'animaux au cours des différentes procédures expèrimentales : - Pour la procédure 1, validation de la stratègie virale et cartographie anatomique, l'injection de virus peut être déficiente, nous estimons donc que des lots de n=5 par groupe sont necessaires. - Pour la procédure 2, qui implique 2 procédures d'injection et d'implantation stéreotaxiques, le risque de perte augmente. Cette procédure implique également des enregistrement en imagerie calcique qui présente de grande variabilité entre individus en fonction de l'expression virale et du site d'implantation. Un nombre de n=20 animaux par groupe est nécessaire. - Pour la procédure 3, s'ajoute à la variabilité induite par les procédures chirurgicales et d'enregistrement, la variabilité comportementale. Par ailleurs, sachant que 30% des souris stressées sont résilientes à la défiate sociale, 80 souris stréssées sont nécessaires pour obtenir 24 souris résilientes.
Raffinement
La nature de certaines de nos expériences, en particulier celles dont le but est de déterminer les effets du stress et de la dépression sur le cerveau, aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée. Par contre, si un animal est en souffrance, alors, il sera euthanasié. Pour limiter l’angoisse des animaux, ceux-ci seront habitues à l’expérimentateur, au dispositif et à la pièce d’expérimentation pour éviter un stress supplémentaire. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et des protocoles analgésiques seront mis en place pour limiter la douleur des animaux. Des points limites ont été établis pour chaque procédure.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude de la fonction des circuits cérébraux dans le cerveau des mammifères : i) l’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine ; ii) L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau de la souris sont bien caractérisées ; iii) Il existe une vaste littérature sur le comportement de la souris, l'apprentissage et la mémoire. Par ailleurs, il est possible d'utiliser une batterie de souris Génétiquement modifiées. La souris est donc le modèle le plus adapté étant donné également sa petite taille et sa reproduction rapide. Les études seront réalisées à l’âge adulte (8-12 semaines) car nous cherchons à étudier les mécanismes neurobiologiques mis en place chez l'adultes pour conserver un état neuropsychobiologique normal en réponse à un évènement stressant. La prévalence de la dépression chez l'adulte a augmenté de 2,5 points en deux ans, ce qui représente 13,5% de le population française de plus de 15 ans.
Etude de l’efficacité de molécules candidates pour le traitement de pathologies cardiaques sur des modèles rongeurs. (2023-B-024)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 1452
1 976 rongeurs, 524 souris et 1 452 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, la plupart dans des procédures classées sévères, une partie opérée sous anesthésie sans réveil. Ils subissent la pose d'une sonde dans le cœur par la carotide, un électrocardiogramme et un cathéter veineux, avant extraction du cœur, pour tester l'efficacité de molécules candidates contre des pathologies cardiaques. Le porteur indique que ces gestes chirurgicaux entraînent douleur et stress, et qu'une perte de poids de plus de 20 % en 24 h déclenche la mise à mort. Il présente la souris comme un moyen pour des "clients" disposant de peu de composé de tester tout de même leur molécule.
Objectifs
Selon l’organisation mondiale de la santé, les maladies cardiaques sont la première cause de mortalité dans le monde. Le cœur, qui est un organe vital, peut présenter des problèmes à la fois de contractilité du muscle cardiaque, de rythme mais aussi de conduction, toutes ces pathologies pouvant amener au décès des patients. Ce projet a pour but de développer différents types de modèles qui miment ces mêmes symptômes chez l’animal afin de tester et de démontrer l’efficacité de molécules en développement. Pour l’ensemble de ces modèles, différents paramètres cardiaques tels que l’électrocardiogramme (paramètre permettant de lire le rythme cardiaque), la pression ventriculaire gauche (paramètre permettant de comprendre comment fonctionne cette partie du cœur) et la pression sanguine seront enregistrés selon le modèle étudié. Ces différents modèles animaux permettront de tester des candidats médicament et de trouver des traitements pouvant améliorer la prise en charge des patients atteints de ce type de maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester l’efficacité de molécules en développement afin de trouver un candidat médicament susceptible de traiter des pathologies cardiaques et ainsi d’améliorer la prise en charge / le pronostic de ces patients.
Procédures
Au cours de sa vie, un animal ne pourra être impliqué que dans une procédure de cette étude. Pour tous les animaux l’identification dure 30 secondes. Le temps pour effectuer une injection d'analgésique est estimé à 30 secondes. Pour les procédures comportant l’anesthésie chimique, le temps d’injection de l’anesthésique est estimé à 30 secondes. Les différents types d'administration prendront moins d'une minute par animal. Les temps d’intervention sur l’animal estimés pour chaque procédure sont les suivants : - Mise en place de la sonde dans le cœur en passant par la carotide ou mise en place d’une sonde reliée à un capteur de pression (20 min), mise en place d’un électrocardiogramme (10 min), mise en place d’un cathéter en vaisseau veineux (15min), extraction du cœur de l'animal (15min).
Impact sur les animaux
Toutes les procédures de ce projet incluant des gestes chirurgicaux, un certain niveau de douleur et de stress sont attendus nécessitant une anesthésie et analgésie préopératoires appropriées. Des signes cliniques dus au traitement par un candidat médicament (en amont des mesures de paramètres cardiaques), pourront être observés (exemple : perte de poids, prostration, yeux mi-clos, …) et feront l’objet d’un suivi spécifique. Pour les animaux ayant un phénotype dommageable, une attention particulière sera portée sur leur suivi. Des points limites spécifiques seront définis pour ces animaux en fonction des données scientifiques connues sur cette lignée et des recommandations de l'éleveur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des deux procédures car leur cœur sera prélevé afin de réaliser des analyses des tissus et/ou des colorations afin de visualiser les lésions au niveau du cœur.
Remplacement
L'efficacité de molécules en développement ainsi que les analyses histologiques que nous souhaitons réaliser par la suite, ne peuvent être étudiées que sur des organismes entiers pour tenir compte des interactions interorganes, cellulaires et moléculaires. Le rat et la souris sont des modèles de choix car les procédures sont bien connues et la physiologie cardiaque de ces animaux est comparable à celle de l'Homme.
Réduction
Une mise au point des modèles préalable aux études permettra une réduction du nombre d’animaux impliqués dans les études. C’est pour cette raison qu’une procédure dédiée à la mise au point des modèles d’efficacité en cardiologie et à l’acquisition des gestes techniques, a été incluse dans ce projet. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux surnuméraires (naïfs de toute expérimentation) ce qui rentre dans le cadre d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. La seconde procédure figurant dans ce projet sera réalisée sur un nombre limité d’animaux utilisés mais suffisants pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents en fonction de l’effet attendu de la molécule testée.
Raffinement
L’expérimentateur s’assurera que toute manipulation sera conforme à la réglementation en vigueur et entrainera un minimum de stress ou de douleur chez l’animal. Préalablement à toute expérimentation, des points limites (exemples : détresse respiratoire, perte de poids supérieure à 20% sur 24h, perte sanguine abondante, etc …) sont définis en accord avec la littérature scientifique et la réglementation en vigueur . La mise en place des points limites permettra un meilleur suivi des animaux lors de la réalisation des différentes procédures de ce projet mais également de maintenir leur bien-être tout au long de l’expérimentation ainsi que la mise en place d’une prise en charge précoce et adaptée de l’animal si cela est nécessaire. Dans le cas où le bien-être de l’animal serait dégradé après 48h de traitement, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du directeur d’étude et /ou du vétérinaire désigné. Avant tout acte de chirurgie, l’anesthésie (type, dose, fréquence) ainsi que l’analgésie (type, dose, fréquence) nécessaires au suivi pré opératoire de l’animal devront être validées par le vétérinaire désigné. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur couverture chauffante avec rétrocontrôle de la température afin qu’ils soient maintenus à 37°C. L’ajout de système de réchauffement complémentaires pourra être utilisé en cas de baisse de température de l’animal (exemple : bouillotes, etc..). Afin de limiter le stress dû à l’hébergement en cage individuelle (par exemple : individualisation des animaux pour mesure de la consommation hydrique et/ou alimentaire) et de maximiser le bien-être de l’animal, de l’enrichissement spécifique à chaque espèce sera utilisée (exemple : igloo, bûchette, coton, etc…), de plus, ils garderont un contact visuel et olfactif. Lors de traitements en intrapéritonéal ou en sous-cutanée, une rotation des sites d’injection sera réalisée afin de minimiser l’impact de l’injection sur le bien-être des animaux. Pour les animaux ayant des caractéristiques de la maladie, une attention particulière sera portée sur leur suivi. Des points limites spécifiques seront définis pour ces animaux en fonction des données scientifiques connues sur cette lignée et des recommandations de l'éleveur. Dans le cas de signes cliniques et/ou notables, une décision sera prise selon l'arbre décisonnel.
Choix des espèces
Le rat sera utilisé car il s’agit d’une espèce bien décrite dans la littérature scientifique et qu’il est plus aisé de pratiquer la chirurgie sur cette taille de rongeur. La souris sera utilisée car il s’agit d’un animal plus petit permettant à des clients ayant peu de composé disponible de pouvoir tout de même tester l’efficacité de leur molécule. C'est pour cette raison que nous souhaitons inclure ces deux espèces dans notre projet. Ce type de modèle de maladie est réalisé chez des animaux adultes car il s’agit de reproduire des pathologies de l’Homme adulte.
Les troubles anxio-dépressifs liés à une douleur chronique induite par constriction du nerf sciatique : Evaluation comportementale et traitement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 souris, mâles et femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une ligature du nerf sciatique leur inflige une douleur neuropathique chronique, suivie de dix-sept évaluations de la douleur et de six tests comportementaux sur sept à neuf semaines, pour comparer selon le sexe les troubles anxio-dépressifs liés à la douleur. Le porteur indique que le développement de ces troubles est attendu et "ne peut être évité car c'est l'objet de l'étude". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale de l'animal vigile.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur. En effet, environ 50% des patients présentent cette co-morbidité. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de cette co-morbidité restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données d’imagerie neuroanatomique et fonctionnelle chez l’homme, ainsi que des résultats obtenus par des approches lésionnelle et d’imagerie, chez la souris montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des régions céréblales. De plus, de nombreuses données de la littérature ont démontré d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. La prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population générale ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements comportementaux éventuels entre mâles et femelles dans un modèle de constriction du nerf sciatique par ligatures chez la souris.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de comparer chez la souris mâle et femelle les comportements de troubles anxio-dépressifs liés à la douleur chronique. Cette comparaison sera aussi menée vis-à-vis des effets des traitements contre la douleur et contre l’état anxio-dépréssif selon le sexe. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de définir le développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes dans un modèle de ligature du nerf sciatique. Cette avancée pourrait permettre d’affiner les interventions thérapeutiques selon le sexe.
Procédures
L'ensemble des animaux subiront une chirurgie (durée 10 min maximum) sous anesthésie. A la suite de quoi les animaux auront une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Pour les animaux de l’expérience 1, nous évaluerons à 17 reprises de la douleur neuropathique (durée du test est de 30min avec 5min d’habituation avant) et 6 tests sur comportement (durée de 5 à 25 min chacun selon le test) une période de 9 semaines de alors que ceux des expériences 2 et 3 seront soumis à 13 évaluations de la douleur neuropathique (durée du test est de 30min avec 5min d’habituation avant) et 6 tests de comportement (durée de 5 à 25 min chacun selon le test) sur une période de 7 semaines.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. De plus comme dans toute chirurgie, il peut apparaitre des signes de douleur, d’inflammation, d’infection ou une perte de poids. Le développement de troubles anxio-dépressifs est attendu et ne peut être évité car c'est l'objet de l'étude.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 souris mâles et 10 souris femelles. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental. Des analyses statistiques finales seront réalisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé et le poids corporel des animaux sera mesuré au minimum lors de chaque expérimentation (test de comportement ou traitement). Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines).
Rôle des cellules natural killer au cours des complications hépatiques associées à l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Nourries d'un régime gras, elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, mises à jeun et prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle des cellules NK dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer gêne, rougeur, infection ou nécrose au point d'injection, et que peuvent survenir obésité, hyperglycémie ou diabète. Il conclut qu'"aucune autre espèce ne peut être utilisée" et que les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est de comprendre comment une famille de cellules immunitaires participent au développement des maladies du foie associées à l’obésité. Afin de répondre à notre problématique, nous utiliserons des animaux qui n’expriment pas une molécule indispensable pour le développement de ces cellules. Nous espérons ainsi démontrer le rôle exact de ces cellules immunitaires dans ces maladies afin de proposer de nouvelles thérapies les ciblant. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Le nombre total d'animaux utilisé dans ce projet sera de 540. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage, d’hébergement et de soins (environnement enrichi, suivis réguliers par les expérimentateurs) afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’une part de valider in vivo le rôle exact des cellules tueuses naturelles (NK) dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. Nous espérons pouvoir proposer de cibler les fonctions des cellules NK comme nouvelle stratégie thérapeutique pour ces maladies qui actuellement ne disposent pas de traitements pharmacologiques.
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront soumis à un prélèvement sanguin en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine pendant 6 semaines.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal, la contention, les mises à jeun de 4h et 6h, les injections intrapéritonéales et les gavages par voie orale, les prélèvements sanguins à la base de la queue, la survenue d'une obésité, d'une hyperglycémie ou d'un diabète. Les injections pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...). Des animaux agressifs pourront été également être isolés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires (effets des lipides et des dérivés bactériens comme le lipopolysaccharide sur la physiologie des cellules). Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris sauvages contrôles et 50% de souris pour lesquelles Eomes est invalidé dans les cellules NK ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expériences.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa fécondité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée Nous utiliserons des souris à partir de la 7ème semaine d'âge c'est à dire à l'âge adulte avec un poids stabilisé.
Evaluation de l’efficacité de molécules contre les modifications physiologiques et comportementales induites par un stress chronique chez le rat adulte (acronyme : STCH-2023).
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trente-six d'entre eux subissent un stress chronique de 2 h 30 par jour pendant 21 jours, un traitement oral quotidien et cinq prises de sang sur animal vigile, pour tester des molécules contre le stress et l'anxiété. Le porteur héberge les rats stressés seuls, sans enrichissement, et précise qu'aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne sera administré, tout en affirmant qu'aucune procédure n'engendrera de douleur. Il affirme que le remplacement n'est "pas envisageable" et que la complexité des mécanismes ne peut être appréhendée qu'in vivo.
Objectifs
Les troubles anxieux et les troubles liés au stress sont particulièrement fréquents dans les pays industrialisés. Il est estimé que 13 à 22% des habitants de ces pays développeront une pathologie anxieuse au cours de leur vie. Par ailleurs, le stress est impliqué dans l’apparition de pathologies d’ordre psychiatrique telle que la dépression, avec, au-delà de l’aspect individuel, un coût important pour la société. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la dépression concerne 300 millions de personnes dans le monde et 800 000 personnes meurent en se suicidant chaque année. Les traitements disponibles concernant l’anxiété et le stress présentent de nombreuses limites dues aux effets secondaires importants et/ou à l’efficacité limitée. Dans le cas de stress chronique, différents traitements médicamenteux peuvent être prescrits mais l’indication de ces traitements n’est pas toujours prioritairement l’effet anti-stress et ils ne sont pas dénués d’effets secondaires. Dans ce contexte, la recherche de nouveaux produits plus efficaces représente donc un enjeu sociétal et économique majeur.
Bénéfices attendus
L’enjeu de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans la lutte contre le stress et l’anxiété qui pourront être développés pour une utilisation chez l’Homme.
Procédures
Dans cette étude, les 48 animaux seront tout d’abord soumis à un test de préférence au sucre pendant 3 jours (1h de test par jour), après mise à jeun pendant 1 heure chaque jour, et placement en cage individuelle afin d’avoir une mesure de la consommation hydrique pour chaque individu. Ensuite, 36 des 48 animaux seront soumis à un stress chronique pendant 21 jours (2,5 heures par jour). Un traitement sera administré sur les 48 animaux vigiles par voie orale pendant 23 jours (environ 1 minute par jour). Un prélèvement sanguin effectué en 1 minute environ sera réalisé sur ces 48 animaux à l’état vigileà 5 reprises au cours de l’étude. Des tests comportementaux seront réalisés à l’issue de l’étude sur 2 jours, avec une durée maximale de ces tests de 5 à 20 minutes par jour pour évaluer les effets des traitements sur le stress induit. Enfin, à la fin du projet, un ensemble d’organes sera prélevé pour analyses. Aucune procédure n’engendrera de douleur.
Impact sur les animaux
L’hébergement en cage individuelle des animaux est nécessaire durant la totalité du projet pour les groupes soumis au stress chronique. Le stress chronique induit tout au long de ces 21 jours peut entrainer une aggressivité, il est donc préférable de limiter les interactions avec leurs congénères. Les traitements par voie orale s’effectuent sur animal vigile afin d’éviter les fausses routes et aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire ne sera utilisée. Pour le test de préférence au sucre, une mise à jeun des animaux est nécessaire 1h avant les mesures afin de garantir le bon déroulé du test. Les séries de prélèvements sanguins comme les tests comportementaux s’effectuent sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire pour ne pas perturber l’activité des animaux et les dosages qui seront réalisés.
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort 24 jours après le début de l’induction du stress chronique, c’est-à-dire à la fin de l'unique procédure expérimentale.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire ou d’évaluer les effets antistress d’un traitement. Le modèle rat est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. La complexité des mécanismes mis en jeux ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont, et notre expérience du modèle, permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non des traitements testés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes. Les rats du groupe Contrôle non stressé seront 3 par cage avec des feuilles de papier kraft et des briques en bois en guise d’enrichissement. Les rats des autres groupes soumis au stress chronique seront hébergés en cage individuelle sans enrichissement pour assurer le bon déroulé de l’étude. Les animaux auront un accès non restreint à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée du projet sauf lors des 3 sessions de test de préférence au sucre où une mise à jeun d’une heure est nécessaire. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5 jours sur 7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Lors des séances d’induction du stress, à la sortie du dispositif, une attention particulière sera apportée à l’animal pour vérifier l’absence de blessure. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant les tests comportementaux. Un expérimentateur surveillera en permanence l’écran vidéo situé dans le couloir jouxtant la salle de test afin d’intervenir en cas de nécessité. Les traitements oraux et les prélèvements sanguins seront effectués par du personnel ayant les compétences requises et une observation régulière des animaux sera effectuée après réalisation de chaque traitement oral ou prélèvements, week-end et jours fériés inclus. Des points limites adaptés sont fixés, si nous constatons le dépassement d’un de ces points limites, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
Le modèle rat est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. De plus, ce modèle est déjà très utilisé dans les tests visant à étudier les comportements de type anxieux et dépressif. Dans cette étude et afin d’être le plus représentatif possible, nous utiliserons des rats des deux sexes. Les animaux utilisés seront des rats mâles et femelles Sprague Dawley de 30 jours à l’arrivée au laboratoire (125-150 g). Nous effectuerons notre modèle sur de jeunes rats afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles dans la littérature scientifique sur les modèles de stress chronique.
Préparation d’anticorps porcins dirigés contre une protéine thérapeutique pour le traitement de l’insuffisance rénale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
3 cochettes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections répétées avec un adjuvant pouvant provoquer des inflammations, voire des abcès, puis subissent en fin de protocole une exsanguination sous anesthésie avant la mise à mort, pour produire un antisérum contre une protéine thérapeutique. Cet antisérum servira de contrôle positif à un test de dosage d'anticorps. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale "satisfaisante" pour produire des anticorps polyclonaux.
Objectifs
La glomérulonéphrite à progression rapide (glomérulonéphrite à croissants) est une maladie rénale rare dans laquelle les unités de filtration des reins, les glomérules, sont irrémédiablement détruites. La production de médicaments visant à empêcher la destruction des glomérules est donc une étape importante dans le traitement de ces pathologies. Grâce à un modèle animal (cochon) mimant cette maladie, une équipe a développé une molécule thérapeutique visant à protéger les glomérules et à prévenir l’insuffisance rénale. Cette étude a montré que cette molécule est capable de prévenir la survenue des lésions rénales liées à cette maladie. Afin de poursuivre le développement de la protéine thérapeutique, nous devons déterminer si les cochons traités ont développé ou non des anticorps, ce qui risquerait dans la durée de réduire l’efficacité du traitement. L’objectif du présent projet est de produire par hyper-immunisation chez le cochon un antisérum contre la protéine thérapeutique. Cet antisérum permettra la mise au point d’un test de dosage d’anticorps contre cette protéine. Ce test servira à tester une collection (déjà constituée) de prélèvements sanguins de cochons traités ou non préalablement avec la molécule à visée thérapeutique afin de vérifier l’absence d’anticorps anti-molécule thérapeutique chez ces animaux.
Bénéfices attendus
La glomérulonéphrite à croissants est une maladie humaine rénale rare, extrêmement grave, qui entraine la destruction des unités de filtration du rein, les glomérules. Cette maladie, d’origine auto-immune, est traitée par des immunosuppresseurs forts, entrainant des effets secondaires sérieux. 10 à 20 % des patients meurent au bout d’un an, en partie à cause du traitement, tandis que jusqu’à 90 % des patients survivants à 5 ans développent une insuffisance rénale terminale. La qualité de vie des patients est extrêmement dégradée. Grâce aux anticorps produits chez les cochettes, un dosage sera développé et permettra d’analyser des échantillons sanguins de cochons traités par ailleurs avec la molécule thérapeutique. Nous attendons du présent projet de pouvoir démontrer que les animaux traités par cette molécule n’ont pas développé d’anticorps contre cette protéine. A terme, le développement pharmaceutique de cette protéine doit pouvoir améliorer considérablement le pronostic des glomérulonéphrites à croissants et la qualité de vie des patients.
Procédures
Les cochettes subiront 6 prises de sang, 6 sessions d'injections indradermiques au niveau de l'aine et 1 injection intraveineuse, toutes sous sédation (15 minutes d’anesthésie par intervention/animal incluant la prise de sang et les injections multiples). Si le protocole le nécessite (quantité d'anticorps dans le sang insuffisante), 2 prises de sang et 1 injection intraveineuse seront ajoutées. En fin de protocole, les cochettes subiront une anesthésie profonde, une pose de cathéter jugulaire par voie chirurgicale, et une exsanguination via ce cathéter avant euthanasie par injection de pentobarbitale.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont les anesthésies successives, le stress lié à la mise à jeun et la manipulation. L’injection de l’antigène à la veine auriculaire ainsi que les médicaments en intraveineuse peuvent entrainer un hématome. Les principaux effets indésirables que nous pouvons envisager sont liés à l’adjuvant utilisé dans la solution injectée lors de l’immunisation. En effet, cet adjuvant peut provoquer des réactions inflammatoires et/ou allergiques, soit locales telles que des lésions au niveau des sites d’injection, voire des abcès, soit au niveau d’autres organes.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés car l'objectif est de collecter leur sang, et ils ne peuvent pas retourner dans leur élevage d'origine pour des raisons sanitaires.
Remplacement
Le projet vise à produire des anticorps polyclonaux dirigés contre une molécule à visée thérapeutique. Les anticorps polyclonaux permettent ainsi d’augmenter la capacité de liaison à la molécule, utilisée ultérieurement pour la mise au point d’un dosage spécifique et favorise les chances de succès. Pour la production d’anticorps polyclonaux, il n’existe pas d’alternatives non animales satisfaisantes. La seule option possible serait d’utiliser un mélange d’anticorps monoclonaux préparés de façon synthétique (par la technique de phage display) mais cela nécessite la présence des anticorps dans les banques disponibles, or la protéine utilisée dans le projet est une protéine modifiée, non native. De plus, cela impliquerait de produire des quantités importantes d’anticorps en système cellulaire in vitro. L’ensemble représenterait un processus fortement risqué, couteux, de longue durée, peu compatible avec l’échéancier du projet.
Réduction
Trois cochettes pourront être utilisées. Nous envisageons d’obtenir entre 2 et 3 litres de sérum contenant les anticorps spécifiques d’intérêt. Les cochettes recevront toutes le même traitement. En raison de la variabilité potentielle de la réponse immunitaire individuelle, le nombre d’animaux utilisés est un minimum afin d’être sûr de pouvoir récupérer la quantité de sérum nécessaire à la seconde partie de l’expérience.
Raffinement
Les animaux seront logés dans une salle climatisée, en groupe, et l’enrichissement du milieu sera réalisé à l’aide d’une quantité de paille suffisante pour qu’ils puissent jouer avec. Des jouets pourront être fournis. Ils seront surveillés quotidiennement avec une attention particulière pour leur état général de santé, leur niveau de stress, leur activité et leur consommation d’eau et de nourriture. Dans ce protocole, la douleur peut survenir en cours d’immunisation. Notamment, l’adjuvant utilisé lors des injections intradermiques pour accroître la réponse immunitaire peut provoquer des réactions inflammatoires chroniques importantes, voire des allergies. Dans le cas des rappels intraveineux, ce type de réaction allergique sera prévenu par une injection préalable d'antihistaminique. Les symptômes auxquels on peut s’attendre sont dépression, abattement, anorexie, prostration. Si des signes de réaction locale sont observés, les injections suivantes devront être effectuées à distance des injections précédentes. En fonction de l’état de l’animal, l’immunisation sera suspendue le temps nécessaire. Si les animaux venaient à exprimer de l'inconfort, voire de la douleur, nous leur administrerons un analgésique par voie orale. Si la douleur ou la détresse restent impossibles à soulager, les animaux seront euthanasiés. En cas d’infection, les mêmes symptômes associés à une forte fièvre sont rencontrés. Dans ce cas, un antibiotique sera administré plusieurs jours jusqu’à rémission complète. Cependant, nous n’avons jamais observé de tels symptômes lors d’immunisations précédentes réalisées selon le même protocole chez le cochon et la brebis. Pour éviter toute douleur et stress liés aux prises de sang, injections intradermiques et intraveineuses, les animaux seront anesthésiés pour chaque manipulation.
Choix des espèces
Nous avons besoin de produire un antisérum anti-molécule thérapeutique chez le cochon car l’étude de l’efficacité thérapeutique de cette molécule a été réalisée chez ce même animal. L’antiserum collecté servira de contrôle positif (présence d’anticorps anti-molécule cible) et le résultat obtenu lors du dosage ELISA sera comparé à celui obtenu avec des serums de cochons ayant suivi une thérapie avec la molécule cible (serums disponibles chez nos collaborateurs). Cette comparaison a pour but de s’assurer de l’absence d’anticorps anti-molécule cible chez les cochons traités. L’homologie d’espèce entre les animaux ayant permis la production d’anticorps et les animaux ayant suivi la thérapie permet d’utiliser les mêmes réactifs dans le dosage, garantissant ainsi la spécificité des résultats obtenus. Nous utiliserons des cochettes en phase de croissance, soit des jeunes femelles de 60-70kg environ (au début de l’expérimentation). Ce stade de développement assure une bonne aptitude à la réponse immunitaire ainsi qu’une taille adaptée pour pouvoir recueillir un volume de sang, et donc d’anticorps, important et en adéquation avec leur utilisation ultérieure.