Procédures sévères
Etude de l’inflammation et de la régulation par les glucocorticoïdes et leurs récepteurs dans les maladies neurodégénératives
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
3 765 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 125 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des chocs brefs répétés, un stress de défaite sociale où une souris agresseur peut les blesser, un isolement, des tests de mémoire de la peur et des chirurgies, pour étudier le rôle des glucocorticoïdes et de l'inflammation dans les maladies de Parkinson et d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier la mémoire et le vieillissement pathologique sans le modèle murin. Les pistes thérapeutiques annoncées restent lointaines, l'objectif immédiat étant de comprendre des mécanismes.
Objectifs
Notre intérêt de recherche se focalise sur les actions des glucocorticoïdes et leur récepteur, le récepteur aux glucocorticoïdes, dans l’inflammation chronique qui caractérise la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. De plus nous étudions le rôle des médiateurs de l’inflammation dans les processus neurodégénératifs qui induisent des anomalies comportementales et cognitives. Les objectifs de ce projet sont de comprendre : a) comment les glucocorticoïdes et leur récepteur GR, par leurs actions sur les cellules immunocompétentes (par exemple les cellules gliales dans le cerveau) et dans les neurones régulent la pathogenèse des maladies neurodégénératives b) les actions des récepteurs aux glucocorticoïdes dans le stress chronique pouvant déclencher des processus neurodégénératifs c) le rôle des molécules inflammatoires dans les anomalies comportementales et cognitives liées à ces maladies.
Bénéfices attendus
Les mécanismes par lesquels le stress, l’inflammation, les glucocorticoïdes et le récepteur aux glucocorticoïde modifient le comportement, l'humeur et la cognition chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson ne sont pas connus. De plus en plus d’études menées chez ces patients montrent un rôle important du stress environnemental ainsi que du système immunitaire. Nos travaux vont apporter une meilleure compréhension de ce sujet et approfondir nos connaissances sur la pathologie de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson. Nos travaux d’analyses moléculaire et cellulaire ainsi que de l’expression des gènes chez nos modèles murins identifieront des facteurs et des processus qui permettront de réaliser ensuite des études chez des patients de la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson.
Procédures
(1) Injections sur souris vigiles, durée=environ 1 minute/souris. Au maximum 2x par jour pendant 5 jours (2) Prélèvement de sang sur souris vigiles (10-20 microlitres) x4 (dans un intervalle de 3h), durée 1-2 minutes par prélèvement (3) Tests comportementaux sur souris vigiles pouvant entrainer une diminution de la prise de nourriture, durée 3 semaines (4) Hébergement en cage individuelle, durée10 jours (5) Certaines souris seront soumises à un choc : durée 2 secondes x3. (6) Procédure chirurgicale avec réveil: injections d’anesthésie et d’analgésie préopératoire, durée de la procédure : environ 30 minutes par souris ; traitements anti-inflammatoire/analgésique post-opératoire-durée 1-3 jours (7) Protocoles de stress (chronique ou aigu), durée 10-15 minutes à 3 h selon le stress. (8) Procédure chirurgicale et sans réveil –injections de l’analgésie suivi par l’anesthésie profonde - durée 20 minutes.
Impact sur les animaux
(1) L’incision dans la queue pour les prises de sang peut entrainer une douleur si elle ne cicatrise pas correctement. (2) Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer a) une perte du poids (5-10%) et/ou une diminution du toilettage et/ou une diminution de la locomotion. (3) Douleur possible durant la chirurgie sans réveil. (4) Risque d’hypothermie ou d’arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie, douleur et affaiblissement post-opératoire possible, risque d’infection ou inflammation autour des zones de suture après les procédures chirurgicales. (5) Effets possibles du protocole de stress: anxiété, dépression, diminution du toilettage et de la prise du poids, diminution des interactions avec les congénères. (6) Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. (7) Pendant les injections, les souris peuvent avoir « peur » ce qui se manifeste par des vocalisations, des émissions d’urine et une défécation. (8) Les souris sont limitées dans leurs mouvements pendant le stress de contention aigu. (9) Durant le stress de défaite sociale, la souris "agresseur" peut blesser la souris soumise à ce stress (10) L’étude de la mémoire à la peur peut entrainer une douleur.
Devenir
Les souris seront euthanasiées, les tissus prélevés pour les analyses biochimique et immunohistochimiques (analyse de la pathologie, de l'inflammation, changements dans chaque type de cellule) et pour les études moléculaires et génomiques.
Remplacement
Notre modèle de souris est le modèle le plus adéquat pour cette étude car les structures impliquées dans la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer chez l’Homme (régions de cerveau qui régulent des comportements moteurs, la mémoire, humeur et le cellules de système immunitaire) sont conservées chez la souris et présentent le même phénotype comportemental associé à des déficits moteurs ou un apprentissage. L'absence de méthodes alternatives quant à l'étude de la mémoire ou de l'apprentissage au cours du vieillissement pathologique nous oblige à utiliser les modèles murins mentionnés.
Réduction
Le nombre total d’animaux estimé est 3765. Nous analyserons nos résultats avec des tests statistiques appropriés pour avoir des valeurs significatives, afin d’obtenir des conclusions sur ces résultats. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental avec une analyse prédictive du nombre d’animaux en utilisant un outil statistique.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation et « handling » puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement l’euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire leur stress. Pour les procédures chirurgicales, les souris sont injectées avec un analgésique suivi par un mélange anesthésique. Les souris sont surveillées étroitement. Des points limites adaptés ont été définis pour toutes les procédures.
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. La souris possède un éventail génétique vaste, une reproductibilité fiable et rapide, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. Dans ce projet, l’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et le système immunitaire périphérique ainsi que le rôle du stress. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire ou subcellulaire. Nous utilisons des souris adultes dont le cerveau est totalement développé pour étudier le rôle du stress dans le contexte de maladies neurodégénératives qui se développent à l'âge adulte chez l'homme. Nous utilisons aussi des animaux au stade périnatal car un stress précoce dans la vie de l'individu a des répercussions une fois adulte, et en particulier, affecte sa réponse au stress. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements moléculaires causés par le stress sur des circuits neuronaux intacts. La nature expérimentale de notre recherche requiert donc l’utilisation de modèles animaux. Nos études sur le rôle du stress dans les maladies neurodégénératives seraient importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mais donnera de nouvelles pistes thérapeutiques.
Évaluation de la réponse aux traitements médicamenteux dans le cancer du foie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie abdominale qui injecte des cellules cancéreuses dans la rate pour provoquer des métastases du foie, puis une chimiothérapie ou un agent anti-vasculaire et jusqu'à quatre IRM sous anesthésie. Le porteur cherche des marqueurs d'imagerie prédictifs de la réponse aux traitements, la validation chez des patients étant renvoyée à plus tard. Il justifie l'effectif par un taux de prise tumorale d'environ 60%.
Objectifs
Le cancer colorectal est l`une des principales causes de mortalité liée au cancer dans le monde. La propagation métastatique représente le principal facteur de mauvais pronostic. Jusqu'à présent, aucun marqueur fiable n'est disponible pour prédire la réponse aux traitements chez les patients atteints de métastases hépatiques (dans le foie). Le traitement standard du cancer colorectal métastatique comprend généralement une chimiothérapie et un agent anti-vasculaire compromettant la survie des cellules cancéreuses. Dans le but de rendre la lésion hépatique opérable, la prise en charge clinique des patients repose essentiellement sur l'évaluation de la réponse des patients aux traitements. La survie globale après la chirurgie dépend de manière cruciale de la réponse à ces traitements. Il n'existe actuellement aucun critère ni marqueur satisfaisant pour prédire la réponse histologique à la chimiothérapie, bien que plusieurs pistes ont été explorées. Par ailleurs nous avons montré dans le contexte du cancer du sein que le mouvement mécanique des cellules permet de distinguer la réponse et la résistance aux thérapies, ainsi que l'impact des agents anti-vasculaires sur la mécanique des tissus. Le but de notre étude est d’identifier de nouveaux marqueurs biologiques en utilisant l'imagerie IRM qui est une technique d`imagerie non invasive pour évaluer l'effet de la thérapie sur le microenvironnement tumoral et le réseau vasculaire afin d'améliorer la survie des patients dans le contexte des métastases hépatiques du cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Identifier des nouveaux marqueurs biologiques pour évaluer l'effet du traitement sur le microenvironnement tumoral et le réseau vasculaire. Valider l'efficacité des ces marqueurs sur une cohorte de patients. Prédiction de la réponse aux traitements pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à : 1) Chirurgie : injection des cellules tumorales dans la rate aprés une incision de la paroi abdominale d'1cm, la plaie sera ensuite fermée à l'aide de plusieurs points de sutures. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et dure 30 minutes. 2) Les traitements anti-tumoraux seront injectés en intrapéritonéale au niveau de l'abdomen, un lot de souris recevra un traitement anti tumoral (une chimiothérapie) deux fois par semaine pendant 4 semaines. Un autre lot de souris recevra un autre traitement tumoral (un agent anti-vasculaire) qui sera injecté 5 jours (de jour 0 à jour 4). 3) Imagerie par résonance magnétique (IRM) :14 jours après l’injection des cellules tumorales, le nombre de séance d’IRM peut aller jusqu’à 4 séances au total, le délai minimal entre les séances d'IRM (Après la première IRM) est d’une semaine. La durée des IRM est de 1heure par souris (cette analyse sera réalisée sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
(1) Risque de douleurs post-opératoire et/ou (2) le développement des tumeurs (dans le foie ou dans d'autres organes) peut également engendrer des modifications des fonctions physiologiques.(3)Perte de poids suite à la chirurgie,(4)Les traitements médicamenteux ont été utilisés dans la littérature et aucun effet secondaire a été relevé, (5) irritation et/ou inflammation de la suture.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin du protocole, pour permettre le prélévement d'organes et l'analyses des tumeurs pour approfondir les connaissances.
Remplacement
Les connaissances issues de cette étude in vivo ne peuvent pas être obtenues actuellement par d'autres méthodes, compte-tenu de la complexité de ce cancer . Ce modèle permettrait d'étudier les métastases du foie dans leur environnement (développement de tumeur dans l’organe), notamment les cellules des vaisseaux sanguins qui jouent un rôle important dans le développement tumoral. Des études in vitro ont été réalisées en amont, qui complèteront ce volet d'expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation de 130 souris pour une durée maximale de 5 ans. Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis pour atteindre l’objectif fixé en prenant compte que le taux de prise tumorale peut varier (environ 60% de réussite).
Raffinement
Acclimatation de 10 jours pour les souris après leur arrivée à l'animalerie avant de débuter le protocole. Les animaux sont surveillés quotidiennement et ont accès à la nourriture et à l’eau. Ils sont hébergés dans un environnement enrichi permettant la formation de groupes sociaux. Lors de la procédure chirurgicale les souris seront endormies et allongée sur un lit chauffant. Le maintien de la température corporelle pendant la chirurgie sera effectué par une sonde rectale. A la fin de la procédure chirurgicale, le réveil des animaux sera surveillé de près. Après leur réveil les animaux seront réintégrés dans leur cage. Des croquettes humidifiées et de l'hydrogel seront mis en place pour favoriser le bien-être des animaux. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé. La chirurgie ainsi que les IRM seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées.Le suivi clinique sera effectué 3 fois par semaine. Un analgésique sera administré avant, pendant et après la chirurgie. L’utilisation de ce dernier sera renouvelée si besoin afin d’éviter toute souffrance à l’animal. La suture sera examinée quotidiennement pour les 5 à 7 jours après la chirurgie en notant la présence d’écoulement, rougeur, enflure, etc…, nous examinerons également la déhiscence de la plaie (ouverture des points sutures). Lors d’observation d’un ou plusieurs signes nous aviserons rapidement le personnel de soins de l’animalerie pour procéder à un traitement adéquat de la condition. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.). Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM.
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris adultes de 8 semaines. Ce modèle est le plus utilisé et validé par la littérature scientifique car la maladie se developpe mieux à l'âge adulte. Les cellules tumorales qui seront utilisées dans ce protocole sont des cellules murines, qui sont compatible avec l'espèce choisie.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
Quatre-vingt-dix minutes sous anesthésie gazeuse, la tête tenue par des barres d'oreille, pour une craniotomie et une injection de virus dans le cerveau : c'est l'une des deux voies comparées sur 297 souris d'une lignée transgénique pour la maladie d'Alzheimer, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'autre voie est une injection intraveineuse derrière l'œil, sous cinq minutes d'anesthésie, de virus modifiés codant pour une "protéine X" que le résumé ne nomme pas. Deux tests comportementaux, que le porteur décrit par ce qu'ils mesurent, alternance spontanée, apprentissage et mémoire, sans les nommer, précèdent un prélèvement de liquide céphalo-rachidien de 20 minutes sous anesthésie, puis la mise à mort de toutes les souris pour des analyses post mortem. Ces souris présentent, selon le porteur, des "signes cliniques dommageables", et leurs couples reproducteurs commerciaux sont eux aussi tués, à la fin de leur période de reproduction, sans aucun prélèvement.
Objectifs
A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les couples reproducteurs commerciaux seront utilisés. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d’un anti-douleur). Deux tests comportementaux permettent de mesurer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes sous anesthésie) et sanguin (1 minute) sera réalisé sous anesthésie après injection d’un anti-douleur.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (297) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’analgésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection sur les yeux de l’animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post-opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L’applicateur est formé au geste d’injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (entre 5 et 6 mois environ) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.
Etude des réponses immunitaires dans un modèle souris de sepsis : rôle d’un messager cellulaire et bénéfices d’une immunonutrition
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un sepsis leur est provoqué par injection de bactéries, avec un affaiblissement et une perte de poids pouvant atteindre le point limite de 20%, pour étudier une dysfonction immunitaire et tester un apport d'acides aminés. Le porteur décrit l'accès aux organes comme "indispensable", ce qui exclut de garder les souris en vie. Les débouchés thérapeutiques annoncés, une immunonutrition pour les patients, restent au conditionnel.
Objectifs
Le sepsis caractérise un état infectieux sévère entrainant des perturbations du système immunitaire, responsables d'une susceptibilité accrue aux infections secondaires à l'origine de la majorité des décès tardifs. Notre projet a pour objectif une meilleure compréhension du défaut des cellules du système immunitaire à produire des anticorps protecteurs lors d'une infection secondaire au sepsis. Nous souhaitons déterminer le rôle d'une molécule (un messager) libérée par les cellules immunitaires lors du sepsis dans le développement de cette dysfonction immunitaire. Nous souhaitons aussi démontrer qu'un apport de nutriments (acides aminés) lors du sepsis est capable de restaurer la capacité du système immunitaire à produire des anticorps protecteurs après un sepsis. Ce projet devrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes permettant de réguler cette dysfonction immunitaire acquise dans le sepsis et par conséquent d’envisager le développement de nouvelles thérapeutiques à base d'immunonutrition, ou ciblant le messager, pour une meilleure prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
Nos travaux permettront une meilleure compréhension des mécanismes qui contrôlent les réponses immunitaires dans le sepsis et plus généralement lors d'inflammation, en démontrant notamment les bénéfices d'un apport en acides aminés dans la production d'anticorps protecteurs, et en élucidant le rôle d'un messager produit lors du sepsis. Nos travaux permettraient ainsi d’envisager le développement de nouvelles thérapeutiques à base d'immunonutrion ou ciblant le messager pour mieux prendre en charge les patients et diminuer ainsi le risque de mortalité lié au sepsis.
Procédures
Pour l’induction du sepsis, les animaux vigiles recevront une seule injection d’une quantité définie de bactéries, geste réalisé en moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront une injection permettant leur réhydratation (geste réalisé en moins d'une minute) 1 fois par jour les premiers jours suivants l'induction du sepsis. L’apport de nutriment sera réalisé sur animal vigile par administration orale, ce geste est réalisé en moins d’une minute, 1 fois par jour, les 5 premiers jours après induction du sepsis. Pour déclencher une réponse immunitaire spécifique, les animaux vigiles recevront une seule injection d’une quantité définie de molécules immunogènes (geste réalisé en moins d'une minute). Pour le suivi des réponses immunitaires, des prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles (environ une minute) à raison d’un prélèvement tous les 5 jours maximum.
Impact sur les animaux
L‘induction d’un sepsis consiste à déclencher une infection péritonéale multi-bactériennes qui engendre un affaiblissement transitoire de l'animal avec une perte de poids transitoire, les 2 premiers jours, inferieure à 20% du poids d'origine. L'immunisation par injection d'agents immunogènes n'entraine aucune pathogénicité et pas de stress en dehors du stress bref et modéré lié à l’injection unique de l'agent réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Dans le cas où un inconfort est observé, la douleur sera soulagée. De plus si l’un des points limites que nous avons définis serait atteint, la souris serait mise à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
L'accès aux organes est indispensable pour évaluer le bénéfice de l'immunonutrition et étudier la mise en place des réponses immunitaires au niveau de la rate, par des techniques de cytométrie en flux et de marquages sur coupes de tissus. Il nous est donc impossible de garder en vie les animaux concernés par l’étude.
Remplacement
Dans ce projet, nous étudierons les réponses immunitaires au cours d'un sepsis et les réponses immunitaires secondaires à un sepsis. L’utilisation du modèle animal est justifiée car les conséquences physiopathologiques d’un sepsis ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, les différents acteurs du système immunitaire sont impactés par le sepsis et contribuent au dysfonctionnement des organes.
Réduction
Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce projet est la continuation de travaux précédents qui nous ont permis d'acquérir l'expertise des modèles utilisés : induction du sepsis, suivi des réponses immunitaires, caractérisation de l'impact d'une immunonutrition. Ces travaux nous ont permis de déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires pour avoir des résultats significatifs et notre expertise nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé dans cette nouvelle étude en utilisant une méthode plus reproductible pour induire le sepsis.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adéquates : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont maintenus maximum à 5 par cage et aucun animal ne sera isolé de ses congénères. Un suivi quotidien des animaux comprenant une évaluation du score de grimace, une mesure de leur poids et une évaluation de leur comportement, permettra de pouvoir contrôler correctement leur état de santé. Les souris recevront une réhydratation, une analgésie si le score de grimace moyen est compris entre 1 et 1.5 et une antibiothérapie en cas de perte de poids moyenne > 10% en 24h. En cas d’atteinte des points limites (perte de poids > 20% et score MGS supérieur à 1.5), les souris seront euthanasiées. Le modèle CS de sepsis sera utilisé dans ce projet, moins invasif et plus reproductible que le modèle CLP.
Choix des espèces
Le modèle animal murin est très utilisé en immunologie, les protocoles pour étudier le système immunitaire sont bien établis. Ce modèle animal permet d'invalider des gènes spécifiquement dans un type cellulaire. Cet aspect est important pour évaluer finement les mécanismes impliqués dans un processus biologique aussi complexe que la réponse immunitaire lors d'un sepsis. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, en effet le système immunitaire atteint sa maturité à l’âge adulte. Cela correspond aux âges utilisés dans les publications scientifiques.
Plasticité activité dépendante de la transmission synaptique inhibitrice dans le système nociceptif spinal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une douleur inflammatoire ou neuropathique leur est provoquée par injection ou chirurgie, sans analgésie possible selon le porteur car elle interférerait avec le modèle, pour une durée allant jusqu'à 24 heures ou deux semaines. Elles subissent jusqu'à vingt tests de mesure de la douleur avant le prélèvement de la moelle épinière et la mise à mort. Le projet relève de la recherche fondamentale sur les neurones inhibiteurs de la douleur, les cibles thérapeutiques restant à identifier.
Objectifs
La douleur résulte de la représentation mentale que notre cerveau produit à partir des informations provenant de certains nerfs sensoriels. Avant d'arriver au cerveau, ces informations passent par la moelle épinière. Dans la moelle épinière, des réseaux de neurones mettent en forme cette information sensorielle avant de la transmettre au cerveau où la douleur pourra être élaborée. Les réseaux de neurones de la moelle épinière qui mettent en forme cette information sont très plastiques: ils travaillent différemment selon ce qu'ils ont fait précédemment. Ainsi, une première stimulation aura un impact sur la douleur ressentie lors d'une seconde stimulation. Cette "plasticité" intervient également lors des douleurs inflammatoires ou neuropathiques: suite à l'inflammation ou à la neuropathie, ces réseaux changent leurs fonctionnement. C'est cela que nous étudions. En particulier, dans ces réseaux, il y a des neurones qui servent à freiner le passage des informations: les neurones inhibiteurs. Ce projet de recherche vise à comprendre comment les neurones inhibiteurs changent leurs propriétés de "frein" en conditions inflammatoires et neuropathiques.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de la plasticité de de l'inhibition dans la moelle épinière en situation neuropathique et inflammatoire. Ceci est important pour comprendre comment des douleurs peuvent devenir chroniques et pour identifier des cibles pour le développement de traitements.
Procédures
Un groupe d'animaux subira un test de mesure de la douleur d'une durée de 5 minutes chaque jour pendant 5 jours puis une chirurgie d'une durée de 15 minutes. Un autre groupe subira une injection sous anesthésie d'une durée de 1 minute, 5 tests de mesure de la douleur d'une durée de 5 minutes puis une chirurgie d'une durée de 15 minutes. Un dernier groupe subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes, 20 tests de mesure de la douleur puis une autre chirurgie d'une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Modèle inflammatoire : douleur sans possibilité d'analgésie d’une durée de 24 h. Modèle neuropathique : -douleur sans possibilité d'analgésie -comportements et stress associés à la douleur. Ces comportements associés à l'état douloureux sont notammant: augmentation ou diminution de la mobilité (comportement spontané), hyporéaction ou hyperréaction (comportement provoqué). Le tout d'une d’une durée de 2 semaines. -perte de poids - irritation et inflammation au niveau de l'intervention
Devenir
Chaque procédure débouche sur un préllèvement et la mise à mort de l’animal.
Remplacement
Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes spinaux responsables du développement des douleurs inflammatoires et du développement et du maintien des douleurs neuropathiques. Le réseau neuronal spinal est encore mal identifié et n’est pas modélisé à ce jour. Les connaissances actuelles ne permettent donc pas de réaliser des études par modélisation, sans avoir recours à l'expérimentation animale.
Réduction
a réduction est appliquée à la fois par une approche statistique appropriée et partage/mutualisation des tissus pour des expériences multiples. Réduction par approche statistique appropriée. Le nombre d’animaux par groupe a été établi en fonction de la dispersion des données mésurées lors des expériences précédemment publiées par l’équipe. Pour chaque protocole, nos expériences d’électrophysiologie nécessitent l’enregistrement de 40 neurones pour atteindre le seuil de significativité (analyses de la plasticité synaptique à court terme par régression non linéaire). Puisqu’environ 4 neurones sont enregistrés par animal, 10 animaux de chaque sexe sont nécessaires. Nos expériences d’électrophysiologie nécessitent donc 20 animaux par protocole. Réduction par partage/mutualisation des prélèvements. Autant que possible, les ganglions rachidiens prélevés en même temps que la moelle épinière seront utilisés pour réaliser en parallèle des expériences d’imagerie du calcium sur cultures primaires (partage des tissus). Par ailleurs, nous avons réalisé une étude bibliographique exhaustive assurant que les expériences proposées n'ont jamais été réalisées.
Raffinement
Le raffinement est assuré en offrant un hébergement approprié aux souris, permettant de respecter leur éthogramme : les animaux sont hébergés dans des cages collectives enrichies avec des barrots de bois, et du matériel de nidification (coton et frisure). Lors des procédures invasives de réalisation des modèles douloureux (injection de carragénine pour le modèle inflammatoire, opération pour le modèle neuropathique) et lors du prélèvement de moelle épinière, les animaux sont maintenus sous anesthésie profonde. Lors de l'induction et du développement des protocoles douloureux durant lesquels des analgésiques ne peuvent pas être utilisés car ils interfèrent avec la mise en place du modèle inflammatoire, des points limites sont établis afin de soustraire les animaux à une souffrance excessive. Par ailleurs, la durée des protocoles douloureux est réduite au strict nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.
Choix des espèces
Les souris sont largement utilisées en recherche sur le système nerveux responsable de la sensation de douleur. En effet, ce système est analogue chez l’homme et la souris car il est apparu chez l’ancêtre commun des rongeurs et des primates. Les souris représentent donc un bon modèle pour l’étude de ce système. De nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles, et pourrons dans le futur nous permettre de disséquer les mécanismes auxquels nous nous intéressons ; ce qui justifie l’utilisation du modèle murin. Les animaux sont utilisés entre 6 et 10 semaines , stade de développement où le système spinal est mâture.
Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur l’inflammation pulmonaire induite par le virus respiratoire syncytial humain, la poussière d’acariens, et leur combinaison chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 4 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus respiratoire syncytial et exposées à la poussière d'acariens pour reproduire une bronchiolite et un asthme, y compris des nouveau-nés de cinq à sept jours infectés éveillés, avec des pertes de poids pouvant dépasser 25% et une trachéotomie avant la mise à mort. Le porteur indique que la manipulation des nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère. Les nouvelles molécules testées ne visent une introduction en clinique qu'à terme, l'apport immédiat restant l'évaluation chez la souris.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de bronchiolite et d’asthme induits par le virus respiratoire syncytial, la poussière d’acariens, ou leur combinaison.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’infection au RSV, l’asthme allergique ou l’asthme exacerbé. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies.
Procédures
Pour reproduire la bronchiolite, des souris de 5-7 jours ou de plus de 6 semaines seront infectées une ou deux fois au virus respiratoire syncytial par voie intranasale, vigile pour les nouveau-nés (acte de 5min) ou sous anesthésie générale pour les animaux sevrés (
Impact sur les animaux
Dans le cas de l’infection au RSV, avec ou sans administration de poussières d’acariens, nous nous attendons à des pertes de poids importantes pouvant dépasser 25%, mais 25% de perte de poids (ou 20% maintenue sur 3 jours) constituera un point limite. Des difficultés respiratoires pourraient être observées et seront suivies grâce à une grille de scoring (voir procédures 1&3). Elles sont toutefois très rares. Les animaux pourraient présenter le poil hérissé de manière transitoire. Dans le cas des poussières d’acariens seules, nous nous attendons à des pertes de poids modérées . Dans ce modèle, nous n’attendons pas de difficultés respiratoires ou d’autre signe que la perte modérée de poids mais leur absence sera surveillée. Compte tenu des volumes administrés, et à l’analgésie et anesthésie si besoin mis en place, le stress et la douleur associés aux administrations et prélèvements seront légers. Dans le cas particulier de la pose d’une minipompe, la douleur associée à la chirurgie sera modérée au vu de l’analgésie mise en place. Le stress associé sera léger. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde (avec ajout de curares pour bloquer les mouvements respiratoires spontanés) et suivies d’une euthanasie sans réveil. Dans le cas d'utilisation de nouveau-nés, leur manipulation pourrait entrainer un rejet par la mère.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus des pathologies telle que décrites chez l’homme.
Réduction
Chez la souris, d’après la littérature et d’après les études déjà réalisées dans notre laboratoire et sur la base de tests de type ANOVA, un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (exemple : inflammation constatée par histologie). Ce nombre pourra monter jusqu’à 15 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (analyse de l’expression de cytokines…). Des animaux satellites devront être utilisés pour les mesures de paramètres mécaniques ventilatoires (sur animaux non infectés donc études sans RSV). La possibilité de se passer d’animaux satellites et de réaliser ces mesures sur les mêmes animaux que les autres analyses sera évaluée lors des premières études utilisant cette méthode.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une réhydratation sous-cutanée sera mise en place • Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Lactate, 0.5mL, une fois par jour • Entre 15 et 20% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, deux fois par jour. Un scoring des difficultés respiratoires sera effectué tous les jours. En pratique, toute gêne respiratoire très marquée constituera un point limite avec euthanasie immédiate. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les principaux points limites en plus de ceux liés au scoring concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction d’inflammation pulmonaire et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cours d’étude, plusieurs anesthésies seront pratiquées notamment en cas de prélèvements de sang ou d’injections de produits : • Les administrations IV, IM, IP, SC et ID de composés tests se feront si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Une administration de buprénorphine sera réalisée avant les administrations IM/ID. • L’implantation d’une mini pompe en sous-cutané pourra être nécessaire lors d’une délivrance continue du composé test. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous anesthésie générale Isoflurane et dans des conditions d’asepsie, avec une prise en charge analgésique 30 min avant l’anesthésie, puis jusqu’à 48 heures post chirurgie si besoin. Le suivi de la cicatrisation sera enregistré, et les sutures désinfectées régulièrement. Afin de minimiser les risques d’infection lors d’injections intradermiques, une tonte de la peau avec désinfection sera réalisée avant injection. Les injections intradermiques se feront sous un volume de 50 µL par site d’injection afin de limiter la douleur.
Choix des espèces
- L’infection RSV chez la souris est bien documentée dans la littérature. - L’inhalation de poussière d’acariens pour déclencher une réponse asthmatique allergique est aussi très bien caractérisée chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie pulmonaire et la dose toxique dans la même espèce. Pour les études RSV, des nouveau-nés de 5-7 jours pourront être utilisés, de même que des animaux sevrés (jeunes adultes ≥ 6 semaines). Des femelles gestantes seront commandées à 2 semaines de gestation, afin d’avoir une mise bas une semaine plus tard dans nos locaux. Les nouveau-nés seront utilisés pour réaliser une primo-infection à l’âge de 5-7 jours, suivie d’une seconde infection 5 semaines plus tard. Cette condition permet de récapituler tous les signes cliniques de la bronchiolite du jeune enfant. L’infection RSV unique ou double pourra aussi être réalisée sur des animaux sevrés (≥ 6 semaines) pour reproduire uniquement la composante inflammatoire de la maladie, sans production de mucus. Pour les études utilisant la poussière d’acariens, seuls des animaux adultes sevrés ≥ 6 semaines seront utilisés. Pour les études combinant infection RSV et poussière d’acariens, seuls des animaux adultes sevrés ≥ 6 semaines seront utilisés.
Ciblage thérapeutique de protéines intracellulaires dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
86 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une sclérose en plaques leur est induite, avec une paralysie progressive pouvant gagner la queue puis les membres postérieurs, des injections répétées dont une voie rétro-orbitale et une perfusion intracardiaque terminale, avant le prélèvement de la rate, des ganglions et de la moelle épinière. Le porteur reconnaît que ses essais in vitro réduisent déjà le développement des cellules immunitaires en cause, mais affirme que l'auto-immunité ne peut pas être étudiée sans un organisme vivant. Les retombées annoncées pour les patients restent au conditionnel, l'objectif immédiat étant de valider des cibles médicamenteuses chez la souris.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux central. Une dysfonction du système immunitaire y entraine des lésions qui provoquent des perturbations motrices et sensitives. La prise en charge thérapeutique des patients est à ce jour imparfaite. La maladie est médiée par une population de globules blancs spécifique, et il a été proposé que les protéines X et Y sont nécessaire au développement de ces cellules. L’objectif de ce projet est de tester le potentiel thérapeutique de candidats médicaments ciblant X et Y, dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris, pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes et les mécanismes de la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre non seulement de mieux comprendre les mécanismes contribuant au développement de la sclérose en plaques, mais aussi de mettre en évidence de nouveaux candidats médicaments pour le traitement de cette maladie.
Procédures
-2 injections par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse isofluorane (2*5 secondes/souris au cours d’une anesthésie de deux minutes au total environ) -2 injections par voie intra-veineuse rétro-orbitale sous anesthésie isofluorane (2*2 secondes/souris au cours d’une anesthésie de deux minutes au total environ) -5 injections par voie intra-péritonéale sur animaux vigiles (5*2 secondes/souris) -1 perfusion intra-cardiaque terminale sous anesthésie médicamenteuse (3 minutes/souris)
Impact sur les animaux
Les injections permettant l’induction de la maladie peuvent induire une douleur légère (traitée par analgésiques). Les symptômes de la maladie se manifestent par une paralysie progressive, commençant par la queue, puis les membres postérieurs et enfin les membres antérieurs. Dans notre animalerie, la sévérité se limite à la paralysie des membre postérieurs. Comme chez l’homme, la maladie peut être associée à des douleurs. Après avoir atteint le score maximum, les animaux entrent dans une phase de rémission (variable, de partielle à complète). Les scores cliniques et le poids sont évalués tous les deux jours et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Les rates, ganglions lymphatiques et la moelle épinière seront prélevées pour analyses histologiques et analyse du phénotype immunitaire.
Remplacement
Nos expériences in vitro ont permis de démontrer que le développement des cellules immuntaires responsables de la sclérose en plaques est fortement réduit en présence des inhibiteurs de X et Y. Néanmoins, à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la bio-informatique, l'étude de l’auto-immunité, le rôle du système immunitaire in situ et la validation des cibles médicamenteuses potentielles ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 3 à 10 souris par groupe.
Raffinement
Certaines procédures peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un antalgique (paracétamol). Les animaux auront accès à de la nourriture gélifiée placée dans le fond de chaque cage. Pour attester de la consommation d’eau, les biberons seront pesés tous les deux jours. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. La procédure 1 a pour but de déterminer la méthode de mise de mise à mort la moins douloureuse pour l'animal en obtenant les résultats attendus.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de sclérose en plaques, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle pathogénique des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire et reflète la maladie humaine qui se déclare généralement chez de jeunes adultes. L’âge sera homogène dans chaque procédure.
Impact des mutations du gène Orai1 sur le développement de l’hypertension pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une hypertension pulmonaire leur est provoquée par une substance toxique ou par trois semaines d'hypoxie, avec échographies, prélèvements de sang et un cathétérisme cardiaque droit et gauche, avant la mise à mort pour analyse du cœur et des poumons. Le porteur décrit des atteintes pulmonaires aiguës, essoufflement et fatigue, comme effets attendus. L'étude cherche à savoir si le canal calcique Orai1 constitue une "cible thérapeutique", perspective encore à établir.
Objectifs
Nous souhaitons explorer le rôle du canal calcique Orai1 dans les mécanismes responsables du remodelage vasculaire pulmonaire au cours de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) en utilisant des rats déficients pour Orai1. Nous étudierons si l’absence d’Orai1 peut réduire le développement de l’HTAP afin de déterminer si il s’agit d’une potentielle cible thérapeutique.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de comprendre l'implication du canal calcique Orai1 dans le développement de l’hypertension artérielle pulmonaire, et permettra de déterminer si ce canal Orai1 peut être envisagé comme une nouvelle cible thérapeutique dans le développement de cette pathologie. Au vu de l'absence de thérapeutique curative pour lutter contre le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.
Procédures
60 animaux seront exposés à la monocrotaline à J0 sous anesthésie avec des aiguilles Stériles de 25G. 60 animaux seront en hypoxie (O2 à)10%) durant 3 semaines. Tous les animaux auront une echographie sous anesthésie à J7, J14 et J21 (20 min par animal). Les prélèvements sanguins à la veine caudale sous anesthésie seront réalisés à J21 au moment des échocardiographies (5 min par animal). A J21 tous les animaux subiront un cathétérisme cardiaque droit et gauche sous anesthésie (30 min par animal).
Impact sur les animaux
Développement d'une hypertension artérielle pulmonaire dont les effets secondaires importants sont des atteintes pulmonaires aigües (essouflement à l'effort, fatigue).
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.
Remplacement
L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre le rôle du canal calcique Orai1 dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'hypertension artérielle pulmonaire qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque, et les tissus prélevés sont partagés afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés. Plusieurs approches expérimentales seront utilisées par différents expérimentateurs sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le test statistique adéquat permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. De l'enrichissement (rouleau, coton) sera ajouté dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celles de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant des rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Jeune adulte (6 à 8 semaines, 100-200g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire est plus rapide
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments de thérapie génique sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies chez les rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 460
3 880 rongeurs, 3 420 souris et 460 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 348 en gravité sévère. Ils subissent des chirurgies du nerf sciatique, une induction de neuropathie et, pour certains, un diabète db/db provoquant obésité morbide et hyperglycémie, avec un risque d'automutilation après section nerveuse. Le projet sert aussi à la formation de personnels, au-delà de la seule recherche, et tous les animaux sont tués pour prélever leurs nerfs. Le porteur annonce des essais chez l'humain entre 2024 et 2026 et une mise sur le marché entre 2026 et 2029, retombées lointaines face à des atteintes immédiates.
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé dans les pattes arrière permettant à la fois de les faire bouger et de ressentir des sensations perçues au niveau de ses pattes (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une membrane autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire), comme les maladies de Charcot-Marie-Tooth (CMT) ou l’hypersensibilité héréditaire à la pression ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie traumatique (causée par une blessure). Il n’existe actuellement aucun traitement. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif du projet est de valider notre approche thérapeutique, basée sur une thérapie génique qui utilise des vecteurs viraux, pour introduire dans les cellules des nerfs des patients, des candidats médicaments au potentiel anti-démyélinisant pendant plusieurs années lors desquelles les troubles moteurs existants et la progression de la maladie seront diminués. Ces vecteurs sont inoffensifs et ne partagent pas leur matériel génétique avec celui des patients. Afin de savoir si nos traitements seront efficaces aux stades précoces et tardifs de la maladie, nous administrerons les traitements soit en amont, soit après l’apparition des premiers symptômes dans des modèles de rongeurs de ces maladies. D’autre part, nous analyserons les nerfs prélevés sur les animaux à la fin de chaque procédure afin d’évaluer l’effet des candidats médicaments sur l’état de myélinisation des nerfs malades.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme Ce projet doit nous permettre de valider notre stratégie thérapeutique pour réaliser par la suite des essais cliniques et créer une banque de tissus pour des analyses ultérieures. Les résultats seront publiés. Avantages à long terme Cette approche thérapeutique permettrait d’administrer une fois tous les 10 ans, un traitement non toxique et stable aux patients. Il n’existe pas encore de traitement pour ces maladies et nous cherchons à en développer un qui diminuerait les symptômes existants et empêcherait la maladie d’évoluer. Nous prévoyons les premiers essais chez l’Homme entre 2024 et 2026 et l’approbation pour la mise sur le marché entre 2026 et 2029.
Procédures
Nuisances - Stress : hébergement individuel des femelles gestantes jusqu’à la mise bas (une semaine) car les cages jetables sont plus petites que les cages standards lavables. - Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. - Douleurs post-opératoires (4 jours) - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (6 à 10 semaines) - Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) - Nuisance associée au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive). -Deux types de chirurgies oLa première chirurgie sera réalisée une seule fois par animal sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez la majorité des animaux car elle consistera à administrer un candidat médicament directement dans les nerfs sciatiques. Elle durera 30 min, la finesse des aiguilles de verre permet de limiter les dommages du nerf. Après injection au niveau du nerf, la peau sera suturée. Aucun autre organe que la peau ne sera incisée. oLa deuxième chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. -L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. -Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum.
Impact sur les animaux
Nuisances : - Stress : hébergement individuel des femelles gestantes jusqu’à la mise bas (une semaine) car les cages jetables sont plus petites que les cages standards lavables. - Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. - Douleurs post-opératoires (4 jours), biopsie (oreilles) - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (6 à 10 semaines). -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour). Effets indésirables : -Effets indésirables du diabète, souris db/db : obésité morbide, une hyperglycémie, une myocardie et un retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive). -Automutilation (nerf coupé lors d’une chirurgie) d’une durée maximale de quelques heures car nous euthanasierons l’animal si nous en faisons le constat. Les données historiques montrent que 1,5% des animaux pourraient être concernés. Les différents modèles animaux présenteront une faiblesse musculaire d’intensité légère à modérée au niveau des pattes arrière qui ne se voit pas par simple observation de l’animal et ne sera mise en évidence que dans nos tests comportementaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous prélèverons leurs nerfs pour étudier l’effet du traitement sur leur pathologie.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Il existe des méthodes pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénération, la régénération du nerf périphérique ne sont reproduits que partiellement in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
En nous basant sur la littérature et nos données internes, nous avons réalisé des tests statistiques afin de déterminer le nombre d'animaux pour chaque groupe expérimental et limiter ainsi le nombre d’animaux aux stricts besoins des procédures en place. Le test statistique utilisé pour l’analyse des résultats sera une one-way ANOVA suivie d’un test-post-hoc de comparaison multiple Dunnett. Les deux sexes seront utilisés dans tous les modèles rongeurs de ce projet car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation à la contention (gentle handling) sera effectuée tous les jours durant une minute par les expérimentateurs avant de débuter les tests comportementaux en vue de diminuer le stress.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet et dans lesquels nos produits, construits pour reconnaitre des cibles à la fois humaines et de souris, seront actifs. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez le rongeur justifiant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Notre objectif est de tester l’efficacité des traitements au début de l’apparition des symptômes, pour stopper la démyélinisation pathologique (stade précoce), ou une fois ceux-ci bien installés (stade tardif) afin d’essayer de stimuler la régénération. Rat/souris : juvéniles et adultes Nouveau-nés : J1 à J4 pour les souris, J6 à J7 pour les rats Femelles gestantes pour fournir les nouveau-nés : elles arrivent pendant le dernier tiers de gestation et sont gardées jusqu’au sevrage de leur portée
Impact de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) sur la réponse immunitaire lors de l’infection aigüe et chronique par Toxoplasma gondii.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
874 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 330 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées une fois par le parasite Toxoplasma gondii, puis tuées à un moment donné pour prélever le foie, la rate et le cerveau. Le porteur indique que 15 à 20 % des souris peuvent développer une forme aiguë avec tremblements, poil hérissé et abdomen distendu, et prévoit une euthanasie dès les premiers signes. Il décrit la souris comme un "modèle incontournable", hôte naturel du parasite, qu'il n'a pas été possible de remplacer par des tests in vitro.
Objectifs
Toxoplasma gondii est un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes impliqués dans la virulence des parasites apicomplexes, qui incluent Plasmodium, agent de la Malaria. Nos recherches sur les mécanismes assurant la dissémination et la survie du parasite au sein de son hôte pourront servir à long terme à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les parasites de ce phylum. De plus, la toxoplasmose chronique est responsable d’encéphalites aigües lors de la réactivation des formes kystiques latentes présentes dans le cerveau des individus infectés souffrant d'immunodépression. Ainsi, l’étude des mécanismes régulant les interactions entre le parasite et le système immunitaire de l’hôte permettra de lutter contre l’établissement de la toxoplasmose cérébrale latente pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement. Préalablement aux expériences sur l'animal, des expériences menées in vitro ont permis de démontrer que l’infection par T. gondii stimule l’induction de la réponse UPR dans des cellules dendritiques. Par la suite, dans les souris, nous avons pu démontrer l’activation de la voie IRE1 de l’UPR dans les cellules dendritiques conventionnelles de type 1 (cDC1) lors de l’infection et que cette activation est essentielle pour monter une immunité protectrice contrôlant la dissémination parasitaire. Cependant, il reste à identifier par quels mécanismes la voie IRE1 stimule les fonctions des cDC1. En particulier, nous nous intéressons à la régulation par la voie IRE1 de l’activité de présentation antigénique sur les molécules CMH-I des cDC1, un processus nécessaire à l'activation des lymphocytes T spécifiques, amenant une protection à long terme contre une ré-infection, ainsi que le contrôle de la toxoplasmose chronique cérébrale. D'autre part, l'évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre cette infection, pour laquelle aucun vaccin n'est disponible chez l'Homme. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro.
Bénéfices attendus
Des études ont montré que l'induction de la voie IRE1 dans les cellules dendritiques est essentielle à la mise en place d'une réponse immunitaire protectrice contre certaines infections bactériennes et parasitaires par l'induction d'une réponse efficcace des Lymphocytes T (LT). Découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents permettra de proposer des thérapies ciblées visant à booster l'activation des LT spécifiques et bloquer l'installation de la toxplasmose latente cérébrale, pour laquelle il n'existe aucun traitements. Nos découvertes pourront également s'appliquer à d'autres agents infectieux comme Mycobactérium (agent de la tuberculose) et des virus respiratoires, qui ont été démontrés comme activant la voie IRE1 dans les cellules dendritiques lors d'une infection. D'autre part, l'évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre la toxoplasmose.
Procédures
L’infection des souris est réalisée une seule fois en début d’expérience par injection intrapéritonéale d’une faible dose de parasites. Les prélèvements sont effectués post-mortem à un temps donné de l’infection, représentant la fin du protocole expérimental. Le foie, la rate, le cerveau sont prélevés ainsi que 100µL de sang par ponction cardiaque. Les souris ne reçoivent aucun traitement ou manipulation avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Les souris sont infectées une seule fois par voie intra-péritonéale en début de protocole expérimental et ne sont soumises à aucun prélèvement. Le prélèvement des organes/sang ne se fait qu'après la mise à mort en fin de protocol expérimental. Les souris infectées par la souche parasitaire PRU sont euthanasiées 6 jours post-infection dans la majorité des procédures expérimentales, avant le développement de symptômes cliniques pouvant entrainer une souffrance de l'animal. Pour le modèle de la toxoplasmose chronique, les souris seront sacrifiées 3 semaines post-infection, mais à ce stade, elles ne développent aucun signe clinique, cette forme de toxoplasmose étant bégnine (certains symptômes neurologiques de changements comportementaux peuvent se développer à partir de 3 mois d’infection). Cependant, certaines souris peuvent développer (dans 15 à 20% des cas) une toxoplasmose aïgue (Jours 9-14 post-infection) corrélée à des changements de comportement : tremblement, diminution de l’exploration, et/ou d'aspect physique externe : poil hérissé, abdomen distendu. Les souris sont surveillées quotidiennement après l'infection et l'apparition de signes précoces de souffrance (point limite fixé est quantifié par une grille de score) entrainera leur euthanasie immédiate.
Devenir
Afin d'évaluer la réponse immunitaire des souris infectées ainsi que la dissémination parasitaire, nos procédures impliquent le prélèvement d'organes vitaux comme la rate, le foie et le cerveau. Les animaux doivent donc être euthanasiés avant prélèvement et analyse de ces paramètres. De manière similaire, la génération de cellules dendritiques primaires à partir de la moëlle osseuse requiert le prélèvement des tibias et fémurs de la souris et ne peut donc se faire qu'après euthanasie de l'animal.
Remplacement
A ce jour, aucun système in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la toxoplasmose aigüe ou cérébrale chronique, caractérisée par l’installation de kystes latents dans le cerveau qui sont résistants aux traitements antibiotiques existants. De plus, l'évaluation de la pathogénicité de certaines souches parasitaires mutantes peut aider à développer de nouvelles stratégies de vaccination contre cette infection. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’Homme et la souris, il est admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du parasite in vivo et l’étude des interactions avec le système immunitaire de l’hôte. Par ailleurs, les différentes stratégies innovantes de lutte contre le parasite peuvent être évaluées et validées chez la souris qui est un modèle naturel d’infection et développe une toxoplasmose aigüe et chronique, similaires à ce qui est observé chez l’Homme. Par ailleurs, nous analysons la modulation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) au stress infectieux dans les cellules dendritiques, une réponse qui permet la mise en place d'une réponse immunitaire efficace contre le parasite. Nos résultats préliminaires montrent un impact de la réponse UPR sur la prolifération d'un sous-type de DC spléniques. Pour ces raisons, notre projet nécessite de réaliser nos études dans des cellules primaires et non des lignées cellulaires immortalisées, qui ont un cyle de division modifié. Cependant, nous utilisons une lignée de cellules dendritiques cDC1 immortalisée (MuTuDC) afin de valider certaines de nos hypothèses mécanistiques avant de les tester sur des cellules primaires issues de souris ou dans la souris, et d'étudier leur impact sur la dissémination parasitaire et la mise en place d'une immunité mémoire.
Réduction
Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, l’analyse de nombreux paramètres se fait simultanément sur une même souris après prélèvement des différents organes (rate, foie, cerveau, sang). Les expériences sont répétées 3 fois et chaque expérience (3-7 souris par groupe expérimental) est analysée de manière indépendante. Ces conditions nous permettent de vérifier la reproductibilité des observations et de générer des résultats statistiquement validés. Notre connaissance préalable des protocoles expérimentaux utilisés ainsi qu'une étude statistique adaptée nous permet d’assurer la fiabilité du résultat tout en limitant à son minimum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur pendant l’expérience : les animaux manipulés sont isolés dans une pièce séparée afin d’éviter tout stress aux animaux non manipulés ; les souris ne sont pas soumises à des traitements ou prélèvements répétitifs mais à un prélèvement unique après euthanasie. De plus, après infection, les animaux sont surveillés quotidiennement afin de détecter les signes éventuels de souffrance le plus tôt possible. L'obtention du point limite fixé, caractérisé par un changement de comportement : diminution de l’exploration, ou d'aspect physique externe : poil hérissé, abdomen distendu, entrainera l’euthanasie immédiate de l’animal . Les animaux sont maintenus dans les conditions standart de température, cycle lumière/obscurité, d'alimentation et la cage possède un enrichissement (maison en dur).
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent d’étude car il est un hôte naturel de T. gondii qui inclut 1) La possibilité d’induction d’une toxoplasmose aigüe et chronique chez la souris par des souches de T. gondii infectant l’Homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2) Les nombreuses connaissances et outils disponibles pour cette espèce. En particulier, de nombreux anticorps contre des cytokines, chimiokines, voies de signalisation pro-inflammatoires assurent la réalisation d’expériences clés pour l’étude de la réponse immunitaire. Aussi, l’existence de LT CD8+ reconnaissant spécifiquement des antigènes de T. gondii sur les cDC murines permettent l’étude de l’activité de présentation antigénique. Ces paramètres font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles.
Comprendre la plasticité cellulaire dans la récidive du glioblastome après traitement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de glioblastome sont injectées dans le cerveau, la tumeur est retirée par craniotomie, puis les animaux reçoivent radiothérapie et chimiothérapie selon le protocole utilisé chez les patients, avant mise à mort pour analyses. Le porteur indique que la craniotomie provoque une douleur et que la tumeur peut entraîner une perte de coordination et de poids. Il affirme qu'il est impossible de recréer le microenvironnement tumoral hors de l'animal, tout en reconnaissant avoir observé in vitro une partie du phénomène étudié.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives chez l’adulte. Malgré un traitement lourd associant chirurgie (résection pour réduire au maximum la tumeur), chimiothérapie et radiothérapie (protocole de Stupp), la survie moyenne des patients n’excède pas 15 mois en raison de l’apparition, quasi-systématique, de récidives. Le principal facteur supposé pouvant expliquer l’apparition de ces récidives est la repousse de cellules très invasives, se propageant à partir de la masse tumorale. L’environnement protecteur empêche l’élimination de ces cellules par le protocole de Stupp. L'unité gliovasculaire (UGV) faite de cellules tumorales, de cellules immunitaires et de cellules cérébrales localisées à proximité des vaisseaux sanguins- est une niche protectrice favorisant la survie, la résistance au traitement et la dissémination des cellules de GBM. Elle a la pleine compétence pour jouer un rôle clé dans la récidive mais son rôle dans ce processus est encore mal connu. Mieux comprendre le comportement des cellules tumorales ainsi que le rôle du microenvironnement au sein de l'unité gliovasculaire et identifier des biomarqueurs spécifiques de la récurrence pourraient transformer considérablement notre vision actuelle de la thérapie des GBM et ainsi améliorer la prise en charge des GBM chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est la tumeur cérébrale agressive la plus fréquente chez l’adulte et l’un des cancers les plus mortels. Malgré des traitements très lourds (chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie), la rechute est pratiquement inévitable (90%). Des données de la littérature ainsi que les résultats préliminaires obtenus au laboratoire, suggèrent que l’unité gliovasculaire (cellules tumorales, endothéliales, péricytaires, astrocytaires et immunitaires) pourrait jouer un rôle déterminant dans la survie des cellules tumorales après traitement. Cette étude nous permettra de définir précisément le rôle de l’unité gliovasculaire dans la résistance au traitement et sera déterminante pour l’identification de cibles thérapeutiques. Ce projet s’insère dans une grande étude réalisée en collaborations avec plusieurs équipes de recherche sur le glioblastome (cliniciens et chercheurs). Les résultats obtenus dans notre modèle préclinique murin seront ensuite validés à partir de biopsie de patients traités ou non au protocole de Stupp. L'application directe et immédiate de ces connaissances pourrait ainsi favoriser le développement de nouvelles thérapies ciblées, dont le GBM a urgemment besoin puisqu’ aucune amélioration thérapeutique pertinente n'a été apportée ces 15 dernières années. Malgré les efforts massifs déployés dans le domaine clinique et de la recherche, le traitement du GBM reste l'un des défis les plus difficiles à relever en oncologie clinique. Presque tous les patients atteints de GBM reçoivent le protocole de Stupp, qui est la norme en matière de soins ; par conséquent, beaucoup d'entre eux bénéficieraient de stratégies thérapeutiques visant à accroître son efficacité. Dans ce contexte, il s'agit d'une approche entièrement nouvelle issue d'une idée novatrice. Les résultats de ce projet jetteront les bases des objectifs futurs : déterminer de nouvelles voies et stratégies pour cibler les voies de résistance gliovasculaire post-Stupp et améliorer le traitement en collaboration avec les cliniciens. La compréhension de la résistance des GBM au protocole Stupp et de la biologie de l’unité gliovasculaire pourraient transformer considérablement notre vision actuelle du traitement des GBM dans le but ultime d’améliorer la survie des patients.
Procédures
L’objectif 1er de cette étude est d’établir un modèle pré-clinique de traitement du GBM chez la souris (protocole de Stupp). Pour cela, différents groupes de souris seront constitués. Groupe 1 : dans cette première procédure visant à mettre au point le retrait chirurgical de la tumeur, des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau (durée de l’anesthésie : 30 min). Après le développement de la tumeur les souris sont opérées afin de procéder au retrait de la tumeur (durée de l’anesthésie : 30min). Groupe 2 : Après mise au point du retrait de la tumeur avec le groupe 1, nous implanterons des cellules tumorales dans de nouvelles souris. Après développement de la tumeur, elle sera retirée. 3 jours après la résection de la tumeur, les animaux anesthésiés seront traités par radiothérapie (durée 15 minutes). Un traitement sera également administré directement dans l’abdomen de l’animal vigile (5 minutes). Ces traitements (radiothérapie et chimiothérapie) seront répétés au maximum 3 fois sur 3 jours consécutifs. Groupe 3 : sur certaines souris du groupe 2, une fenêtre d’observation sera posée après la résection (durée d’anesthésie 30 min). Ces animaux seront également traités par chimiothérapie et radiothérapie selon le même protocole décrit plus haut. Les animaux seront suivis par imagerie une fois avant le début du traitement puis en fin de traitement à raison d’une fois par semaine pendant 3 semaines. Des prélevements de sang seront réalisés à raison de 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (durée du geste inférieur à 30 sec).
Impact sur les animaux
Lors de l’injection : Les animaux greffés avec les cellules tumorales vont développer une tumeur cérébrale dont la taille sera évaluée fréquemment par dosage sanguin. Lors la résection : L’os du crane étant peu innervé, la craniotomie est à l’origine d’une douleur mesurée. La résection de la tumeur en elle-même ne provoque pas de douleurs puisque le cerveau ne possède pas de terminaisons nerveuses. Cependant, la craniotomie peut engendrer un changement de pression intracrânienne et la résection en elle-même peut être à l’origine de petites hémorragies. Suite à cette intervention, une réduction des mouvements et de la mobilité de l’animal, une perte de coordination peuvent subvenir dans les heures qui suivent la chirurgie. Dans les jours suivant, une perte de poids peut également être observé. Le traitement aux rayonnement ionisants n’entraine pas d’inconfort en lui-même et est réalisé sur des animaux anesthésiés Les nuisances attendues suite à l’injection de la chimiothérapie seront celles liées à l’injection (douleur légère de courte durée). D’après notre expérience aucune douleur n’est attendue suite à l’administration de ce traitement. Les prélèvements sanguins réalisés au niveau de la queue de l’animal provoqueront une douleur légère et un stress de courte durée chez la souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des résultats préliminaires du laboratoire couplés à des données de la littérature nous mènent à penser que les modifications de comportement des cellules tumorales après traitement (protocole de Stupp) sont intimement dépendantes de leur environnement. Or, le microenvironnement tumoral est un système complexe aux paramètres extrêmement nombreux et dont la plupart sont inconnus : il est aujourd’hui impossible de recréer totalement cet environnement ex vivo. C’est pour cela que nous devons avoir recours à des études sur l’animal dans lequel tous les paramètres sont réunis. Notre hypothèse est qu’après le traitement les cellules tumorales résiduelles localisées au sein de l’unité gliovasculaire protectrices sont à l’origine de la récidive. Nous avons développé des méthodes alternatives pour éviter au maximum d’avoir recours aux animaux. Ainsi, nous avons au préalable observé in vitro que des cellules de GBM acquéraient un phénotype de résistance lorsqu’elles étaient au contact de vaisseaux sanguins. Cependant, ce modèle ne représente qu’une version simplifiée du microenvironnement tumoral. En effet, le microenvironnement tumoral est un système complexe aux paramètres extrêmement nombreux et dont la plupart sont inconnus il nous est donc impossible de recréer totalement cet environnement ex vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons fait un travail de recherche bibliographique rigoureux. De plus, notre expérience passée nous permet de limiter le nombre d’animaux. En effet : 1-Nous avons identifié le nombre de cellules à injecter pour obtenir une tumeur qui sera résécable environ un mois après l’injection. Nous ne testerons donc pas différentes concentrations de cellule. 2-Nous maitrisons la résection de la tumeur 3-Pour le traitement radio et chimiothérapeutique, nous avons mené de nombreuses expériences in vitro qui nous permettent de cibler les doses et le timing de traitement ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux utilisés. 4-Le suivi régulier de la progression tumorale grâce à la mesure d’un marqueur sanguin nous permet de savoir quand effectuer la résection mais également de monitorer la récurrence de la tumeur ce qui réduira également le nombre d’animaux utilisés. 5-Les analyses requièrent une faible quantité de matériel et permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales, en particulier dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis individuellement et ce plusieurs fois par semaine (2 à 3 fois) afin d’assurer leur bien-être. Celui-ci sera évalué selon une grille de score. Si nécessaire, les expérimentations seront stoppées avant toute souffrance. Les manipulations lourdes sont faites sous anesthésie et les animaux recevront systématiquement les traitements antibiotiques et analgésiques adaptés pendant et après les opérations. Dès l’apparition d’une tumeur de taille importante (évaluée par un marqueur sanguin) les animaux sont suivis quotidiennement afin d'évaluer leur bien-être selon la grille de score jointe. En cas de signes de détresse les soins adaptés seront apportés (analgésie, hydratation …). Si aucun soulagement n’est possible ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Nos expérimentations seront menées chez la souris, modèle de choix pour les expériences en cancérogenèse. Leur petite taille, et la méthodologie expérimentale bien établie en font une espèce animale pertinente pour les expériences de laboratoire. Nous étudierons des lignées cellulaires humaines et murines. Deux souches de souris seront utilisées dont des souris immunodéficientes pouvant recevoir des injections de cellules humaines sans développer de réactions immunitaires contre celles-ci. A l’inverse, l’autre lignée de souris est immunocompétente et permet donc de réaliser notre étude dans un contexte de réponse immunitaire complète. Adulte de 7-8 semaines, un âge qui permet une bonne prise tumorale mais également avec un potentiel de croissance limité afin d’éviter que les dispositifs chirurgicaux (fenêtres crâniennes) ne gênent leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux l’anesthésie et la chirurgie.
EU1:2_Identification de la source de production précoce de GM-CSF lors de la mise en place d’une réponse Th17
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie de parabiose, qui consiste à coudre deux souris ensemble pour qu'elles partagent leur circulation sanguine, puis des prélèvements et injections, soit cinq interventions au total avant mise à mort et prélèvement des organes. Le porteur classe la parabiose en sévère du fait de l'inconfort postopératoire, tout en affirmant que les animaux se déplacent normalement dès deux à trois jours. Il décrit cette chirurgie et le modèle murin de la sclérose en plaques comme les seules alternatives pour localiser l'origine d'une cytokine.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune qui se caractérise par l'infiltration du système nerveux central (CNS) par des cellules immunitaires conduisant à la destruction de la gaine de myéline qui est à l'origine des désordres moteurs chez les patients. Afin de développer des traitements plus ciblés, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie. Nous avons identifié une nouvelle fonction pour une cytokine pro-inflammatoire, le GM-CSF, en mettant en évidence son rôle crucial dès les premières étapes de la maladie. Nous souhaitons dans ce projet identifier la source cellulaire de cette cytokine.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'anticorps antagonistes bloquant le GM-CSF est une piste thérapeutique prometteuse et les premiers résultats testant l'inocuité du traitement chez les patients sont prometteurs. Notre projet permettra de proposer un nouveau mécanisme d'action du GM-CSF en montrant que l'utilisation d'un anticorps monoclonal bloquant la cytokine agit non seulement au niveau du système nerveux central, mais aussi en périphérie au niveau des organes lymphoïdes secondaires dès les étapes les plus précoces de la maladie, renforçant ainsi la pertinence de son utilisation dans le traitement de la SEP.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie de parabiose sous anesthésie générale (durée de la chirurgie 60 min environ). Deux semaines après la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (durée moyenne = 2 min). Quatre semaines après la chirurgie, les animaux recevront, sous anesthésie gazeuse, une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue ainsi qu'une injection intra-veineuse au niveau de la veine caudale (durée moyenne = 5 min) . Les animaux seront mis à mort aux alentours de 5 semaines après la parabiose par inhalation de CO2 (8 min) suivie d'une dislocation cervicale (10 sec). Au total les souris subiront 5 interventions.
Impact sur les animaux
Les expériences de parabiose sont des expériences classées sévères du fait de l'inconfort qu'elle crée en post-opératoire. Cependant, nous avons déjà réalisé ce type de chirurgie pour un autre projet, et dès 2-3 jours après la parabiose, les parabiontes se déplacent dans la cage, se suspendent à la grille et accèdent sans problème à la nourriture et au biberon.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort, afin de prélever leurs organes et d'analyser la réponse immunitaire.
Remplacement
L'objectif de notre projet est d'identifier la source de GM-CSF et de distinguer si le GM-CSF est sécrété par une population cellulaire circulante ou une population résidente dans les tissus lors des premières étapes de la mise en place de la réponse inflammatoire mise en place lors d'une encéphalite auto-immune expérimentale, le modèle murin de la sclérose en plaques. C'est un processus complexe et intégré qui nécessite l'implication de plusieurs types cellulaires dans des organes distincts avec une cinétique précise. Ces étapes ne peuvent pas être mimées in vitro. De plus, les expériences de parabiose, à savoir le partage du système sanguin, sont les seules alternatives expérimentales afin de répondre à notre question.
Réduction
Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 2 fois. Nous effectuerons le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux ...
Raffinement
Avant la procédure de parabiose, les futurs parabiontes seront isolées dans une cage enrichie (igloo/papier kraft pour nidification) pendant deux semaines afin qu'elles s'habituent l'une à l'autre. Lors de la procédure de parabiose, les souris seront anesthésiées pendant 60 min. Nous nous assurerons de la perte de conscience des animaux avant la chirurgie par une absence de reflexe palpébral et du reflexe du retrait. Durant l'opération, un gel oculaire sera appliqué afin d'éviter tout dessèchement de la cornée. Après la chirurgie et jusqu'à leur réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de limiter l'hypothermie. En post-opératoire, les animaux seront analgésiés pendant 48h, 2 fois/24h. Durant 10 jours, les animaux recevront des antibiotiques sous forme d'un traitement dans l'eau de boisson. Nous nous assurerons aussi que les animaux aient une prise hydrique et alimentaire correcte en rajoutant dans la cage du gel d'hydratation ainsi que des croquettes sous forme de gel. Une attention particulière sera portée aux sutures cutanées pendant la première semaine. Les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement pour détecter des signes de douleur et de détresse (tremblement, léthargie, dos arqué, manque de toilettage...). Une perte de poids sévère (>20% du poids initial) ou des signes de douleur et de détresse >24h et non soulagé par le traitement analgésique constituent des points limites et la mise à mort des animaux. Pour réaliser l'immunisation, les animaux seront anesthésiés sous anesthésie gazeuse. La procédure n'entraîne pas de douleurs, ni de dommages aux animaux.
Choix des espèces
Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l'espèce humaine. Elles nous permettent d'étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, avec son modèle murin l'EAE (encéphalite auto-immune expérimentale). Nous disposons aussi des modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d'évaluer l'origine du GM-CSF dans la réponse mise de place da réponse immune encéphalitogène. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet afin que le système immunitaire soit mature.