Procédures sévères
Développement de modèle de fibrose évoluant vers la cirrhose hépatique chez le rat. Application à l’évaluation de propriétés thérapeutiques de composés dans la décompensation aigue de la cirrhose.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Ils subissent une vingtaine de gavages, une intoxication du foie sensibilisée au phénobarbital et, pour une partie, une ligature et perforation du cæcum, pour reproduire une cirrhose décompensée avec état de choc et détresse cardio-respiratoire. Le porteur revendique de reproduire une gravité qu'il juge sévère et indique avoir écarté la buprénorphine, jugée délétère pour son modèle, ce qui revient à priver d'analgésie les rats du volet inflammatoire. Il affirme qu'aucun système in vitro ne remplace l'animal entier à ce stade préclinique et renvoie au conditionnel les traitements espérés contre la défaillance du foie.
Objectifs
La décompensation de la cirrhose est caractérisée par la jaunisse, l’œdème, l’ascite et des troubles du système nerveux central, elle conduit à la mort dans un délai de 5 ans. La transplantation hépatique doit être envisagée pour maintenir le patient en vie. Chez un malade chronique du foie, elle est appelée défaillance hépatique aigüe, elle provoque des défaillances d’autres organes (reins), qui sont souvent fatales. La décompensation aigue est provoquée par une inflammation induite par une infection microbienne ou prise abondante d’alcool. La recherche de moyens médicaux est nécessaire et nécessite des modèles animaux pour les développer. Notre projet vise donc à développer le modèle décrit proche de la situation vécue par les malades de cirrhose et à évaluer la capacité de nouveaux médicaments à améliorer leur état général. Pour satisfaire à la règle des 3 R, nous avons estimé le nombre d’animaux pour chaque procédure pour avoir une réponse statistiquement analysable. Les procédures seront appliquées par des personnes habilitées, dans un hébergement adapté et bénéficiant de l’enrichissement du milieu, respectant au maximum le bien-être des animaux. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires et de ne pas altérer les résultats de l'étude, des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Etant donné la complexité de l’évènement étudié qui produit le dysfonctionnement de plusieurs organes, il nous est impossible de totalement remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro mais la sélection des composés est effectuée in vitro ce qui participe partiellement à l’emploi de méthodes alternatives. Ainsi le nombre total de souris prévu est de 1380 animaux sur 5 années.
Bénéfices attendus
Lors de défaillance hépatique aigue, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les multiples troubles qui affectent les autres organes le plus précocement possible. Aujourd’hui on utilise des traitements qui vont agir sur la pression sanguine, l’infection, les hémorragies du système digestif, ou le dysfonctionnement des reins à l’aide de corticoïdes. Le but est de préserver les fonctions vitales dans les meilleures conditions afin de conserver les chances de succès de la greffe du foie. Les traitements que nous espérons proposer visent à agir simultanément très tôy sur les mécanisme qui sont à l’origine des défaillances multiples des organes. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
Les animaux recevront 20 gavages par sonde oro gastrique (volume de 2ml/kg), chaque gavage prendra 15 secondes au cours d’une période de 12 semaines Les animaux subiront 1seul prélèvement sanguin intermédiaire à la fin de la période d’induction de la fibrose (en 10 semaines) et un second prélèvement sanguin à la fin de la procédure ( à la douzième semaine) , ils seront pratiqués sous anesthésie, la durée totale d’un acte (anesthésie et prise de sang) prend 5minutes . Les animaux recevront 1 injection intrapéritonéale au moment du déclenchement de l'ACLF (injection LPS ou Bactéries à la fin de la douzième semaine), elle sera pratiquée sur animaux vigiles contraints. La durée d’un acte est de 30 seconde. Les gestes suivants seront réalisés aux animaux qui subiront une chirurgie abdominale : • rasage de la fourrure (état vigile) durée 3 minutes • 1 injection péritonéale d'agents anesthésiques, (la durée d’un acte est de 30 secondes.) • laparotomie, ligature et percement du cécum, suture du plan musculaire et du plan cutané (sous anesthésie). La durée totale de l’acte chirurgical sur l’animal anesthésié est de 10 minutes.
Impact sur les animaux
La rupture des fonctions hépatiques représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez l'animal présente dans sa phase finale des signes cliniques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure au moment du prélevement terminal pour recueil des organes en vue d'analyses histologiques et génomiques
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présent chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée in vitro, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/repression de gènes, effets histologiques etc) doivent être relevants. Nous écartons les paramètres dont la pertinence serait trop faible pour être statistiquement décelable qu'avec des effectifs trop importants. Ces études pilotes permettent sur la base des effets et résultats obtenus d'établir une approche statistique du choix des effectifs par un calcul de la puissance statistique.
Raffinement
L'utilisation du phénobarbital en temps qu'agent sensibilisateur à l'agent hépatotoxique à pour but d'homogénéiser, raccourcir le délai d'exposition et réduire les riques de mortalité, permettre de réduire le nombre d'animaux et la durée d'inconfort des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères , nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur introduirait un biais expérimental. Nous avons fait l'étude des effets de buprénorphine dans un de ces modèle qui se sont avérés délétères. Dans un premier temps une étude bibliographique plus approfondie sur l'emploi de moyen analgésique d'autres classes médicamenteuses est menée. Pour le modèle chirurgical , nous employons en prémédication la lidocaine localement et la buprénorphine pour la prise en charge de la douleur causée par l'acte chirurgical, la médication permet d'améliorer le bien être de l'animal en phase post-op et de réduire la durée de la période de récupération.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie. Le génome du rat et celui de l'homme ont 90% de leurs gènes en commun et ces derniers sont présents dans le même ordre sur les chromosomes, ce qui fait des petits rongeurs un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Très jeunes rats à l’arrivage (environs 21 jours, âge du sevrage), la taille optimale du rat pour commencer le traitement au phénobarbital a été déterminée à 100 g dans la littérature scientique.
Lymphocytes T CD8 et immunité anti-tuberculeuse: comprendre quelles sous-populations lymphocytaires protègent contre la tuberculose
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie de la tuberculose par voie nasale sous anesthésie, et reçoivent vaccins, cellules ou molécules par injections parfois répétées jusqu'à quatre fois. Le porteur indique une pathologie pulmonaire inflammatoire comme principale atteinte, et précise que le cumul des interventions, chacune jugée modérée, conduit à déclarer l'ensemble sévère. L'objectif est d'identifier les sous-populations de lymphocytes qui protègent contre la tuberculose, les animaux infectés étant tués car ils ne peuvent quitter la zone de biosécurité ni être réutilisés.
Objectifs
La tuberculose reste l'une des pathologies les plus mortelles avec près de 2 millions de décès par an. Il existe de nombreuses difficultés pour la diagnostiquer, suivre de façon fiable l'évolution des patients mais aussi et surtout la prévenir par la vaccination ou la traiter par des molécules thérapeutiques. Si l'importance du système immunitaire n'est plus à démontrer dans cette pathologie, la compréhension que nous en avons est encore limitée et n'offre pas les outils pour répondre aux problématiques évoquées plus haut. Exploitant la proximité entre les mécanismes associés à la protection chez l'Homme et la souris, le projet a pour but d'approfondir nos connaissances sur les cellules de l'immunité que sont les lymphocytes T afin d'apporter des éléments de réponses à ces problématiques. Très concrètement, l'objectif du projet est de comprendre quelles sous-populations de lymphocytes T sont associées à une protection dans le cas de l'infection par l'agent de la tuberculose Mycobacterium tuberculosis. Il visera à caractériser ces populations sur le plan phénotypique (les molécules qui les caractérisent), de leur localisation dans les poumons (notamment vis-à-vis des cellules infectées par la bactérie) et également sur le plan de leur propriétés fonctionnelles (les molécules anti-bactériennes qu'elles produisent). Le projet ambitionne également de comprendre si l'on peut favoriser la génération et/ou la persistence de ces sous-populations par des stratégies d'intervention vaccinales ou l'administration de molécules modulant la génération ou la détection de dommages pulmonaires préjudiciables à ces lymphocytes (regroupées sous le terme de thérapies ciblant l'hôte).
Bénéfices attendus
Il est attendu du projet un gain de connaissances fondamentales concernant l'identité des sous-populations lymphocytaires T les plus à même de protéger de l'infection. Ces résultats pourront à terme fournir des informations sur des tests à réaliser chez les patients afin de comprendre si leur évolution est favorable ou pas en fonction de l'évolution chez eux de la présence des cellules associées à la protection. Par ailleurs, les résultats obtenus sur les stratégies vaccinales proposées et sur l'efficacité des molécules administrées pour moduler la génération ou la détection des dommages pulmonaires offrira des possibilités translationnelles qui pourront être exploitées dans d'autres projets. Ceci est d'autant plus vrai que la majorité des molécules testées est déjà utilisée en thérapeutique humaine.
Procédures
Les procédures prévues incluent l'induction de la tuberculose chez les souris par administration de la bactérie responsable ainsi que l'administration de vaccins ou de molécules pharmacologiques visant à diminuer l'impact de la pathologie. Chacune de ces interventions peut être classée comme modérée mais l'effet cumulatif dans les procédures nous conduit à déclarer ces dernières sévères. Seront administrées les bactéries responsables de tuberculose (Mycobacterium tuberculosis, Mtb) ou vaccinales (BCG), des cellules immunitaire de type lymphocytes, des molécules permettant soit de détecter les cellules immunitaires, soit d'éliminer des cellules immunitaires soit de moduler la réponse immunitaire. S'agissant des bactéries Mycobacterium tuberculosis et BCG, chacune ne sera administré qu'une fois par voie intranasale (Mycobacterium tuberculosis ou BCG) ou sous-cutanée ou intraveineuse (BCG seulement) et systématiquement sous anesthésie. S'agissant des cellules, elles seront réinjectées une seule fois soit par voie intranasale soit par voie intraveineuse sous anesthésie appropriée. Les molécules administrées seront soit des anticorps ou des molécules pharmacologiques. Certaines seront administrées pendant 10 jours dans l’eau de boisson des souris ou par injection intrapéritonéale sans anesthésie, intranasale ou intraveineuse (sous anesthésie appropriée dans les 2 cas). Il y aura au maximum 3 injections sur une période de 10 jours. Selon les procédures, les animaux recevront au minimum une administration de bactéries et une injection intraveineuse d'anticorps en 3 semaines et au maximum 2 administrations de bactéries (BCG puis Mycobacterium tuberculosis) et jusqu'à 4 injections intraveineuses et/ou intranasale d'anticorps et de molécules pharmacologiques sur une période de 4 à 8 semaines.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances causées aux animaux résideront dans l'induction d'une pathologie pulmonaire liée à la réponse inflammatoire induite par l'infection par la bactérie Mtb. Une autre nuisance à un niveau moindre provient de l'administration intraveineuse ou intranasale de bactéries (BCG ou Mtb), cellules (lymphocytes protecteurs) et/ou molécules pharmacologiques et anticorps, parfois répétées (jusqu'à 4 fois).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort de façon éthique pour 3 raisons. Tout d'abord, étant infectés par un pathogène pour l'homme, ces animaux ne peuvent pas quitter la zootechnie de sécurité biologique ni être réemployés dans de nouvelles procédures. Par ailleurs, si nos procédures prévoient un terme à un temps plutôt précoce après infection et une pathologie peu développée et non mortelle (quelques semaines), le maintien des animaux à des temps longs (plusieurs mois) conduirait à une mort liée à la perte de fonction pulmonaire étant donné que les souris ne peuvent éliminer mais seulement contrôler plus ou moins efficacement le bacille tuberculeux. Enfin, pour notre projet nous devons analyser la totalité des cellules présentes dans les poumons.
Remplacement
Etant donné que les populations de lymphocytes d’intérêt sont assez rares, qu’elles sont pour certaines accessibles seulement dans les poumons et qu’il n'existe aucun modèle cellulaire ni de possibilité de culture ex vivo, nous devons utiliser un système intégré dans lequel la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et les poumons sont nécessaires (ce qui exclue les modèles multicellulaires du type "organoide"). Dans un soucis de Remplacement, nous incorporerons néanmoins chaque fois que cela sera possible des étapes dans des modèles alternatifs. Notamment, une fois établie la diversité des sous-populations lymphocytaires déclenchées par l'infection, nous rechercherons leur caractère protecteur. Cela sera réalisé en exposant des macrophages infectés par la bactérie à ces populations dans des tests cellulaires in vitro. Seules les sous-populations protectrices in vitro seront par la suite testées in vivo en les administrant à des souris infectées.
Réduction
Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré 4 étapes dans notre raisonnement. Tout d’abord, certaines expériences réalisées font suite à des étapes de validation dans des modèles cellulaires : ainsi les expériences proposées sont réalisées au stade où les méthodes de remplacement de l’expérimentation animale ont été exploitées et s’avèrent suffisamment prometteuses pour utiliser le modèle intégré murin. Ensuite, certaines étapes de nos projets pourront en effet être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des promesses offertes par les résultats. De plus, nous avons développé des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés (exemple : préparation d’ARN, cytométrie de flux et charges bactériennes peuvent maintenant être réalisées sur le même échantillon). Finalement, l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille minimale des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Il existe 3 grandes catégories de sources de douleurs et/ou de stress dans nos procédures. La première est l'induction d'une pathologie pulmonaire par administration de la bactérie M.tb. Dans ce cas, notre façon de gérer la douleur se situe à 4 niveaux: la dose, faible; la souche bactérienne, peu virulente; la durée de suivi, très inférieure à la durée léthale chez la souris immunocompétente; le suivi quotidien. La deuxième cause de douleur/stress réside dans le mode d'administration des bactéries, molécules pharmacologiques ou cellules. Nous privilégions les modes d'administration peu on non traumatisants ou douloureux (eau de boisson ou injection intrapéritonéale chaque fois que cela est possible. Dans les autres cas, ces injections seront accompagnées des mesures appropriées (anesthésie/analgésie dans le cas d'administration intranasale ou intraveineuse ou sous-cutanée). La troisème source potentielle de stress/douleur fait référence aux suites de l'administration de vaccins (induisant une réaction inflammatoire) ou de molécules pharmacologiques ou des cellules. Dans la cas des vaccins, nous serons attentifs aux plaies éventuelles sur le site d'injection et à l'état général de l'animal dans les jours suivant l'injection. Pour les molécules pharmacologiques, les substances administrées sont attendues pour avoir des effets bénéfiques sur la pathologie. Toutefois, même si nous injecterons des molécules déjà utilisées chez la souris sans conséquences dommageables et pour lesquelles les doses pharmacologiques sont bien connues, nous exerçerons une surveillance quotidienne. Toutes les souris seront maintenues dans une zootechnie de sécurité biologique. Elles sont logées selon les normes éthiques en vigueur et bénéficient d'un enrichissement pendant la stabulation. Une surveillance quotidienne des animaux et une inspection de leur apparence (posture, pelage) sont effectuées tout au long de l'expérience par des membres du personnel formés. Nous disposons d'un comité chargé du bien-être des animaux sous la supervision d'un vétérinaire, qui assiste les expérimentateurs notamment pour gérer le stress ou la douleur des animaux.
Choix des espèces
Il existe de nombreux modèles de tuberculose chez l'animal. Du primate non-humain (le modèle le plus proche de l'homme) au poisson zèbre en passant par les rongeurs, chacun avec ses avantages et inconvénients. Nous avons opté pour le modèle de la souris car, en termes d'immunité, il est assez prédictif de ce qui se passe chez l'homme. En termes de pathologie et notamment de lésions pulmonaires, il a été longtemps peu représentatif mais l'identification d'une mutation (SP140) permettant le développement de lésions plus proches de celles de l'homme a largement comblé ce manque (tout en maintenant un statut immunocompétent à l'animal porteur de la mutation). Un avantage supplémentaire est la possibilité de travailler et d'utiliser des outils moléculaires très fins (permettant le suivi de cellules fluorescentes ou la détection de cellules très spécifiques d'antigènes mycobactériens), et ce, dans le même fond génétique (évitant ainsi les facteurs confondants). C'est ainsi que la base de notre projet prévoit d'utiliser les souris C57BL/6 porteuses ou non de la mutation SP140, qui pourront être analysées avec les mêmes outils moléculaires établis, très performants et informatifs tout en présentant des lésions et une sensibilité différentielle à l'infection. Cette possibilité unique n'est accessible dans aucun autre modèle animal.
Remédiation ou prévention de l’émergence de troubles neurodéveloppementaux par l’exercice, l’irisine ou la lactoferrine chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
650 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. 110 femelles gestantes subissent une réduction de l'irrigation de l'utérus puis sont tuées au sevrage, et 540 ratons subissent soit cette privation avant la naissance, soit une immobilisation des pattes arrière 18 heures par jour de la naissance au sevrage. Le porteur indique une spasticité, des douleurs, un retard de croissance et des troubles moteurs et cognitifs induits par ces modèles. Le projet teste l'exercice, une protéine musculaire et la lactoferrine du lait bovin pour prévenir des troubles neurodéveloppementaux, les rats étant ensuite opérés sans réveil pour des enregistrements avant prélèvement des tissus.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux (TND) chez l’enfant liés à la prématurité ou à l’hypo-activité physique sont croissants. Le microbiote chez ces enfants est perturbé, tout comme la communication entre les sytèmes immunitaires, intestinaux et nerveux, conduisant à plus d’inflammation précoce et à l’apparition de TND divers. Ces troubles neurodéveloppementaux et intestinaux semblent exister dans nos modèles animaux. Nous cherchons ici à prévenir ou remédier précocément à l’apparition de ces TND par plusieurs traitements. Les objectifs de ce projet visent à déterminer l’impact de traitements comme 1) la lactoferrine issue du lait bovin, aux propriétés immunitaires bénéfiques, anti-inflammatoires et facilitatrices du métabolisme du fer, 2) l’exercice physique et l’enrichissement, et 3) l’irisine, une substance neuroprotectrice produite par les muscles et médiatrice des effets bénéfiques de l’exercice, sur i) le microbiote, la perméabilité hémato-intestinale/encéphalique, ii) les processus inflammatoires, et iii) la structure et les fonctions cérébrales, tels que réflexes et comportements sensorimoteurs, comportements cognififs et fonctions exécutives, et les corrélats électrophysiologiques de ces troubles, que l’on observe dans nos 2 modèles animaux: 1) de prématurité basé sur une hypoperfusion intra-utérine (Lot 1: 270 animaux) ou 2) de troubles de l’acquistion de la coordination, basé sur une restriction sensorimotrice (Lot 2: 270 animaux) au cours du développement.
Bénéfices attendus
Composant majeur du colostrum et du lait humain, la lactoferrine bovine (bLf) est une glycoprotéine aux propriétés anti-inflammatoires, antiseptiques et facilitatrices du métabolisme du fer. L’administration prénatale de cette glycoprotéine vise à contribuer au développement harmonieux du microbiote, diminuer l’inflammation par une réduction de la perméabilité des barrières hémato-intestinale/encéphalique, améliorer le développement cérébral en minimisant les lésions cérébrales diffuses, observées dans notre modèle de prématurité et réduire les troubles divers du comportement que l’on retrouve dans nos 2 modèles animaux. La bLf est actuellement utilisée dans des essais cliniques chez les enfants prématurés et a montré des effets bénéfiques sur les infections, la mortalité et les comorbidités chez ces enfants, ainsi que l’absence d’effets secondaires. Notre étude préclinique vise à améliorer les connaissances concernant les effets de la bLf sur le développement cérébral et les mécanismes d’action, avec une portée à terme sur le développement de prochains essais cliniques. La sédentarité et l’hypo-activité physique en général, comme l’indiquent de nombreuses ONG ou l’OMS, induisent de multiples troubles du développement du métabolisme et du cerveau. De même, les enfants prématurés ou atteints de troubles de la coordination qui présentent généralement une hypo-activité, de moindres interactions sociales et avec l’environnement développent de multiples troubles du neurodéveloppement (TND). Ce programme de recherche vise à étudier la remédiation précoce des TND observés dans nos 2 modèles animaux induits par un programme d’enrichissement de l’environnement pour favoriser et multiplier les interactions sociales et environnementales et des exercices physiques controlés qui contribuent au développement neuromusculaire harmonieux. L’irisine, une substance sécrétée par les muscles en exercice, favorise la neuroprotection et le développement cérébral harmonieux. Nous étudierons les effets bénéfiques potentiels de l’administration de l’irisine pour contrer l’apparition des TND dans nos 2 modèles animaux. L’irisine commence à être étudiée intensivement et nos données précliniques permettront d’étudier les effets de l’irisine chez des enfants atteints de TND qui présentent une hypo-activité physique et de faibles interactions sociales et avec l’environnement par le biais d’essais cliniques.
Procédures
Les femelles gestantes du lot 1 (hypoperfusion intra-utérine) seront soumises à une sténose des artères utérines au jour embryonnaire 17 (E17) sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, puis seront mises à mort au sevrage par anesthésie gazeuse suivie d’une dose léthale d’euthasol car non réutilisables pour d’autres gestations. Les ratons issus des femelles du lot 2 (restriction sensorimotrice) subiront une restriction de mouvements par immobilisation des pattes postérieures durant 18h par jour de la naissance au jour du sevrage (30 jours). Les femelles du lot 2 seront mises à mort après plusieurs gestations successives, de manière comparable à celles du lot 1. Les femelles gestantes et/ou allaitantes des lots 1 et 2 seront soumises à 2 diètes alimentaires (supplémentation en lactoferrine ou un régime isocalorique) durant la période prénatale ou postnatale, ou sur les 2 périodes selon le groupe expérimental. Chaque groupe expérimental de ratons des lots 1 et 2 subira après sevrage un des traitements suivants : Un enrichisssement et des exercices physiques consistant à élever une dizaine de rats du même sexe dans une grande cage où est disposée une roue d’activité, l’administration d’irisine ou de solution saline isotonique par injection intrapéritonéale, des tests comportementaux variés, tels que le test de la nage de l’âge de 14 à 28 jours, un test de locomotion acrobatique sur échelle inclinée ou automatique le lond d’un corridor (Catwalk), le test d’agrippement pour mesurer la force de préhension, le test de l’open-field dans une arène vide, le von Frey électronique pour mesurer le niveau de sensibilité tactile, le test nociceptif pour déterminer la latence de retrait lors de l’application de stimulus thermique, le test de l’elevated plus maze pour évaluer le niveau de désinhibition des animaux, le test de reconnaissance d’objets pour tester les capacités mnésiques. Chaque animal des lots 1 et 2 subira également un prélèvement sanguin à l’âge de 1 et 2 mois. Enfin à lâge de 3 mois, chaque animal subira de manière terminale une chirurgie cranienne et des muscles sous anesthésie gazeuse profonde pour effectuer ensuite des enregistrements électrophysiologiques, un dernier prélèvement sanguin, puis après mise à mort par injection léthale d’euthasol le prélèvement des tissus intestinaux, musculaires et du système nerveux. Les animaux subiront également le contrôle quotidien du poids et les manipulations correspondant aux différentes interventions citées.
Impact sur les animaux
La MIUH (hypoperfusion intra-utérine) à E17 et la restriction de mouvements lors de la SMR induisent une inflammation systémique au cours du développement, un neurodéveloppement atypique, la présence de lésions cérébrales, un retard de croissance, des troubles sensorimoteurs, locomoteurs avec une mobilité réduite, comportementaux et cognitifs, ainsi que des signes de spasticité. La spasticité correspond à des spasmes et co-contractions de muscles antagonistes, liée à une hyperréflexie ou hyperexcitabilité du réseau spinal, qui peut conduire à des douleurs. Les nuisances principales dans nos 2 modèles sont liées à la présence de spasticité (i.e. réduction de la mobilité) et un retard de croissance, que nous contrôlons régulièrement. Ce retard de croissance est compensé graduellement au cours du temps dans nos 2 modèles. La spasticité et les troubles locomoteurs, comportementaux et cognitifs perdurent chez les animaux adultes. Les traitements proposés (lactoferrine, exercices et enrichissement, administration d’irisine) dans ce projet de recherche visent à limiter l’inflammation, réduire les lésions cérébrales, améliorer le neurodéveloppement, la mobilité et la perte de poids, donc leur bien-être et limiter ainsi les nuisances induites, comme nous cherchons à effectuer chez l’enfant atteint de troubles du neurodéveloppement (TND). Nous cherchons également à évaluer l'impact de ces interventions (MIUH, SMR et supplémentations en lactoferrine) sur le microbiote intestinal, dont l'altération peut aussi conduire à des nuisances, telles qu'une dysbiose. D’autre part, les animaux subissent également de nombreuses interventions dans ce projet, comme des anesthésies, injections et prélèvements sanguins répétés ou réguliers en sous-cutané (sc) ou intrapéritonéal (ip), une supplémentation alimentaire en lactoferrine bovine ou en caséine (diète isocalorique), des tests comportementaux, le contrôle quotidien du poids, l’implantation des puces RFID, et les manipulations de l’animal correspondantes qui peuvent entraîner des nuisances et des effets indésirables, telles que du stress, une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les femelles gestantes des lots 1 et 2 (n = 110) seront mises à mort après une ou plusieurs reproductions et les 540 ratons issus de ces femelles seront soumis à partir de l'âge de 3 mois à une chirurgie avec anesthésie profonde sans réveil pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques, puis après mise à mort des prélèvements de tissus sanguins, nerveux, intestinaux et musculaires une fois la session d'enregistrements achevée pour chaque animal.
Remplacement
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en oeuvre après une une hypoxie-ischémie intra-utérine ou une restriction de mouvements au cours du développement sont proches de celui de l’humain. Ces mécanismes ne peuvent être étudiés sur des cultures cellulaires ou in silico, mais uniquement sur un modèle animal vivant, pas de remplacement possible en l’état.
Réduction
Réduire le nombre d’animaux. Autant que possible, ce sont les mêmes animaux qui sont engagés dans les différents tests sensorimoteurs et comportementaux, ainsi que dans les analyses électrophysiologiques et neuro-anatomiques des réseaux neuronaux correspondants. Le nombre d'animaux a été réduit au maximum (n = 15 animaux max. par groupe expérimental) tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisants (différences statistiquement observables entre les animaux expérimentaux, traités et les animaux contrôles). Nous chercherons notamment à réduire le nombre de femelles gestantes nécessaires à produire les ratons hypotrophes du lot 1 (hypoperfusion intra-utérine ou MIUH) et si c'est possible se limiter à 10-12 animaux par groupe lorsque les bornes de significativité sont atteintes, en utilisant des tests paramétriques (ANOVAS à mesures répétées avec 1 ou 2 facteurs indépendants) et non-paramétriques (Tests de Wilcoxon, Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney) selon la distribution des résultats.
Raffinement
Dans tous les cas, les procédures expérimentales seront réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur le bien être et les points limites. Des points limites sont établis afin de réduire toute source d'angoisse et de souffrance et d'assurer le bien être animal. Le suivi des points limites et l'observation régulière de l'état général des rats dès la naissance permettent d'arrêter à tout moment l'expérience pour éviter l'angoisse et la souffrance de l'animal (voir Annexe 2 pour les détails des observations et interventions adaptées). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, 2 à 3 animaux sont regroupés par cage pour un enrichissement social et disposent de nourriture, d’eau ad libitum et d’objets pour compléter l’enrichissement dans les conditions standard. Nous nous efforçons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés, notamment une relaxation des animaux par manipulation avant, pendant et après tout prélèvement, intervention et test comportemental. Les analgésiques et anesthésiques utilisés sont adaptés aux expérimentations et conformes à la législation en vigueur.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l’accès in vivo aux modifications d’activité neuronale dans l’encéphale et la moelle épinière dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail expérimental sur l’animal entier et vivant anesthésié. Nous utilisons des rats Sprague-Dawley jeunes et adultes, mâles et femelles car nous ne pouvons pas effectuer l'hypoperfusion intra-utérine (MIUH) chez la souris, un modèle bien trop petit et délicat, ni la restriction sensorimotrice au cours du développement chez la souris, car les souris femelles allaitantes éliminent leurs souriceaux à la suite de telles manipulations. Les rates sont bien plus conservatrices et protectrices avec leur progéniture que les souris qui tendent à éliminer plus facilement leur progéniture. D'autre part, les microchirurgies (ex: sténose par pose de micrcoils) et les enregistrements électrophysiologiques ne peuvent être conduits chez la souris, car modèle trop réduit en taille et trop fragile, comparativement au rat qui est définitivement le meilleur choix dans notre cas. Comme cette étude porte sur le neurodéveloppement structurel et fonctionnel après expérimentation prénatale (Lot 1 = MIUH: sténose jour embryonnaire 17) ou postnatale (lot 2 = SMR de la naissance au sevrage: 1 mois), nous effectuons des traitements pré- et postnataux (1 semaine avant la naissance au sevrage), des tests fonctionnels sensorimoteurs et comportementaux étalés de la naissance à l'âge adulte, des prélèvements sanguins à 1 et 2 mois, et enfin une analyse électrophysiologique finale à partir de 3 mois, suivie de prélèvements des tissus sanguin, nerveux et musculaires une fois l'animal mort.
Evaluation de l’efficacité de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’attaque thromboembolique chez le rat (acronyme : AVC-MATER-2023)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
306 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie du cou de 40 minutes pour injecter des caillots dans une artère et provoquer un accident vasculaire cérébral, suivie de traitements, de prélèvements sanguins et de tests comportementaux jusqu'au 21e jour. Le porteur indique un déficit sensorimoteur, des lésions cérébrales et des signes de paralysie, certains animaux atteignant des points limites imposant une mise à mort anticipée. Il affirme qu'il paraît "indispensable" de développer de nouveaux médicaments et écarte les méthodes in vitro ou in silico, jugées incapables de reproduire la complexité de l'AVC.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la 2ème cause de mortalité dans le monde. Environ 80% des AVC sont induits par une interruption de la circulation sanguine dans le cerveau. A l’heure actuelle, le rt-PA est le seul médicament préconisé dans cette pathologie. Toutefois, ce traitement possède de nombreuses limites : efficacité limitée et risque de complication avec aggravation des symptômes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.
Bénéfices attendus
Cette étude pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre l’AVC.
Procédures
L’ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter des caillots dans une artère pour induire l’accident vasculaire cérébral. Cet acte chirurgical durera 40 minutes sous anesthésie générale. Deux heures plus tard, sur animaux vigiles, un traitement sera administré. Avant et après chirurgie, un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s’étalant de J1 à J21 post AVC, seront réalisés pour une durée totale de 20 minutes maximum. Enfin, à la fin du projet, un ensemble d’organes sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie
Impact sur les animaux
L’hébergement en cage individuelle des animaux induits, nécessaire durant les 48h suivant la chirurgie, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture ou le cathéter nécessaire au traitement, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. Le modèle par définition reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entrainer des pertes d’équilibre, une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion et une atteinte des fonctions motrices. L’AVC est un évènement grave chez un patient et sa survie est engagée. Le modèle d’étude chez l’animal présente, lors de l’induction et durant les 48 premières heures suivant l’induction, des signes cliniques d’inconfort manifestes (paralysie). Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé et une mise à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Pour évaluer les effets de notre composé, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort 3 ou 21 jours après l’induction de l’AVC, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire l’efficacité d’un traitement dans le cadre d’une intervention visant par exemple à limiter la taille des lésions cérébrales au cours d’un AVC chez l’Homme. Le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux chez l’Homme ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Sur la base de notre expérience de ce modèle, le nombre de rats utilisé pour chaque étude est réduit au minimum et révisé à la baisse au fur et à mesure de nos expériences tout en garantissant une interprétation statistique et scientifique des résultats. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations du cerveau post-mortem. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. En effet, l’analyse des expériences passées a révélé qu’environ 10% à 20% des animaux ne se réveillent pas après la chirurgie et que 40% à 60% des animaux étaient exclus des études (intensité des troubles et des lésions cérébrales trop fortes ou trop faibles).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront 3 par cage avec des feuilles de papier absorbant comme enrichissement, auront un accès non restreint à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie, anesthésie générale, maintient de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale) ainsi qu’après. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, limitant le risque pour l’animal de rompre ses points. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle dans une pièce dédiée chauffée à 28°C jusqu’à leur réveil. Pour pallier aux problèmes liés aux signes cliniques du modèle (perte d’équilibre, faiblesse musculaire, atteinte des fonctions motrices), les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Ce gel améliore la prise en charge des rats après la chirurgie et demeure davantage accessible (placé sur le sol de la cage, contrairement aux granulés situés en hauteur). Une litière à forte granulométrie sera également utilisée pour éviter les risques d’étouffement après la chirurgie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et durant les 48h suivantes. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. La remise en cage par 3 ne sera réalisée que lorsque la récupération des animaux sera suffisante (reprise de poids après la perte attendue liée à la chirurgie. Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.
Choix des espèces
Les mécanismes et les conséquences physiologiques de l'AVC sont similaires chez le Rat et chez l’Homme. Le Rat est donc une espèce pertinente pour modéliser les AVC chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des rats mâles Wistar Han de 350-400g et des rats femelles Wistar Han de 200-225g à l’arrivée au laboratoire. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Effet d’une thérapie cellulaire sur les symptômes liés au diabète chez un modèle de diabète de type 1 induit par la streptozotocine chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On les rend diabétiques par une injection de streptozotocine, puis on leur implante par chirurgie abdominale des îlots pancréatiques encapsulés dans un polymère développé par un laboratoire partenaire. Le porteur indique que l'hébergement individuel constitue une nuisance pour ces animaux sociaux, s'ajoutant à l'état diabétique et aux douleurs post-opératoires. L'étude teste la formulation d'un laboratoire pharmaceutique client, les rats étant tués pour prélever pancréas, tissu adipeux et reins.
Objectifs
Le laboratoire pharmaceutique partenaire développe des formulations pour des composés déjà utilisés en clinique humaine dans le domaine des troubles métaboliques (obésité, diabète...) et qui permettent d'en améliorer leur biodisponibilité et leur efficacité (meilleures propriétés pharmacocinétiques) tout en améliorant la qualité de vie des patients (par amélioration de la posologie). Parmi ses axes de recherche, le laboratoire a développé des formulations sous forme de polymères permettant d'encapsuler des ilots de Langherans exogènes. Des données préliminaires, réalisées in vitro, indiquent que les polymères développés sont capables : 1) d'autoriser la détection des taux de glucose par les cellules beta des ilots de Langerhans 2) d'autoriser la sécrétion de l'insuline par ces mêmes cellules et son relargage en dehors du polymère 3) d'améliorer la survie des cellules béta transplantées, notamment par une réduction de l'action du système immunitaire de l'hôte. Le présent projet vise à tester l'impact de leurs polymères sur l'efficacité d'une thérapie cellulaire à base d'ilots de Langerhans de rat chez un modèle de rat rendu diabétique de type 1 par une administration unique de streptozotocine.
Bénéfices attendus
De nos jours, les options thérapeutiques dont nous disposons face au diabète sont relativement nombreuse. Néanmoins, une des difficultés rencontrées aujourd'hui provient du fait que les composés anti-diabétiques ne permettent pas une régulation optimale et continue de la glycémie. L'une des approches actuelles pour contourner ce problème consiste à développer des technologies se rapprochant d'un "pancréas artificiel". Les approches les plus évoluées dans ce domaine consistent en des implants d'ilots de Langerhans exogènes. Une telle approche permettrait à l'implant d'être directement sensible aux variations de glycémie de l'organisme et d'y répondre en adaptant sa sécrétion d'insuline notamment. Ces approches restent cependant pour l'heure grandement théoriques, notamment du fait de la difficulté de contourner les rejets d'implants et de la mort cellulaire au sein de ce dernier. Notre client est très actif dans ce domaine de développement et propose une approche innovante consistant à empaqueter les implants dans une formulation à base de polymères stables afin de contourner les difficultés mentionnées ci-dessus. Notre étude préclinique fait suite à une série d'études préliminaires réalisées in vitro et vise à démontrer l'efficacité de ce procédé. Si les résultats s'avèrent positifs, la solution de notre client serait testée en conditions cliniques. A terme, une telle approche pourrait fournir une option de thérapie cellulaire proche d'un "Pancréas artificiel" dans la lutte contre le diabète et améliorer considérablement la prise en charge à long terme des patients diabétiques de type 1.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Administration de Streptozotocine pour induction du diabète (administration unique). / 2) Mesures régulières de prise alimentaire et poids corporel (2/3 fois par semaine sur la durée de l'étude, sauf après administration de STZ où la mesure sera quotidienne pendant 5 jours). / 3) Chirurgie d'implantation des ilots de Langerhans enrobés (durée 20-30 minutes). / 4) Mesures de glycémie (6 mesures à l'éat nourri et 5 mesures après 5h de mises à jeun. / 5) Un test de tolérance au glucose intrapéritonéal. /5) Une mesure de composition corporelle par RMN (durée de la mesure: 2 minutes environ).
Impact sur les animaux
L'hébergement individuel, nécessaire pour des raisons scientifiques (les mesures de prise alimentaire individuelles sont des données clés de l'étude) et pratiques (les rats diabétiques ont une production d'urine extrêmement importante obligeant un change des cages tous les deux jours pour un seul animal), constitue une nuisance pour les rats qui sont des animaux sociaux. L'administration de Streptozotocine induit une destruction partielle du Pancréas et un état diabétique qui constitue une nuisance chez les animaux. La procédure implique une chirurgie abdominale pour administrer les implants qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les prélèvements sanguins, seuls ou au cours de l'IPGTT, bien que pratiqués en bout de queue et avec des volumes très limités peuvent engendrer des nuisances. Enfin, la mesure de composition corporelle, peut engendrer un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses génomiques et histologiques sur le pancréas, le tissu adipeux et les reins qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’une thérapie cellulaire basée sur l'implantation d'ilots de Langerhans sur la régulation glycémique. Notamment, la capacité de sécrétion d'insuline par l'implant et son efficacité d'action dans un organisme entier ainsi que l'impact du système immunitaire de l'hôte sur la survie des cellules beta sont des paramètres nécessaires à considérer dans le système d'étude.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de rat diabétique de type 1 et sur l'analyse des paramètres d'intérêt de la présente étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction : 1) du fait qu'environ 25-30% des animaux sont résistants à l'induction du diabète par la STZ. 2) qu'environ 5-10% des animaux sont susceptibles de sur-réagir à l'administration de STZ dans les 4 jours suivants son administration et être exclu de l'étude suite au dépassement des points limites établis. 2) des paramètres d'intérêt majeur de notre étude. Le n a ainsi été adapté de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés dans notre modèle d'étude.
Raffinement
Les animaux seront utilisés 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Ils seront hébergés dans des cages enrichies de briquettes de bois et de tube en cartons spécifiques pour rongeur. Après administration du STZ, les rats devenant diabétiques et présentant une polyurie très importante, les fond de cages et les litières seront changés tous les deux jours. Une attention particulière sera portée à l'état de remplissage des biberons du fait de l'état polydipsique des animaux diabétiques (vérification matin et soir). Après administration de STZ, et après la chirurgie d'implantation, les animaux seront observés de façon renforcée (4 visites / jour au minimum) afin de détecter tout inconfort ou toute atteinte d'un des points limite établis. Concernant la chirurgie d'implantation, celle-ci sera réalisée sur tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle des animaux et une couverture péri-opératoire par de la Buprénorphine sera mise en place (une dose avant chirurgie, une dose en fin de chirurgie et une troisième dose le soir de la chirurgie). Le nombre de prélèvements sanguins nécessaires au cours de l'étude étant nombreux, nous avons limité au minimum les volumes de prélèvements à chaque point (entre 10 et 30 µl de sang). Nous limiterons à 5h la durée de mise à jeun préalable avant les mesures de glycémie dites "à jeun" afin d'induire un minimum de perturbation aux animaux. Par ailleurs, la moitié des dosages de glycémie se feront à l'état nourri. Enfin, pendant l'intégralité de l'étude, une fiche de score de souffrance sera établie de façon quotidienne afin d'être en mesure de réagir le plus rapidement possible à toute altération de l'état de santé des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de diabète de type 1 chez le rat par administration de streptozotocine est extrêmement bien documenté dans la littérature et utilisé de façon courante dans les études précliniques visant au développement de thérapie anti-diabétiques. Par ailleurs, les ilots de Langerhans utilisés dans les implants développés par notre client sont des ilots prélevés chez le rat, justifiant de maintenir ce modèle dans notre étude. Les animaux seront livrés à un âge de 6 semaines, et recevront l'implant à l'âge de 9 semaine, soit au stade jeune adulte. Cet âge a été choisi afin de mimer au mieux la population humaine à laquelle le produit en développement sera destiné.
Evaluation de nouveaux agents d’embolisation chez le lapin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
720 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère, la majorité tués à l'issue et une soixantaine réutilisés. Ils subissent jusqu'à quatre interventions, implantation d'une tumeur au foie, embolisation d'une artère avec ou sans réveil, et des séances d'imagerie répétées jusqu'à dix fois sous anesthésie. Le porteur indique un risque de perte de mobilité voire de paralysie d'une patte, une ischémie de zones non ciblées et le développement de métastases hépatiques et pulmonaires. Il précise que beaucoup d'animaux sont tués pour ne pas atteindre les points limites ou parce qu'ils souffriraient de séquelles lourdes après des embolisations multiples, le projet testant des agents d'embolisation internes ou de partenaires.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité et la facilité d’utilisation d’agents d'embolisations divers sur différents territoires et différentes pathologies. Ce sont des produits qui peuvent être issus de la recherche interne ou de partenariats académiques ou privés.
Bénéfices attendus
L'embolisation est une pratique courante en clinique permettant une alternative à la chirurgie qui est invasive, douloureuse et parfois non réalisable. Cette procédure permet une récupération beaucoup plus rapide pour les patients et une durée d’hospitalisation plus courte. Dans ce contexte, proposer aux praticiens des solutions diverses répondant à toutes les utilisations potentiellement éligibles à l'embolisation est un problème de santé publique.
Procédures
4 procédures chirurgicales et des prélèvements sont prévus dans ce projet. - L’implantation tumorale hépatique (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois - L’embolisation artérielle sans réveil (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois mais ils peuvent avoir subi une implantation tumorale au préalable - L’embolisation artérielle avec réveil (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois mais ils peuvent avoir subi une implantation tumorale au préalable - L’imagerie Rayon X, échographique ou IRM (10, 20 et 50 minutes respectivement sous anesthésie générale). Cette procédure peut être répétée jusqu’à 10 fois mais avec des délais leur permettant de récupérer entre 2 procédures d’imagerie. Ces lapins auront tous subi une procédure d’embolisation avec réveil au préalable plus, éventuellement, une implantation tumorale. - Les prélèvements sanguins seront réalisés à l’oreille (quelques secondes en vigile) sur tous les animaux ayant eu une procédure d’embolisation avec réveil, pour les dosages de biomarqueurs ou de produit.
Impact sur les animaux
La chirurgie au niveau de l’artère fémorale peut potentiellement entrainer une perte de mobilité, voire une paralysie de la patte arrière chirurgiquée. Celle ci se produit dans de rares cas ou le catheter inséré dans l'artère fémorale bloque de façon prolongée la vascularisation collatérale de celle ci. C'est potentiellement le cas lors d'une imagerie prolongée avec injection dans le système d'imagerie. Une ouverture du plan cutané au niveau abdominal peut se produire dans les 24 heures suivants l'opération si l'animal ote accidentellement ces points de suture une fois réveillé dans sa cage. L'embolisation avec des matériaux solides (microsphères) peut atteindre des zones non ciblées et générer une petite ischémie de ces zones. L'anesthésie prolongée peut provoquer une deshydratation de l'animal. Le développement de la tumeur hépatique conduit à terme à l'apparition de métastases hépatiques et pulmonaires. Enfin, les anesthésies répétées diminuent les prises hydriques et alimentaires des lapins.
Devenir
La majorité des animaux du projet sera euthanasiée afin de ne pas atteindre les points limites pour les lapins porteurs de pathologies évolutives (tumeur) ou parce qu'une étude histologique sera nécessaire afin de déterminer les effets du traitement ou encore parce que les animaux auront eu des embolisations multiples, pour diminuer le nombre total d'animaux du projet, mais ne pouvant pas être réveillés car ils souffriraient de sequels lourds.. Certains animaux (une soixantaine) pourront être réutilisés car ils n'auront subi qu'une procédure modérée (embolisation partielle et transitoire d'un organe) et qu'un suivi sur un mois aura été fait (paramètres sanguins) pour s'assurer de l'absence d'effets secondaires.
Remplacement
La réussite d'une embolisation est dépendante de différents paramètres. Il y a tout d'abord les paramètres intrinsèques à l'agent embolisant (taille, stabilité, viscosité ...) qui seront déterminés in vitro pour faire un premier tri des molécules. En parallèle, des études sur des systèmes en flux donneront des premiers renseignements sur le pouvoir embolisant des différents produits et permettront de réduire le nombre d'agents d'embolisation à tester in vivo. Passée cette préselection, seule l’expérimentation in vivo, permettra d'évaluer l'efficacité attendue chez l'homme. En effet, il est nécessaire de prendre en compte toutes les interactions entre l'agent d'embolisation et le vaisseau comme le flux, la tortuosité des vaisseaux, les interactions avec la paroi vasculaire, les systèmes de coagulation .....
Réduction
Chaque étude évaluant un nouvel agent d’embolisation, sera composée par 2 groupes d’animaux (n= 6 animaux par groupe) : le premier groupe aura le but d’évaluer le nouvel agent d’embolisation qui sera comparé à une référence clinique (deuxième groupe). Un animal pourra être utilisé pour plusieurs indications, c'est-à-dire, l'embolisation de divers organes afin de réduire le nombre d'animaux inclus dans ce projet. Un seul groupe d’animaux contrôle sera utilisé comme référence pour tous les agents d’embolisation d’une même classe (liquide, solide …). De plus, les animaux ayant reçu des agents d'embolisation transitoire sur un seul organe (1 seul rein, un lobe de foie ....) seront réutilisés pour le même ou un autre projet. Enfin, certains animaux permettront de tester l'efficacité de plusieurs agents d'embolisation sur un territoire ou d'un seul agent sur plusieurs territoires. Le nombre de 6 animaux par groupe est nécessaire et suffisant pour réaliser des analyses statistiques et comparer ainsi le l'efficacité des traitements
Raffinement
Une prémédication avec un antidouleur de la famille des morphines est systématiquement mise en place 1 heure avant chirurgie ou embolisation avec réveil de l’animal. Pour pallier aux nuisances et effets indésirables liés à la chirurgie les mesures suivantes sont mises en place: une hydratation sous cutanée (50 mL) est réalisée avant la chirurgie ,une injection locale d'anti douleur sur le site d’incision et une injection IV d'anti coagulant sont réalisés pour compléter les mesures anti douleur et prévenir les complications post opératoires. Une couverture anti inflammatoire est également mise en place sur les 16 heures post réveil de l’animal. Les lapins subissant chirugie abdominale porteront une collette pendant 5 jours post opération pour éviter qu’ils ôtent leur suture et soient opérés de nouveau pour la refaire. De même la tablette présente en temps normal dans la cage est retirée pendant 5 jours pour ne pas gener les déplacements de l'animal porteur de collerette et éviter de frotter sur la suture. Du foin (appétant pour les lapins) et une eau gélifiée sont placés dans la cage leur permettre de récupérer plus rapidement post chirurgie. Les objets (balle, morceaux de bois) sont conservés dans la cage. Le comportement des animaux opérés et embolisés est observé par les zootechniciens chaque jour de la semaine. Les points limites ont été définis sur la perte de poids de l'animal, sa mobilité, son comportement, la taille de la tumeur pour les animaux porteurs de tumeurs hépatiques,
Choix des espèces
Le lapin a été choisi car du fait de sa taille, il répond à tous les critères permettant de réaliser l'ensemble des procédures. La mesure du flux sanguin est accessible par les méthodes non invasives (échographie, IRM) ou mini invasives (fluoroscopie) et la réalisation de l'embolisation sélective se fait comme en clinique par montée de cathéter via l'artère fémorale. C'est également le modèle le plus référencé dans la littérature. Il est donc déjà validé et cela nous permettra de comparer nos résultats à ceux des autres agents embolisants. Enfin, l'expérience acquise dans le laboratoire sur cette espèce et avec des procédures similaires permet de s'assurer la meilleure inclusion des animaux. Animaux matures de plus de 10 semaines, d'environ 3.0 kg. Les animaux doivent avoir atteint leur taille adulte pour avoir des calibres artériels suffisants pour réaliser la procédure de cathétérisation.
Etude de la dynamique mitochondriale hypothalamique dans le modèle murin Activity Based Anorexia : Rôle du microbiote intestinal
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
468 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un modèle d'anorexie par restriction de l'accès à la nourriture, puis un gavage et des injections terminales, une partie recevant des antibiotiques dans l'eau de boisson. Le porteur indique une perte de poids importante, une hyperactivité, une fatigue, une prostration et parfois une hypothermie, avec un suivi quotidien et des points limites. L'objectif est d'étudier le rôle du microbiote intestinal dans l'anorexie, les pistes thérapeutiques pour les patients restant renvoyées au long terme.
Objectifs
Ce projet vise à étudier le rôle de la dynamique mitochondriale, impliquée dans le métabolisme énergétique cellulaire, chez un modèle murin d’anorexie largement documenté à l’international et au sein du laboratoire : le modèle Activity Based Anorexia (ABA). Le deuxième objectif principal est d’évaluer le rôle du microbiote intestinal dans l’axe microbiote-intestin-cerveau sur la neuro-inflammation et la dynamique mitochondriale centrale. L’hypothalamus sera particulièrement étudié, étant un noyau majeur dans le contrôle du métabolisme énergétique et de la prise alimentaire. De plus, certains symptômes ou comorbidités chez les patients anorexiques, comme les troubles fonctionnels digestifs, l’anxiété et la dépression, participent à l’entretien de la pathologie et sont donc des freins majeurs à l’efficacité de la prise en charge et en particulier de la renutrition. Les problèmes physiopathologiques centraux tels qu’une diminution des facultés cognitives, une baisse du volume cérébrale et des anomalies de sécrétions d’hormones du métabolismes énergétiques justifient l’étude centrale chez l’animal dénutri présentant la même physiopathologie périphérique. Ce projet permettrait d’apporter de nouvelles connaissances sur la physiopathologie centrale et le rôle du microbiote intestinal pour pouvoir proposer de nouvelles pistes thérapeutiques innovante pour dépasser ces freins à la renutrition.
Bénéfices attendus
Sur le long terme, une meilleure compréhension dans le modèle ABA de l’interconnexion des facteurs du microbiote intestinal modulant la neuro-inflammation, la dynamique mitochondriale, la synthèse protéique, et l’activité physique permettrait de proposer des solutions thérapeutiques innovantes pour aider à la renutrition des patients anorexiques. Des compléments alimentaires à base de probiotiques ayant un impact positif central sur la régulation du comportement alimentaire permettrait et de limiter les troubles fonctionnels digestifs et les altérations cognitives retrouvées chez les patients. Cela permettrait idéalement de lever les freins à la renutrition présents en clinique.
Procédures
100% des animaux seront manipulés tous les jours pour la pesée. 100% des animaux subiront la procédure terminale à savoir un gavage et deux injections intrapéritonéales. 100% des animaux seront maintenus en contention 2 min pour la mesure de la composition corporelle deux fois, au début et en fin de protocole. 234 animaux recevront une injection intrapéritonéale une fois par jour 5 jours consécutifs. 78 souris auront dans leur eau de boisson un cocktail d'antibiotiques sur l'ensemble du protocole.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux seront isolés le temps du protocole, sans impact sur le score de bien-être animal mesuré. Le jeûne terminal des animaux concerné pourra entrainer un stress. Les animaux ABA, quant à eux, peuvent présenter une diminution de la prise hydrique, une hyperactivité physique anticipatoire, particulièrement les premiers jours de la limitation d’accès à l’alimentation. Ainsi, lors de l’évaluation du bien-être animal, nous pouvons généralement observer, dans ce modèle bien décrit, une fatigue des animaux (au bout de plusieurs jours de réduction du temps d’accès à l’alimentation), une prostration et, dans de rares cas une température corporelle basse des animaux, ce qui est pris en compte dans notre évaluation du bien-être pour décider des points limites adaptés. Les animaux ABA ont une perte de poids importante au cours du protocole, en accord avec ce qui est observé en clinique, cet aspect fait également l’objet d’un suivi quotidien et d’un point limite. Lors des mesures de composition corporelle, la contention de 2 minutes engendre un stress aigu.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort pour l’étude de leurs tissus à la fin du protocole et des procédures. Une utilisation conjointe sur plusieurs projets peut être envisagée, soit la récupération de tissus non utilisés lors de ce projet ou inversement sur d’autres projets ABA ne récupérant pas l’hypothalamus et/ou le cerveau complet.
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche intégré, la dénutrition étant la conséquence de relations métaboliques inter-organes complexes. Ce projet permettra d'un point de vue physiologique de visualiser l’intégration des signaux mettant en jeu des relations importantes entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau. Le recours à des modèles animaux est donc nécessaire pour prendre en compte cet aspect multi-organes. Cependant pour des études plus mécanistiques telle que l’étude des relations microbiote-cellules intestinales, nous avons recours à des techniques de culture cellulaire in vitro.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, en prenant en compte les résultats de la littérature et notre équipe, nous avons fait le choix de ne pas réaliser certains groupes contrôles comme les animaux soumis uniquement à la limitation progressive d’accès à la limitation (Rôle de la dénutrition) ou les animaux ayant un accès libre à l’alimentation et à une roue d’activité (Rôle de l’activité physique). Les analyses ont été préalablement optimisées et nous permettent de limiter le nombre d’animaux par groupe à 12.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, les animaux auront une période d’acclimatation à l’animalerie d’une semaine puis 5 jours d’acclimatation aux cages d’expérimentation. L’antibiothérapie, pour les animaux concernés, est réalisée dans l’eau de boisson et non par gavage comme fréquemment retrouvé dans la littérature, ce qui limite le stress des animaux et les risques liés au gavage. Un enrichissement par cage sera mis en place.
Choix des espèces
La souris C57Bl/6 est communément utilisée dans les modèles soumis à des interventions nutritionnelles. De plus, la souris C57Bl/6 est une souche ayant un bon taux de réponse dans le modèle ABA. C’est un modèle validé au sein du laboratoire et à l’échelle internationale. Les modèles génétiques utilisés dans ce projet sont d’ailleurs sur ce même fond génétique. En considérant une précédante publication du laboratoire sur la dynamique mitochondriale, les souris arriveront à l'animalerie pour l’expérimentation à l’âge de 8 semaines pour un protocole ABA classique. De la même manière les animaux arriveront à l’âge de 7 semaines pour les protocoles avec antibiothérapie et avec injection de tamoxifène, pour permettre ces traitements avant les 8 semaines. Cet âge correspond à un stade jeune adulte, un pic d’incidence étant observé chez l’Homme jeune adulte.
Modèle murin de remplacement trachéal par une matrice aortique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une autre opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil pour prélever un greffon d'aorte. Les souris opérées subissent une chirurgie de remplacement de la trachée par une matrice aortique de 45 minutes, avec des injections de tamoxifène cinq jours de suite pour les lignées transgéniques, et sont euthanasiées entre 7 et 90 jours après. Le porteur indique des douleurs post-opératoires, un risque d'infection et une perte de poids temporaire possibles. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise ce remplacement et retient la souris pour ses lignées génétiquement modifiées, l'ancien modèle étant la brebis.
Objectifs
La greffe trachéo-bronchique est un véritable défi chirurgical et biologique. Des échecs successifs ont été observés avec les prothèses synthétiques, les bioprothèses, les allogreffes trachéales, et les autogreffes d’organes et tissus divers. Le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle cryopréservée soutenue par une endoprothèse a été réalisé récemment chez l'Homme. Cette technique est la seule à avoir prouvé son efficacité et durabilité. Des études expérimentales chez la brebis et des applications chez l’homme ont toutes montré la formation d’un nouveau conduit respiratoire avec de l’épithélium respiratoire et du cartilage « de novo ». Le greffon aortique cryopréservé joue un rôle très important dans cette régénération car il contient des cellules viables et libère des facteurs de croissance et des cytokines diverses . Le corps humain de l’hôte est un bioréacteur qui induit, en présence de la matrice aortique, des facteurs favorisant la migration et l’activation des cellules inflammatoires et des cellules progénitrices dans le greffon. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu lors du remplacement trachéal par la matrice aortique, nous souhaitons développer un modèle murin de remplacement trachéal par l’aorte qui nous permettra d’étudier les étapes-clés du processus de régénération plus facilement que chez la brebis. Afin de déterminer l’origine cellulaire des nouveaux anneaux cartilagineux présents dans la matrice aortique, des souris double transgéniques seront utilisées pour faire du traçage de la lignée chondrocytaire. OBJECTIFS i. Mettre au point le modèle de remplacement trachéal par l’aorte ascendante chez la souris. ii. Identifier les programmes cellulaires et moléculaires intervenant dans la néochondrogenèse au sein de la matrice aortique.
Bénéfices attendus
Ce projet représente la suite des travaux de recherche concernant le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle, réalisée chez la brebis, permettant l'utilisation de la technique chez l'homme, avec la formation de nouvelles voies respiratoires. Ce nouveau projet représente une étape d’un travail de recherche essentiel qui vise à identifier les mécanismes cellulaires qui favorise la régénération et la réparation tissulaire mis en jeu lors du remplacement trachéal. La mise en évidence de ces mécanismes permettra de proposer des solutions thérapeutiques afin d’améliorer et accélérer l’apparition de nouvelles voies respiratoires après le remplacement par allogreffe artérielle.
Procédures
- prélèvement post mortem d'un greffon aortique (1 intervention, durée de l'intervention: 15 minutes, acte réalisé après euthanasie), - injection de tamoxifène pour les animaux transgéniques uniquement (1 injection/jour pendant 5 jours continus, durée de l'intervention: 20 secondes, acte réalisé après traitement analgésique) - procédure chirurgicale (1 intervention, durée de l'intervention: 45 minutes, acte réalisé après traitement analgésique et anesthésique; prise en charge analgésique au cours de la période post-opératoire, l'euthanasie des animaux opérés aura lieu de 7 à 90 jours après la procédure chirurgicale).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont le risque anesthésique, la douleur post-opératoire, une infection post-opératoire, une perte de poids temporaire au cours de la période post-chirurgicale, le stress associé à des administrations intrapéritonéales répétées de tamoxifène.
Devenir
A la fin des procédures , les 480 animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour modéliser le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle. Cette affirmation se base sur : - des discussions avec des confrères; - des conférences en pneumologie ; - une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2010-2021 dans les bases de données en utilisant es mots-clés suivants: replacement, trachea, aorta, alternatives.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les mises au point de la technique chirurgicale seront réalisées sur des souris euthanasiées, issues de surplus de colonie. Le calcul de la taille d'échantillon a été déterminé par un calcul de puissance à partir de données de la littérature. Un modèle murin de remplacement trachéal a été publié récemment en utilisant soit des trachées de souris syngéniques, soit des structures synthétiques. Cet article, unique référence existante sur ce type de modèle expérimental murin, déclare observer un taux de survie post-opératoire de 80% à 60 jours pour les greffons syngéniques. A partir de ces résultats, nous avons réalisé un calcul de puissance pour déterminer la taille des effectifs. Le nombre total d'animaux pour le projet est de 480 souris. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Avant la réalisation d'une procédure expérimentale, les souris seront maintenues en cage de 370 cm2. Les animaux seront logés en groupes sociaux stables formés de 4 individus compatibles. Il n'y aura pas de limitations en apports alimentaires et hydriques. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification et d'abri en cellulose. Afin de vérifier la profondeur de la dose d'anesthésie, les signes suivants seront vérifiés: le relachement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe palpébral, une respiration calme. Si l'un de ces signes est toujours présent 10 minutes après l'injection ou apparait avant la fin de l'intervention chirurgicale, une deuxiéme injection de produits anesthésiques sera réalisée. La douleur post-opératoire sera prise en charge par l'application locale d'analgésique au niveau de la zone opérée et par une injection sous-cutanée d'analgésique. Si besoin, celle-ci sera répétée les jours suivants la chirurgie. Les interventions chirurgicales auront lieu le matin, permettant ainsi une vérification de l'état général des animaux en post-chirurgie, en particulier en s'assurant que les animaux sont complètement sortis de l'anesthésie en fin de journée (retour de la mobilité, prise hydrique et alimentaire). Une observation journalière des animaux est réalisée (apparence physique externe, changement de comportement, réponse aux stimuli externes, courbe de poids). Les animaux seront pesés quotidiennement lors des 5 jours suivant l’acte chirurgical. Par la suite, le poids sera enregistré 3 fois par semaine. Une perte de plus de 20% du poids initial ou la perte totale de mobilité seront considérés comme des points-limites, justifiant la fin du protocole expérimental. La cicatrisation sera observée en même temps que le suivi de poids. Des signes d’inflammation seront scrutés (rougeur, gonflement). La perte des fils de suture indiquera une bonne cicatrisation.
Choix des espèces
Le modèle de remplacement trachéal chez la souris offre la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés (contrairement au modèle ovin précédemment utilisé) pour pouvoir cibler le rôle de certaines populations cellulaires et des molécules impliquées dans le processus ide néochondrogenèse et ainsi, identifier des mécanismes responsables de la régénération trachéale. Pour le modèle de remplacement trachéal, des souris adultes (8-12 semaines) seront utilisées. En pathologie humaine, la technique de remplacement trachéal s’adresse surtout aux adultes (sténoses acquises bénignes et pathologie maligne de l’arbre respiratoire).
Impact de E. coli dans la colonisation et pathogénèse de S. agalactiae
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
788 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des femelles gestantes sont inoculées par voie orale, urétrale ou vaginale, et des souriceaux nouveau-nés reçoivent une goutte de suspension bactérienne sur la région naso-buccale. Le porteur indique que l'infection au streptocoque peut provoquer chez les souriceaux une bactériémie ou une pneumonie aiguë, les animaux étant tués selon un score clinique prédéfini. Il décrit le recours à la souris comme "irremplaçable", aucun modèle in vitro ne permettant selon lui d'observer la dissémination bactérienne entre organes et de la mère aux nouveau-nés.
Objectifs
Les infections au Streptocoque du groupe B (Streptococcus agalactiae) sont une cause majeure de morbidité et de mortalité, notamment chez les femmes enceintes et les nouveau-nés. Le streptocoque du groupe B est la cause la plus fréquente d'infection néonatale. Les facteurs de risque de l’infection néonatale sont la colonisation vaginale ou rectale de la mère. L’infection néonatale à début précoce (moins de 7 jours après la naissance) est attribuée à la transmission verticale du Streptocoque par la mère, par infection ascendante à partir du tractus génital, ou lors du passage dans le canal vaginal pendant l'accouchement. Les manifestations typiques sont une bactériémie et pneumonie. L’infection tardive (7-90 jours après la naissance) est attribuée à l'acquisition horizontale. La méningite est plus fréquente dans l’infection tardive, et peut se présenter aussi sous forme de bactériémie, d'infection urinaire, de pneumonie ou d'infection d’autres sites. Escherichia coli est une bactérie intestinale commensale ubiquitaire chez l’Homme. E. coli fait partie des premières bactéries qui colonise le nouveau-né après la naissance, puis persiste dans le microbiote durant toute la vie de l’individu. E. coli peut aussi être responsable d’infections urinaires, fréquentes chez la femme. Les E. coli infectent la vessie par infection ascendante de l’arbre urinaire à partir du réservoir intestinal, ou encore à partir de la colonisation des cellules épithéliales du vagin. Des observations pilotes in vitro démontrent que E. coli produit et excrète un métabolite qui peut être utilisé par le Streptocoque de groupe B pour respirer et devenir plus virulente. Ce projet vise à étudier l’interaction entre E. coli et Streptocoque de groupe B, deux espèces bactériennes qui colonisent la mère et le nouveau-né, et comment cette co-colonisation périnatale peut influer sur la pathogénèse du Streptocoque. L’objectif du projet est de comprendre comment le métabolite produit par E. coli agit sur la dissémination et la virulence de S. agalactiae chez l’hôte gestant et chez les nouveau-nés.
Bénéfices attendus
Les infections néonatales au Streptocoque du groupe B aboutissent à une mortalité qui peut atteindre jusqu’à 10%. L'antibioprophylaxie intra-partum a réduit l'incidence des infections néonatales à début précoce, mais sans avoir un impact notable sur l'incidence de l’infection à déclenchement tardif. L'augmentation de la fréquence de la résistance aux antibiotiques a été observée. Le développement de stratégies visant à identifier les hôtes, et à traiter judicieusement et prévenir les maladies invasives est donc essentiel pour réduire la charge de ces infections. Ce projet permettra de découvrir de nouvelles pistes pour la prévention ou le traitement de cette infection néonatale grave.
Procédures
Les souris gestantes seront inoculés per os, ou via l’urètre, ou dans le vagin, avec des suspensions de bactéries d’intérêt, sous anesthésie gazeuse et avec des cathéters lubrifiés avec un gel anesthésiant. L'intervention dure une minute par animal. Des souriceaux seront inoculés avec les bactéries d’intérêt, par dépôt d’une goutte de suspension bactérienne sur la région naso-buccale (pas de gavage forcé). Cette inoculation est effectuée en moins d'une minute pour chaque animal. Des prélèvements de fèces et urine seront effectués sur les animaux adultes, par contention par un expérimentateur entrainé. Des lavages vaginaux seront effectués sous anesthésie gazeuse. Ces prélèvements sont effectués en environ une minute par animal.
Impact sur les animaux
La colonisation recto-vaginale par les deux bactéries est asymptomatique et sans conséquence pour la souris adulte. L’infection urinaire induit un inconfort au niveau de l’aine, mais aucun autre signe clinique aigüe n’est attendu. Chez le souriceau l’infection au Streptocoque, avec une bactériémie ou une pneumonie, peut induire une pathologie aigüe. Une attention particulière sera donc portée sur le suivi des animaux, qui seront euthanasiés selon un score clinique objectivé prédéterminé.
Devenir
Les animaux sont sacrifiés et les organes d'intérêt sont analysés (histologie..); ce sort est justifié par le but de l'expérimentation.
Remplacement
Des études ont été préalablement conduites in vitro ainsi que sur des cellules épithéliales en culture pour étudier l’interaction E. coli et Streptocoque B et montrent une forte interaction entre ces 2 microorganismes. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes (intestin, vagin, vessie, poumons, sepsis) et entre la mère et les nouveau-nés.
Réduction
Une attention particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. Des groupes expérimentaux de 6 à 10 animaux seront utilisés qui pourront être analysés avec des outils statistiques ANOVA et Kaplan-Meir.
Raffinement
Raffiner : Le protocole d’expérimentation est adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur. Ainsi, les injections vaginales ou trans-urétrales sont effectuées sous anesthésie gazeuse, et avec un gel lubrifiant anesthésiant. Pendant les phases infectieuses, une grille de lecture du score clinique est utilisée pour chaque animal afin de déceler au plus tôt une souffrance. L’abandon du souriceau par la mère est pris en compte dans la grille de lecture. Une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial ou une baisse de température nous conduira à l’euthanasier. Enrichir : l'enrichissement de l'environnement des animaux, essentiel à leur bien-être, sera effectué selon la réglementation en vigueur et en accord avec les pratiques de l’animalerie. Des blocs de cellulose et de cartons et des briques de bois seront rajoutées dans les cages pour satisfaire au besoin naturel de nidation et pour que les animaux puissent ronger. Des nids de polycarbonates semi-transparentes rouges seront fournies pour que les animaux puissent se cacher.
Choix des espèces
La souris est un animal modèle bien connu et maitrisé pour l’étude de la colonisation recto-vaginale, pour l’infection urinaire, et pour la colonisation périnatale des nouveau-nés. Le projet examine la colonisation de mères gestantes et de leurs souriceaux nouveau-nés. Les animaux seront donc utilisés de la naissance jusqu’à l’âge adulte.
Traitement thérapeutique in utero de la souris Moblo, un modèle d’étude de la maladie de Menkes (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester un transporteur synthétique de cuivre contre la maladie de Menkès. Les femelles reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept pendant la gestation et les mâles malades des injections jusqu'à J38 ainsi que sept tests neurocomportementaux. Le porteur décrit une mortalité importante des souriceaux à la naissance et un risque d'anévrisme aortique mortel chez les animaux non traités. Douze femelles sont tuées au vingtième jour de gestation et les mâles destinés aux analyses tués à J38, tandis que quarante femelles sont gardées pour la reproduction et des mâles surnuméraires gardés vivants pour une étude de survie.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie génétique rare au niveau du chromosome X qui a pour conséquence un déficit en cuivre dans l’ensemble de l’organisme. C’est l’incapacité du cuivre à franchir les barrières biologiques (placenta, intestin, cerveau) qui est responsable de la pathologie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants malades reste extrêmement pauvre avec des troubles graves aboutissant à un décès dans les premières années de vie. Les nanoparticules ont la capacité de franchir différentes barrières biologiques dont la barrière placentaire. Nous suivons une piste thérapeutique chez la souris porteuse de cette mutation, par l’utilisation d’un transporteur synthétique du cuivre (TSC) qui permet d’acheminer le cuivre aux organes cibles tels que le cerveau ou le placenta. Nos travaux ont montré une tolérance des souriceaux à ce traitement. Nous avons déterminé une dose et un rythme d’administration optimaux de TSC, et démontré l’amélioration des signes cliniques chez les souriceaux mâles malades traités par TSC. Néanmoins, malgré un allongement très net de l’espérance de vie et un comportement exploratoire plus alerte, nous n’avons pas corrigé les troubles squelettiques dont les malformations apparaissent au stade embryonnaire, notre traitement actuel ne démarrant qu’au 5e jour post-natal. De plus, les souriceaux mâles non traités montrent une forte mortalité à la naissance avec des ratio sexe/génotype non respectés. Les atteintes liées au déficit en cuivre apparaissent dès le stade embryonnaire. Notre projet vise à montrer qu’un traitement précoce des souris gestantes porteuses de la mutation va permettre une viabilité́ plus importante tout en corrigeant les troubles squelettiques des descendants malades. Le gène de la maladie du métabolisme du cuivre étant porté par le chromosome X, les mâles sont fortement touchés. L’étude sera donc menée sur des femelles dites hétérozygotes, i.e. porteuses d’une version mutée et d’une version non mutée du gène responsable de la maladie, et ne déclarant que peu ou pas de symptômes. Les souris mâles hémizygotes, i.e. porteuses d’un exemplaire unique du gène muté et donc souffrant de la maladie, et nées de ces femelles seront également utilisées pour réaliser les tests neurocomportementaux pour certains, tandis que les animaux surnuméraires seront traités tout au long de leur vie afin d’établir une courbe de survie pour ce modèle d’étude.
Bénéfices attendus
1) Une restauration des ratios sexe/génotype avec une diminution importante de la mortalité à la naissance 2) Une croissance squelettique normalisée pour les descendants mâles malades mais traités avec le médicament. 3) Une restauration des fonctions biologiques altérées. 4) Une restauration des fonctions cognitives principales. 5) Une amélioration de la survie.
Procédures
- Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’au 20e jour de gestation pour les femelles porteuses de la maladie mais non atteintes - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie - Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
1) Une mortalité importante à la naissance des souriceaux issus de femelles porteuses de la maladie mais non atteintes, et non traitées pendant la gestation. 2) Mort des animaux non traités ou traités par histidine-cuivre liée au risque d’anévrisme aortique. Ce point est prévisible dans la plupart des cas notamment avec une stagnation voire une perte de poids, ainsi qu’une apathie et une fébrilité (troubles de la mobilité, difficultés d’alimentation). Les études précédemment réalisées ont montré que les souriceaux recevant le TSC avaient une espérance de vie considérablement augmentée, ce qui nous permet de dire que les animaux traités ne subiront pas d’anévrisme aortique grâce au traitement administré. 3) Modification du comportement maternel pendant la gestation et à la naissance (construction du nid, gestion de la portée...) grâce au traitement.
Devenir
Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) destinées à l’étude du passage placentaire (au nombre de 12) seront mises à mort au vingtième jour de la gestation, juste avant la mise bas. Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) (40) allant jusqu’à la mise bas seront gardées en vie pour de futurs accouplements. Les descendants mâles seront gardés en vie jusqu’à J38 pour ceux destinés aux tests neurocomportementaux (40) dans le but d’effectuer les analyses biochimiques et histologiques. La descendance mâle surnuméraire (40) destinée à l’étude de survie sera gardée vie jusqu’à J100 dans le but de valider les effets bénéfiques du traitement sur la survie. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traitées avec le placebo ou l’histidinate de cuivre (traitement actuel mais inefficace de la maladie de Menkes) est comprise entre 3 et 5 semaines. Au total 132 souris seront impliquées dans ce protocole expérimental.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie, le ratio sexe/génotype dans les portées et l’amélioration de la mobilité et du comportement du souriceau porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L'étude gestationnelle portera sur 52 femelles au total reparties en 4 groupes de 3 femelles pour la validation du traitement gestationnel. La cohorte de 12 femelles porteuses saines de la mutation, sera mise à mort au 20e jour de gestation dans le but de confirmer les effets positifs potentiels du traitement au cours de la gestation. Au vu des résultats encourageants que nous avons obtenus sur nos travaux portant sur le franchissement de la barrière sang-cerveau, et partant du principe que les mécanismes biologiques régissant le transport du cuivre sont similaires au niveau du cerveau et du placenta nous pensons que le TSC franchira cette barrière placentaire. Si les résultats de dosage du cuivre confirment notre hypothèse de transport à travers le placenta, 4 autres groupes de 10 femelles porteuses saines de la mutation seront destinées à l'étude de l'impact du traitement gestationnel sur la descendance mâle. L’étude comportementale, quant à elle, portera sur 40 souris réparties en 4 groupes de 10 souris malades qui seront étudiés et mis à mort une fois les tests comportementaux terminés, à l’âge de 38 jours. La courbe de survie sera évaluée à partir d'animaux surnuméraires, selon la même distribution de 40 souris mâles supplémentaires et porteuses de la maladie. Au total 132 souris seront impliquées dans l'étude, un nombre d’animaux nécessaire pour mener à bien ce protocole expérimental et obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, l’hypothèse faite serait que grâce au traitement, les ratios sexe/génotypes devraient être restaurés et produire au moins 2 mâles mutants par portée. Un mâle sera dédié aux tests neurocomportementaux tandis que le deuxième permettra d’établir une courbe de survie nécessaire pour valider l’effet positif du traitement gestationnel.
Raffinement
Toutes les cages du protocole sont garnies d’éléments enrichissants (coton, buchettes, etc.). Ces éléments permettront notamment aux femelles gestantes de nidifier, ce qui va créer une atmosphère sécurisante pour l’ensemble des souris. Au cours des expérimentations, les souriceaux devant subir un traitement seront isolés de la mère le temps de l’expérimentation (injection et/ou tests neurocomportementaux), et la mère mise à distance, dans le but de réduire le stress maternel. A la fin de l’expérimentation, les petits seront remis rapidement dans la cage avec la mère et isolé au calme (pièce d’hébergement, sans mouvement brusque de la cage). S’agissant d’une maladie génétique, les troubles physiologiques sont présents tout au long de la vie de l’animal et il n’est pas prévu de pratiquer une analgésie qui pourrait d’une part générer un stress supplémentaire lors du traitement quotidien et d’autre part perturber fortement les tests neuro-comportementaux, rendant les résultats inexploitables. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites : isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux.
Choix des espèces
La souris ATP7Amoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. L'utilisation d'un modèle mammifère, et de souris en particuliers, permet d'étudier l'efficacité du médicament dans l'intégralité d'un organisme vivant proche de l'homme. Ce choix se justifie aussi par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins utilisés pour l'étude d'autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude de la conception jusqu’au-delà du sevrage, à J38 pour les souriceaux destinés aux études neurocomportementales et J100 pour les souriceaux surnuméraires destinés à l’étude de la survie. Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité du traitement du développement embryonnaire et ce jusqu’à l’âge adulte. Les femelles porteuses saines de la mutation seront mises en accouplement à l'âge de 3 à 5 mois, et celles qui subissent le traitement pendant la gestation seront utilisées à nouveau pour maintenir la lignée.
Effets de la chirurgie bariatrique sur l’amélioration des fonctions cardio-vasculaires, hépatiques, métaboliques et osseuses de la femelle rat obèse et sur sa descendance
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère. Des femelles rendues obèses subissent une chirurgie bariatrique classée sévère, puis elles et leur descendance passent prises de sang, scanners osseux, échographies et tests de glycémie avant d'être tuées pour prélèvement de multiples organes. L'étude évalue les effets de cette chirurgie avant la grossesse sur les mères et leurs petits. Le porteur affirme que les répercussions d'une chirurgie ne peuvent être évaluées ni sur cellules en culture ni en biobanque, "sans alternative" au recours aux animaux non-humains.
Objectifs
Ce projet continue une recherche déjà en cours afin de la poursuivre et de l'achever, au vu des retards pris durant la crise sanitaire du Covid 19. Son objectif global est d'établir, dans un modèle d'obésité induite par la nourriture grasse et sucrée chez le rat, les effets à court et long terme de la chirurgie bariatrique (ou "chirurgie de l'obésité") des mères avant leur grossesse sur leur propre santé, mais aussi sur celle de leur descendance. Nous allons ainsi: 1. Evaluer les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse sur le statut nutritionnel et métabolique (diabète et cholestérol), sur les risques cardiaques et vasculaires (hypertension, risques d'infarctus du myocarde), sur le devenir hépatique (maladie du foie gras), sur la fragilité osseuse (ostéoporose) et sur les capacités de lactation des mères. 2. Evaluer sur les mêmes paramètres les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse chez les descendants des mères opérées placés sous alimentation normale. 3. Evaluer sur les mêmes paramètres les effets de la chirurgie bariatrique réalisée avant la grossesse chez les descendants des mères opérées placés sous alimentation grasse et sucrée au sevrage, afin de rechercher des effets protecteurs ou délétères de la chirurgie bariatrique maternelle sur le développement précoce d'altérations métaboliques, cardio-vasculaires ou hépatiques. 4. Identifier des biomarqueurs de risque de l'obésité chez les descendants, et évaluer leurs modifications potentielles induite par la chirurgie bariatrique maternelle.
Bénéfices attendus
Amélioration des connaissances sur les répercussions de la chirurgie bariatrique faite avant la grossesse sur la santé globale des mères opérées, avant, pendant et après la gestation et l'allaitement. Analyse des risques potentiels induits à court et long terme chez leurs descendants, dans un environnement nutritionnellement normal ou hypercaloriqueet en prenant en compte l'existence de possibles différences en fonction du sexe, d'une susceptibilité au développement d'une obésité, d'anomalies du métabolisme du sucre et des lipides, de stéatose hépatique, d'anomalies cardiaques et vasculaires précoces, et de fragilisation osseuse. Recherche de facteurs pouvant expliquer le ou les profils à risque identifiés et de biomarqeurs de risques, pouvant être utilisés secondairement en clinique pour des stratégies de prévention primaire dans le cadre d'une médecine personnalisée. Ces résultats pourront être validés en clinique par des tests faits sur les biocollections locales, sans contrainte supplémentaires sur des animaux ou des patients.
Procédures
Les mères seront soumises à une procédure chirurgicale (une heure maximum d'intervention), dont seules les procédures de chirurgie bariatrique sont classées en procédures sévères, et à deux prises de sang, effectuées sous anesthésie générale, avec un intervalle de plus de 3 mois. Elles auront également, sur la durée totale de suivi de 8 mois, deux passages de moins de 24 heures en cage isolée pour quantifier les calories ingérées, 4 scanners osseux d'une durée de 30 minutes (test indolore, réalisé sous anesthésie générale courte), 3 échographies cardiaques de 10 minutes, 3 séries de tests de glycémies, et deux séries de prises de tension artérielle. Les descendants auront, dans les 15 jours précédant leur euthanasie, une mesure de tension artérielle, une échographie cardiaque, un scanner osseux, une mise en cage isolée de moins de 24h, une prise de sang (sous anesthésie générale), et un test de glycémies.
Impact sur les animaux
Stress induit par la mise en cage d'isolement des animaux d'une durée inférieures à 24 heures, réalisé une fois par animal, et minimisé par intégration dans la cage de petit tunnel comme objet de distraction. Douleur post-opératoire après chirurgie bariatrique durant environ 48-72 heures, avec risque de nausées, prévenus par l'administration systématique de médicaments anti-douleurs et anti-émétiques et surveillance rapprochés pluri-quotidienne des animaux dans les trois jours postopératoires. Les mesures de glycémie à la queue de l'animal occasionnent une douleur très brève initiale lors de la première ponction, non accessible à une antalgie orale ou intra-veineuse, et minimisée par le maintien de l'animal dans sa cage avec ses congénères qui permet de diminuer son stress lors de l'examen.
Devenir
Les femelles obèses opérées et leurs descendants inclus dans les groupes de suivi longitudinal seront euthanasiés pour prélèvement multi-organes afin de réaliser dessus des analyses fonctionnelles et histologiques sur les différents tissus. Ces dernières permettront de déterminer s'il existe des anomalies du tissu osseux (résistance), du coeur (facteurs favorisant les infarctus), des artères (plaques d'athérosclérose, anomalies du fonctionnement favorisant l'hypertension artérielle), de la graisse (quantification, analyse de la morphologie des cellules de graisse) et du foie (accumulation de tissus gras, fibrose, voire cellules cancéreuses).
Remplacement
Contrairement à l'effet d'une molécule, les répercussions d'une intervention chirurgicale ne peuvent pas être évaluées sur un modèle de cellules en culture ou des analyses de tissus en biobanque, et continuent donc à nécessiter l'utilisation d'animaux, sans alternative ou solution de remplacement possible.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires par groupe a été calculé par analyse statistique en amont au plus juste, portant à 12 (6 mâles et 6 femelles) le nombre d'animaux par groupe d'âge d'analyse.
Raffinement
La gestion du bien-être animal sera assurée par un habitat optimisé, et groupes de 3 à 5 individus, avec des objets de stimulation dans la cage, une surveillance clinique quotidienne, et l'utilisation de médicaments antidouleurs adaptés à tout geste potentiellement douloureux. Tous ces gestes seront limités au maximum et effectués sous anesthésie générale . Les situations non douloureuses mais stressantes seront également limitées en nombre et dans leur durée.
Choix des espèces
Contrairement à l'effet d'une molécule, les répercussions d'une intervention chirurgicale ne peuvent pas être évaluées sur un modèle de cellules en cultures, et continuent donc à nécessiter l'utilisation d'animaux, sans alternative ou solution de remplacement possible. Il a été démontré que les modèles de rongeurs pouvaient reproduire fidèlement le profil de patients avec une obésité induite et les effets de la chirurgie bariatrique. Leur rapidité d'évolution et de reproduction, en comparaison avec l'observation de cohortes humaines, devrait en outre nous permettre d'obtenir des résultats rapidement, et de mener dans les cinq ans à une bonne identification des profils des descendants à risque métabolique particulier. Les femelles rat Sprague-Dawley seront incluse dans le protocle de régime obésogène, en vue d'une chirurgie bariatrique ou sham à 7 semaines de vie, afin d'avoir un âge compatible avec un bon taux de fertilité au terme du protocole (obésité induite + chirurgie bariatrique, 10 semaines +/- 1 au total). Leurs descendants seront inclus dans le protocole de suivi longitudinal au moment du sevrage. Les mâles reproducteurs auront aux alentours de 12 semaines de vie.
Développement d’une molécule thérapeutique pour la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 722 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, la grande majorité en sévère. Génétiquement modifiées pour développer une paralysie progressive proche de la sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent des injections, une pose de minipompe par chirurgie et des tests moteurs répétés, pour tester une molécule dérivée du virus de la rage. Le porteur indique que la paralysie apparaît vers cent jours et que les souris sont mises à mort à un score neurologique de 4 ou une perte de poids de 25 %. Il affirme que le modèle murin est "le plus utilisé" pour développer de nouvelles thérapies de cette maladie.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est provoquée par une dégénérescence progressive des neurones moteurs du cerveau et de la moelle épinière qui contrôlent la contraction et le relâchement des cellules musculaires. Cette mort neuronale entraîne une atrophie des muscles qui ne sont plus stimulés et une paralysie. Une réaction inflammatoire impliquant plusieurs populations de cellules immunitaires amplifie ce processus de mort neuronale et aggrave la pathologie. Il a été démontré que cette neuroinflammation est en partie causée par une déficience des cellules régulant l’inflammation, les lymphocytes T régulateurs (Treg).Ces cellules inhibent normalement l’activité des autres cellules immunitaires. Les souris transgéniques SOD1G93A expriment plusieurs copies du gène humain SOD1 comportant la mutation G93A qui est responsable de cas familiaux de SLA chez l’homme. Ce modèle murin développe une pathologie très proche de la SLA sur le plan clinique et pathologique. Sur le plan histopathologique, une diminution progressive du nombre de neurones moteurs dans la moelle épinière est observée ainsi que des processus neuroinflammatoires. Cette lignée de souris est la référence dans le domaine de la SLA et est largement utilisée pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques. Nous souhaitons tester dans ce modèle expérimental de SLA, les propriétés neuroprotectrices et anti-inflammatoires de la biomolécule «NV», développée et brevetée par notre laboratoire. NV est un bio-peptide dérivé du virus de la rage. Notre laboratoire a montré sur des cultures de neurones que NV favorise la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones, et la repousse de ces connections après lésion. L’effet neuroprotecteur de NV a également été démontré in vivo dans un modèle murin de dégénérescence des neurones de la rétine. Par ailleurs, nous avons observé que NV possède des propriétés anti-inflammatoires par un mécanisme impliquant l’augmentation de l’expression d’une molécule immunosuppressive, PDL1 (Programmed Death PD-1 ligand). De plus, il a été montré que PDL1 était également un activateur de l’activité des cellules Treg. Ces résultats suggèrent que NV pourrait être utilisé dans la SLA à la fois pour protéger les neurones moteurs de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) et inhiber le processus neuroinflammatoire délétère (effet anti-inflammatoire).
Bénéfices attendus
La SLA est une maladie neurodégénérative qui détruit graduellement les motoneurones induisant une paralysie musculaire progressive et qui devient rapidement létale lorsque les muscles respiratoires sont touchés. Les traitements actuellement disponibles se limitent à deux molécules qui ne prolongent que de quelques mois la vie des patients. Dans ce contexte, de nouvelles molécules sont activement recherchées et plusieurs essais cliniques suivant de nouvelles approches thérapeutiques sont actuellement en cours. NV, une nouvelle molécule qui pourrait à la fois stimuler la survie des motoneurones, ralentir leur atrophie et en même temps inhiber la neuro-inflammation retarderait le début de la paralysie létale et prolongerait la vie des patients. En traitant les symptômes communs à toutes les formes de SLA et non la cause, NV pourrait être appliquée à tous les patients atteints de SLA.
Procédures
Tout d’abord, les nuisances prévues sont liées au phénotype dommageable. A cela s’ajoute les nuisances prévues lors des procédures testant l’administration de la molécule NV directement ou vectorisées par un vecteur viral par différentes voies d’injections en liens avec les protocoles d’anesthésie et d’analgésie. Chaque animal ne sera inclus que dans une seule des procédures du projet de recherche. Par conséquent, chaque animal ne subira qu’une injection unique, quelle que soit la voie d’administration nécessitant une chirurgie ou non. Les souris seront soumises à 6 types d’interventions : anesthésie gazeuse à l’isoflurane, injection de la biomolécule ou du vecteur virale, prélèvements sanguins, intervention chirurgicale pour la pose d’une minipompe osmotique, test neurologique et test moteur. Toutes les souris subiront une anesthésie gazeuse à l’isoflurane, ponctuelle, de 3 minutes environ. Cette anesthésie gazeuse précédera soit une injection unique de la biomolécule NV ou du vecteur viral par voie intraveineuse (moins d’une minute), par voie intrathécale (moins d’une minute) ou par voie intracérébroventriculaire (moins de 5 minutes). Soit l’anesthésie gazeuse, suite à une analgésie, précédera une intervention chirurgicale d’une dizaine de minute pour la pose d’une minipompe osmotique diffusant la biomolécule NV durant au moins 4 semaines. Les souris subiront toutes un prélèvement sanguin hebdomadaire de moins d’une minute pendant 3 à 17 semaines selon les procédures. Enfin, 3 fois par semaines, les souris subiront un test neurologique et un test des capacités motrices de moins de 5 minutes chacun.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris SOD1G93A. Les souris SOD1G93A expriment plusieurs copies d’un transgène contenant le gène humain mutant SOD1 et sont le modèle animal de référence pour l’étude de la SLA. Ce modèle murin présente des signes cliniques et pathologiques en commun avec la maladie chez l’Homme tel que la perte des motoneurones, une faiblesse et une atrophie musculaire progressive avec une éventuelle paralysie allant jusqu’à la mort de l’individu. Les souris SOD1G93A développent une SLA agressive caractérisée par une paralysie progressive des membres postérieurs dès l’âge de 3 mois (90 jours) suivi d’une mort des individus à l’âge de 5 mois environ. Pas d’effets indésirables liés à la molécule NV en elle-même ne sont attendus. De même, pas d’effets indésirables liés à l’utilisation des vecteurs viraux ne sont attendus. Les potentiels effets indésirables sont liés aux interventions chirurgicales (injections intra-cérébro-ventriculaire et pose de la pompe osmotique) où il est probable qu’une infection se développe après l’intervention. Néanmoins, les mesures d’hygiène seront rigoureusement respectées afin d’éviter au maximum ces effets liés à la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. L’ euthanasie des animaux est nécessaire afin d’étudier et de comprendre le plus précisément possible les potentiels effets bénéfiques de NV au niveau immunitaire et au niveau histologique dans les tissus nerveux.
Remplacement
Au préalable de ce projet d’étude, la biomolécule NV a fait l’objet d’une sélection in vitro sur des cultures de neurones parmi plusieurs molécules candidates. Seule la molécule ayant montrée les meilleurs résultats a été retenue. Les effets bénéfiques de NV ayant été démontré sur des cultures de neurones in vitro, l’étape suivante est de tester la biomolécule NV dans un modèle in vivo. Cette étape est nécessaire pour savoir si les effets de NV sont effectivement bénéfiques dans un modèle murin de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), De plus, l’utilisation d’un modèle animal est une étape cruciale et déterminante pour évaluer efficacement le potentiel thérapeutique de la biomolécule NV avant de la tester chez des patients atteints de SLA.
Réduction
La lignée SOD1G93A a été historiquement utilisée sur un fonds génétique mixte. Nous utiliserons dans ce projet les souris SOD1G93A sur un fonds pur C57BL/6 ce qui limitera la variabilité phénotypique et ainsi le nombre d’individus requis dans les différentes procédures. Pour réduire le nombre d’animaux, une seule molécule thérapeutique sera testée in vivo. Le nombre d’animaux requis pour pouvoir démontrer l’efficacité de NV dans le modèle SOD1G93A a été calculé par des tests de puissance statistique à partir de données publiées dans la littérature sur le phénotype des souris SOD1G93A.
Raffinement
Les techniques de chirurgie nécessaires à la réalisation du projet (injections intracérébroventriculaires, pose de minipompe osmotique) seront acquises auprès d’un laboratoire de référence. Les animaux recevront des antalgiques avant et après chirurgie. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 5-7 jours suivant les chirurgies, puis bihebdomadaire. La douleur et le stress seront mesurés selon une grille d’évaluation mise en place en partenariat avec la structure responsable du bien-être animal encadrant notre laboratoire. Les souris SOD1G93A développent de façon spontanée une paralysie progressive à partir de 100 jours. La progression de la pathologie musculaire sera évaluée deux fois par semaine à partir de 80 jours à l’aide d’un système de score neurologique de référence.. A partir d’un score de 2 les souris seront suivies quotidiennement. Le poids sera mesuré deux fois par semaine. A un score neurologique de 4, une immobilité > 24h ou une perte de poids > 25%, les animaux seront mis à mort
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris car son génome est facilement modifiable et permet d’établir des lignées transgéniques. Le modèle souris SOD1G93A développe une pathologie très proche de la SLA humaine et est le modèle le plus utilisé pour développer de nouvelles thérapies. Nous utiliserons à la fois des nouveau-nés et des souris adultes pour administrer les AAV-NVs. Chez les nouveau-nés, l’administration d’AAV permet de cibler un plus grand nombre de neurones que chez l’adulte. En effet les barrières hématoencéphaliques et la barrière liquide céphalorachidien/cerveau sont plus perméables chez le nouveau-né et permettent un meilleur accès des AAVs au système nerveux central. L’expression du transgène par les neurones et ensuite stable tout au long de la vie de l’animal. Ces expériences nous permettront de réaliser une preuve de concept de l’efficacité de NV lorsque la molécule est exprimée avant le développement de la maladie. L’administration chez les adultes permettra de déterminer l’effet thérapeutique de la molécule NV lorsque la pathologie est déjà présente.