Procédures sévères

16 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 13 tuées à l'issue et 3 rendues à l'élevage après un simple prélèvement de moelle. Les brebis opérées subissent sous anesthésie une ponction de moelle osseuse, l'implantation d'un dispositif dans le genou et des IRM, avant l'euthanasie pour prélever les condyles. Le porteur justifie l'augmentation des effectifs par le risque qu'un incident sur un seul animal "compromette le résultat de l'ensemble de l'étude". Il affirme qu'il n'y a "pas d'alternative non animale" pour étudier le cartilage articulaire et que le passage sur animal vivant est "indispensable".

Objectifs

Les pathologies ostéo-articulaires sont aujourd’hui un problème de santé publique dont la prévalence augmente avec l’augmentation de l’âge de la population avec plus de 10 millions personnes qui souffrent de l’arthrose en France aujourd’hui . Actuellement, les possibilités thérapeutiques proposées chez l’homme ne permettent pas de régénérer un tissu cartilagineux articulaire normal, et de ce fait, sont incapables de restaurer la fonction de l’articulation. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité de ce biomatériau en termes de régénération tissulaire et avons également confirmé ces résultats après implantation chez le petit rongeur. Une étude in vitro réalisée sur le modèle ovin a permis de montrer l'efficacité de notre implant associé une autogreffe de cellules souches mésenchymateuses autologues pour la régénération de lésions ostéocartilagineuses. Dans l’étude actuelle, nous souhaitons confirmer ces résultats chez la brebis, en utilisant le même modèle d’étude que précédemment pour la régénération cartilagineuse avec comme différence l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) allogéniques de brebis et d’une membrane déposée en superficie du matériau composite utilisé dans l’étude précédente, au niveau de lésions intra-articulaires du genou. Nous avons développé des biomatériaux résorbables hybrides dans le but de régénérer à la fois le tissu ostéochondral mais également le cartilage articulaire. Ces matériaux sont d’une part nanofibreux et équipés de nanoréservoir contenant de l’hydroxyapatite, pour régénérer l’os sous-chondral et d’autre part, ils sont recouverts d’un hydrogel d’alginate contenant des CSM allogéniques pour la réparation du cartilage articulaire en surface. Une couche superficielle supplémentaire nanofibreuse contenant de la chondroitine sulfate et de l’acide hyaluronique vient recouvrir l’ensemble du biomatériel dans certains groupes à tester. L’hypothèse est que les données apportées par cette étude nous permettrons ainsi de confirmer le potentiel de réparation ostéo-chondrale de ces biomatériaux associés à des CSM allogèniques. L’objectif de cette étude sera d’évaluer l’efficacité sur la régénération du cartilage articulaire de ces implants hybrides.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court terme est la validation de l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans la réparation des lesions du cartlilage articulaire chez la brebis. Ce travail fera l’objet d’une publication. Le bénéfice à long terme concerne essentiellement l’être humain. Le but est de traiter les lésions cartilagineuses pour éviter qu’elles aboutissent à une arthrose évoluée nécessitant une intervention de type prothèse. Ce serait un bénéfice (une économie) en termes de coût de la santé. Il est nécessaire de tester cette hypothèse sur un modèle gros animal avant de proposer ce type de traitement chez l’être humain (principe de précaution) car les tests sur des petits animaux ne sont pas transposables pour des raisons évidentes de taille, d’anatomie et donc de contraintes mécaniques. Les principaux avantages de l’utilisation de cellules allogéniques par rapport aux cellules autologues sont : a/ d’éviter le prélévement de moelle osseuse 2 à 3 semaines avant l’intervention sur le cartilage b/ de pouvoir administrer un nombre connu à l’avance de cellules.

Procédures

Il n'est pas prévu de prélèvement sur animaux vigiles. Tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. 3 procédures seront utilisées .1. ponction de moelle osseuse (5 min). 2. intervention pour implantation du dispositi (45 min). 3. IRM (3 x15 min)

Impact sur les animaux

Une intervention sur les genoux et douleur post-opératoire au niveau des genoux opérés, traitée par antalgiques adaptés. Tout geste sur une articulation peut entraîner des complications : -Anesthésiques : difficultés à l’intubation, troubles du rythme cardiaque etc … Moyens mis en œuvre = surveillance permanente de l’animal -Per-opératoires : pas de complications per-operatoires prévisibles car - pas de risque de hémorragique puisqu’on est à distance des gros vaisseaux qui sont à la face postérieure du genou. L’hémostase des petits vaisseaux sera faite au bistouri électrique et la brebis n’est pas sous anticoagulant. - Pas de risque de fracture car aucune contrainte sur l’os, seul un geste sur le cartilage - Post-opératoires : comme pour tout geste chirurgical sur une articulation les risques sont : - Une douleur post-opératoire, qui n’est pas certaine mais dont la présence sera détectée par l’observation de l’animal - Un retard de cicatrisation : surveillance quotidienne - Infection : surveillance quotidienne et geste chirurgicale adapté si nécessaire ou euthanasie Déambulation libre en box de 3,5 m x 3,5 m pendant la période de cicactrisation puis jusqu’au 6ème mois, Déambulation quotidienne sur un périmétre plus large.

Devenir

Les 3 brebis prévues pour le prélèvement de moelle osseuse, pourront être replacées dans l’élevage. Ce prélèvement ne modifie en rien leur état. Les 7 brebis opérées devront être euthanasiées pour pouvoir prélever les condyles en vue de l’analyse des implants et de leur effets sur la régénération du cartilage, ainsi que les 6 brebis surnuméraires (3 déjà autorisées, et 3 demandées dans cet avenant).

Remplacement

Ce protocole d’étude respecte la règle des trois R de l’expérimentation animale (Replacement, Reduction, Refinement) grâce à la possibilité d’imagerie non invasive de l’IRM qui permet de suivre l’évolution des lésions sans avoir à faire de prélèvement chez l’animal. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques évite une anesthésie supplémentaire car il n’est plus nécessaire de prélever de moelle osseuse autologue. Il n’y a pas d’alternative non animale pour étudier le cartilage articulaire. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité des implants 3D des chondro-, ostéo-inducteurs et des CSM en termes de régénération ostéochondrale. La principale limite des études-in vitro est l’absence de contrainte biomécanique et son effet sur l’implant et la cicatrisation. Le passage sur animal vivant est ensuite indispensable pour valider notre approche. Il n’est actuellement pas légal de tester chez l’homme une technique innovante sans l’avoir testé chez l’animal quand cela est possible (principe de précaution)

Réduction

Une première étude a été faite sur ce même schéma avec 4 brebis mais en utilisant des CSM autologues, confirmant leur utilité dans la réparation des lésions cartilagineuses.

Raffinement

Dans le protocole actuel le même schéma est reproduit avec comme différence l’utilisation des CSM allogéniques et dans un des groupes une membrane superficielle sensée améliorer la cicatrisation du cartilage. Les 4 brebis de la première étude (opérées des 2 genoux) ont pu être toutes suivies jusqu’au terme de l’expérimentation, ce qui a permis de valider le concept de l’implant utilisé. Cependant sur un aussi petit effectif un incident (problème à l’anesthésie, mauvaise récupération post-opératoire, infection du site opératoire) la perte d’un seul animal peut compromettre le résultat de l’ensemble de l’étude et donc finalement avoir inclus inutilement les autres animaux. Pour pallier cela et augmenter les chances d’atteindre les objectifs scientifiques il est prévu d’augmenter le nombre d’animaux à 7 brebis minimum pour pallier aux éventuels incidents rendant inexploitable une implantation chez l’un des animaux. 3 brebis supplémentaires ont déjà été autorisées afin de comparer l’efficacité des cellules allogénique du premier groupe aux cellules autologues de ce nouveau groupe. 3 de plus font l'objet de cet avenant, afin de tester le même implant avec des cellules autologues (provenant des 3 brebis de l’avenant d’octobre 2022) et allogéniques sur 6 brebis (les 3 brebis ayant fourni les cellules, et 3 brebis supplémentaires faisant l’objet de cet avenant) en induisant l'arthrose à l'aide d'une curette. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante, difficulté à se déplacer ; - Fièvre, abattement, polynée en cas d’infection post opératoire.

Choix des espèces

La brebis est le modèle gros animal reconnu pour l’étude de l’arthrose. Les brebis agées de 2 à 4 ans sont le modèle animal utilisé habituellement dans les autres études sur le cartilage. Pour ne pas induire une variable supplémentaire par rapport aux études existantes il a été décidé de conserver ce sexe et cette tranche d’age .

85 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une tumeur cérébrale leur est injectée, suivie pour la plupart d'une chirurgie d'ablation partielle et, pour certaines, de séances de radiothérapie, sous imagerie et anesthésies répétées. Le porteur indique que la tumeur provoque des effets délétères non réversibles et que toutes les souris atteignent des points limites entraînant leur mise à mort. L'objectif déclaré est de reproduire le glioblastome opéré pour étudier la combinaison de radiothérapie et de chimiothérapie après chirurgie.

Objectifs

Nos projets de recherche portent sur le développement et la validation de stratégies innovantes pour le traitement des glioblastomes, tumeurs cérébrales très agressives et de très mauvais pronostic. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner nos modèles , tant in vitro qu'in vivo afin qu'ils deviennent plus pertinents et plus représentatifs de la réalité clinique de cette pathologie. Nos modèles jusqu'à présent étaient limités car l'intervention chirurgicale pratiquée en première intention chez les patients n'était pas appliquée dans nos expérimentations. Nous sommes parvenus à mettre au point le modèle de glioblastome opéré chez la souris immunodéprimée porteuse d'une tumeur intracérébrale. Nous souhaitons donc maintenant appliquer à nos animaux, le traitement classiquement délivré aux patients (appelé "protocole de Stupp") qui combine chirurgie + radiothérapie + chimiothérapie : l'objectif est de caractériser les effets des traitements et de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la récidive tumorale.

Bénéfices attendus

L'utilisation d'un modèle de glioblastome opéré dans nos expérimentation permettra de replacer nos recherches dans un contexte thérapeutique plus représentatif de la pratique clinique. En particulier, cette étude devrait nous aider à comprendre les mécanismes induits par la radiothérapie et la chimiotherapie, lorsque celles-ci sont administrées juste après une chirurgie, et déterminer comment les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement favorisent la rechute. Au final, ces données seront essentielles pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les phénomènes de récidives.

Procédures

Tous les animaux (85) recevront une injection de cellules tumorales dans le cerveau : l'injection est réalisée une fois au début de l'étude (durée 45min) et le suivi du développement de la tumeur intracérébrale se fait par imagerie de bioluminescence 2 à 3 fois par semaine (durée de chaque examen environ 15 min). Parmi les 85 animaux prévus, 72 animaux subiront une intervention chirurgicale permettant de retirer partiellement la tumeur qui s'est développée dans le cerveau : cette chirurgie d'exérèse est réalisée une fois au milieu de l'étude (durée 45min) et les animaux sont placés après l'opération en cage individuelle pendant 4 jous pour convalescence. Pour 54 animaux : traitement par radiothérapie (chaque irradiation dure environ 5 min ; 18 animaux recevront 1 irradiation ; 18 animaux recevront 2 irradiations espacées de 72h, 18 animaux recevront 5 irradiations à raison d'1/jour pendant 5 jours consécutifs)

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine en phase péri-opératoire de l'exerèse) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux, qui se produiront de surcroit lors de la phase péri-opératoire. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire et l'augmentation du volume injecté est de l'ordre d'une dizaine de µL entre le début et la fin des expérimentations. La bioluminescence et la radiothérapie sont des protocoles rapides et nécessitent une anesthésie de 15 minutes maximum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de raffinement. Chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après la chirurgie d'exérèse pouvant conduire à un stress des souris (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet développent une tumeur qui ne peut pas être contrôlée par les traitements appliqués : la tumeur finit par provoquer l'apparition de points limites qui expliquent la mise à mort à l'issue de chaque procédure (soit 85 souris au total)

Remplacement

Dans notre contexte, le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est clairement pas possible puisque nous tentons de modéliser chez l'animal l'impact de l'ablation chirurgicale des tumeurs dans le cas de tumeur cérébrale très agresssives et de très mauvais pronostic : la chirurgie ne peut pas être réalisée sur des modèles in vitro.

Réduction

Pour deux groupes d'études, nous avons réduit le nombre d'animaux car nous avons, lors une étude préliminaire, acquis des données qui pourront être compilées avec celles acquises dans ce nouveau projet. Afin de suivre la croissance tumorale, nous utiliserons une méthode d'imagerie permettant ainsi un suivi dans le temps de chaque animal. De plus, concernant les animaux qui recevront les différentes modalités de radiothérapie, les procédures se feront de façon séquentielle, palier par palier, de la procédure d'irradiation la moins contraignante à la procédure d'irradiation la plus contraignante pour les animaux. Seules les procédures bien tolérées seront conduites.

Raffinement

Un soin tout particulier sera apporté aux animaux notamment par un suivi post-opératoire rigoureux (désinfection de la plaie, analgésie, réhydratation par injection de glucose à 37°C...). Les souffrances de l'animal seront évaluées en appliquant une grille de score adaptée aboutissant à une prise de décision adéquate, en fonction de points limite et de crières d'arrêt préalablement définis et validés pour nos protocoles. Les conditions d'hébergement et d'enrichissement garantiront les conditions de bien-être animal. Le transport des animaux se fera de façon à éviter au maximum le stress des animaux.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles souris et rats. Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de son accessibiltié et de sa facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines. Nous privilégions des souris femelles, plus dociles et moins agressives, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur crâne a une conformation très bien définie qui permet l'injection de cellules tumorales sans danger et sans difficulté.

132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour tester un traitement in utero de la maladie de Menkès. Les femelles gestantes reçoivent des injections sous-cutanées cinq jours sur sept, et les souriceaux mâles malades subissent sept tests neurocomportementaux de J3 à J38. Le porteur décrit une mortalité importante des souriceaux non traités et un risque de mort par anévrisme aortique, précédé de perte de poids et d'apathie. Douze femelles sont tuées au vingtième jour de gestation et les mâles à J38, tandis que quarante femelles sont gardées vivantes pour de futurs accouplements.

Objectifs

La maladie de Menkes est une maladie genetique rare au niveau du chromosome X qui a pour conséquence un deficit en cuivre dans l’ensemble de l’organisme. C’est l’incapacite du cuivre a franchir les barrieres biologiques (placenta, intestin, cerveau) qui est responsable de la pathologie. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir des enfants malades reste extremement pauvre avec des troubles graves aboutissant a un deces dans les premieres annees de vie. Les nanoparticules ont la capacite de franchir differentes barrieres biologiques dont la barriere placentaire. Nous suivons une piste therapeutique chez la souris porteuse de cette mutation, par l’utilisation d’un transporteur synthetique du cuivre (TSC) qui permet d’acheminer le cuivre aux organes cibles tels que le cerveau ou le placenta. Nos travaux ont montre une tolerance des souriceaux à ce traitement. Nous avons determine une dose et un rythme d’administration optimaux de TSC, et demontre l’amelioration des signes cliniques chez les souriceaux males malades traites par TSC. Neanmoins, malgre un allongement tres net de l’esperance de vie et un comportement exploratoire plus alerte, nous n’avons pas corrige les troubles squelettiques dont les malformations apparaissent au stade embryonnaire, notre traitement actuel ne demarrant qu’au 5e jour post-natal. De plus, les souriceaux males non traites montrent une forte mortalite a la naissance avec des ratio sexe/genotype non respectes. Les atteintes liees au deficit en cuivre apparaissent des le stade embryonnaire. Notre projet vise a montrer qu’un traitement precoce des souris gestantes porteuses de la mutation va permettre une viabilité plus importante tout en corrigeant les troubles squelettiques des descendants malades. Le gène de la maladie du métabolisme du cuivre étant porté par le chromosome X, les mâles sont fortement touchés. L’étude sera donc menée sur des femelles dites hétérozygotes, i.e. porteuses d’une version mutée et d’une version non mutée du gène responsable de la maladie, et ne déclarant que peu ou pas de symptômes. Les souris mâles hémizygotes, i.e. porteuses d’un exemplaire unique du gène muté et donc souffrant de la maladie, et nées de ces femelles seront également utilisées pour réaliser les tests neurocomportementaux pour certains, tandis que les animaux surnuméraires seront traités tout au long de leur vie afin d’établir une courbe de survie pour ce modèle d’étude.

Bénéfices attendus

1) Une restauration des ratios sexe/génotype avec une diminution importante de la mortalité à la naissance 2) Une croissance squelettique normalisée pour les descendants mâles malades mais traités avec le médicament. 3) Une restauration des fonctions biologiques altérées. 4) Une restauration des fonctions cognitives principales. 5) Une amélioration de la survie.

Procédures

- Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’au 20e jour de gestation pour les femelles porteuses de la maladie mais non atteintes - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie - Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.

Impact sur les animaux

1) Une mortalite importante a la naissance des souriceaux issus de femelles porteuses de la maladie mais non atteintes, et non traitees pendant la gestation. 2) Mort des animaux non traites ou traites par histidine-cuivre liee au risque d’anevrisme aortique. Ce point est previsible dans la plupart des cas notamment avec une stagnation voire une perte de poids, ainsi qu’une apathie et une febrilite (troubles de la mobilite, difficultes d’alimentation). Les études précédemment réalisées ont montré que les souriceaux recevant le TSC avaient une espérance de vie considérablement augmentée, ce qui nous permet de dire que les animaux traités ne subiront pas d’anévrisme aortique grâce au traitement administré. 3) Modification du comportement maternel pendant la gestation et a la naissance (construction du nid, gestion de la portee...) grâce au traitement.

Devenir

Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) destinées à l’étude du passage placentaire (au nombre de 12) seront mises à mort au vingtième jour de la gestation, juste avant la mise bas. Les femelles porteuses de la maladie (mais non atteintes) (40) allant jusqu’à la mise bas seront gardées en vie pour de futurs accouplements. Les descendants mâles seront gardés en vie jusqu’à J38 pour ceux destinés aux tests neurocomportementaux (40) dans le but d’effectuer les analyses biochimiques et histologiques. La descendance mâle surnuméraire (40) destinée à l’étude de survie sera gardée vie jusqu’à J100 dans le but de valider les effets bénéfiques du traitement sur la survie. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traitées avec le placebo ou l’histidinate de cuivre (traitement actuel mais inefficace de la maladie de Menkes) est comprise entre 3 et 5 semaines. Au total 132 souris seront impliquées dans ce protocole expérimental.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie, le ratio sexe/génotype dans les portées et l’amélioration de la mobilité et du comportement du souriceau porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.

Réduction

L'etude gestationnelle portera sur 52 femelles au total reparties en 4 groupes de 3 femelles pour la validation du traitement gestationnel. La cohorte de 12 femelles porteuses saines de la mutation, sera mise a mort au 20e jour de gestation dans le but de confirmer les effets positifs potentiels du traitement au cours de la gestation. Au vu des résultats encourageants que nous avons obtenus sur nos travaux portant sur le franchissement de la barrière sangcerveau, et partant du principe que les mécanismes biologiques régissant le transport du cuivre sont similaires au niveau du cerveau et du placenta nous pensons que le TSC franchira cette barrière placentaire. Si les résultats de dosage du cuivre confirment notre hypothèse de transport à travers le placenta, 4 autres groupes de 10 femelles porteuses saines de la mutation seront destinees a l'etude de l'impact du traitement gestationnel sur la descendance male. L’etude comportementale, quant a elle, portera sur 40 souris reparties en 4 groupes de 10 souris malades qui seront etudiés et mis a mort une fois les tests comportementaux termines, a l’age de 38 jours. La courbe de survie sera évaluée à partir d'animaux surnuméraires, selon la même distribution de 40 souris mâles supplémentaires et porteuses de la maladie. Au total 132 souris seront impliquées dans l'étude, un nombre d’animaux necessaire pour mener a bien ce protocole expérimental et obtenir une puissance statistique suffisante. De plus, l’hypothèse faite serait que grâce au traitement, les ratios sexe/génotypes devraient être restaurés et produire au moins 2 mâles mutants par portée. Un mâle sera dédié aux tests neurocomportementaux tandis que le deuxième permettra d’établir une courbe de survie nécessaire pour valider l’effet positif du traitement gestationnel.

Raffinement

Toutes les cages du protocole sont garnies d’éléments enrichissants (coton, buchettes, etc.). Ces éléments permettront notamment aux femelles gestantes de nidifier, ce qui va créer une atmosphère sécurisante pour l’ensemble des souris. Au cours des expérimentations, les souriceaux devant subir un traitement seront isolés de la mère le temps de l’expérimentation (injection et/ou tests neurocomportementaux), et la mère mise à distance, dans le but de réduire le stress maternel. A la fin de l’expérimentation, les petits seront remis rapidement dans la cage avec la mère et isolé au calme (pièce d’hébergement, sans mouvement brusque de la cage). S’agissant d’une maladie génétique, les troubles physiologiques sont présents tout au long de la vie de l’animal et il n’est pas prévu de pratiquer une analgésie qui pourrait d’une part générer un stress supplémentaire lors du traitement quotidien et d’autre part perturber fortement les tests neuro-comportementaux, rendant les résultats inexploitables. Une procedure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : differents elements visuels chez l’animal sont evalues afin d’etablir un score qui permet d’anticiper et d’eviter d’atteindre les points limites : isolement, yeux fermes, dos voute, poils herisses, immobilite, perte de poids, yeux et abdomen creux.

Choix des espèces

La souris ATP7Amoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant une étude de cette pathologie génétique. L'utilisation d'un modèle mammifère, et de souris en particuliers, permet d'étudier l'efficacité du médicament dans l'intégralité d'un organisme vivant proche de l'homme. Ce choix se justifie aussi par la possibilité de faire des liens avec d’autres modèles transgéniques murins utilisés pour l'étude d'autres maladies métaboliques. Nous focaliserons l’étude de la conception jusqu’au-delà du sevrage, à J38 pour les souriceaux destinés aux études neurocomportementales et J100 pour les souriceaux surnuméraires destinés à l’étude de la survie. Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité du traitement du développement embryonnaire et ce jusqu’à l’âge adulte. Les femelles porteuses saines de la mutation seront mises en accouplement à l'âge de 3 à 5 mois, et celles qui subissent le traitement pendant la gestation seront utilisées à nouveau pour maintenir la lignée.

216 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, les mères réutilisées et tous les nouveau-nés tués jusqu'à l'âge de trois ans. Les nouveau-nés sont infectés par le virus respiratoire syncytial et le SARS-CoV-2, leur microbiote perturbé par des antibiotiques, et subissent jusqu'à trente prélèvements sanguins par an, dix-sept lavages broncho-alvéolaires et dix ponctions de moelle osseuse. Le porteur étudie l'effet du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né, en s'appuyant sur l'impossibilité éthique de telles expériences chez l'enfant humain. Il affirme que seul le primate non-humain présente une proximité suffisante avec l'humain pour ce type d'étude.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’explorer le rôle du microbiote dans l’immunité, dès la naissance, et d’anticiper les effets délétères causés par son altération (dysbiose) précoce, dans le cas notamment des infections respiratoires virales chez l’enfant. Le système immunitaire est immature à la naissance et se développe dans les premières années de vie par interaction avec l’environnement. Le microbiote intestinal, qui regroupe l’ensemble des micro-organismes qui peuplent nos intestins, est acquis principalement lors de l’accouchement par voie basse puis via le lait maternel. Il interagit avec le système immunitaire au travers des composés issus de son métabolisme, les métabolites, et des cytokines produites par les cellules immunitaires. Le microbiote est indispensable au rôle de barrière des muqueuses et pour l’apprentissage de l’immunité locale, en régulant la reconnaissance des espèces pathogènes ou non et en assurant ainsi l’homéostasie locale. La littérature montre qu’une dysbiose perturbe les capacités du système immunitaire à faire face à une infection. Or ce microbiote peut être facilement fragilisé, notamment par l’utilisation d’antibiotiques, pratique courante en pédiatrie. Même s’il se reconstitue, les effets à court et à long terme de cette fragilisation transitoire restent mal compris. Notre hypothèse est que cette perturbation chez le nouveau-né peut-être responsable de la sévérité observée de certaines pathologies respiratoires de la petite enfance. Comprendre le rôle du microbiote paraît donc déterminant pour appréhender ces situations et envisager des stratégies thérapeutiques pertinentes adaptées. Dans ce projet nous nous intéressons à différents virus ayant un profil pathologique propre à l’enfant. C’est le cas du virus respiratoire syncytial (VRS), principal responsable de bronchiolites aigües, et du virus SARS-CoV-2 de la COVID-19, dont les présentations cliniques sont différentes de ce que l’on observe chez l’adulte, pouvant être sévères (infection VRS) ou asymptomatiques (SARS-CoV-2). L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né primate non-humain à une infection virale. Nous comparerons des microbiotes altérés ou non par une antibiothérapie dans les premiers jours de vie, sur des animaux nés par voie basse et allaités. Nous évaluerons des stratégies thérapeutiques basées soit sur la vaccination maternelle, soit sur une intervention néonatale (vaccin ou traitement probiotique).

Bénéfices attendus

Ces travaux sur le primate non-humain permettront d’approfondir les connaissances en immunité pédiatrique actuellement limitées chez le nouveau-né humain pour des raisons évidentes d’éthique, mais aussi d’accès aux différents compartiments (sang, muqueuses, moelle, poumons) et de volume disponible pour les échantillons. Le bénéfice attendu dans un premier temps est une meilleure compréhension des interactions et des mécanismes régulateurs entre système immunitaire et microbiote au cours des premiers temps de vie d’un nouveau-né, période au cours de laquelle se façonne la capacité du système immunitaire à réagir à une infection virale ainsi que sa mémoire immunitaire. En analysant ensuite l’impact d’un microbiote intact ou altéré sur la réponse immunitaire à une infection, nous espérons pouvoir anticiper les effets délétères causés par une dysbiose précoce. Et en explorant des stratégies préventives (vaccination maternelle ou néonatale, administration néonatale de probiotiques), pouvoir contrer ces effets le plus précocement possible en l’ajustant aux capacités et aux besoins spécifiques du nouveau-né. Quant aux bénéfices à long terme, notre réseau autour de l’immunité pédiatrique et nos collaborations avec des pédiatres nous permettront également de confirmer et comparer nos résultats à ce que l’on observe chez les enfants en clinique. Les nouveau-nés bénéficieront des résultats obtenus sur le modèle préclinique pour mieux appréhender et idéalement prévenir les effets délétères d’une dysbiose précoce sur la réponse immunitaire à une infection respiratoire ultérieure et éventuellement à d’autres infections ou agressions.

Procédures

Mères : - Anesthésie : 40 en moyenne. Pour chacune des interventions, durée 30min à 1h - Echographies : 2 à 3 fois avec un intervalle d’un mois entre, 30min par examen - Prélèvement de sang : une fois par semaine pendant huit semaines au cours de la gestation. Ensuite une à deux fois par mois jusqu’au sevrage. Enfin une fois par semaine pendant un mois après le sevrage. Jusqu’à 25 fois en moyenne. 5min par prélèvement - Ecouvillonnage des muqueuses aux mêmes dates que le sang. Jusqu’à 25 fois en moyenne. 10min - Lait maternel : aux mêmes dates, Jusqu’à 25 fois en moyenne. 10min par collecte - Lavage broncho-alvéolaire : sept lavages. Un pendant la gestation, puis six après la naissance avec un intervalle minimum de deux semaines entre. 20min - Ponction de moelle osseuse : cinq ponctions. Quatre ponctions à deux mois d’intervalles jusqu’au sevrage, puis un mois après sevrage. 20min - Vaccination : deux injections au cours de la gestation. 5min Nouveau-nés : - Anesthésie : entre 18 et 30 en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement, entre 15 et 30min - Contention : jusqu’à 12 fois pour certains points rapides (avec sang et écouvillons) jusqu’à 2 mois de vie maximum. - Prélèvement de sang : 2-3 fois/semaine (0-2 mois de vie), puis toutes les deux semaines (2-6 mois), toutes les trois semaines (6-12 mois), tous les mois (1-2 ans) et enfin tous les trois mois (2-3 ans). Jusqu’à 30 fois en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement. 5min par prélèvement - Ecouvillonnage des muqueuses : compartiments nasal, oropharyngé, salivaire, rectal, anal, vaginal (si femelle) et oculaire, aux mêmes dates que le sang. Jusqu’à 30 fois en moyenne la première année, puis 12 et 4 fois la deuxième et troisième année respectivement. 10min - Lavage broncho-alvéolaire : jusqu’à 17 lavages. 20min - Ponction de moelle osseuse : jusqu’à 10 ponctions. 20min - Exposition virale : une exposition. 30min - Vaccination : deux injections. 5min - Traitement antibiotique ou probiotique : administration quotidienne pendant une à quatre semaines. 20min - Imagerie in vivo : trois sessions. Moins d’une heure - Euthanasie en fin d’étude

Impact sur les animaux

Nous distinguons les effets de l’expérimentation sur le nouveau-né primate non humain des effets liés aux infections et traitements. Nous devons maîtriser la fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie afin de ne pas interférer avec la croissance du nouveau-né ni impacter la relation mère/nouveau-né. Cela peut se traduire par un impact sur la prise de poids de l’animal en croissance, à savoir une absence de prise de poids voire une perte. Sur certains points précoces, le nouveau-né sera seulement immobilisé pour ne pas risquer le rejet du petit par sa mère lié à des odeurs non reconnues ou une réactivité moindre suite à l’anesthésie, ainsi qu’une hypothermie difficile à gérer chez le nouveau-né. Ce projet repose sur notre expérience passée qui a démontré que nous pouvons suivre un schéma expérimental tel que celui décrit, sans impacter la croissance des nouveau-nés ni la relation avec les mères. Les pathogènes entraînent chez le nouveau-né des formes asymptomatiques, légères ou modérées, d’après la littérature et notre expérience. Des symptômes pourront être relevés (fièvre, baisse d’activité, lésions pulmonaires) mais sont transitoires et résolus en moyenne après deux semaines. La vaccination maternelle ou néonatale, de même que l’administration d’antibiotiques, pourront être associés à une réaction locale au site d’injection qui serait transitoire, avec érythème et gonflement, résolue en quelques jours. Enfin l’administration de probiotiques par voie orale se fera autant que possible par succion et non par gavage, en respectant les volumes préconisés. Comme il n’est pas possible d’entraîner un nouveau-né à la manipulation pour limiter le stress, une attention toute particulière sera portée aux techniques employées ainsi qu’au matériel utilisé pour être adapté au mieux aux spécificités du nouveau-né, avec du personnel spécifiquement formé et entraîné sur le modèle.

Devenir

Tous les nouveau-nés primates non-humains seront euthanasiés à des âges différents, jusqu’à l’âge de 3 ans, pour accéder aux organes et ainsi à l’analyse fine des différents compartiments d’intérêt (charge virale, populations immunitaires, microbiote, métabolites, histologie…). Les femelles primates non-humains seront sorties du projet un mois après le sevrage et pourront être réutilisées. Elles servent de contrôle des différents systèmes matures et adultes, mais il n’est pas nécessaire d’accéder aux tissus, nos données de laboratoire seront utilisées si nécessaire.

Remplacement

Ce projet nécessite l’étude du système immunitaire et du microbiote en fonctionnement, et ces systèmes intégrés et leurs interactions ne peuvent pas être reproduits in vitro. De même, reproduire in vitro des symptômes dans le cadre d’une pathologie respiratoire n’est pas possible. Dans la mesure du possible, des tests ex vivo seront réalisés en amont sur des explants de poumons par exemple, pour déterminer une souche et/ou une dose de virus adaptées à notre modèle. Le recours à l’animal reste donc indispensable. Nous utiliserons un modèle de primate non humain, le macaque cynomolgus, pour sa proximité phylogénétique avec l’Homme : il présente une forte homologie au niveau des acteurs et de l’organisation de la réponse immunitaire et vaccinale mais aussi de la composition microbiotique, contrairement à ce que l’on peut retrouver chez d’autres modèles animaux. Il sera exposé à des virus auxquels il est sensible à l’infection, aussi bien chez le jeune que chez l’adulte.

Réduction

Nous avons établi un nombre minimum d’animaux par condition afin de déterminer si les variations observées entre les différents groupes sont bien dues aux conditions expérimentales et non aux variations propres à chacun des individus. Nous avons ainsi établi des groupes avec un maximum de six animaux par groupe. Ce chiffre représente le nombre maximum d’animaux par groupe et dans certains cas il pourra être réduit pour des phases préliminaires. Par ailleurs tous les modèles auront été validés sur des animaux adultes et/ou juvéniles à la faveur d’autres projets, avant de les transposer au nouveau-né.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les jours avec une attention particulière pendant les deux premières semaines de vie. Des grilles d’évaluation permettront de suivre et détecter tout écart au bien-être animal. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure du bien-être animal. Egalement en cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’unité minimale d’hébergement des animaux sera le couple mère/enfant qui ne sera séparé qu’au-delà de l’âge minimal réglementaire de sevrage pour cette espèce afin de reformer de nouveaux groupes. Dans l’ensemble, le groupe social multifemelles et multi-nouveau-nés sera favorisé au maximum. Toute intervention sera faite sous anesthésie générale réversible pour permettre un réveil rapide des animaux, avec une anesthésie non systématique du nouveau-né lors des premières semaines de vie, lorsque la balance bénéfice/risque n’est pas favorable (risques d’hypothermie ou de rejet maternel trop importants) par rapport au temps nécessaire pour l’intervention. Enfin, toutes les techniques et analyses ont été miniaturisées afin de réduire les volumes de sang nécessaires à prélever.

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact d’une perturbation du microbiote d’un nouveau-né sur sa réponse immunitaire à une infection respiratoire, et ainsi évaluer le bénéfice de certains traitements ou vaccins sur les effets délétères liés à cette perturbation. Seuls les primates non humains présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et immunologiques, en terme de réponse immunitaire et vaccinale, suffisamment proches de l’Homme pour permettre une étude pertinente de ces phénomènes. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, qui a déjà été modèle d’infection pour nos virus d’intérêt dans des études scientifiques, et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire et du microbiote sont disponibles et maitrisés. Notre étude, qui s’intéresse à des développement in utero et néonataux, nécessite d’avoir accès à des femelles gestantes et aux nouveau-nés issus de ces gestations.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent l'ablation des glandes lacrymales pour provoquer une sécheresse oculaire douloureuse, puis l'instillation d'une solution qui active les nocicepteurs et provoque une sensation de brûlure, avec des tests nommés de sensibilité cornéenne et d'imagerie de la cornée. Le porteur veut cartographier les circuits neuronaux de la douleur oculaire chronique et le rôle de l'inflammation. Il affirme qu'une approche sur animal entier reste incontournable car ces circuits impliquent tout l'encéphale.

Objectifs

La cornée est le tissu le plus innervé de l’organisme et le générateur de douleur le plus puissant. La sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes. Elle engendre des douleurs, picotements, sensation de brûlure oculaire et sensibilité à la lumière (photophobie) avec des atteintes cornéennes. C’est une douleur chronique qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients (anxiété, dépression) et qui en fait l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Les douleurs oculaires chroniques sont les plus difficiles à traiter notamment car les circuits neuronaux et les mécanismes qui en sont à l’origine sont encore mal connus. Ce projet, en utilisant un modèle murin de sécheresse oculaire qui mime les symptômes de la pathologie humaine, a pour but de cartographier précisément les circuits neuronaux impliqués dans la douleur cornéenne. Le rôle de l’inflammation dans ces douleurs sera également évalué. Ce projet repose sur l’utilisation de souris sauvages afin de mettre en évidence les circuits cérébraux de la douleur oculaire et de souris transgéniques afin d’évaluer le rôle de l’inflammation dans ces douleurs.

Bénéfices attendus

La prise en charge de la douleur chronique oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces. Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation des circuits neuronaux de la douleur cornéenne et de permettre d’améliorer notre compréhension de ses mécanismes d’initiation et de maintien, encore largement inconnus, afin de faire le lien entre manifestations cliniques et mécanismes neurologiques fin de développer des traitements réellement efficaces.

Procédures

Les procédures expérimentales nécessitent de tester la sensibilité cornéenne au niveau basal, puis durant et après le développement de la douleur neuropathique cornéenne (CNP). Dans toutes les procédures, les animaux seront soumis à des tests de sensibilité cornéenne, imagerie de la cornée, avant puis durant et après la mise en place de la CNP. Ces tests ne durent qu’entre 1 à 5 minutes. - Test de sensibilité cornéenne : animal vigile, réalisé 3 fois (J0, J7 et J14), durée du test : 2 minutes/session - Imagerie de la cornée : animal anesthésié, réalisé à J0, 1 injection d’anesthésique et le test dure 3minutes. - Imagerie IVCM : animal anesthésié, réalisé 1 fois (J0), durée du test : 5 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l’aide de techniques non invasives (lampe à fente, biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’Homme par un ophtalmologiste sous anesthésie locale et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Le test de la sensibilité cornéenne se fera chez l’animal vigile contrairement aux études d’imagerie de la cornée qui nécessitent une ’immobilisation complète de l’anima. Ces tests seront alors pratiqués sous anesthésie générale. Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. La stimulation nociceptive cornéenne se fait par instillation d’une solution activant les nocicepteurs cornéens. L’instillation est réalisée une fois et dure 1 minute. La solution est lavée par dépôt d’une goutte de PBS. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui nécessite l’injection d’un analgésique puis d’une dose létale d’anesthésique.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. La douleur de la chirurgie d’exérèse sera contrôlée par une analgésie pré, per- et post-opératoire. Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soi un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les tests pratiqués peuvent engendrer une gêne transitoire de courte durée comme on peut le constater chez l’Homme. Le test de sensibilité chimique sera réalisé, chez l’animal éveillé, par l’instillation d’une solution contenant un alcaloïde activant les neurones nocicepteurs entrainant ainsi une sensation de douleur (brûlure) et une inflammation.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable.

Réduction

Nous utiliserons 280 animaux dans ce projet. Afin de respect la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton, maison en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 21°C et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Le taux d’humidité des cages est contrôlé. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites validés par le comité local du bien-être animal en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin de mettre à mort l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique. Les tests de la lampe à fente et l’imagerie confocale in-vivo qui peuvent induire un stress et nécessitent que l’animal soit immobile seront réalisés sous anesthésie générale légère.

Choix des espèces

Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Les animaux utilisés seront adultes (âgés de 2mois) à leur arrivée dans notre animalerie. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 7 jours. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis.