Procédures sévères

230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de tumeur du col de l'utérus, des injections d'un composé de platine et des irradiations pouvant provoquer une toxicité cutanée. Le porteur teste de nouveaux complexes radiosensibilisants ayant fait l'objet d'un brevet européen, en évoquant une valorisation industrielle et une étude de marché. Il indique que les résultats obtenus en culture cellulaire doivent être vérifiés sur un organisme vivant avant la clinique.

Objectifs

La combinaison de la chimiothérapie (à base de cisplatine) avec la radiothérapie est une stratégie habituelle dans le traitement de certains cancers. Si cette stratégie a fait ses preuves, pour certains cancers le taux de survie globale des patients reste faible, des résistances apparaissent fréquemment et le cisplatine induit des effets indésirables avec de fortes toxicités secondaires. Le projet a pour objectif de développer une nouvelle série de complexes de platine aux capacités radiosensibilisantes supérieures à celles du cisplatine. Le choix s’est porté sur le cancer du col de l’utérus pour lequel les traitements actuels restent insuffisants, en particulier avec le développement des phénomènes de résistance. Nous avons montré que ces nouveaux complexes agissent en synergie avec la radiothérapie sur différentes lignées de cellules cancéreuses du col de l’utérus (qui sont résistantes à plusieurs chimiothérapies), ce qui les distingue du cisplatine puisque celui-ci n’exerce qu’un effet additif avec la radiothérapie. De plus, certains de ces complexes exercent leur effet radiosensibilisant à des doses n’engendrant pas de toxicités, permettant de réduire ainsi la toxicité intrinsèque de chacun des deux traitements et donc d’envisager un réel bénéfice pour le traitement des patients. Nous devons maintenant apporter la preuve de concept in vivo, sur des xénogreffes de tumeur du col de l’utérus d’intérêt. Cette étude permettra de valider sur des modèles in vivo les résultats démontrés sur les lignées cellulaires. Elle a pour but de déterminer si les complexes choisis pourraient être envisagés comme de potentiels nouveaux médicaments qui, administrés en combinaison avec la radiothérapie, surmonteraient les résistances médicamenteuses acquises des cancers du col de l’utérus

Bénéfices attendus

Les expériences programmées in vivo ont pour but de valider la stratégie de combinaison radiothérapie-chimiothérapie avec de nouveaux complexes de platine sur les xénogreffes de tumeurs du col de l’utérus dérivées de patientes résistantes à plusieurs traitements chimiothérapeutiques. Ainsi, si la preuve de concept que la combinaison des deux traitements apporte, au niveau de cette étude préclinique, un effet synergique comparé aux traitements isolés, ces complexes pourraient donc être envisagés dans le cas des cancers ayant développé des résistances et être pertinents également dans le cas d’autres cancers incurables pour lesquels la combinaison chimiothérapie/ radiothérapie est déjà préconisée. Les travaux sur ces complexes innovants ont conduit au dépôt d’un brevet européen revendiquant leur synthèse et leurs propriétés radiosensibilisantes, et une extension internationale a été déposée. Cette étape permet donc d’envisager une valorisation industrielle de ces complexes A court terme, si les résultats sont positifs, nous pourront envisager de regarder leurs activités sur d’autres cancers présentant encore à l’heure actuelle une impasse thérapeutique comme les cancers de l’œsophage (programme de prématuration qui débutera en septembre 2022) A plus long terme, nous pourrons envisager, après étude de marché lors du projet de prématuration, un programme ultérieur de maturation pour l’activité radiosensibilisante d’un complexe identifié comme pertinent sur des cancers dont le traitement actuel est insuffisant, en collaboration avec un industriel afin de faire bénéficier les patients de ces avancées thérapeutiques

Procédures

Dans la première procédure visant à caractériser la radiosensibilité des modèles tumoraux, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée sur le flanc aux animaux vigiles (une fois au cours de l’expérience) (durée du geste inférieure 1 minute). Quelques jours/semaines après la greffe, les animaux vigiles seront placés dans des systèmes de contentions avant d’être exposés au niveau de la tumeur aux rayonnements ionisants. L’irradiation de la tumeur sera réalisée 1 ou 5 fois en fonction des lots expérimentaux (durée du geste inférieure 15 minutes). Dans la deuxième procédure visant à évaluer l’efficacité de la combinaison des composés avec un traitement par radiothérapie, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée sur le flanc aux animaux vigiles (une fois au cours de l’expérience) (durée du geste inférieure 1 minute). Quelques jours/semaines après la greffe, les animaux vigiles seront traités une première fois (Jour 1) avec les composés ou le véhicule en utilisant la voie d’administration retenue à l’issue des expériences préliminaires (injection directement dans l’abdomen, injection en sous-cutanée autour de la tumeur ou administration orale). Le lendemain (Jour 2), les animaux vigiles recevront le traitement de radiothérapie retenu après la réalisation de la première procédure (durée du geste inférieure 15 minutes. Le troisième jour (Jour 3) sera réalisée la deuxième injection de composé sur animaux vigiles (durée du geste inférieure 1 minute).

Impact sur les animaux

L’administration des traitements peut induire une perte de poids observée pendant 7 à 15 jours. L’inoculation de tumeur conduira au développement de tumeurs en sous-cutanée qui seront mesurées régulièrement. L’irradiation en elle-même n’est pas douloureuse mais une toxicité cutanée (dépilation, plaies) peut apparaitre pour les doses les plus élevées.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nous avons mené des études in vitro sur des cellules humaines issues de cancer de col de l’utérus afin de valider nos hypothèses. Pour l'évaluation pré-clinique des traitements, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris avant une application clinique chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini à l’aide d’outils statistiques de façon à limiter les animaux utilisés tout en s’assurant d’obtenir des résultats exploitables.

Raffinement

Conformément aux recommandations internationales, les souris seront suivies deux fois par semaine pour s’assurer de leur bien-être et les expériences seront arrêtées si un des point limite défini dans la grille de score est atteint. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux Dans le cas d’une perte de poids liée aux traitements, les animaux recevront des aliments gélifiés en première intention. Une réhydratation parentérale sera également mise en œuvre. En cas d’apparition d’une toxicité cutanée suite à l’irradiation, une crème cicatrisante sera appliquée.

Choix des espèces

La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en biologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés au stade adulte du fait que le cancer du col de l’utérus est une tumeur de l’adulte. Les souris Swiss nude et BALB/c nude arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation de 7 jours à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 8 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 20 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de glioblastome humain dans le cerveau, puis des séances de radiothérapie, des anesthésies répétées et l'administration d'un composé. Le porteur teste la combinaison de ce composé avec la chimiothérapie et la radiothérapie, en évoquant un brevet européen et une valorisation industrielle. Il affirme que le remplacement par des méthodes alternatives n'est "pas possible" pour un phénomène dépendant du statut hormonal.

Objectifs

Les gliomes constituent l'un des groupes de tumeurs cérébrales les plus fréquents chez l'adulte. La forme la plus sévère est le glioblastome dont la survie médiane n'excède pas 15 mois. Ces tumeurs touchent préférentiellement les hommes et les femmes ménopausées, suggérant un rôle protecteur des hormones féminines (œstrogènes). Des études sur des modèles de rongeurs indiquent que les œstrogènes limitent l'agressivité de la tumeur et sont bénéfiques pour la survie des patients atteints de ce type de tumeur. Cependant, aucune donnée n'est aujourd'hui disponible sur les modalités de réponses des cellules tumorales aux œstrogènes. Ceci apparait donc comme un axe de recherche majeur. Dans une étude préliminaire, nous avons analysé les données moléculaires de patients atteints de glioblastomes et identifié qu'un récepteur était justement plus présent chez les femmes qui survivent longtemps avec une tumeur cérébrale que chez les hommes qui présentent un pronostic plus sombre. In vitro, nous avons montré pour la première fois que l'activation de ce récepteur par une molécule bloque la multiplication des cellules tumorales. La combinaison de cette molécule avec le traitement de radio et chimiothérapie actuellement prescrit contre les glioblastomes conduit à un effet anticancéreux amplifié. A terme, l'utilisation de cette molécule pourrait constituer une stratégie thérapeutique nouvelle, ce que nous voulons démontrer dans une étude "in vivo" (sur modèle animal), en étudiant les réponses selon le sexe.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour proposer l'utilisation du composé étudié pour le traitement des glioblastomes. En effet, ce projet innovant permettra de mieux comprendre les processus responsables des différences de survenue des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettra d'apporter de nouvelles voies de stratégies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des agonistes (molécules interagissant avec des récepteurs membranaires) de certains récepteurs des œstrogènes dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimiosensibilisation).

Procédures

- Xenogreffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections itératives IP) : durée 15 min - Traitement par radiothérapie (6 itérations) : durée 10 min pour chaque session - Traitement par le composé +/- combiné au temozolomide (12 itérations) : durée 1 min par traitement. Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min.

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus, non réversibles. Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée. Les administrations quotidiennes du composé étudié conduisent à un dérangement journalier des animaux. Les injections intra-péritonéales répétées pourront conduire à une réaction cutanée modérée.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. Ainsi 80 souris seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 40 souris femelles et 40 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser des analyses histologiques et biochimiques pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte pas possible puisque le développement des glioblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence des hormones naturellement présentes chez les souris mâles ou femelles ...). En l'occurrence, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Des études préliminaires ont déjà été réalisées in vitro mais aussi en biologie moléculaire et ont donné des résultats très encourageants. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.

Réduction

- Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées de façon prospective, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux « satellites » mâles et femelles de chaque groupe (24 souris mâles et 24 souris femelles avec un effectif de 6 souris par groupe de traitement). Si nos hypothèses concernant l’analyse des signatures moléculaires sont vérifiées (franchissement de la BHE=barrière hémato-encéphalique (barrière agissant comme un filtre protégeant le cerveau)), alors le projet sera secondairement mené sur les souris dédiées à l’étude d’efficacité/survie (de la même façon 40 souris mâles et 40 souris femelles avec un effectif de 10 souris par groupe de traitement). En raison du nombre important de souris dans l’étude, notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Ces dernières seront ainsi constituées de représentants de chaque groupe et de chaque sexe pour éviter un biais expérimental. - Concernant le nombre de souris satellites : il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs histologiques et moléculaires. Ces types d’analyses sont très fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour mettre en lumière un effet, s’il existe. Ainsi on estime - à priori - que même si l’effet des traitements sera faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour révéler une différence significative via des tests statistiques. Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, de la même façon la comparaison se fera indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures (bioluminescence) seront réalisées en suivi de traitement. Après simulation, le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé à n = 10 pour garantir une approche statistique pertinente.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique mélange kétamine/xylazine, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post-opératoire rigoureux) puis à la suite de la xénogreffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de la fenêtre temporelle d'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger, hébergement en portoir ventilé). Quel que soit le groupe, nous ne laisserons en aucun cas les animaux mourir de mort dégradée et anticiperons cette dégradation en réalisant nous-mêmes la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles rongeurs (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 6-12 semaines au moment des greffes (22 à 30g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, développent des symptômes neurologiques et une perte de poids, puis subissent gavages et injections répétés pendant trois semaines. Le porteur teste l'inhibition de gènes et des médicaments contre ce cancer du cerveau, de nouvelles pistes thérapeutiques restant attendues. Il indique que des organoïdes remplacent une partie des tests, mais que la greffe intracrânienne reste selon lui le seul modèle des interactions tumorales.

Objectifs

L’Organisation Mondiale de Santé classifie les cancers du cerveau (ou glioblastomes) comme des tumeurs très agressives. Ils sont caractérisés par une grande diversité et une invasion importante du cerveau. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs se résume à un traitement associant la chimiothérapie et la radiothérapie. L’extraxtion partielle ou totale de la tumeur, lorsqu’elle est réalisable, améliore la survie des patients. Toutefois, malgré la lourdeur des soins, la survie des patients est aujourd’hui évaluée à environ 18 mois. L’objectif de ce projet est d’étudier dans un premier temps l’inhibition de trois gènes impliqués dans la croissance des glioblastomes. Dans un second temps, il s’agit d’étudier l’effet de médicaments sur le développement de ces tumeurs. Ces 2 approches nécessitent d’avoir recours à un modèle animal. Ce modèle consiste à injecter dans le cerveau de souris des cellules cancéreuses issues de patient ou de souris. Il est prévu de tester 16 lignées humaines afin de couvrir l’ensemble des 4 types de cancer du cerveau adulte et de l’enfant. 2 lignées de cancer murins seront testées afin d’évaluer le rôle du système immunitaire. L’étude de l’inhibition de gènes, consistera à évaluer le rôle de ces gènes dans le développement des tumeurs et donc de la survie des animaux. Pour cela un groupe de souris recevra des cellules dont l’expression du gène n’est pas modifiée, l’autre groupe des cellules dont l’expression du gène est inhibée. L’étude de l’effet de médicaments (5) sur la survie de souris greffées avec des cellules cancéreuses, consistera à comparer un groupe de souris traitées avec le médicament à un groupe de souris traitées avec un placebo.

Bénéfices attendus

Compte tenu de l’agressivité des glioblastomes, la recherche d’un nouveau traitement permettant de prolonger la survie des patients demeure une priorité. Ce projet se propose d’explorer l’intérêt du ciblage thérapeutique de différentes voies métaboliques récemment identifiées comme des acteurs importants du comportement agressif des glioblastomes. Ces travaux devraient donc fournir de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces tumeurs.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie unique de 30 minutes maximum lors de la greffe des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée en présence d’analgésie. Lors des traitements thérapeutiques (durée de trois semaines), certains animaux subiront des gavages (21 fois, 10 sec) ou des injections intrapéritonéales (21 fois, 2 sec) ou des injections intraveineuses (9 fois, 50 sec). Au cours de la mise en place du traitement thérapeutique, certains animaux recevront une anesthésie gazeuse une fois par semaine pendant un mois, pour la réalisation d’un suivi de croissance tumorale par imagerie (4 fois, 5 sec à 8 min). Ils recevront également une injection intrapéritonéale d’une molécule permettant le suivi en imagerie (4 fois, 2 sec). Des prélèvements sanguins, sous anesthésie locale, seront aussi réalisés chaque semaine (15 sec) au niveau de la queue pour mesurer la glycémie.

Impact sur les animaux

Ces animaux développeront des tumeurs avec les nuisances liées aux cellules tumorales de cancer du cerveau. Elles devraient développer comme chez l’homme des symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids. Lors des traitements (durant trois semaines), certains animaux subiront également des gavages ou injections abdominales ou intraveineuses répétées. Ces traitements pourraient entrainer un inconfort ou des inflammations.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, afin de collecter les cerveaux pour analyses.

Remplacement

L’existence de modèles cellulaires en 3 dimensions appelés organoïdes permettent de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant in vitro l’efficacité des drogues. Dans le cadre de notre projet, l’utilisation d’un modèle murins de greffe intracrânienne reste néanmoins le seul capable de modéliser finement les mécanismes et les interactions complexes qui prennent place dans une tumeur et son environnement biologique. Seuls les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales in vitro seront testées in vivo.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé des guides statistiques et des résultats préalables détaillés dans la littérature. Grâce à ces approches, nous avons déterminé que des groupes expérimentaux composés de 10 animaux permettront d’obtenir des résultats statistiquement corrects qui ne compromettront pas l’interprétation de nos résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de 4 ou 5 selon leur poids. Toutefois, en cas d’agressivité (surtout observé chez les mâles) et afin de garantir le bien-être animal et le succès de l’étude, les animaux pourraient être temporairement isolés. Les animaux sont surveillés quotidiennement afin de d’observer leur comportement, leur apparence et les signes cliniques et identifier ainsi tout signe révélateur de souffrance. Toutes les manipulations des animaux seront effectuées dans le respect du bien-être animal et avec pour objectif de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. C’est pourquoi, avant toute chirurgie, les souris recevront des analgésiques et seront anesthésiées (anesthésie générale et locale) lors de la chirurgie. Pendant, la chirurgie les souris bénéficieront d’un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle, du gel sera appliqué sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. L’administration d’analgésiques sera poursuivie pendant 48h après la greffe. Les prélèvements sanguins seront précédés d'une anesthésie locale. Pendant l’imagerie, les souris seront anesthésiées et déposées sur un plateau chauffant. Les animaux seront également suivis périodiquement et l’atteinte d’un des points limites entraînera leur mise à mort.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés dans la communauté scientifique. Dans ce contexte, les modèles de souris immunodéficientes permettront de greffer des cellules tumorales de glioblastomes de patients sans rejet. Pour les études portant sur le compartiment immunitaire, nous utiliserons des souris immunocompétentes (albinos ou pas) qui permettront la compréhension des mécanismes immunologiques prenant place suite à l’étude des traitements thérapeutiques testés. Le modèle de souris albinos facilitera notamment l’imagerie intracrânienne que nous souhaitons réaliser pour étudier l’évolution des tumeurs en réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, pour les études avec des lignées de glioblastome adulte. Pour les lignées de glioblastome pédiatriques, des souris de 3 à 4 semaines seront utilisées.

1 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de LPS provoquant un choc septique, avec chute de pression, troubles de conscience puis coma, suivie d'échographies et de prélèvements intracardiaques. Le porteur étudie le rôle d'une protéine, l'ANGPTL4, dans la fuite capillaire, l'objectif d'un traitement pour les patients restant à long terme. Il indique que des études in vitro préalables ne reproduisent pas les voies physiologiques en jeu et conclut au recours "nécessaire" au modèle animal.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 (ANGPTL4), cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de l’ANGPTL4 dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’ANGPTL4 permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique.

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront chacun une injection en intra-péritonéal (IP) de LPS (d’une durée de moins d’une minute) puis d’ANGPTL4 qui se fera soit en IP de la façon précédemment décrite, soit en intraveineuse (au niveau caudal, procédure d’une durée d’environ 3 minutes), soit par minipompes (durée d’environ 10 minutes par souris pour l’implantation de cette dernière). Ensuite, une échographie (d'une durée totale de 20 minutes) suivie d’un prélèvement intracardiaque (typiquement 1 à 2 minutes) seront réalisés sur une partie des souris. Sur une autre partie, une mesure de la pression artérielle (également d’une durée de 20 minutes) sera réalisée. Enfin, une injection prophylactique d’antalgique (buprénorphine) sera réalisée systématiquement en IP en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à l'injection de lipopolysaccharides (LPS) sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma).

Devenir

Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et l’ANGPTL4 régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le nombre d’animaux nécessaires est calculé a priori. Le dimensionnement de notre étude a été réalisé grâce à un test de puissance.

Raffinement

À des doses modérées de LPS, le choc induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques entre l’injection de LPS et le stade de coma. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, une antalgie prophylactique par une injection sous-cutanée (SC) de buprénorphine sera réalisée. Durant l’ensemble du projet, l’inconfort sera systématiquement dépisté par la « mouse grimace scale » toutes les 2h heures et complétée par le score validé par le comité éthique s’il est ≥ 2. Si ce score est ≥3 un traitement antalgique par buprénorphine sera administré par voie SC. Néanmoins, si malgré l’administration de buprénorphine, l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal à l’issue d’une intervention comme les injections de LPS (en IP, en IV ou par le système de diffusion passive), les examens d’imagerie ou simplement dans le cadre du suivi (animal prostré, tremblant, isolé ou présentant une nécrose d’un membre ou une difficulté respiratoire), l’expérience sera interrompue par dislocation cervicale sous anesthésie profonde par isoflurane. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Concernant l’étude de survie, en plus des précautions prises ci-dessus, les animaux seront davantage surveillés (3 fois/jour). Enfin, les animaux sont élevés dans les conditions usuelles d’hébergement, en groupe, validées par la structure bien-être de l’animal au sein du centre de recherche agréé. Chaque chercheur demandeur du projet APAFIS est détenteur du niveau 1 d’expérimentation animale et du diplôme de chirurgie expérimentale.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS (Syndrôme de Réponse Inflammatoire Systémique) au LPS est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de l’ANGPTL4 dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si l’ANGPTL4 peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.

4270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 4200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane, une irradiation puis une injection d'hybridomes qui provoque une accumulation de liquide et un gonflement de l'abdomen, la mise à mort se faisant par prélèvement d'un volume de fluides ne permettant pas la survie. Le porteur relie explicitement le nombre d'animaux aux "prévisions de vente" de tests de diagnostic. Il qualifie cette production in vivo d'anticorps d'"indispensable" à la santé publique tout en indiquant que les nouveaux kits passent à une production in vitro.

Objectifs

La fabrication de test de diagnostics de maladies infectieuses (telles que, le sida, les hépatites, la toxoplasmose ou les méningites bactériennes) nécessite un approvisionnement en Anticorps monoclonaux. Le principe de détection de ces kits repose sur la réaction spécifique d'antigènes viraux ou bactériens avec ces anticorps monoclonaux. Même si pour les nouveaux tests commercialisés, les Anticorps sont fabriqués "in vitro", il reste un certain nombre de produit fabriqué à base d'anticorps fabriqué "in vivo". En effet, le passage à une production "in-vitro" progresse mais il est toujours nécessaire de produire des anticorps en process "in-vivo" car nous sommes dépendants de certaines conditions : - Pour certains produits trop anciens, le passage de leurs anticorps en In-vitro est compromise par le manque de matière première biologique permettant de valider ces kits ; Si on change le type de production de l'anticorps, l'enregistrement devient alors irréalisable et par conséquent, le risque est de ne plus fournir un certain nombre de référence-produit destiné au diagnostic de maladies infectieuses (impossibilité pour le médecin d'avoir un diagnostic-patient dû à une rupture produit). C’est le cas par exemple de la trousse de détection du prion bovin pour laquelle il n’existe plus assez d’échantillons positifs pour pouvoir la revalider ce qui entrainerait un arrêt de cette trousse clé pour la détection de la maladie de la vache folle (BSE). - Difficultés d'enregistrement auprès des instances de certains pays (comme avec la Chine où les délais d'enregistrement sont de 18 à 24 mois minimum, sans pour autant être sûr d'un résultat positif). La quantité d'animaux utilisée dépend donc directement du besoin lié aux prévisions de vente des produits de diagnostic nécessaire pour le maintien de la santé publique et animale. Cependant, une politique de réduction de stock de ce type d'anticorps permet de diminuer le nombre d’animaux de façon significative. Ce projet suit les recommandations de raffinement issue de CNREEA et parues le 28 juin2017 sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la production de réactifs de diagnostic in vitro. Ces réactifs permettent de dépister des maladies infectieuses telles que, le sida, les hépatites, la toxoplasmose ou les méningites bactériennes. Ces pathologies mondiales touchent pour le sida 38.4 millions de personnes (avec 1.5 million de contaminations par an), pour les hépatites 325 millions de personnes (dont 1.3 million de décès par an et 1.7 million de nouvelles contaminations), pour la toxoplasmose 2 millions de cas en Europe. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (la souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés. Le CNREEA note qu'il n'est pas souhaitable que la production d'anticorps in vivo indispensable à la santé publique soit délocalisée dans des pays tiers où la règlementation en matière de protection animale est peu développée.

Procédures

Chaque animal subira une injection intra-péritonéale d'agent activateur de la réponse immunitaire (sous traitement analgésique), suivi 15 jours plus tard d'une irradiation à une dose modérée, suivi 7 à 15 jours plus tard d'une injection intra-péritonéale d'hybridomes entrainant la production d'anticorps en 2-4 semaines.

Impact sur les animaux

Après les étapes de pristanisation et d'irradiation, l'animal peut être amorphe associé ou non à du poil hérissé pendant 24h maximum, puis récupère complètement. La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d’ascite qui engendre un gonflement de l’abdomen de l’animal qui induit des modifications du comportement et de l'aspect de l'animal.

Devenir

Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements de fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal.

Remplacement

Dans les nouveaux produits et les nouvelles versions de produit, les anticorps utilisés sont fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro ». A titre d'exemple : (1) Kit HIV (Version 1) : 4 anticorps in-vivo // Kit HIV (Version 2) : 4 anticorps in-vitro (2) Kit Hépatite : internalisation de la production d'un anticorps qui se fera in-vitro (actuellement production in-vivo) + passage de la production in-vivo vers une production in-vitro pour 2 anticorps dans le même kit (3) KIT HIV (autre format) en cours de développement : 2 anticorps produits in-vitro La mise au point des conditions de production in vitro est longue (plusieurs mois) et les rendements sont souvent inférieurs à ceux in vivo. Les développements nécessaires pour chaque production les rendent moins efficaces en termes de mise au point et ils ne sont guère compatibles avec certaines applications comme les screening de molécules. L'utilisation d'animaux est rendue nécessaire en cas d'urgence sanitaire où la production in vitro ne peut être imposée. L'approche alternative doit être mis en œuvre en effet dès lors que la production in vitro a d'ores et déjà donné des résultats satisfaisants pour un antigène considéré dans les critères de performances définis dans la formulation du produit final, sachant qu'il peut y avoir des échecs de la production in vitro en termes de quantité ou qualité. Les anticorps monoclonaux utilisés dans les tests de diagnostics provenant de ce projet ont été développées in vivo. La qualité et les quantités annuelles requises d'anticorps purifiés sont atteintes via des cycles de production in vivo, mais tous les anticorps en développement se font en technique in vitro.

Réduction

L'aspect réduction du nombre d'animaux est traité via une politique de réduction des stocks d'anticorps. Une baisse significative du nombre de souris peut être notée en 5 ans passant d’une demande de 7800 souris / an (soit 23400 animaux faite en 2018, sur 3 ans) à 4270 souris / an pour les années suivantes (soit un total de 4270 animaux pour la durée de ce projet). La baisse du nombre d’animaux est donc de 47%. Il est à noter que pour les nouveaux kits/produits commercialisés depuis la précédente demande d'autorisation, les anticorps sont produits in vitro.

Raffinement

Le raffinement sera obtenu par application dans le plus grand respect de la recommandation (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, associé à la mise au point de procédures rigoureuses à chaque étape du projet, à leur réalisation par du personnel formé et habilité (pour l'irradiation), à la surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux, à une évaluation pré-transport des animaux, à un hébergement avec enrichissement adapté à l'espèce et à son état physiologique et à un protocole analgésique à chaque étape le permettant.

Choix des espèces

La souris possède une durée de vie courte, ce qui permet d'avoir des études de courtes durées et l'élaboration d'hypothèses sur des modèles plus complexes dont l'Homme. Le modèle souris est utilisé du fait de l'origine des hybridomes (murine). La souche de souris BALB/c est appropriée car elle se révèle excellente pour la production ultérieure in vivo d’anticorps à partir de ces hybridomes. Les animaux utilisés sont âgés au minimum de 8 semaines (souris adultes). A ce stade, les souris sont assez matures et robustes pour supporter l'injection des hybridomes sans mortalité en cours d'expérimentation.

5040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les mâles subissent des chirurgies des testicules, des laparotomies et des aspirations d'épididymes, des injections d'ADN ou d'ARN et des séances d'imagerie répétées, avant l'euthanasie pour prélever les testicules. Le porteur vise une technique de restauration de la fertilité pour les hommes atteints d'azoospermie, présentée comme un projet préclinique. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la spermatogenèse et que le recours à la souris est "incontournable".

Objectifs

L’infertilité est un problème fréquent : 1 couple sur 7 serait concerné en France. L’infertilité est définie comme étant l’incapacité à obtenir une grossesse après un an de rapports sexuels réguliers sans moyen de contraception. On estime que dans la moitié des cas, l’infertilité est d’origine masculine. Certains hommes souffrent d’une absence totale de spermatozoïdes dans leur sperme. Ce phénomène concerne environ 15 % des hommes infertiles et se nomme « azoospermie non obstructive ». À l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients souffrant d’azoospermie non obstructive, car elles nécessitent la présence de spermatozoïdes. De nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être mises en place pour ces patients. L’azoospermie non obstructive est souvent liée à des défauts au niveau d’un seul gène, ce qui entraine l’absence de la protéine normalement produite grâce à ce gène. L'objectif de ce projet est de développer de nouvelles approches pour ces hommes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales productrices de spermatozoïdes, le message génétique capable de produire cette protéine manquante: soit de l’ADN du gène manquant ; soit de l’ARNm qui code pour la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y aura pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Les molécules, ADN ou ARNm, seront injectées au niveau des testicules. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité.

Bénéfices attendus

Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de l’azoospermie non obstructive, une cause importante d’infertilité masculine.

Procédures

Les animaux sont répartis en deux procédures : -Les animaux de la première procédure PE1 (720) vont subir 3 chirurgies de 30 min sous anesthésie générale une au niveau des testicules, une laparotomie et 3 aspirations maximum au niveau des épididymes pour prélever des spermatozoïdes. Les chirurgies seront réalisées avec un intervalle de 7 jours minimum entre deux chirurgies. Ils subiront 20 séances d'imagerie sous anesthésie générale d'une durée de 10 min maximum et espacée de 7 jours sur une période de 120 jours. Seules les souris de la PE1 injectée avec ADN subiront en plus 20 injections de luciférines pour permettre l'imagerie in vivo par bioluminescences. . À la fin du cycle d’imagerie de chaque souris (120 jours), les souris seront euthanasiées pour réaliser des coupes histologiques des testicules. - Les animaux de la deuxième procédure PE2 (4320) vont subir une chirurgie de 30 min sous anesthésie générale au niveau des testicules. Ensuite, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale à 6 temps 1-2-7-15-21-35 jours post injection afin de prélever les spermatozoïdes et les testicules. Dans cette deuxième procédure, aucun prélèvement ne sera réalisé sur animaux vivants.

Impact sur les animaux

L'anesthésie des animaux demandera leur préhension. Suite à la chirurgie, les males pourront perdre du poids et avoir une mobilité réduite sur quelques jours seulement. Les animaux transportés de l’animalerie Htag à l'animalerie I’IAB pour réaliser les séances d'imagerie pourraient avoir un stress engendré par le transport.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, les testicules seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.

Remplacement

L’étude des mécanismes de la spermatogenèse et de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro, et il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables. La fécondation nécessite l’obtention de gamètes matures, qui ne peuvent être obtenus que sur des animaux. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine nécessite des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. En conclusion, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, aucun modèle alternatif ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et les impacts sur la fertilité.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte . La procédure d'imagerie in vivo va nous permettre de réduire le nombre d'animaux utilisé puisque les souris seront imagées à différents temps post-chirurgie sur une période de 4 mois. L'aspiration micro-chirurgicale de spermatozoïdes épididymaire et l'aspiration percutanée de spermatozoïdes épididymaires permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque chaque souris sera utilisée pour plusieurs mesures. Les deux testicules de chaque souris seront injectés, le testicule gauche sera injecté avec du PBS, il va servir de contrôle et le testicule droit sera injecté avec l’ADN ou de l'ARN. Cela va nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les deux techniques de transfection sonoporation et électroporation évoquées en PE1 et PE2 seront effectuées en parallèle mais nous n’utiliserons pas la technique non efficace dans la P2.

Raffinement

Les douleurs associées à la chirurgie sont traitées avec des anti-douleurs et des anesthésiques. L'acte chirurgical sera réalisé sur des tapis chauffants et le réveil se fera dans une cage chauffée. La personne réalisant la chirurgie attendra le réveil de tous les animaux. Suite à l'opération, des croquettes mouillées seront disposées dans la litière. Pendant l'opération, les yeux seront recouverts d’une pommade pour les yeux (Vitamine A Dulcie). Les opérations seront réalisées le matin et le comportement des animaux sera suivi toutes les heures dans l’après-midi. L’état de santé des animaux opérés sera quotidiennement suivi aprés l'opération pendant 7 jours . En cas d'inflammation et/ou suppuration, la souris sera traitée avec un antibiotique non critique par voie intra-péritonéale pendant 5 jours. Le suivis de l’état de santé des animaux est réaliser dans le respect des 3R et se basent sur un arbre décisionnel en fonction des observations faites pour l’application des points limites gradés précis, et qu’en cas de dépassement des points limites les souris sont sortie de l’étude et sacrifiées (critères d’arrêt).

Choix des espèces

Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Dix modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Lors de leur entrées dans les procédures les souris males utilisées seront matures, âgées minium de 6 semaines,car la spermatogenése n'est pas fonctionnelle avant 6 semaines