Procédures sévères

198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections répétées de chimiothérapie qui provoquent des érosions douloureuses de la bouche, une perte de poids et une baisse des globules blancs, pour tester des dérivés de probiotiques contre la mucite orale. Le porteur décrit des ulcérations attendues vers le quatorzième jour, censées durer moins d'une semaine sans traitement. Il affirme que le modèle murin est "incontournable" avant toute application clinique et ne peut être remplacé par des tests in vitro.

Objectifs

La mucite orale est une inflammation de la muqueuse orale secondaire à traitement anticancéreux comme la chimiothérapie. Elle peut être à l’origine d’ulcérations des muqueuses orales douloureuses et conduire à une modification ou un arrêt de la thérapie anticancéreuse ce qui impacte le pronostic vital des patients atteints. De nombreux traitements ont été évalués mais leur efficacité s’est révélée partielle et peu démontrée. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la mucite orale, et en particulier l’inflammation, afin d’évaluer au mieux l’efficacité de nouveaux traitements tels que les dérivés des probiotiques. Le modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris choisi constitue une référence dans l’étude de cette maladie car il est particulièrement mimétique du fait de sa ressemblance à la plupart des régimes anticancéreux humains actuels utilisant le 5-fluorouacil (5-FU) (médicament utilisé dans le traitement des cancers) et car il ne nécessite pas l’application d’autres facteurs agressant l’organisme. Une approche thérapeutique novatrice et prometteuse de la mucite orale chimio-induite est constituée par des dérivés de probiotiques. Nous émettons l’hypothèse que les dérivés des probiotiques grâce notamment à leurs propriétés anti-inflammatoires/ immunomodulatrices pourraient exercer un effet thérapeutique dans la mucite orale chimio-induite. Si cette hypothèse se confirme, nos résultats pourraient ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques dans le traitement de cette maladie. Les objectifs de ce projet sont donc : (i) Introduire au sein de notre laboratoire un modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris et d’en caractériser la chronologie de l’inflammation (procédure expérimentale 1), (ii) Evaluer le potentiel thérapeutique des dérivés de probiotiques dans ce modèle, délivrés localement par un gel adhérent aux muqueuses (procédure expérimentale 2).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. D’abord, mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la mucite orale chimio-induite , et en particulier le rôle des médiateurs inflammatoires, en utilisant l’un des modèles les plus mimétique décrit dans la littérature chez la souris. Ensuite, vérifier notre hypothèse selon laquelle les dérivés des probiotiques pourraient exercer un effet thérapeutique dans ce modèle. Si cette hypothèse se confirme, nos résultats pourraient ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques dans le traitement de cette maladie chez l’Homme et pour laquelle il n’existe pas de traitement réellement efficace à l’heure actuelle.

Procédures

Ce projet va nécessiter l’utilisation de souris qui seront réparties de la manière suivante : 1) Etude de chronologie de l’inflammation dans le modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris. La mucite orale sera induite chez la souris uniquement par des injections d’une faible dose de chimiothérapie (5-FU) tous les 2 jours pendant 14 jours (7 injections au total, durée du geste entre 30 secondes et 1 minute) sous anesthésie gazeuse. 2) Etude de l’efficacité thérapeutique des dérivés des probiotiques dans un modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris. La mucite orale sera induite chez la souris uniquement par des injections de 5-FU comme décrit dans la procédure expérimentale 1 (gestes identiques en tout point). Les différents traitements topiques à évaluer seront déposés quotidiennement en intrabuccal tout au long du protocole (durée du geste entre 30 secondes et 1 minute, la durée du traitement sera déterminée précisément lors d’expériences préliminaires mais ne devrait pas excéder 21 jours) sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La mucite orale sur lequel porte notre étude est un effet indésirable de la chimiothérapie. Dans le modèle que nous allons utiliser, des érosions douloureuses qui caractérisent les stades avancés de la mucite orale sont attendues vers 14 jours, sur une zone très limitée de la cavité buccale (jusqu’au maximum 13% de la surface de langue) et devraient durer moins de 7 jours en l’absence de traitement. La fonction intestinale sera maintenue. Les autres conséquences de l’administration de la chimiothérapie prévisibles sont une perte de poids inférieure à 20% ainsi qu’une diminution du nombre de certains globules blancs dans le sang impliqués dans la lutte contre les infections (neutropénie), réversibles à l’arrêt du traitement.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever leurs tissus et réaliser les analyses permettant de répondre à nos questions de recherche.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est indispensable au bon déroulement de ce projet, permettant de faire un lien entre les résultats obtenus in vitro, et une éventuelle application clinique. Aucune autre manière de procéder ne permet d’étudier la physiopathologie de la mucite orale dans sa globalité. L’utilisation de ce modèle animal est incontournable avant une application clinique et ne peut être remplacée par des expérimentations in vitro.

Réduction

Un suivi longitudinal de chaque animal n’est pas possible pour évaluer la chronologie de la mucite orale (procédure intrabuccale) ce qui impose de sacrifier les animaux à différents temps du protocole. Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet sera réduit au maximum pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative. Ce nombre a été basé sur les données issues de la littérature.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera primordial durant les expérimentations, notamment par des phases d’acclimatation, un enrichissement de l’environnement (ajout de papier dans chaque cage pour leur permettre la conception d’un «nid »), une visite quotidienne, une gestion de la douleur via l’utilisation d’anesthésiques ou d’analgésiques suivant une échelle stricte et des points limites adaptés, ainsi que des critères d’arrêt bien établis.

Choix des espèces

Le modèle de mucite orale chimio-induite chez la souris choisi constitue une référence pour l'étude de la mucite orale car il est mimétique et reproduit la physiopathologie observée chez l'Homme. Il est adapté pour étudier l’efficacité de traitements délivrés au moyen d’un gel adhérent aux muqueuses tel que nous allons utiliser. De plus, le choix de la souris par rapport au rat par exemple nous permettra d’avoir éventuellement recours à des modèles transgéniques pour des études ultérieures. Les animaux seront âgés de 8 semaines. Cet âge correspond à un animal adulte afin de pouvoir établir une corrélation avec la pathologie chez l’Homme et d’éviter des biais potentiellement induits par la phase de croissance de l’animal.

1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont immobilisées dans un dispositif de contention, une fois dix heures d'affilée sans pouvoir bouger, manger ni boire, ou deux heures par jour pendant sept jours, puis irradiées et greffées, pour étudier l'effet du stress psychologique sur le vieillissement des cellules souches du sang. Le porteur indique que la transplantation peut entraîner un rejet de greffe, une prostration et des infections. Il décrit la contention comme un stress sans douleur et affirme que le maintien de ces cellules in vitro n'est "pas possible".

Objectifs

Le vieillissement de la population, en particulier au sein de la population occidentale, est aujourd’hui l’un des principaux problèmes socio-économiques. Le vieillissement du système sanguin et en partie de la population de ses cellules appelée cellules souches hématopoïétiques (CSH) entraîne un dysfonctionnement de la formation de sang. Ceci accroit le risque de développer diverses maladies malignes du sang telles que la myélodysplasie, un ensemble de maladies caractérisées par une production insuffisante de cellules sanguines matures saines par la moelle osseuse, la leucémie ou encore le lymphome. Au sein de notre laboratoire, nous supposons que le vieillissement "sain" ou "normal" est une succession de moments de stress. Notre hypothèse ici est donc de vérifier si des signaux de stress psychologiques (anxiété, dépression, etc.) provoquent des changements dans les cellules constituant ainsi une signature du vieillissement prématuré des CSH. Pour répondre à cette hypothèse nous 1) vérifierons si les cellules sont capables de se souvenir d’un stress subi et donc de répondre plus rapidement ou plus fortement à un second stress ; nous 2) évaluerons si cette mémoire contribue au vieillissement ; et finalement nous 3) déterminerons si le vieillissement à un impact sur la réponse au stress en laissant des marques permanentes et potentiellement héréditaires.

Bénéfices attendus

L'augmentation continue du pourcentage de la population âgée est l'une des principales préoccupations socioéconomiques du monde occidental. De plus, les humains souffrent d'une accumulation de stress au cours de leur vie conduisant à diverses maladies telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète, la dépression, etc. Ce projet vise à répondre à une partie de cette préoccupation, à savoir comment le stress psychologique affecte la prolifération et la différenciation des cellules sanguines, et s'il laisse une marque permanente dans ces cellules simulant ainsi un vieillissement prématuré.

Procédures

- Stress de contention aigue : 1 fois, 10 heures - Stress de contention chronique : 1 fois 2 heures par jour pendant 7 jours. - 2 Irradiations à 4 et 6 heures d‘intervalle pour une durée de 5 minutes. - 1 injection intra-veineuse de cellules (15 secondes) - 3 prélèvements sanguin à 4, 8 et 12 semaines après l’injection cellulaire (15 secondes)

Impact sur les animaux

Le test d'immobilisation vise à bloquer l'activité physique des souris et à les laisser dans un état de stress psychologique. Le dispositif de contention supprime les mouvements physiques des membres sans causer de douleur ou de blessure. La taille du dispositif sera choisie en fonction de la taille des souris, avec des trous de ventilation adéquats pour s'assurer que les souris peuvent respirer normalement. Les souris ne peuvent ni bouger, ni manger, ni boire pendant la période d’immobilisation (soit une fois 10 heures pour le stress aigu de contention et 2 heures par jour pendant 7 jours pour le stress chronique de contention). Les injections en intra-veineux peuvent induire des rougeurs et des gonflements. La diminution du système immunitaire des souris receveuses de transplantation peut entrainer des infections par une diminution de l’efficacité du système immunitaire. La transplantation peut induire un rejet de greffe qui se traduit par une absence de système immunitaire (donc des infections), une prostration des animaux et une grande fatigue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure afin d’isoler et d’étudier les cellules souches hématopoïetiques.

Remplacement

Pour l’étude du système hématopoïétique et en particulier des cellules souches hématopoïétiques le recours à un système in vivo est nécessaire car la présence de la niche et ses interactions avec les cellules sont essentielles à leur bon fonctionnement. A ce jour le maintien des cellules souches hématopoïétiques in vitro n’est pas possible. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les tests d'unités de formation de colonies, et elles seront utilisées. Cependant, ces tests, bien que réalisés in vitro sont fait à partir de cellules prélevées des souris des différentes procédures. Ils ne peuvent donc pas être réalisé sans expérimentation in vivo en amont.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire déterminé par tests statistiques pour récupérer la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 2 répétitions pour vérifier si la variation entre conditions est importante. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Afin de suivre le bien-être animal au cours de notre procédure expérimentale et de remédier au plus vite à la survenue de douleur et/ou souffrance induite, nous avons établi une grille d'observation Cette grille d’observation définit les points limites les plus précoces et précis auxquels des actions seront prises afin de palier à la souffrance et/ou douleur de l’animal. Cette grille d’observation indique également les mesures que nous prendrons à l'apparition des premiers signes de douleur. Afin de prévenir les infections bactériennes, les souris transplantées recevront un traitement antibiotique dans l'eau de boisson. Elles seront contrôlées et leur santé évaluée pendant 5 jours après la transplantation, ainsi que les jours ouvrables la deuxième semaine. Au cours des semaines suivantes, elles seront évaluées deux fois par semaine. En cas de fatigue légère ou de difficulté de déplacement léger de la nourriture hydratée sera mise à disposition dans la cage.

Choix des espèces

La souris est le système idéal pour étudier la formation du sang car le système sanguin est hautement conservé entre les souris et les humains. Le vieillissement du système sanguin est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre les humains et les souris est connue. Des études antérieures ont indiqué que le stress psychologique modifie des signaux et gènes des souris. Nous avons émis l'hypothèse que le stress de contention peut laisser une empreinte dans les cellules de la souris, illustrant une partie des effets du stress psychologique sur les cellules sanguines humaines. De plus, l’isolement des cellules sanguines murines est bien définie. Les procédures telles que la transplantation sont également faciles à réaliser chez la souris car les protocoles sont en place. Les animaux utilisés seront divisés en trois groupes : très jeunes (4-8 semaines), jeunes (4-6 mois) et d'âge moyen (10-14 mois). Ces âges simulent les humains très jeunes (0-10 ans), jeunes (20-30 ans) et d'âge moyen (40-45 ans). Les souris receveuses de la transplantation seront toutes âgées de 3 mois (âge idéal pour une transplantation optimisée)

Composés radiomarqués ou non administrés par le nez, la trachée, la vessie, le cerveau ou par minipompe implantée chirurgicalement, jeûne jusqu'à 16 heures, privation d'eau jusqu'à 4 heures, hébergement individuel sur sol grillagé en cage à métabolisme : 1 250 souris et 1 250 rats, soit 2 500 rongeurs, subissent ces procédures d'un niveau de souffrance sévère et sont tous tués à l'issue de chacune des deux procédures. Le séjour en cage à métabolisme peut durer 72 heures d'affilée, et jusqu'à 168 heures pour les souris, sur une phase expérimentale qui s'étend jusqu'à douze mois. L'objet est de mesurer où se distribuent ces composés et comment l'organisme les élimine, en amont d'études d'efficacité, et le rat est retenu en partie parce que la réglementation l'impose pour certaines études. Le projet est déclaré de souffrance sévère, mais la description des effets s'arrête à la faim, la soif, une "légère déshydratation" et une "douleur modérée transitoire", sans dire quel acte atteint ce niveau.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La première procédure de ce projet permettra de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide ou radioactive, avec placement en cage à métabolisme d’une durée maximale de 72h. La deuxième procédure traitera le cas particulier où des placements longs ou répétés en cage à métabolisme seront nécessaires, uniquement pour les souris. Pour les deux procédures et dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc, dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon ); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure . Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages à métabolisme, au maximum 72h en une fois ou au maximum 3 fois 24h sur 2 semaines glissantes espacés d’au moins 24h (si aucune mise à jeun n’est prévue), ou pour les souris uniquement au maximum 168h ou 7 fois 24h espacées de 24h sur 2 semaines glissantes si une mise à jeun n’est pas prévue. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Afin de réaliser certains tests de biodistribution, il pourra être nécessaire de mettre les animaux à jeun d’alimentation, au maximum 16 heures. Pour certaines administration intravésicales, il pourra être nécessaire de les priver d’eau au maximum 4h. Cela pourra générer une sensation de faim, de soif et une légère déshydratation, et une perte de poids légère. Des pertes de poids liées aux composés administrés pourraient être observées. Dans le cas des placements en cage à métabolisme, les animaux pourront être hébergés individuellement (avec les congénères visibles), dans des cages plus petites que les cages standard, avec un fond ajouré gênant modérément la locomotion. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat. Dans le cas du placement en cages à métabolisme, les animaux seront sur un sol grillagé ce qui pourrait gêner leur locomotion.

Devenir

Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupe seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux par groupe devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront effectuées

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal.[

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera utilisée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, du fait de son faible poids et car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Dans le cas contraire, le rat sera utilisé. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Toutefois, le rat sera aussi très utilisé en particulier du fait des études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée car il est imposé par la règlementation de réaliser des études sur le rat. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

58 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 12 réutilisés en l'absence de tumeur et le reste tué. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans le cerveau puis jusqu'à six séances d'IRM par semaine, avec cathéters dans la veine caudale, pour comparer des agents de contraste. Le porteur classe la procédure sévère faute de pouvoir garantir l'absence de signes cliniques liés au développement tumoral. Les rats non réutilisés sont tués une fois le suivi terminé ou à l'atteinte d'un point limite.

Objectifs

Le Gold Standard en imagerie diagnostique concernant les pathologies cérébrales est l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) avec injection d’agents de contraste (AC) à base de gadolinium. En effet, les tumeurs cérébrales sont mises en évidence via l’accumulation des AC au sein des tumeurs selon les caractéristiques de ces dernières (nécrose, vascularisation…). La détermination de l’efficacité de nouveaux ACs sur la détection tumorale est primordiale pour permettre de détecter le plus tôt possible les tumeurs afin de mettre en place les traitements appropriés. Dans cette étude, l’utilisation d’un modèle oncologique rongeur va permettre de déterminer l’efficacité de divers agents de contraste de nouvelle génération en comparaison avec des ACs de référence d’ores et déjà utilisés en clinique chez l’Homme. Dans le cadre de ce projet d’une durée de 3 ans, un total de 58 animaux (rats) sera utilisé. L’expertise du centre expérimental ainsi que les compétences/expériences des intervenants dans ces différentes procédures garantissent une prise en charge optimale du bien-être de l’animal.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité de nouveaux AC sur la détection de tumeurs in vivo. La comparaison de nouveaux AC entre eux et par rapport à des agents déjà commercialisés ou en développement dans ce modèle animal a pour but de déterminer leurs performances et leurs limites. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients. En effet, il va permettre de déterminer l’efficacité de nouveaux produits de contraste utilisés à doses réduites pour la détection de tumeurs cérébrales.

Procédures

Injection de cellules tumorales au niveau cérébral (une fois) et imagerie par résonance magnétique (jusqu'à 6 par semaine).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels qui pourront être observés sur les animaux seront principalement dû à la répercussion du modèle oncologique mis en place. En effet, des signes cliniques peuvent apparaître à partir 3 semaines post-implantation tumorale. Cependant, le développement tumoral n’est pas obligatoirement associé à l’apparition de signes cliniques. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement et une grille d’évaluation par scoring sera mise en place (2fois/semaine). Concernant les produits qui seront injectés aux animaux, ce sont des agents de contraste destiné à l’usage chez l’Homme. Les produits de contraste ont globalement un excellent profil de tolérance, avec une élimination rapide très majoritairement par les reins. Concernant les effets potentiels chez l’animal, ils sont considérés comme très faibles : ces produits ont en effet suivi toutes les phases de développement et présentent un excellent profil de sécurité. Par conséquent, il n’est pas attendu de toxicité particulière dans cette étude chez le rat. Concernant les voies d’administration intraveineuses choisies. La mise en place de cathéters au niveau de la veine caudale à plusieurs reprises pour l’injection des produits de contraste peut entraîner un hématome.

Devenir

La procédure sera considérée modérée en cas d’absence de pousse tumorale. La pousse sera contrôlée par 2 ou 3 sessions d’imagerie différentes. Dans le cas d’une absence de pousse tumorale, l’animal pourra être réutilisé. Tous les animaux non réutilisés seront euthanasiés une fois que leur suivi en imagerie sera considéré comme terminé ou lors de l’atteinte d’un point limite.

Remplacement

Pour limiter l’utilisation d’animaux dans l’étude, un modèle vitro sera mis en place pour étudier les propriétés de diffusion des différents agents de contraste. Cependant, pour s'assurer de l'efficacité réelle des agents de contraste, des tests in vivo sont indispensables. En effet, le recours aux animaux permet de reproduire un modèle oncologique proche de l’Homme soulignant ainsi l’aspect translationnel des résultats. Une telle étude permet de standardiser un protocole pour comparer dans les meilleures conditions possibles différents agents de contraste au sein de mêmes individus. En effet, ce projet évaluera l’efficacité de plusieurs agents de contraste injectés chez un même animal. La conception du protocole de cette étude se base sur de précédentes études effectuées en interne pour évaluer l’efficacité d’agents de contraste. Le projet sera conduit sur des rats Sprague Dawley à partir de 150 g.

Réduction

Les procédures seront réalisées par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie, de la chirurgie et de l’euthanasie chez le rat. En se basant sur la littérature des groupes de 8 animaux sont suffisants pour conclure de façon statistiquement pertinente sur les propriétés d’efficacité d'un agent de contraste. De plus, le modèle oncologique utilisé est un des plus référencés dans la littérature. Cela nous permettra de comparer nos résultats à ceux obtenus avec d’autres agents de contraste utilisés à diverses doses.. Cette approche permet de limiter les biais liés à la variabilité intrinsèque d’un modèle tumoral (ex : taux de nécrose, micro-architecture tumorale..) Le calcul du nombre d’animaux nécessaire a été déterminé selon l’expertise du laboratoire et en s’appuyant sur des analyses rétrospectives d’études similaires. Ces retours d’expérience permettent de s'assurer d’une meilleure inclusion des animaux. Un total de 58 rats sera nécessaire sur la durée totale du projet de 3 ans.

Raffinement

Des actions seront mises en place pour assurer le suivi et le bien-être des animaux. Lors de la chirurgie, la prémédication pré-opératoire ainsi que le suivi peropératoire et post-opératoire sont mis en place afin de limiter au maximum la douleur pouvant être infligée aux animaux entrant dans ce projet. Dans ce modèle, l’apparition des premiers signes cliniques s’effectue à partir de 3 semaines post implantation. Les animaux seront imagés dans les 21 jours suivants l’induction tumorale, aucun signe clinique n’est donc attendu. Cependant, un suivi régulier des animaux sera mis en place. Si toutefois des signes cliniques apparaissent, cela conduira à la mise en place d’actions pouvant aller jusqu’à l’euthanasie pour soulager l’animal en cas de souffrance. Pour déterminer les actions à mettre en place, un scoring clinique de l’état de l’animal sera réalisé 2 fois par semaine à partir d'une grille d’évaluation comprenant plusieurs catégories (apparence, abreuvement et alimentation, comportement naturel, comportement provoqué). Selon le score obtenu lors de l’examen clinique, des actions thérapeutiques peuvent être mises en place en accord avec le directeur d’étude et/ou le vétérinaire.

Choix des espèces

L’utilisation des modèles rongeurs permet d’intégrer les caractéristiques de la pathologie humaine ou au moins un grand nombre de ces caractéristiques (expansion tumorale, caractère invasif de la tumeur, vascularisation…). Le modèle de gliome C6 chez le rat est un modèle très référencé dans la littérature par conséquent très utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche en cancérologie pour l’évaluation de nouvelles molécules qu’elles soient à portée du diagnostic ou thérapeutique. Dans ce modèle, l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de nouveaux AC à détecter une tumeur tout en recherchant la dose de produit de contraste minimale à injecter pour permettre l’obtention d’une performance de détection équivalente aux agents de contraste utilisés à dose clinique. Ces nouveaux agents de contraste seront comparés aux agents de contraste déjà existants et reconnus sur le marché comme les plus efficaces et les mieux tolérés dans l’indication ‘’tumeur cérébrale’’. Les rats seront utilisés à partir d’un poids de 150g g.

Une ligature suivie d'une perforation du cæcum en trois minutes de chirurgie, ou une injection de contenu cæcal dans le péritoine : 496 souris adultes, munies d'une sonde thermique sous la peau, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour déclencher chez elles une septicémie. Les deux méthodes s'accompagnent d'un changement important de la température du corps, d'une perte de poids, de possibles diarrhées, d'une prostration et d'une activité sociale fortement altérée, avec une prise de sang par jour sous anesthésie gazeuse pendant les 48 premières heures. L'équipe veut contrôler leur température pour vérifier son hypothèse d'une fièvre bénéfique en cas d'infection, sur une espèce retenue parce que ces protocoles y sont "largement décrits dans la littérature scientifique", puis toutes sont tuées par surdose d'anesthésique gazeux pour prélever leurs organes. Le porteur ne mentionne aucun antidouleur, ni pour la chirurgie du cæcum, dont il ne précise pas l'anesthésie, ni pendant la septicémie.

Objectifs

Le choc septique est le dysfonctionnement des organes à la suited'une infection, impliquant une atteinte des vaisseaux sanguins et un changement de la température corporelle. Malgré les recherches et les travaux publiés ces dernières années, le rôle de la température sur ce dysfonctionnement est encore mal connu. Notre hypothèse est que la fièvre est bénéfique chez des souris atteintes d'infections. Dans ce projet, nous souhaitons contrôler la température pour étudier finement la dysfonction des organes lors d'un choc septique chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle que joue la température dans l'évolution du choc septique, et pourrait aider les cliniciens à mieux prendre en charge la température chez les patients en choc septique.

Procédures

Les souris seront implantées avec des sondes thermiques en sous-cutanée sous anesthésie (2 minutes par souris). Un modèle de septicémie sera induit chez ces souris au niveau du péritoine, soit par injection de contenu caecal dans le péritoine (simple injection péritonéale), soit par ligature et perforation du caecum par chirurgie (3 minutes par souris). Puis les souirs seront placées sous surveillance. Un prélèvement sanguin quotidien sera réalisé durant les 48 premières heures après une courte anesthésie gazeuse, afin de suivre les paramètres sanguins au cours du temps. Les souris seront euthanasiées par excès d'anesthésie gazeuse lors de la fin de l'expérience, et les organes seront prélevés.

Impact sur les animaux

Les deux modèles sont associés à un un changement important de la température corporelle des souris, à une perte de poids, à des diarrhées possibles, à une prostration et à une activité sociale fortement alterée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés « afin de prélever les organes et le sang nécessaires pour l'étude que nous menons

Remplacement

Afin de tester les mécanismes moléculaires, des expériences in vitro seront menées indépendamment. Néanmoins, le remplacement total par la culture cellulaire n'est pas possible à ce jour car les expériences in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des intéractions moléculaires et physiologiques qui ont lieu dans un organisme comme l'homme ou la souris. Nous utilisons les modèles de péritonite afin de nous rapprocher au plus près des causes du choc septique chez l'homme, qui représentent la 1ere cause de mortalité dans le monde. A cet égard, aucune étude expérimentale chez l'animal n'a permis de contrôler finement la température corporelle dans un modèle de sepsis.

Réduction

Pour minimiser le nombre d'animaux, nous nous sommes basés sur des études préalablement publiées dans la littérature ainsi que sur des tests statistiques. Des résultats antérieurs fournissent des informations importantes concernant la mortalité, les modalités de modèles de sepsis, les temps d'étude etc. Ainsi, nous proposons d'utiliser 496 animaux au total. Cet effectif permettra d'approfondir les mécanismes de la septicémie en réponse à la température, tout en limitant l'étude.

Raffinement

Afin de minimiser le stress animal, les souris seront placées en groupe avec des éléments d’enrichissements comme des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés quotidiennement. La mise en place de nourriture humidifiée dans la cage sera faite une semaine avant le début du protocole pour éviter le stress. Nous mettrons en place une grille d'évaluation de la souffrance des souris pour suivre l'évolution de la maladie. Le poids, l'apparence, la conscience, l'activité physique, la réponse aux stimuli, les yeux, la respiration seront évalués pour suivre l’évolution de la maladie et intervenir par euthanasie lorsque les points limites seront atteints.

Choix des espèces

Pour notre étude, nous avons choisi la souris car les modèles de choc septique que nous utilisons sont largement décrits dans la littérature scientifique chez la souris. De plus, de nombreux souris génétiquement modifiées permettant l'étude des mécanismes pathologiques sont largement développés. Age adulte (2 à 3 mois). Nous utiliserons des souris adultes car les données de la littérature scientifique montrent que l'incidence de la péritonite est beaucoup plus importante chez l'adulte que chez l'enfant.

Pour tester des nanoparticules qui, chauffées par un rayonnement infrarouge, doivent détruire les cellules responsables de l'inflammation des articulations, 1 320 souris DBA/1J vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue après un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. L'équipe leur provoque une arthrite avec jusqu'à quatre injections de collagène ou de LPS sous anesthésie, plus une sans anesthésie, puis leur administre une ou quatre injections intraveineuses de nanoparticules, chacune suivie 20 heures plus tard de 10 minutes d'infrarouge sous anesthésie générale, et trois prises de sang. Le porteur prévoit inconfort, douleur, handicap et difficultés à se déplacer, une souffrance possible dès le début de l'induction, et des points limites, des "signes de souffrance importante", au-delà desquels une souris est retirée des procédures. Aucun antidouleur n'est prévu : "aucun médicament ne pourra être utilisé", écrit-il, pour ne pas fausser l'évaluation de nanoparticules qui "pourraient permettre d'espérer à terme" stabiliser la maladie chez les patients.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune caractérisée par une inflammation chronique des articulations qui conduit à une destruction de structures (cartilage, os) et à une déformation articulaire irréversible. Aujourd’hui pour soulager les patients, des immunosuppresseurs (molécules inactivant la réponse immunitaire) sont souvent prescrits ; s’ils peuvent réussir à réduire l’inflammation locale ils ne sont pas spécifiques et sont donc responsables d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme. Par ailleurs, aucun traitement aujourd’hui n’est suffisant pour induire une stabilisation complète et durable de la maladie. C’est pourquoi de nouvelles pistes de traitement émergent. En particulier, réussir à éliminer les cellules responsables de l’inflammation de l’articulation apparait comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Dans ce contexte, notre objectif est de cibler les cellules responsables de l’inflammation articulaire avec des nanoparticules aux propriétés photothermiques afin de les supprimer. En réponse à une stimulation lumineuse dans le proche infrarouge, les nanoparticules photothermiques produisent de la chaleur qui provoque la mort des cellules les ayant internalisées. Ainsi en développant des nanoparticules qui ne sont prises en charge que par les cellules pathologiques de l’arthrite puis en activant ces nanoparticules avec un rayonnement approprié nous pouvons espérer supprimer les cellules pathologiques et améliorer les signes de la maladie. Il est important de noter que l’activation lumineuse est sans danger pour les tissus environnants et l’ensemble de l’organisme son impact serait ainsi restreint aux seules cellules pathologiques ayant internalisé les particules. Après une pré-sélection de nanoparticules candidates in vitro nous étudierons leurs propriétés thérapeutiques dans un modèle animal d’arthrite. Nous travaillerons avec un modèle largement utilisé : il est décrit depuis des décennies que l’injection de collagène chez la souris provoque le développement d’une maladie proche de la polyarthrite humaine. Les souris recevront ensuite des injections de nanoparticules qui seront activés avec un rayonnement lumineux et nous suivrons, à l’aide d’une grille d’atteinte articulaire préétablie, l’évolution de la maladie afin de conclure sur un bénéfice de notre stratégie thérapeutique.

Bénéfices attendus

Nos nanoparticules photothermiques ciblées aux cellules responsables de l’inflammation articulaire pourraient constituer une innovation thérapeutique qui enrichira l’arsenal des outils disponibles pour soigner l’arthrite. Seules ou en combinaison avec d’autres stratégies, nos nanoparticules pourraient permettre d’espérer à terme réussir à stabiliser chez les patients la progression de la maladie. Par ailleurs, notre stratégie thérapeutique de suppression par effet de photothermie de cellules inflammatoires (production de chaleur par les nanoparticules conduisant à la mort des cellules les ayant internalisées) est polyvalente puisque ces cellules sont impliquées dans d’autres maladies inflammatoires et auto-immunes. Ainsi, si notre stratégie se confirme prometteuse dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde nous pourrons envisager l’adapter et la transposer à d’autres maladies.

Procédures

Les animaux inclus dans cette étude recevront au plus : quatre injections de réactifs induisant l'inflammation réalisées sous anesthésie d’une durée de 10 minutes et une autre injection (geste rapide de moins d’une minute) réalisée sans anesthésie. Ensuite, après leur répartition dans un groupe de traitement, les animaux recevront une ou quatre injection(s) de nanoparticules thérapeutiques par voie intraveineuse sous anesthésie générale d’une durée d’une minute complétée par une anesthésie locale au niveau du point d’injection. Chaque injection de nanoparticule sera suivie 20 heures plus tard de l’application, sous anesthésie générale, d’un rayonnement infrarouge de 10 minutes, non invasif. Afin de suivre la progression de la maladie, 2 fois par semaine, les animaux seront pesés, l’aspect des pattes sera surveillé et l’épaisseur des chevilles de pattes arrière mesurée. Pour suivre certains marqueurs de la maladie, 3 prélèvements de sang sont prévus sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

1-Injections de collagène/lipopolysaccharide (LPS). Les injections de collagène, de LPS ou du mélange qui permettent l’induction de la pathologie peuvent être source de stress pour l’animal et peuvent occasionner un œdème modéré et un inconfort transitoire d’environ deux jours au niveau du site d’injection. Enfin, une lésion cutanée locale (type ulcère) peut apparaître. Ces injections sont par ailleurs responsables de la mise en place d’une inflammation au niveau des articulations et d’une réaction auto-immunitaire qui conduisent au développement progressif de la maladie. 2-Développement de l’arthrite Si les premiers signes cliniques d’arthrite perçus par l’expérimentateur apparaissent entre 21 et 28 jours après la première injection de collagène, le processus d’inflammation initié par les injections de collagène peut être source de souffrance pour l’animal dès le tout début de l’expérimentation. Les souris peuvent être sujettes à différents symptômes proches des manifestations humaines de la polyarthrite rhumatoïde. Ainsi, en lien avec l’inflammation articulaire, les animaux peuvent souffrir d’inconfort, de douleur, de handicap et éprouver des difficultés à se déplacer. La pathologie peut s’accompagner d’autres signes de mauvaise santé générale (pelage terne, perte de poids…). 3-Administration de nanoparticules et application locale d’un rayonnement proche infra-rouge L’administration de nanoparticules sera réalisée par voie intraveineuse. Ces injections peuvent être sources de stress. Elles seront réalisées par un personnel formé et habitué à effectuer le geste technique associé. L’application locale sur les articulations d’un rayonnement proche infrarouge 20 heures après l’injection des nanoparticules est nécessaire à l’activation des nanoparticules. L’application du rayonnement ne devrait ni être source de souffrance pour l’animal ni responsable d’altérations des tissus environnants : seules les cellules ayant internalisé les nanoparticules photothermiques seront impactées par le rayonnement. 4- Prélèvements sanguins. Les éventuels prélèvements sanguins seront de volume adapté à leur fréquence pour laisser le temps à l’entièreté du volume sanguin de se régénérer entre deux prélèvements, leur effet devrait donc être très limité sur la santé de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure après la réalisation sous anesthésie d’un prélèvement sanguin terminal nécessaire pour analyser les effets de la nanoparticule candidate sur la progression de la maladie.

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées pour sélectionner des nanoparticules candidates non toxiques. Ces études sont une première étape mais ne suffisent pas pour conclure sur l’effet thérapeutique des nanoparticules. En effet, le recours à un modèle animal dans lequel les cellules immunitaires interagissent de manière complexe au sein d’organes organisés est nécessaire. Il existe différents modèles d’arthrite (dont le modèle induit au collagène que nous avons choisi) qui se rapprochent de la pathologie humaine de la polyarthrite rhumatoïde. Le recours à ce genre de modèle animal est obligatoire car c’est un outil qui permet d’étudier les éventuels bénéfices thérapeutiques de la nanoparticule à différents niveaux (état général des animaux, apparence des articulations, analyses sanguines…).

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans chaque groupe de ce projet a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables et reproductibles. Nous évaluerons dans une étude pilote quel protocole d’injection de collagène induit l’arthrite dans notre établissement avec une bonne incidence puis sur des animaux malades nous évaluerons l’efficacité du traitement par photothermie à l’aide de tests statistiques adaptés. Il est prévu de réaliser chaque protocole thérapeutique 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, 5 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 20 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience (effectif de 5 animaux) des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence sur tous les paramètres étudiés des différences entre les groupes de souris et de conclure quant à l’efficacité thérapeutique du traitement photothermique

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de matériel de nidification et de bâtons à ronger. Les animaux seront surveillés visuellement, manipulés et injectés par des personnes compétentes et formées au bien-être animal. Pour limiter l’inconfort des animaux qui peuvent être réticents à se déplacer à cause du développement de l’arthrite, l’accès à l’eau et à la nourriture sera facilité. Afin de limiter le stress occasionné par les prélèvements sanguins, les injections de collagène et de nanoparticules et par les applications de rayonnements infra-rouges sur les articulations, les animaux seront, lors de toutes ces manipulations, placés sous anesthésie générale gazeuse. De plus, pour les injections intraveineuse, l’anesthésie gazeuse sera complétée d’une anesthésie locale. Pour réduire la douleur des animaux, aucun médicament ne pourra être utilisé puisqu’il pourrait interférer avec l’étude de notre potentielle nanoparticule thérapeutique et fausser les résultats. 2 fois par semaine, l’état général des animaux sera surveillé pour repérer l’éventuelle présence de signes de stress ou de souffrance (démarche anormale, lésions…). A cette occasion, une observation des articulations et une mesure de l’épaisseur des chevilles évaluera à l’aide d’une grille préétablie la progression de la maladie allant d’une atteinte articulaire faible à sévère. Nous avons établi des points limites, signes de souffrance importante, qui s’ils sont atteints chez un animal conduiront à la soustraction de celui-ci des procédures.

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain. Il existe par ailleurs chez la souris plusieurs modèles déjà établis d’arthrite dont les caractéristiques sont proches de la polyarthrite rhumatoïde humaine. En particulier le modèle d’induction de l’arthrite par injection de collagène chez des souris de la souche DBA/1J âgés de 6 à 8 semaines est un modèle largement utilisé. C’est ce modèle que nous mettrons en place dans cette étude.