Procédures sévères
Le rôle de la thrombine, acteur clé de la coagulation, dans le développement des anévrismes dans les vaisseaux du cerveau 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à trois interventions chirurgicales pour provoquer des anévrismes cérébraux et implanter une pompe, 768 souris vont toutes être tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. À ces opérations s'ajoutent des prélèvements sanguins par voie rétro-orbitaire et des séances d'IRM sous anesthésie, l'objectif étant de tester si des anticoagulants déjà utilisés chez l'humain freinent la rupture. Le porteur indique qu'environ une souris sur dix ne survit pas à chacune des deux premières chirurgies. Les bénéfices annoncés pour les patients restent au conditionnel, tandis que les cerveaux sont prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Un anévrisme intracrânien, c’est comme une petite « bulle fragile » qui se forme dans un vaisseau sanguin du cerveau. Cela concerne environ 1 personne sur 25, surtout les femmes. Tant que cette bulle ne se rompt pas, elle passe inaperçue, mais si elle éclate, cela provoque une hémorragie cérébrale très grave, souvent fatale ou entraînant des séquelles irréversibles. Aujourd’hui, le seul moyen de traiter ces anévrismes est une intervention chirurgicale délicate, qui vise à isoler la zone fragilisée du reste de la circulation. Il n’existe donc pas encore de traitement médicamenteux capable de prévenir leur rupture. Nos recherches, qui se déroulent dans 2 établissement de recherche, s’intéressent à un processus central du sang : la coagulation. Normalement, ce mécanisme permet de réparer un vaisseau abîmé en formant un caillot. Mais dans les anévrismes, ce processus pourrait au contraire fragiliser la paroi et favoriser leur rupture. Nous étudions plus particulièrement une molécule clé appelée thrombine, qui déclenche la coagulation, et son « frein naturel », qui limite son action. Grâce à des modèles expérimentaux innovants en laboratoire, nous cherchons à comprendre si ce duo joue un rôle dans la rupture des anévrismes. À terme, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour prévenir leur rupture et protéger les patients à risque.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à trouver de nouveaux traitements contre l’anévrisme du cerveau, une maladie qui peut avoir des conséquences dramatiques, parfois mortelles. Aujourd’hui, la seule option est une opération chirurgicale lourde, qui comporte des risques importants comme des séquelles neurologiques, des hémorragies ou même le coma. Nous explorons la piste de médicaments déjà utilisés chez l’être humain pour fluidifier le sang ou limiter l’activation des plaquettes en travaillant sur le rôle du sang et des molécules qui le composent dans cette maladie. Si ces approches se révèlent efficaces dans nos modèles expérimentaux, elles pourraient être adaptées rapidement aux patients atteints d’anévrisme. À long terme, l’objectif est d’offrir de nouvelles alternatives médicamenteuses, afin de mieux protéger les patients et de réduire le recours à la chirurgie.
Procédures
À l’exception de la mesure de la pression artérielle , l’ensemble des gestes techniques est réalisé chez des souris anesthésiées par anesthésie gazeuse afin d’éviter toute douleur. Tous les animaux inclus dans ce projet suivent une procédure expérimentale visant à induire la formation d’anévrismes cérébraux, correspondant à une dilatation anormale de certains vaisseaux sanguins du cerveau. Cette procédure repose sur deux interventions chirurgicales (d’une durée approximative de 40 minutes puis 50 minutes) destinées à modifier la circulation sanguine et la pression dans les vaisseaux. Lors de ces chirurgies, les animaux reçoivent systématiquement un traitement antidouleur adapté. Une troisième intervention chirurgicale est réalisée afin d’implanter une pompe sous la peau, permettant l’administration continue d’un traitement pendant plusieurs semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume sont réalisés chez les animaux anesthésiés par voie rétro-orbitaire (au niveau de l’œil), à trois temps distincts au cours du projet, afin d’étudier l’évolution des paramètres sanguins. Chaque prélèvement dure environ une minute. La pression artérielle est mesurée chez les animaux éveillés, à des temps définis au cours de la procédure, lors de séances d’environ 30 minutes. Afin de limiter le stress, les souris sont habituées à la manipulation avant les mesures. Le bon déroulement des chirurgies et l’évolution de la maladie sont suivis grâce à des examens d’imagerie par résonance magnétique (IRM) réalisés chez des animaux anesthésiés. Deux séances d’IRM, espacées de 7 jours, sont effectuées, chacune d’une durée d’environ 30 minutes. Enfin, certains animaux reçoivent un traitement administré par l’alimentation, intégré directement dans les croquettes, afin d’évaluer son effet sur l’évolution de la pathologie. L'ensemble des interventions décrites dans ce projet auront lieu dans le laboratoire de rattachement à l'exception des séances d'IRM qui auront lieu sur le site de la plateforme technique d'imagerie située à 5 minutes à pieds du laboratoire de où les recherches se dérouleront.
Impact sur les animaux
Lors des interventions chirurgicales, certaines souris peuvent malheureusement ne pas survivre : environ 1 sur 10 après la première chirurgie, et une proportion similaire après la deuxième. Les souris qui restent en vie peuvent présenter des effets temporaires, généralement légers à modérés : - Douleur ou gêne pendant environ 1 jour après l’opération - Perte de poids temporaire - Difficultés de déplacement liées aux interventions ou à des troubles neurologiques - Stress lors des mesures de tension artérielle, qui nécessitent une manipulation - Irritation ou inflammation locale au niveau des sutures chirurgicales - Atteinte oculaire rare suite aux prélèvements sanguins rétro-orbitaux En cas de rupture d’anévrisme, des troubles plus sérieux peuvent apparaître, comme une perte de poids importante ou des difficultés motrices. Dans toutes ces situations, l’expérience est immédiatement arrêtée pour l’animal, afin de prévenir toute souffrance inutile.
Devenir
À la fin de l’expérience ou si l'anévrymse se rompt, les souris sont euthanasiées, afin d'étudier leur cerveau.
Remplacement
Pour comprendre comment les anévrismes du cerveau apparaissent et évoluent, nous devons utiliser des souris. C’est le seul moyen, car seul un organisme vivant complet peut vraiment développer cette maladie, un peu comme chez les humains. C 'est en observant ce qui se passe dans leurs vaisseaux sanguins — par exemple l’inflammation, les changements de la paroi des vaisseaux ou la façon dont le sang circule — que nous pouvons mieux comprendre comment l’anévrisme se développe et devient dangereux.
Réduction
Pour notre expérience, nous avons besoin d’un certain nombre de souris pour être sûrs que nos résultats soient fiables. Ce nombre a été calculé grace à des test statistiques. Nous allons utiliser plusieurs types de souris, certaines modifiées génétiquement nous permettant de comprendre el rôle de certains acteurs qui nous interessent dnas la maladies et d’autres souris normales, pour comparer les différences. Certaines souris recevront un médicament spécial pour voir comment il agit sur la maladie.
Raffinement
Après les opérations, les souris peuvent ressentir un peu de douleur ou être fatiguées. Pour limiter leur inconfort, elles reçoivent des médicaments contre la douleur et sont gardées au chaud sur un petit tapis chauffant. Les souris sont observées tous les jours pour vérifier qu’elles se déplacent, mangent et se comportent normalement. Des contrôles cliniques plus détaillés sont réalisés chaque jour à l’aide d’une grille de critères incluant la posture, la mobilité, l’alimentation et le comportement social. Ces observations permettent de détecter rapidement tout problème et de décider des actions à prendre : par exemple, donner un complément de médicaments contre la douleur, placer de la nourriture facile à attraper au sol si elles ont du mal à bouger, ou arrêter l’expérience et euthanasier l’animal si la douleur ou la perte de poids dépasse les points limites définis. Avant de mesurer leur tension artérielle, les souris sont habituees à la manipulation pour réduire le stress. Dans leurs cages, elles disposent de coton pour nidifier et de tunnels ou roues pour se cacher ou se déplacer librement, ce qui améliore leur confort et leur bien-être.
Choix des espèces
Les souris sont très utiles parce que leur corps fonctionne un peu comme celui des humains : leur cœur, leur sang et leurs défenses naturelles sont très semblables. Cela permet de mieux comprendre les maladies et de tester des traitements avant de passer aux humains. En plus, nous pouvons créer des souris « sur mesure » en modifiant certains gènes pour étudier exactement certaines protéines ou parties du corps. Pour ce projet, nous travaillons sur des souris adultes, car nous voulons étudier une maladie qui touche surtout les adultes. Nous nous intéressons particulièrement à une substance dans le sang appelée thrombine et à la façon dont le corps la contrôle, pour mieux comprendre comment se forment et évoluent les anévrismes dans le cerveau.
Développement d’une approche de thérapie génique non virale pour le traitement de la myopathie myotubulaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Porteuses d'une myopathie qui provoque une faiblesse musculaire jugée sévère dès cinq semaines, 204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Elles reçoivent des injections répétées dans la queue et en rétro-orbitaire, puis une mesure de force sous anesthésie profonde, pour tester une thérapie génique sans virus contre une maladie qui touche surtout de très jeunes garçons. Sur les 204, 152 sont classées en souffrance sévère. Le porteur décrit cette étape sur souris malades comme "indispensable" pour espérer un jour proposer le traitement, après des essais viraux arrêtés chez l'enfant pour effets secondaires graves.
Objectifs
Ce projet de recherche concerne une maladie génétique rare qui touche surtout les très jeunes garçons. Elle provoque une grande faiblesse des muscles dès la naissance, rendant difficiles des fonctions essentielles comme bouger ou respirer. Cette maladie est très grave et entraîne souvent un décès précoce. À l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement capable de soigner cette maladie. Les soins disponibles permettent uniquement de soulager certains symptômes, sans agir sur la cause. Des tentatives récentes de traitement ont utilisé des virus modifiés pour corriger le problème à l’origine de la maladie, mais ces essais ont entraîné des effets secondaires très graves chez certains enfants, ce qui a conduit à leur arrêt. L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle approche thérapeutique plus sûre, qui n’utilise pas de virus. Cette stratégie sera d’abord testée chez la souris afin de mieux comprendre son efficacité et sa sécurité, dans l’espoir d’ouvrir la voie à un futur traitement pour les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à montrer, pour la première fois, qu’un nouveau type de traitement peut fonctionner dans un modèle animal atteint d’une maladie musculaire grave. Cette approche utilise un système innovant, sans virus, pour apporter aux muscles les éléments nécessaires à leur bon fonctionnement. Le traitement testé pourrait permettre d’améliorer fortement, voire de corriger, les symptômes de la maladie chez la souris, tout en réduisant les effets indésirables observés avec les méthodes utilisées jusqu’à présent. L’objectif est d’agir directement sur les muscles de manière plus sûre. À plus long terme, cette nouvelle technologie pourrait également servir à développer des traitements pour d’autres maladies des muscles, en offrant une alternative plus sûre et plus flexible aux approches actuelles.
Procédures
Une injection intraveineuse au niveau de la queue de la souris d’une durée maximale d’une minute sera réalisée une fois tous les 2 jours pendant 6 jours. Une injection rétro-orbitale d’une durée maximale de 30 secondes sous anesthésie sera réalisée une fois tous les 2 jours pendant 8 jours. Un anesthésique sera appliqué en inhalation aux souris pendant 5 minutes. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes et les souris recevront une anesthésie profonde et un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, plusieurs nuisances potentielles et effets indésirables pourraient survenir chez les animaux. Bien que l'utilisation de vecteurs non viraux soit conçue pour minimiser les risques, il peut y avoir des réactions au site d'injection pouvant provoquer des irritations localisées, des inflammations ou des douleurs temporaires au niveau du site d'injection. De plus, des réactions systémiques peuvent avoir lieu telles que des réactions immunologiques aux nanoparticules lipidiques ou aux peptides ciblant le système musculaire pourraient survenir, entraînant de l'inconfort ou des changements dans le comportement des animaux. Les souris portant la maladie manifestent une faiblesse musculaire sévère, une réduction significative de la mobilité spontanée et des difficultés à se nourrir avec une installation du phénotype progressive qui est considérée comme sévère à partir de 5 semaines.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de collecter les tissus pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Des expériences ont d’abord été réalisées en laboratoire sur des cellules musculaires afin d’évaluer la capacité des vecteurss dépourvus de virus à faire entrer un matériel thérapeutique dans les cellules. Ces essais permettent d’obtenir des informations préliminaires, mais ils ne peuvent pas reproduire le fonctionnement d’un organisme entier. Ils ne permettent notamment pas d’étudier la répartition du traitement dans le corps, ses effets sur les différents organes, ni les réactions globales de l’organisme, comme la réponse immunitaire. Ainsi, les modèles cellulaires seuls ne sont pas suffisants pour évaluer de manière fiable l’efficacité et la sécurité du traitement. L’utilisation de modèles murins, sains et atteints de la maladie, est donc nécessaire. La souris présente des caractéristiques biologiques et physiologiques proches de celles de l’Homme, en particulier au niveau du muscle, ce qui permet d’obtenir des résultats pertinents et prédictifs avant une application chez l’être humain.
Réduction
Pour utiliser le strict nécessaire d'animaux, nous avons calculé la taille de nos groupes grâce à une méthode statistique précise appelée analyse de puissance. En nous basant sur des recherches précédentes en thérapie génique pour le muscle, nous avons défini qu'un nombre réduit de souris par groupe suffit pour obtenir des résultats fiables et significatifs. L'étude compare six groupes au total, mêlant des souris saines et des souris malades, avec ou sans traitement. Afin d'optimiser chaque vie animale, nous ne créons pas de groupes supplémentaires pour chaque type d'examen. Au contraire, chaque souris d'une même cohorte permet d'étudier à la fois la force, la structure des tissus et les molécules biologiques. Cette approche de mutualisation réduit considérablement le nombre total d'animaux utilisés dans le projet. Enfin, pour garantir que chaque donnée compte, nous appliquons des tests mathématiques rigoureux qui s'adaptent à la nature des résultats obtenus, assurant ainsi une conclusion solide dès la première expérience.
Raffinement
Plusieurs mesures de raffinement seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long du protocole expérimental. Afin d'anticiper les éventuelles difficultés locomotrices liées au phénotype pathologique ou aux effets secondaires potentiels des nanoparticules, des aménagements spécifiques seront prévus : la nourriture sera disposée au sol de la cage pour faciliter l'accès sans nécessiter de déplacements importants, et des dispositifs d'abreuvement bas seront utilisés si nécessaire. Une surveillance quotidienne du bien-être et de l'état clinique des animaux sera effectuée par le responsable du projet et les techniciens animaliers à l'aide d'une grille d'évaluation standardisée, permettant de détecter précocement tout signe de souffrance ou de détresse (apathie, prostration, ptosis, troubles locomoteurs, perte de poids, modifications comportementales). Des points limites clairement définis permettront d'identifier les animaux devant être euthanasiés de manière anticipée pour éviter toute souffrance prolongée. En cas de douleur ou d'inconfort manifeste, une analgésie appropriée sera administrée (par voie sous-cutanée, toutes les 8-12 heures si nécessaire). Si malgré ces mesures l'état de l'animal se dégrade ou si les critères d'arrêt sont atteints, une euthanasie précoce sera pratiquée conformément aux recommandations éthiques, afin de préserver le bien-être animal.
Choix des espèces
Notre choix s'est porté sur la souris car elle possède un gène très proche de celui de l'être humain pour cette maladie musculaire. Avant d'en arriver là, nous avons d'abord testé nos traitements sur des cellules en laboratoire, puis vérifié sur des souris saines que le médicament voyageait bien jusqu'aux muscles. Ces étapes préliminaires réussies nous permettent aujourd'hui de passer à l'étude sur des souris malades qui développent exactement les mêmes symptômes que les patients humains, comme la perte de force et la fragilité des muscles. C'est une étape indispensable pour espérer, un jour, proposer ce traitement aux malades. Nous avons choisi d'intervenir sur des souris âgées de 5 semaines, ce qui correspond à la période de l'adolescence. À cet âge, la maladie est déjà bien installée et bien visible, ce qui ressemble beaucoup au stade où les symptômes apparaissent chez les enfants atteints de cette myopathie. Tester le traitement à ce moment précis est crucial pour vérifier s'il est capable de réparer des muscles déjà affaiblis et d'améliorer durablement la santé des sujets.
Evaluation de l’effet antithrombotique et de l’impact sur l’hémostase d’un agent thérapeutique ciblé amélioré
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à une chirurgie et à des injections, parfois jusqu'à une coupure de l'extrémité de la queue, 640 souris vont être utilisées dans des procédures dont la souffrance va de nulle sous anesthésie à sévère. Certaines subissent des interventions de 40 minutes à près de deux heures sans réveil, d'autres présentent apnées, respiration haletante ou saignements provoqués par les molécules de référence. L'objectif est de tester un agent antithrombotique censé réduire le risque de saignement par rapport aux traitements actuels. Ce bénéfice reste renvoyé au long terme, face à des thromboses et des hémorragies infligées ici et maintenant à 640 animaux.
Objectifs
La thrombose est un processus pathologique dû à du sang qui coagule, forme un caillot (ou thrombus) et obstrue le vaisseau. Il en résulte un défaut d’apport en oxygène, ou une accumulation de sang en amont et en fonction des organes atteints, comme le cœur, les poumons ou le cerveau, c’est une urgence vitale. Il existe des traitements comme les anticoagulants ou les thrombolytiques, qui visent à détruire le thrombus. Mais malgré les traitements actuels, l’efficacité reste limitée, avec un taux de mortalité ou de morbidité qui restent importants. Les complications chroniques sont fréquentes à cause d’un thrombus résiduel qui diminue drastiquement la qualité de vie du patient et est un fardeau économique pour la société. À cela s’ajoutent des effets indésirables des traitements comme le risque de saignement ou la toxicité cérébrale. L’objectif du projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique ciblée, fondée sur des agents améliorés. Ces agents, ciblant spécifiquement un composant du thrombus, la fibrine, et couplés à un anticoagulant ou à un agent thrombolytique, visent à traiter localement la thrombose tout en limitant le risque de saignement.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait nous permettre : -De mettre en évidence une réduction de la thrombose dans des modèles expérimentaux. -De mettre en évidence un effet des agents améliorés sur l’hémostase moins important que celui des traitements de référence, donc un risque de saignement réduit et acceptable. -De déterminer la durée et l’intensité de l’action des agents améliorés. Ce projet pourrait permettre à long terme d’améliorer la prise en charge des patients atteints de thrombose et de réduire les séquelles associées.
Procédures
Un groupe de souris est soumis à une injection sur animal vigile (30 s). Certaines souris anesthésiées sont soumises à une chirurgie et deux injections, sans réveil de l’animal (entre 40 min et 1h45). Certaines souris anesthésiées sont soumises à une chirurgie, maximum deux prélèvements de sang et deux injections (30 min). Certaines souris anesthésiées sont soumises à une injection puis à une coupure de l’extrémité de la queue (35 min).
Impact sur les animaux
Pour toutes les procédures, un stress dû à la contention peut apparaître. Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que des risques de saignement au site d’incision. D’éventuelles douleurs peuvent apparaître lors du réveil de l’animal et dans les heures suivantes. Dans les procédures de thromboembolisme, une apnée de plus d’1 minute peut être observée. L’animal peut également présenter une respiration haletante. Dans la thrombose veineuse, on peut observer des douleurs au niveau de la plaie, une altération de la motricité et de la locomotion. Dans l’ensemble des procédures, des saignements dû à la nature des molécules de références peuvent apparaître.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux sont mis à mort. Les prélèvements réalisés ne sont pas compatibles avec un réveil des animaux suite aux PE.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique ciblée améliorée, reposant sur le développement d’agents agissant sur la thrombose. Les deux pathologies étudiées (thrombose veineuse et artérielle) étant des processus particulièrement complexes faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que des conditions de flux (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de totalement substituer les modèles animaux par des modèles in vitro. Les principaux modèles in vitro permettent d’étudier la formation de thrombus sous flux contrôlés sur des surfaces induisant une thrombose, mais dans des conditions très simplifiées, sans endothélium fonctionnel et avec une architecture vasculaire artificielle. Ils ne peuvent donc pas reproduire la complexité d’un organisme vivant ni prédire de façon fiable la réponse globale des agents testés, ce qui justifie le recours à un modèle in vivo pour répondre à notre question scientifique. Les agents améliorés ont été préalablement testés dans des modèles in vitro sur sang humain afin de valider l’efficacité antithrombotique et anticoagulante des molécules avant de les tester in vivo. Obtenir des données chez la souris est nécessaire pour poursuivre le développement de ces agents, vers un potentiel essai clinique.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Afin de limiter le nombre de souris, nous réaliserons une première procédure visant à mettre en évidence l’effet d’un de nos agents sur la thrombose déjà formée. Si aucun effet n’est observé, le développement de cet agent sera stoppé. De plus, lorsque des prélèvements sanguins sont nécessaires, ils ne seront effectués que si l’agent est encore présent dans l’échantillon collecté au temps précédent.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 14 jours entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation à la manipulation est prévue 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : •Par l’hébergement dans des cages en groupes sociaux. Ces cages seront munies de divers enrichissement ce qui permet aux souris d’organiser leur environnement selon leurs besoins. •Par des mesures péri-opératoires permettant de réduire les douleur et souffrances à leur minimum. •Des points limites ont été établis, permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont maîtrisés, notamment les modèles d’hémostase et de thrombose. Elle est la plus adaptée pour ce projet, car les mécanismes de thrombose et d’hémostase y sont très bien connus et très proches de ceux de l’être humain. De plus, les médicaments contre la thrombose efficaces utilisés actuellement chez l’Homme ont prouvé leur efficacité dans des modèles de thrombose chez la souris, ce qui nous permet de comparer nos agents aux traitements actuellement utilisés en clinique. Dans toutes les procédures, les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Le vieillissement des animaux n’est pas souhaitable car il introduit des variabilités physiologiques majeures qui pourraient masquer les effets spécifiques de nos ADCs. Les animaux pubères sont préférables car ils présentent un système cardiovasculaire et hémostatique physiologique, sans comorbidités.
Évaluation de 3 nouveaux candidats de radiothérapie interne vectorisée, ciblant le récepteur à l’apeline dans différents modèles murins de tumeurs.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2040 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur implantée par injection ou par chirurgie puis soumise à des séances d'imagerie sous anesthésie répétées jusqu'à quatre fois par semaine. Les procédures impliquent un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère pour 1200 d'entre elles, avec anesthésies répétées, douleurs postopératoires et gêne croissante liée à la tumeur au cerveau, aux poumons ou au ventre. Le projet évalue trois candidats de radiothérapie interne censés cibler les tumeurs tout en épargnant les tissus sains. Les souris porteuses de tumeurs sont tuées pour analyse, celles qui n'en développent pas étant gardées en vie pour un autre projet.
Objectifs
Ce projet vise à créer un nouveau traitement contre le cancer en utilisant la radioactivité ciblée. L'idée est d'envoyer de petites doses de rayonnement directement au cœur des tumeurs pour les détruire, tout en épargnant les tissus sains. Le problème actuel Aujourd'hui, nous utilisons déjà des petites molécules pour transporter la radioactivité vers les tumeurs. Le problème, c'est qu'elles sont éliminées beaucoup trop vite par l'organisme (par les urines). Elles n'ont donc pas le temps de bien se fixer sur la tumeur pour la détruire efficacement. Notre solution : Le "Vecteur à deux mains" Pour corriger cela, nous développons un nouvel outil (appelé nanobody) qui fonctionne comme s'il avait deux mains : Une main pour s'accrocher à la tumeur : elle reconnaît une signature spécifique à la surface des cellules cancéreuses. Une main pour s'accrocher au sang : elle s'agrippe à une protéine naturellement présente dans le sang pour s'en servir comme d'un "bus". Cela permet au médicament de rester circulant beaucoup plus longtemps au lieu d'être éliminé tout de suite. Comment allons-nous procéder ? Pour vérifier que cette idée fonctionne, nous allons comparer quatre outils différents : Le modèle classique (qui est éliminé vite). Un modèle qui s'accroche mieux à la tumeur mais circule peu. Un modèle qui circule longtemps mais ne vise pas la tumeur. Notre candidat final : celui qui sait à la fois voyager longtemps et s'accrocher fermement au cancer. Les étapes du projet En laboratoire : On prépare nos outils et on vérifie qu'ils sont bien "armés" avec la radioactivité. L'étude du voyage : On observe chez la souris comment l'outil se déplace dans le corps et s'il trouve bien le chemin de la tumeur. L'efficacité : On vérifie si ce nouveau traitement permet réellement de réduire la taille des tumeurs et d'améliorer la santé des animaux.
Bénéfices attendus
Le but de cette recherche est de créer une nouvelle arme contre des cancers très agressifs et difficiles à soigner, comme ceux du cerveau (glioblastome) ou du pancréas. (1). Une avancée pour la médecine Actuellement, nous savons utiliser certaines molécules pour "voir" les tumeurs grâce à l'imagerie. Ce projet propose d'aller plus loin : transformer ces outils de diagnostic en véritables outils de soin. Au lieu de simplement montrer où est le cancer, notre molécule servira de véhicule pour transporter un traitement radioactif capable de détruire les cellules malades de l'intérieur. (2). Un traitement plus précis et moins toxique L'un des grands défis de la radiothérapie est d'éliminer la tumeur sans abîmer les organes sains autour. En apprenant à notre "véhicule" à rester plus longtemps dans le sang et à mieux s'accrocher au cancer, on s'assure que la radioactivité se concentre là où elle est utile. C'est ce qu'on appelle la médecine de précision : un traitement sur-mesure, plus efficace et mieux toléré par le patient. (3). Une étape clé avant les tests sur l'humain En testant cette solution sur des modèles qui imitent la réalité de la maladie (avec un système immunitaire actif), nous préparons le terrain pour de futurs essais chez l'homme. Cela permet de vérifier la sécurité et l'efficacité du traitement avec une grande fiabilité. 4. Un moteur pour l'innovation locale Enfin, ce travail ne reste pas enfermé dans un laboratoire. Il est soutenu par des organismes qui aident à transformer les découvertes scientifiques en solutions concrètes. S'il réussit, ce projet pourra déboucher sur la création de brevets et de nouveaux médicaments produits par l'industrie, faisant de notre région un acteur majeur de la lutte contre le cancer.
Procédures
Chaque animal aura : (1) Une mise en place du modèle tumoral sous anesthésie générale : soit par injection sous-cutanée (procédure d'environ 5 min), soit par chirurgie (procédure de 15 à 45 min). (2) Une série d'imageries sous anesthésie générale avec une injection dans la veine de la queue du traceur, durée moyenne : 5 min pour l'injection et 30 minutes pour l'imagerie par session, fréquence maximale : 4 par semaine pendant 2 semaines, ou 1 par semaine pendant 2 mois. (3) Des contentions sur souris vigile 1 à 2 fois par semaine pour mesurer la croissance des tumeurs, environ 2-3 min. (4) Des prélèvements sanguins au niveau de la queue sous anesthésie générale en même temps que les imageries pour limiter le nombre d'anesthésies (temps de prélèvement 1 à 2 min, fréquence : 4 prélèvement le premier jour à 20 minutes d'intervale, puis 1 prélèvement par jour pendant 6 jours).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, l'inconfort pour les animaux peut venir de deux sources : les interventions de l'équipe scientifique et le développement naturel de la maladie. (1). L'inconfort lié aux examens et aux soins Pour tester le traitement, nous devons faire des injections et de petites prises de sang (l'équivalent d'une goutte). Même si ces gestes sont rapides, ils peuvent causer un léger stress ou de petites marques sur la peau. De plus, pour que les images (scanners) soient nettes, les animaux doivent être endormis. Ces anesthésies répétées peuvent fatiguer leur organisme ou rendre leur réveil un peu plus difficile. (2). L'inconfort lié aux interventions chirurgicales Pour certains types de cancers situés à l'intérieur du corps, une petite opération est nécessaire. Comme pour un humain, cela peut provoquer des douleurs juste après l'intervention, des risques de fatigue ou de petites infections au niveau de la cicatrice. (3). L'inconfort lié à l'évolution de la maladie Au fur et à mesure que la tumeur grandit, elle peut gêner l'animal de différentes façons selon l'endroit où elle se trouve : (a) Au cerveau : Elle peut causer des difficultés à se déplacer, des tremblements ou une perte d'appétit. (b) Aux poumons : Elle peut rendre la respiration plus lourde ou plus rapide. (c) Au ventre (pancréas, côlon, prostate) : Elle peut gêner la digestion, provoquer un gonflement du ventre ou des difficultés pour uriner. (d) Au sein : Elle peut créer une gêne physique due à son volume ou fatiguer l'organisme.
Devenir
Les animaux qui développeront des tumeurs seront mis à mort, car ils ne peuvent être soignés et leurs organes et tumeurs seront prélevés afin de faire des analyses post mortem et de potentialiser le maximum d'informations que l'on pourra retirer de cette étude. Les animaux ne développant pas de tumeurs seront gardés en vie et pourront être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
Pour savoir si un médicament contre le cancer fonctionne, il ne suffit pas de regarder s'il tue les cellules dans une éprouvette. Il faut comprendre comment il voyage dans le sang, comment il évite les pièges du corps et s'il arrive à trouver sa cible sans être éliminé trop vite par les reins. Aujourd'hui, aucun ordinateur ni aucun test en laboratoire ne peut reproduire fidèlement cette complexité d'un corps vivant. Pour utiliser le moins d'animaux possible, nous effectuons un tri drastique en amont : (1) Vérification des cibles : Nous ne travaillons qu'avec des cellules dont nous sommes certains qu'elles portent la "serrure" (le récepteur) que notre médicament doit ouvrir. (2) Tests de laboratoire préalables : Avant d'être testé chez la souris, chaque nouveau médicament doit prouver son efficacité dans des tubes à essais. Si la molécule ne s'accroche pas parfaitement aux cellules en laboratoire, elle est abandonnée et n'est jamais testée sur l'animal. Nous utilisons des modèles de souris spécifiques qui permettent soit d'étudier des tumeurs humaines, soit d'observer comment les défenses naturelles (le système immunitaire) réagissent au traitement. C'est cette précision qui nous permet d'obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d'études nécessaires.
Réduction
Grâce aux caméras de haute technologie (l'imagerie), nous pouvons suivre l'évolution d'une tumeur chez la même souris tout au long de l'étude. Autrefois, il fallait sacrifier des groupes d'animaux à chaque étape pour comprendre ce qu'il se passait. Aujourd'hui, une seule souris nous donne des informations sur plusieurs semaines, ce qui divise massivement le nombre d'animaux nécessaires. Nous ne lançons pas d'études au hasard. Avant de passer à l'étape animale, nous effectuons de nombreux tests en éprouvette. Si nous connaissons déjà bien un modèle de cancer grâce à nos travaux précédents, nous sautons les étapes de mise au point pour aller directement à l'essentiel. Cela évite d'utiliser des animaux pour des étapes de préparation inutiles. Nous utilisons des outils statistiques pour calculer exactement combien d'animaux sont nécessaires pour que nos résultats soient vrais et incontestables : Pour l'étude du voyage du médicament : Nous avons calculé qu'il nous faut environ 10 souris par groupe pour comparer nos 4 molécules de manière fiable. Pour l'étude de l'efficacité du traitement : Nous utilisons 12 souris par groupe. Ce nombre est un peu plus élevé pour nous permettre de suivre la survie des animaux sur le long terme et de garantir que nos conclusions sur l'efficacité du soin sont solides. En résumé, chaque animal compte. Nous n'utilisons que le strict minimum pour garantir que les futurs traitements pour les patients seront basés sur des preuves scientifiques indiscutables.
Raffinement
Le "Raffinement" consiste à mettre en place toutes les mesures possibles pour réduire le stress et la douleur des animaux durant l'étude. (1). Un cadre de vie plus agréable. Pour que les souris se sentent bien, nous aménageons leurs cages avec des accessoires : petites maisons, coton pour faire des nids et tunnels pour se cacher. Si une souris est un peu fatiguée, nous lui facilitons la vie en plaçant une nourriture spéciale (plus molle ou sous forme de gelée) directement au sol pour qu'elle puisse manger sans faire d'effort. Les souris sont hébergées par groupe de 5 afin d’avoir un contact social nécessaire à l’espèce et sont laissées tranquilles pendant une période d’au moins 7 jours lors de leur arrivée pour qu’elles s’habituent à leur nouvel environnement. La zone d’hébergement et d’expérimentation est une zone très propre sans aucun microbe : tout le matériel est stérilisé, le flux d’air est filtré et indépendant pour chaque cage, l’eau de boisson est filtrée et la nourriture est irradiée, afin d’avoir un environnement complètement sain pour nos souris avec un système immunitaire déficient. (2). Une gestion rigoureuse de la douleur et des soins. Contre la douleur : Pour chaque opération, nous utilisons plusieurs types d'antidouleurs. C'est comme pour une chirurgie humaine : nous combinons des médicaments qui agissent sur tout le corps avec des produits anesthésiants appliqués directement sur la zone de l'opération. Soins attentifs : Nous surveillons très précisément la cicatrisation. Si un signe d'infection apparaît, nous donnons des antibiotiques après avis d'un vétérinaire. Maintien de la chaleur : Comme l'anesthésie a tendance à refroidir le corps, les souris sont systématiquement installées sur des tapis chauffants pendant les examens et jusqu'à leur réveil complet. (3). Une surveillance de chaque instant. Les souris sont visitées chaque jour et 2 fois par semaine, nous utilisons une grille de suivi pour noter l'état de santé de chaque animal. Nous avons fixé des limites très claires : si un début de mal-être est perçu, des actions adaptées à la cause sont mises en place, comme des antalgiques, des pommades cicatrisantes, de la nourriture plus appétissante, des antibiotiques ; et si une souris perd trop de poids ou si elle commence à avoir de vraies difficultés à respirer ou à se déplacer, nous prenons la décision de l'endormir définitivement. Le but est d'obtenir des réponses scientifiques sans jamais laisser une souffrance inutile s'installer.
Choix des espèces
La souris est l'animal de référence pour ce projet pour plusieurs raisons pratiques et scientifiques : 1. Une compatibilité avec les cellules humaines Certaines souris ont un système de défense naturel (immunité) volontairement affaibli, ce qui nous permet d'étudier directement des tumeurs humaines. Pour d'autres tests, nous utilisons des souris avec un système immunitaire complet pour observer comment les défenses naturelles réagissent au traitement. 2. Un format idéal pour nos caméras La petite taille de la souris est parfaitement adaptée à nos scanners de haute précision. Cela nous permet de voir avec une grande clarté où se fixe le médicament radioactif dans le corps, tout en utilisant des quantités très faibles de produit. 3. Des connaissances déjà solides Le corps de la souris est très bien connu des scientifiques. Nous savons déjà comment nos cibles (les "serrures" sur lesquelles le médicament se fixe) fonctionnent chez elle. Cela nous permet de comparer nos résultats avec d'autres études déjà réalisées et d'être plus confiants dans nos conclusions. 4. Des réponses prévisibles pour utiliser moins d'animaux Les souris utilisées en laboratoire sont biologiquement très proches les unes des autres. Cette similitude garantit que leurs corps réagiront de façon très semblable au traitement. Cela réduit les différences de résultats "au hasard" et nous permet d'obtenir des preuves scientifiques solides avec un nombre d'animaux réduit au strict minimum.
Rôle du système nerveux périphérique sur la physiopathologie de la tuberculose pulmonaire dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
Génétiquement modifiées pour visualiser leur système nerveux, 2943 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 1020 classées sévères, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par la tuberculose, une infection sous anesthésie brève, l'autre plus longue, puis reçoivent des traitements pharmacologiques jusqu'à 42 jours. Les effets attendus vont de la perte de poids à la détresse respiratoire, en passant par des troubles moteurs et l'isolement social. Les retombées annoncées contre une maladie qui reste une cause majeure de mortalité mondiale sont formulées comme un espoir, face à des atteintes immédiates et certaines sur plus d'un millier d'animaux en souffrance sévère.
Objectifs
La tuberculose pulmonaire est une maladie provoquée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis. La personne infectée développe une inflammation chronique qui change, parfois de façon irréversible, l’architecture de ses poumons. Des travaux récents ont révélé que cette infection entraîne aussi des modifications importantes dans l’organisation du système nerveux périphérique. Cependant, on ignore encore la nature exacte de ces changements. Permettent-ils une meilleure interaction avec le système immunitaire local ? Contribuent-ils à la résolution de la pathologie ? Ou à son aggravation ? L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment le système nerveux périphérique s’adapte à l’infection par Mycobacterium tuberculosis au niveau des poumons. Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser et de manipuler différents compartiments du système nerveux. Ces modèles permettront d’identifier les cellules nerveuses impliquées, de suivre leur évolution pendant l’infection, et d’évaluer leur rôle fonctionnel dans la progression de la maladie. Plus précisément, nous étudierons : ● Le remodelage des fibres nerveuses autour des bronches, ● Le rôle des cellules qui les accompagnent et les soutiennent dans ce processus, ● Les interactions entre cellules nerveuses et cellules immunitaires dans le tissu pulmonaire infecté. Ces analyses utilisent des approches d’imagerie (microscopie), de biologie cellulaire (tri et culture de cellules), et des techniques avancées de séquençage pour étudier finement les réponses des cellules nerveuses et immunitaires au cours du temps. À terme, ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes de communication entre système nerveux et système immunitaire dans un contexte infectieux. Ces connaissances pourraient ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour mieux contrôler l’inflammation et les dégâts pulmonaires associés à la tuberculose.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter des bénéfices scientifiques et médicaux importants dans la lutte contre la tuberculose, une maladie qui reste aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité infectieuse dans le monde. Les résultats attendus permettront d’améliorer notre compréhension d’un aspect encore très peu étudié de la maladie : l’implication du système nerveux dans les infections pulmonaires chroniques. En effet, il est de plus en plus évident que les nerfs présents dans les poumons ne sont pas de simples structures passives, mais qu’ils peuvent influencer l’inflammation, la réparation des tissus, et même la réponse immunitaire face aux bactéries. En étudiant précisément le rôle de différents types de nerfs et de cellules nerveuses pendant l’infection tuberculeuse, ce projet pourra : ● Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter les dégâts causés aux poumons pendant la maladie, ● Mieux comprendre pourquoi certains patients développent des formes sévères de tuberculose avec des atteintes pulmonaires importantes, ● Éclairer le rôle du système nerveux dans d’autres maladies inflammatoires chroniques du poumon. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer au développement de stratégies dites « à visée neuro-immunologique », c’est-à-dire ciblant les interactions entre les nerfs et le système immunitaire pour mieux contrôler l’inflammation. Ce type d’approche est déjà en cours d’exploration dans d’autres pathologies (maladies auto-immunes, cancer), mais n’a jamais été appliqué à la tuberculose. Sur le plan fondamental, ce projet aidera également à mieux comprendre comment les cellules de soutien des nerfs (appelées cellules de Schwann) peuvent changer de fonction en réponse à une infection et participer aux mécanismes de défense ou de réparation. Ces connaissances pourront donc aussi bénéficier à d’autres domaines de recherche, comme la régénération nerveuse ou les maladies neuro-inflammatoires.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à plusieurs types d’interventions : ● Deux types d’infections différentes : l’une sous anesthésie générale d'une durée de 30 seconde , l’autre d’une durée de 40-45min au total. ● Des injections engendrant une contention de 1min. ● Des traitements pharmacologiques ciblés d’une durée de maximale de 42 jours. ● Des manipulations génétiques conditionnelles par administration d’une substance d’une durée maximale de 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables répertoriés précédent pourraient être en fonction des procédures : une perte de poids, une baisse d'activité, des troubles moteurs, une perte d'appétit, une altération du comportement, une détresse respiratoire modérée, une altération temporaire de l'état général, une diminution des interactions sociales.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet feront l’objet d’analyses approfondies. Ils seront donc mis à mort de manière programmée et encadrée à la fin des procédures expérimentales pour répondre au mieux aux problématiques scientifiques.
Remplacement
L’étude proposée cherche à comprendre comment les nerfs pulmonaires et les cellules du système immunitaire interagissent lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis. Aujourd’hui, aucun modèle de culture cellulaire ou système artificiel ne permet de reproduire fidèlement la complexité du tissu pulmonaire, notamment l’organisation des nerfs et des cellules gliales dans un environnement en 3 dimensions, avec toutes les interactions mécaniques, nerveuses, vasculaires et immunitaires qui se produisent dans un animal vivant. La bactérie responsable de la tuberculose (M. tuberculosis) se développe très lentement et son comportement dépend fortement du fonctionnement global du corps. Les alternatives existantes ne permettent pas de suivre l’évolution réelle de l’infection, ni les modifications des nerfs ou des cellules. Pour toutes ces raisons, l’utilisation de la souris reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques du projet : identifier les types de nerfs impliqués, comprendre leur rôle pendant l’infection, et explorer la manière dont les cellules s’adaptent à la présence de la bactérie. Aucun autre modèle ne permet actuellement d’atteindre ces objectifs de manière fiable.
Réduction
Les effectifs proposés ont été définis à partir de données préliminaires, d’expériences antérieures réussies et d’outils d’analyse statistique reconnus. Les résultats seront traités avec des méthodes statistiques appropriées, permettant d’évaluer les différences entre groupes de manière rigoureuse sans multiplier inutilement les animaux. Nous avons également mis en place des approches permettant d’extraire plusieurs types d’informations à partir d’un seul animal. Par exemple, à partir d’un même poumon, nous réalisons l’analyse des bactéries présentes, l’étude de l’expression des gènes, et le dosage des molécules inflammatoires. Enfin, le projet suit une logique progressive : si une étape expérimentale ne donne pas de résultats exploitables, elle sera arrêtée immédiatement.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin de minimiser les nuisances pour les animaux. Les temps de contention lors des phases d’infection et d’injection seront réduits au strict minimum nécessaire. Une surveillance renforcée sera établie après chaque intervention. Une grille de scoring ainsi que des points limites précoces et adaptés à chaque procédure seront mis en place pour suivre au mieux l’évolution de l’état général des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce avec une réponse immunitaire bien caractérisée et comparable à celle de l’humain. Ce modèle permet aussi d’examiner finement les interactions entre nerfs périphériques, cellules gliales, et cellules immunitaires dans le contexte pulmonaire. De nombreuses lignées transgéniques nécessaires à ce projet sont disponibles chez la souris et permettent d’isoler, tracer ou manipuler spécifiquement les populations cellulaires ciblées. Seules des souris adultes (6 à 10 semaines) seront utilisées. Ce stade garantit une immunité pulmonaire mature, indispensable pour étudier les conséquences de la tuberculose.
Etude par imagerie moléculaire du rôle de l’inflammation intestinale dans l’accident vasculaire cérébral chez la souris Mus musculus – Etude pilote
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
À J1, une colite est déclenchée chez la moitié des 120 souris par un produit dans l'eau de boisson, à J5 vient une IRM sous anesthésie, à J6 un AVC provoqué par injection de thrombine lors d'une chirurgie d'une à deux heures, puis deux IRM à J7 et J13. Ces souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec diarrhées, saignements rectaux et faiblesse d'une patte. L'étude déclare n'être qu'un pilote, destiné à calibrer une expérience plus large sur les liens entre inflammation intestinale et AVC. Toutes sont tuées à J13 par exsanguination pour prélever cerveau et intestin.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un enjeu majeur de santé publique. Le traitement de l’AVC ischémique repose actuellement sur la thrombolyse et/ou la thrombectomie. Cependant, ces interventions ne sont pas toujours réalisables et ne garantissent pas une récupération fonctionnelle complète. Cela justifie le développement de nouveaux outils pronostiques et thérapeutiques. Le rôle de l’inflammation intestinale dans la pathophysiologie de l’AVC suscite un intérêt croissant. Plusieurs travaux récents mettent en évidence des interactions étroites entre inflammation intestinale et neuroinflammation post-AVC. Dans ce contexte, l’objectif principal de ce projet pilote est de réaliser des expérimentations préliminaires visant à évaluer l’impact d’un état inflammatoire intestinal élevé sur la sévérité de l’AVC dans un modèle murin. Les données obtenues permettront d’optimiser les protocoles ultérieurs, en fournissant notamment les éléments statistiques nécessaires à une estimation rigoureuse du nombre d’animaux requis, dans une logique de réduction et de raffinement conformément aux principes des 3R. Ces expérimentations préliminaires aideront également à identifier d’éventuelles contraintes techniques ou biologiques, afin d’ajuster au mieux les procédures et d’améliorer le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude pilote constitueront une base expérimentale pour une étude de plus grande envergure, destinée à approfondir l’analyse des interactions entre l’inflammation intestinale et la neuroinflammation post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une séquence expérimentale unique comprenant l’induction d’une inflammation intestinale, des examens IRM, l’induction d’un AVC thromboembolique et la mise à mort pour analyses histologiques. 1. Induction de l’inflammation intestinale (J1–J5) Chez la moitié des animaux (n = 60), une inflammation intestinale modérée sera induite par administration de DSS 2 % dans l’eau de boisson pendant 5 jours. Cette étape ne nécessite pas d’anesthésie. Un suivi clinique quotidien sera assuré. 2. IRM moléculaire (J5) Tous les animaux (n = 120) seront anesthésiés à l’isoflurane (2 % dans O₂/N₂O 30/70) pour un examen IRM de 30 à 45 minutes. Un cathéter sera inséré dans la veine caudale pour l’injection de MPIO, puis retiré en fin de séance. Une analgésie locale (lidocaïne/xylocaïne) sera appliquée au point d’insertion. 3. Induction du modèle d’AVC (J6) Sous anesthésie générale (isoflurane 2 % dans O₂/N₂O 30/70) et analgésie systémique (buprénorphine 0,1 mg/kg s.c. en prémédication), une chirurgie stéréotaxique sera réalisée pour induire une ischémie focale par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne. La procédure dure 60 à 90 minutes. Les animaux recevront ensuite soit du tPA (10 mg/kg i.v.), soit une solution saline. 4. IRM post-AVC (J7 et J13) Deux nouveaux examens IRM seront réalisés sous les mêmes modalités anesthésiques (isoflurane 2 %, durée 30–45 min) afin d’évaluer le volume lésionnel, la neuroinflammation et l’inflammation intestinale. 5. Mise à mort et prélèvements (J13) À l’issue du dernier examen, les animaux encore sous anesthésie générale seront mis à mort par exsanguination induite par perfusion intracardiaque de sérum physiologique (isoflurane 5 % en O₂/N₂O 30/70 ; fentanyl 0,3 mg/kg i.p. en prémédication). Les organes d’intérêt (cerveau, intestin) seront prélevés immédiatement pour analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Le modèle d’induction d’une inflammation intestinale par traitement au DSS peut entraîner une perte de poids, des diarrhées et des saignements rectaux. Ces symptômes seront suivis avec attention grâce à l’utilisation quotidienne d’échelles de scores cliniques déjà établies, permettant un ajustement rapide des soins si nécessaire. Nos travaux antérieurs ont de plus montré que la dose de 2 % utilisée dans cette étude n’entraîne que des signes modérés de colite tout en induisant une inflammation intestinale suffisante pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Concernant le modèle d’AVC, certains animaux peuvent présenter des signes transitoires de douleur dans les heures suivant la chirurgie, ainsi qu’un affaiblissement temporaire de la patte avant gauche, correspondant à la zone cérébrale lésée, qui disparaît généralement au cours de la première semaine. Afin de limiter au maximum toute forme d’inconfort ou de souffrance, des analgésiques locaux seront appliqués au niveau du site chirurgical avant l’intervention, et des analgésiques systémiques seront administrés avant et après l’intervention. La surveillance quotidienne des animaux, associée à ces conditions environnementales contrôlées et à la prise en charge analgésique, permettra de réduire autant que possible les nuisances et la douleur liées aux procédures expérimentales.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux (n = 120) seront mis à mort afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques indispensables à la compréhension des mécanismes étudiés. Ces prélèvements visent notamment à confirmer et compléter les observations issues des analyses d’imagerie in vivo (IRM), en permettant une évaluation fine des lésions cérébrales, de la neuroinflammation et de l’inflammation intestinale. Les échantillons obtenus fourniront également les données quantitatives nécessaires à l’optimisation et à la standardisation des protocoles ultérieurs. La mise à mort interviendra à la fin de la procédure. La mise à mort de tous les animaux se justifie par la nécessité scientifique de disposer de tissus parfaitement préservés pour les analyses post-mortem et par le souci constant de limiter toute utilisation et toute souffrance inutile, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).
Remplacement
Les modèles animaux constituent à ce jour les outils expérimentaux les plus pertinents pour répondre à la question scientifique posée. En effet, aucun modèle de substitution disponible actuellement ne permet de reproduire la dimension multi-organe de la pathophysiologie de l’AVC étudiée ici et, donc d’apporter une réponse adéquate à la problématique susmentionnée.
Réduction
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques ne pouvant être ici exclue, nous veillerons à en limiter le recours au strict nécessaire. La présente demande d’autorisation de projet couvre une étude pilote, dont les résultats permettront de mieux anticiper et d’optimiser l’utilisation d’animaux lors des études ultérieures. Nonobstant le caractère préliminaire de cette étude, nous nous attachons à réduire le nombre d’animaux employés, tout en conservant un effectif suffisant pour assurer la robustesse et la validité des analyses. Par ailleurs, l’utilisation de méthodologies d’imagerie in vivo autorise le suivi longitudinal des mêmes individus et contribue, de fait, à la réduction du nombre total d’animaux nécessaires. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires tient également compte des aspects méthodologiques de la procédure expérimentale, notamment l’habileté et l’expérience de l’expérimentateur, ainsi que des risques de perte inhérents à la conduite de la procédure.
Raffinement
Au cours de la procédure expérimentale, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux. La procédure inclut des modèles et des modalités d’imagerie susceptibles d’entraîner certaines nuisances et/ou un stress. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi quotidien assuré par du personnel qualifié. Les symptômes intestinaux induits par le traitement au DSS seront évalués quotidiennement à l’aide d’une échelle de score spécifique, permettant d’anticiper la persistance ou l’aggravation des nuisances. Des protocoles validés d’anesthésie et d’analgésie seront également mis en œuvre, notamment lors de l’induction du modèle d’AVC et des examens IRM, afin de limiter au maximum toute forme de douleur, de détresse ou d’angoisse liées aux interventions. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel expérimenté et formé aux procédures chirurgicales et aux soins post-opératoires. Les animaux seront hébergés en petits groupes sociaux (n=5) dans des cages standard, dans des conditions conformes aux normes européennes en vigueur (température stabilisée à 21 °C, hygrométrie de 55 %, intensité lumineuse de 100 lux, et cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h), avec du matériel d’enrichissement et un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie comme espèce expérimentale pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique et de sa faisabilité technique. La physiologie murine, notamment en ce qui concerne le système immunitaire intestinal et la réponse neuroinflammatoire post-AVC, présente des similitudes établies avec celle de l’humain, permettant ainsi d’étudier de manière appropriée les interactions entre inflammation intestinale et sévérité de l’AVC. De plus, des modèles murins bien caractérisés existent à la fois pour l’induction d’une colite expérimentale et pour l’ischémie cérébrale thromboembolique focale, avec des protocoles reproductibles et validés à l’échelle internationale. Enfin, aucune alternative in vitro ou modèle in silico ne permet aujourd’hui de reproduire de manière intégrée les interactions multi-organes dans le contexte post-AVC, rendant l’utilisation de la souris indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. L’AVC est une pathologie qui touche principalement l’adulte, le plus souvent au-delà de 65 ans, mais son incidence augmente également chez l’adulte jeune. Pour reproduire au mieux la pathophysiologie humaine, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), stade où la maturation physiologique et la réponse neurovasculaire sont comparables à celles de l’adulte humain.
Etude de la toxicité aigüe et du potentiel sensibilisant de substances chimiques, agrochimiques ou pharmaceutiques sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle souris.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
La toxicité testée peut aller jusqu'à tuer l'animal, et celui qui atteint un point limite est mis à mort avant la fin de l'étude. 1 275 souris vont être utilisées, hébergées seules pour partie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. On leur administre par gavage, sur la peau ou par injection des produits chimiques, agrochimiques ou pharmaceutiques dont les effets vont des convulsions et tremblements aux brûlures cutanées. Le porteur indique que le nombre d'animaux est fixé par les normes réglementaires et qu'aucun test statistique n'est fait pour le réduire.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques dans un contexte réglementaire ou de recherche et développement afin de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Parmi les paramètres permettant d’évaluer la toxicité d’un produit chimique, nous évaluons sa toxicité systémique aigüe et son potentiel sensibilisant. Pour répondre aux exigences des instances réglementaires européennes ou de recherche avant mise sur le marché de produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests de toxicité systémique aigue ou de sensibilisation. Pour cela, le produit à tester est administrée par la voie qui convient chez la souris afin de déterminer la toxicité du produit, par les différents signes cliniques observés et les mortalités dénombrées.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’évaluer la dangerosité potentielle d'une substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique pour la santé humaine. Ces études de toxicité et de sensibilisation permettront de définir les conditions de sécurité nécessaires pour leur manipulation lors de leur fabrication, leur stockage, leur transport et leur utilisation. Sur un plan plus large, ces évaluations, basées sur des normes réglementaires très strictes, permettent d’évaluer l’innocuité des médicaments ou des denrées alimentaires destinées à l'homme ou aux animaux.
Procédures
Toxicité aiguë orale : traitement unique par gavage (temps de contention + gavage maximum 1min). Pesée à J0, J2, J7 et J14 (1min). Observations cliniques répétées dans les premières heures puis quotidiennes (si l’animal ne présente aucun signe il est observé dans sa cage, sinon il est tenu par l’expérimentateur sans contention pendant un temps pouvant varier en fonction des signes (max 5min)). Procédure pour la mise à mort (30sec x2). – Toxicité aiguë dermique : rasage (30 sec), traitement unique local par patchage (30 sec) / dépatchage (30 sec) (mise d’un pansement pendant 24h puis retrait). Pesée à J0, J2, J7 et J14 (1min). Observations cliniques répétées dans les premières heures puis quotidiennes (si l’animal ne présente aucun signe il est observé dans sa cage, sinon il est tenu par l’expérimentateur sans contention pendant un temps pouvant varier en fonction des signes (max 5min)). Procédure pour la mise à mort (30 sec x2). - Sensibilisation cutanée : 3 applications locales sur les oreilles (30secondes/animal) et 2 mesures de l’épaisseur de l’oreille (10secondes/animal) sur animaux vigiles. Pesée à J0 et J6. Une injection intrapéritonéale à J5 sur animaux vigiles (30secondes/animal). Procédure pour la mise à mort (30 sec x2).
Impact sur les animaux
Concernant les études de toxicité systémique, les réactions attendues sont des signes cliniques généraux relevant d’une toxicité systémique : augmentation/diminution de l’activité spontanée des animaux ; diminution du réflexe de Preyer (mouvement involontaire des oreilles lors d’une stimulation auditive) ; augmentation/diminution de la respiration, de la température corporelle, et du tonus musclaire ; limitation du réflexe de retournement ; aspect anormale de la ptose palpébrale (abaissement de la paupière supérieure), de l’aspect de la pupille, de l’aspect du poil ; observation de convulsions, tremblements, salivation, et larmoiement. La toxicité systémique peut également aboutir à la mort de l’animal. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être mise à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. Pour le test de toxicité par voie dermique, en plus des effets systémiques, des réactions locales limitées à la zone de traitement peuvent être observées (sécheresse cutanée, perte de souplesse de la peau, érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escharre et/ou de croûte, desctruction de l’épidermes et du derme, œdème). Pour le test de sensibilisation, en plus des effets systémiques, des réactions locales limitées à la zone de traitement peuvent également être observées (sécheresse cutanée, érythème, œdème). De plus les animaux sont hébergés seuls. Il nous est impossible d’estimer ou de prédire la durée de ces nuisances car elles seront dépendantes du produit testé. En revanche, des grilles d’évaluation sont mises en place en parallèle pour suivre le bien-être de l’animal, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. De plus les animaux traités par voie orale seront avant le test mis à jeûn pendant plusieurs heures (max 4h), les animaux traités par voie dermique seront isolés pendant la durée de l’application (24 heures) et les animaux utilisés pour le test de sensibilisation seront hébergés en cage individuelle.
Devenir
Tests de toxicité aiguë : mise à mort pour autopsie avec observation des sites de traitement. Test de sensibilisation: mise à mort puis récupération des ganglions (si besoin).
Remplacement
L’ensemble de ces tests n’est mené qu’après analyse de la fiche de données sécurité par le directeur d’étude. Ces fiches rassemblent l’ensemble des données permettant de caractériser le produit : identité et structure chimique, propriétés physico-chimiques, résultats obtenus dans tous les autres essais de toxicité in vitro et in vivo, données toxicologiques de substance structurellement apparentées et l’usage escompté. L’analyse de ces fiches permettra de déterminer la dose de produit au démarrage de l’étude, et des études d’irritation et de corrosion in vitro (sur tissus de peau reconstitués) peuvent également être exigées si un doute persiste sur le produit avant le début de l’étude in vivo. Néanmoins à ce jour aucun modèle in vitro permettant d’évaluer la toxicité systémique aiguë des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques n’est décrite dans les normes communément accepté pour autoriser la mise sur le marché. Concernant l’évaluation du potentiel sensibilant d’un dispositif, là encore, à l’heure actuelle aucun modèles in vitro n’est assez élaborés pour être représentatif d’un organisme vivant et donc accepté par les autorités réglementaires pour accorder une mise sur le marché.
Réduction
Ces tests ne sont réalisés que sur un seul sexe afin de limiter le nombre d’animaux. Des femelles sont préférentiellement utilisées car elles sont moins agressives. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étape est fixé par les normes spécifiques aux procédures. Et ne peut donc pas être réduit. En effet pour établir ces normes des tests statistiques ont été réalisés pour établir le nombre d’animaux nécessaire pour statuer sur la toxicité d’un produit. Ces tests statistiques ne sont donc plus faits en routine. Le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vu du nombre de tests effectués les années précédentes. Aucun test statistique ne sera effectué dans ces projets.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par groupe de 5 animaux, par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. Seuls les animaux participant au test de sensibilisation sont hébergés individuellement. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont transparentes avec une grille perforée sur le dessus et contiennent de la litière constituée de copeaux de bois résineux déshydratée puis tamisée, ainsi que des frisottis, une balençoire et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. Les cages des souris hébergées en individuel sont placées les unes à côté des autres pour permettre un lien visuel (paroi transparente) et olfactif et auditif (grille pour fermer la cage au-dessus) entre les animaux. Pour le test de sensibilisation un essai préliminaire, sur un nombre le plus réduit possible d’animaux, est effectué afin de déterminer la dose non irritante qui sera testé lors de l’essai définitif sur un plus grand nombre d’animaux. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. Les points limites sont définis pour ces tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux. Enfin, une permanence est effectuée les week-ends et jour fériés par le personnel du laboratoire. Au vu du but de ces tests (évaluation des effets toxiques ou sensibilisant d’un produit) aucune médication ne pourra être mis en place durant la phase expérimentale car cela biaiserait les résultats des études. Les seules étapes de soins pouvant être mis en place sont l’isolement de l’animal afin de mieux l’observer (comportements, selles, alimentation), mise en place d’une lampe chauffante dans le cas d’une diminution de la température, nourriture mouillée et broyée pour faciliter la prise alimentaire, désinfecter une blessure, réhydratation par injection de sérum physiologique. L’ensemble de ces étapes sera mis en place sur conseil et avec l’accord du vétérinaire.
Choix des espèces
La souris, reste le modèle de choix utilisé pour ces essais, cela est décrit dans des normes réglementaires. Ce sont ces normes qui imposent l’espèce a utilisé en fonction du test. Des souris d’espèce différente sont utilisées pour les tests de toxicité et pour le test de sensibilisation. Ces normes imposent également le stade de développement des animaux qui est de 8 à 12 semaines. Les femelles utilisées sont nullipares et non gravides.
Évaluation par IRM des ultrasons focalisés pour ouvrir la barrière hématoencéphalique et améliorer le traitement des métastases cérébrales du cancer du sein chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rendues immunodéficientes pour accepter des cellules tumorales humaines, 298 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. On leur implante des métastases cérébrales de cancer du sein, puis on ouvre leur barrière hémato-encéphalique par ultrasons pour y faire passer une chimiothérapie, au risque d'un œdème ou d'une hémorragie du cerveau. Les tumeurs peuvent provoquer maux de tête, troubles neurologiques et perte de poids. Leur cerveau est prélevé après la mise à mort, pour analyses histologiques et moléculaires.
Objectifs
Les métastases cérébrales (MCs) du cancer du sein représentent une complication fréquente et sévère chez les patientes atteintes d’un cancer du sein avancé. L’utilisation de nouveaux traitements, tels que les conjugués anticorps-médicaments, a démontré son efficacité dans le traitement des cancers du sein primaires. Cependant, la barrière hémato-encéphalique en limite l’efficacité dans le cas des atteintes cérébrales. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de ces conjugués anticorps-médicaments dans le traitement des MCs, en les combinant avec des ultrasons afin d’ouvrir temporairement la barrière hémato-encéphalique. Grâce à cette technique, qui induit la formation de pores dans la barrière, les traitements pourraient ainsi atteindre plus efficacement les cellules cancéreuses localisées dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Le traitement actuel des métastases cérébrales est restreint et permet de prolonger la survie des patientes pour quelques mois seulement. Le frein majeur à l’amélioration des soins reste principalement sur la barrière hémato-encéphalique. Ce projet vise à valider l'efficacité de la combinaison des ultrasons avec les traitements dans le but de poursuivre vers un essai clinique.
Procédures
L’implantation cellulaire par chirurgie sera réalisée une seule fois pendant 30 minutes sur une souris anesthésiée. La pose du cathéter (3 fois par semaine, toutes les deux semaines pendant 6 semaines) et les injections intraveineuses (3 fois par semaine, toutes les deux semaines pendant 6 semaines) sont réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, afin de limiter la douleur et le stress.
Impact sur les animaux
Les animaux développeront des tumeurs intracrâniennes qui peuvent entraîner : - Des maux de tête - Des étourdissements - Des symptômes neurologiques - Une perte de poids liée au cancer Les contentions multiples (pesée, traitement, suivi par imagerie) peuvent générer du stress chez l’animal. Les injections de chimiothérapies peuvent s’accompagner d’effets indésirables tels que : - Nausées, perte d’appétit – fatigue. Très rarement, les injections répétitives de traitements au même point d’injection peuvent engendrer des irritations ou infections locales. Les nuisances et effets indésirables prévus sur les animaux par le protocole ultrasons pourraient être : - Une surdose ultrasonore peut entraîner un risque d’œdème cérébral local ou d’hémorragie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour collecter le cerveau, à des fins d’analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
En amont de ce projet, nous avons réalisé des études in vitro préliminaires pour évaluer les traitements sur nos lignes cellulaires, pour affiner les paramètres des ultrasons, et limiter le nombre d’expériences in vivo. Cependant, la barrière du cerveau et son environnement cérébral ne sont pas reproductibles in vitro à ce jour. Ni la modélisation in silico, ni l’expérimentation in vitro ne permettent de prédire l’efficacité de la délivrance des molécules et l’impact du traitement ultrasonore sur le tissu. Il est donc indispensable d’utiliser des modèles animaux.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé des guides statistiques et des résultats préalables détaillés dans la littérature. Grâce à ces approches, nous avons déterminé que des groupes expérimentaux composés de 12 animaux permettront d’obtenir des résultats statistiquement corrects qui ne compromettront pas l’interprétation de nos résultats.
Raffinement
L’ensemble des actes effectués chez les animaux seront faits par des personnes formées. Chaque suivi par imagerie sera réalisé sous anesthésie et l’animal sera maintenu sur un tapis chauffant pour assurer son bien-être. Lors des sessions de thérapie, les injections seront réalisées sous anesthésie. Les souris seront hébergées en groupe avec un milieu enrichi. Des points limites seront définis en amont des interventions, ceux-ci auront vocation à limiter et surtout éviter une souffrance animale. Une grille de score basée sur ces points limites sera utilisée.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné la souris pour notre étude, car il a été démontré, par l’utilisation de cellules de cancer du sein, qu’elle était capable de développer la pathologie avec les mêmes manifestations que l’humain. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines. A cet âge, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise de l’implantations. Les souris sont immunodéficientes car les cellules injectées sont des cellules d’origines humaines ainsi il n’y a pas de rejet de la l’implantation. Les individus sélectionnés sont exclusivement des femelles. Ce choix résulte du fait que la pathologie touche presque uniquement les femmes.
Évaluation du potentiel thérapeutique du leucettinib-21 pour le traitement des déficits neurologiques après un accident vasculaire cérébral (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué, puis elles reçoivent pendant dix jours un composé oral, le leucettinib-21, avec IRM, tests comportementaux et imagerie cérébrale, avant une perfusion intracardiaque et le prélèvement de la boîte crânienne. Les souris utilisées ont seize mois, un âge choisi pour reproduire la vulnérabilité liée au vieillissement. La nouvelle thérapie annoncée pour les patients victimes d'AVC reste une perspective, quand les lésions cérébrales infligées, elles, sont immédiates.
Objectifs
Le Leucettinib-21, un inhibiteur de la kinase DYRK1A, a démontré des effets prometteurs sur la cognition et l'inflammation dans des modèles précliniques de la trisomie 21 et de la maladie d'Alzheimer. Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) demeurent une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde, entraînant souvent des déficits neurologiques significatifs dus aux lésions cérébrales et à une inflammation persistante. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet neuroprotecteur du Leucettinib-21 dans un modèle murin d'AVC et de déterminer sa capacité à améliorer la récupération fonctionnelle post-AVC. Ce projet se déroule dans deux établissements différents.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait révéler une potentielle nouvelle thérapie innovante pour réduire les déficits neurologiques et améliorer la qualité de vie des patients victimes d'un AVC.
Procédures
Les procédures expérimentales (chirurgie, imagerie, comportement, administration du traitement) sont réalisées dans un premier établissement utilisateur. L’hébergement des animaux, le suivi clinique post-procédural et la surveillance quotidienne sont assurés dans un second établissement utilisateur, situé à proximité immédiate et relié par un accès interne Pour tous les animaux : EU 1/2 : Induction de l’ischémie (J0 ; 60 minutes) Imagerie IRM de la lésion ischémique (J1 ; 10 minutes) Traitement oral (J2 à J11 ; 2 minutes par jour) Tests comportementaux (J-2, J2, J7, J13 ; 30 minutes par jour) Imagerie du débit sanguin cérébral et de la connectivité fonctionnelle par ultrasons (fUS) (J14 ; 60 minutes) Perfusion intracardiaque - (J14 ; 15 minutes) EU 2/2 : Hébergement, suivi post opératoire, surveillance quotidienne (5 minutes)
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour leur habituation et la gestion de leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et de la désorientation à la suite de l’AVC. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et par le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids, observation dans la cage en s’assurant du bien-être des animaux, Mouse Grimace Scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux de la procédure seront mis à mort afin de prélever les boites craniennes pour de futures analyses.
Remplacement
Les procédures expérimentales prévues pour la réalisation du projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants, car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La physiopathologie du modèle, globalement établie, nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra de mieux comprendre la physiopathologie de l’accident vasculaire cérébral et de ce fait améliorer la récupération des patients.
Réduction
Notre projet ne permettant pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux conformément au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes mises en œuvre, de la littérature scientifique et de nos travaux antérieurs. Pour chaque phase du projet, le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour permettre une analyse robuste des résultats. Les effectifs ont été définis à partir d’analyses préalables basées sur des données issues de modèles comparables déjà utilisés au sein de l’unité et décrits dans la littérature. Les tailles de groupes ont également été ajustées afin de prendre en compte les contraintes liées au modèle expérimental utilisé, notamment la variabilité interindividuelle et la mortalité associée à l’âge des animaux et au modèle d’AVC. Le nombre d’animaux pourra être ajusté à la baisse en fonction de l’expérience acquise au cours du projet. Enfin, l’ensemble des échantillons biologiques prélevés pourra être partagé et exploité pour plusieurs analyses, contribuant ainsi à une réduction supplémentaire du nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun comportement de maladie. Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (échelle de grimace de la souris) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle malgré les soins apportés. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra en un simple coup d’oeil d’identifier et de surveiller particulièrement les animaux les plus « à risque ». Durant les chirurgies prévues dans la procédure, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l’endroit à inciser. Les yeux des souris seront couverts par du gel ophtalmique afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris sont placées dans des enceintes de réveil chauffées, avant d’être remises dans leur cage respective, où elles disposeront de croquettes humides ou de diet gel auxquels elles auront été habituées sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Le déplacement des animaux entre les deux établissements utilisateurs se fait exclusivement entre deux bâtiments adjacents reliés par un couloir interne. Les cages sont transportées sur un chariot dédié, sans sortie extérieure, sans rupture de conditions environnementales. La durée du déplacement est inférieure à 2 minutes. Cette organisation permet de limiter au strict minimum le stress lié au transport, les variations thermiques et les manipulations supplémentaires.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature, et les techniques employées sont bien maîtrisées. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont similaires chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. La procédure implique l’utilisation d’animaux âgés de 16 mois, correspondant à un stade adulte âgé. Cela permettra de fournir un modèle pertinent et de reproduire la variabilité liée à l’âge dans l’inflammation et la récupération post-ischémique.
Identification de gènes impliqués dans le développement du médulloblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
6858 souris vont être utilisées pour ce projet sur le médulloblastome, une tumeur cérébrale de l'enfant, dont 6114 classées en souffrance sévère. Des fragments de tumeur sont greffés sous la peau ou des cellules injectées dans le cerveau, suivies d'imagerie sous anesthésie, de traitements répétés et de tests de mémoire. Toutes seront tuées pour analyses. Ce chiffre de près de sept mille animaux, dont la grande majorité en souffrance sévère, accompagne des bénéfices thérapeutiques décrits au conditionnel et à long terme.
Objectifs
Le médulloblastome (MB) est une tumeur pédiatrique invasive du cervelet. Il représente la tumeur maligne du système nerveux central la plus fréquente chez l'enfant. Même si le taux de guérison a été amélioré pour atteindre 70 à 80% de survie suite aux traitements classiques, associant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie, les effets secondaires associés sont sévères et 20 à 30% des patients restent incurables et ne survivent pas. Quatre groupes de MB ont été identifiés possédant des caractéristiques moléculaires et cliniques différentes et répondant différemment aux traitements. Le groupe 3 (20 à 25% des cas), le plus problématique d'un point de vue clinique, est métastatique, de très mauvais pronostic et résistant aux thérapies actuelles. Les MB de ce groupe restent encore mal caractérisés. Il est donc urgent d'identifier les événements oncogéniques (processus capables d’induire de la tumeur) participant à leur carcinogenèse afin de proposer des stratégies thérapeutiques alternatives. In vitro, nous avons sélectionné et validé l'importance dans la progression tumorale de plusieurs gènes dont l'expression est augmentée dans le MB de groupe3 par rapport aux trois autres groupes dans nos modèles de lignées cellulaires. Nous allons implanter des cellules de MB génétiquement modifiées chez la souris pour évaluer si la modulation de l’expression de notre gène d'intérêt influence la croissance tumorale. Nous analyserons également in vivo les effets d’inhibiteurs pharmacologiques ciblant les processus dans lesquels nos gènes d’intérêt sont impliqués. Nous évaluerons si un traitement avec ces molécules conduit à une régression du MB ainsi qu’à une augmentation de la survie des souris. Au préalable, ces inhibiteurs pharmacologiques, potentiels agents thérapeutiques, seront testés in vitro dans différents modèles. Seuls les plus prometteurs seront testés in vivo. La réalisation de ce projet de recherche pourrait permettre d'identifier de nouveaux acteurs clés de la carcinogenèse du MB et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces MB agressifs résistants à l'ensemble des thérapies actuelles.
Bénéfices attendus
L’étude portant sur l’identification d'oncogènes et de gènes suppresseurs de tumeur dans le médulloblastome permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des tumeurs et la rechute. Ce projet a pour but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer le traitement de ces cancers tout en diminuant les effets secondaires indésirables associés. Les bénéfices directs attendus sont de deux ordres : l'un cognitif pour une meilleure compréhension des mécanismes tumoraux et de résistance aux traitements, l’autre, d’ordre sociétal en santé humaine avec le potentiel développement de nouvelles thérapies plus efficaces pour soigner des patients atteints de cancers pédiatriques. En effet, la validation de cibles thérapeutiques permettra l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques notamment des thérapies ciblées qui s’inscrivent dans le développement d’une médecine personnalisée. Cette forme de médecine plus précise cible de manière spécifique le type de tumeur propre à chaque patient. Les thérapies ciblées peuvent être combinées à d’autres traitements tels que la radiothérapie ou la chimiothérapie déjà bien connus mais ayant des effets secondaires lourds. Dans le cas de combinaison de traitement, on peut envisager de diminuer les doses et ainsi réduire les effets secondaires. Cette stratégie thérapeutique permettrait donc d’améliorer l’efficacité des traitements tout en diminuant les effets délétères. De plus, les thérapies ciblées préservent davantage les cellules saines et donc impactent moins la qualité de vie des patients contrairement aux chimiothérapies ou à la radiothérapie. Les effets indirects attendus en réduisant les effets secondaires indésirables pourront donc avoir un effet sociétal en diminuant les handicaps associés et permettant une meilleure intégration des patients dans la société, mais aussi avoir un impact économique en réduisant la nécessité de soins liés aux effets secondaires. La bonne connaissance de nos modèles nous garantira une qualité au niveau de nos expériences ce qui contribuera à l’enrichissement des connaissances à travers la publication de nos résultats dans des journaux scientifiques.
Procédures
Dans un premier lot, des fragments de tumeurs seront greffés aux souris anesthésiées (1 fois par expérience/ 10 minutes/ souris) ou des cellules tumorales seront injectées aux animaux éveillés (1 fois au cours de l’expérience/ 1 minute/ souris). Les animaux seront ensuite suivis, et les tumeurs mesurées à l’aide d’un pied à coulisse (1 à 2 fois par semaine/ 1 minute/souris). Les animaux recevront un ou plusieurs traitements (7 administrations max /semaine) soit par injection soit par voie orale,. (Environ 1 minute/souris) Dans un second lot, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des souris anesthésiées (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris), puis suivies à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Ces mêmes animaux recevront un ou plusieurs traitements (max/ 7 semaines) soit par injection soit par voie oral. (Environ 1 minute/souris) Afin d’évaluer la capacité d’apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaine (chaque séance ayant une durée de moins de 10min par animal).
Impact sur les animaux
À la suite de la greffe des cellules ou de fragments de tumeurs, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe. Ces souris développeront des tumeurs. En fonction de la zone d’implantation, les nuisances attendues seront différentes. Pour les tumeurs se développant au niveau du flanc, les souris pourront rencontrer une gêne liée à la croissance tumorale, lors des déplacements notamment. Pour les tumeurs se développant au niveau du cerveau, les souris pourront ressentir des troubles neurologiques tels que troubles de motricité, perte d’équilibre. La tête penchée peut être un signe clinique spécifique survenant à l’injection de cellules au niveau cérébral, caractérisant une perte de l’équilibre. Les nuisances attendues lors des administrations d’agents pharmacologiques sont liées à l’administration en elle-même (douleur légère de courte durée suite aux injections, stress de courte durée lié à la contention de l’animal lors des administrations orales) ainsi qu’à la composition du solvant utilisé pouvant entraîner une sensation de brûlure. Un léger stress ou angoisse peuvent être ressentis lors des anesthésies pour les séances d’imagerie. Les nuisances attendues lors des tests comportementaux sont liées au stress provoqué par les modifications apportées à l’environnement des animaux : conditions du test, type d’hébergement, expérimentateur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des données générées à partir d'un grand nombre d'échantillons de patients atteints de MB permettent de mettre en évidence l’importance de certains gènes régulant la progression du MB. Cependant, il reste encore à valider ces cibles in vitro puis dans un modèles intégrés in vivo comme la souris. Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles in vitro : des cellules neuronales en culture, des lignées cellulaires humaines sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales seront toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. De la même façon, tous les composés de thérapies ciblées seront testés in vitro, et ne seront testés in vivo que ceux pour lesquels les résultats seront prometteurs. Des travaux sont également en cours en ce moment dans notre laboratoire sur l’obtention d’organoïdes de cervelet à partir de cellules humaines souches induites pluripotentes (iPS) ce qui nous permettra dans l’avenir d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales. Enfin, l’étude de la toxicité des nouveaux traitements ne peut s’envisager que sur animal. Nous chercherons en particulier à évaluer l’effet de ces traitements sur la croissance tumorale mais aussi à travers des tests comportementaux permettant de s’assurer du moindre impact sur les déficits moteurs ou cognitifs semblables à ceux observés chez les patients. Aussi, malgré le développement et l’utilisation de méthodes alternatives au laboratoire l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Pour minimiser le nombre d’animaux, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Des études préliminaires (pilotes) seront réalisées pour l’administration d’agent pharmacologique en fonction des données déjà publiées ou non. Les Patient derived Xenograft de médulloblastome (PDX) sont établies à partir de tumeurs fraîchement opérées. Au contraire des lignées, ces greffes primaires sont très stables et restent très proches de la tumeur d'origine. En cancérologie, elles sont reconnues pour mimer les processus tumoraux chez l'Homme et constituent donc un modèle de choix pour valider nos traitements thérapeutiques potentiels. L’utilisation de ces PDX (maintenues sur animaux vivants) est mutualisée avec les autres projets de l’équipe ce qui contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux estimé dans ce projet est un nombre maximum, qui sera certainement réduit. Pour limiter le nombre d’animaux, nous travaillerons par lot de manière à avoir un nombre suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe sera de 8 souris si possible. Le nombre d’animaux par groupe devra être augmenté (12 à 15 animaux par groupe) pour les études comportementales pour atteindre une puissance statistique suffisante pour conclure. Chaque expérience sera répétée 2 fois et une 3ème si nécessaire, (dans le cas de résultats discordants entre les 2 premières expériences). Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser le geste technique nécessaire à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux et/ou généraux pendant l’opération et si besoin en post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Une surveillance accrue est mise en place post-chirurgie, avec changement des cupules d’aliments gélifiés le lendemain, ajout de croquettes humifiées au fond de la cage. L’expression d’un marqueur par les cellules tumorales permettra de suivre leur croissance dans le cerveau par une méthode non invasive d’imagerie. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale soit par mesure à l’aide d’un pied à coulisse soit par imagerie en fonction du site d’implantation et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux, mettre en place les soins adaptés voire mettre à mort l’animal.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes dans des lignées murines immunodéficientes. De plus, le modèle murin est un modèle de choix puisque les tumeurs spontanées sont rares et la croissance tumorale induite par greffe est relativement rapide. Les souris arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation d’une semaine minimum à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats. En fonction des résultats obtenus, il est possible que nous utilisions des souriceaux à la place des adultes cependant dans un premier temps, le stade adulte semble être plus approprié pour adapter un traitement pharmacologique par exemple. Le Médulloblastome étant une tumeur pédiatrique, il se peut que nous passions sur un modèle murin au stade juvénile pour se rapprocher au mieux du microenvironnement de la tumeur étudiée.
Évaluation du potentiel thérapeutique du leucettinib-21 pour le traitement des déficits neurologiques après un accident vasculaire cérébral (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris âgées de 16 mois vont être utilisées, toutes classées en souffrance sévère et tuées à l'issue. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par une ischémie d'une heure, suivie d'imagerie, d'un traitement oral pendant dix jours et de tests comportementaux, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le projet évalue une molécule, le leucettinib-21, sur la récupération après AVC. Le bénéfice annoncé se limite à ce que le composé "pourrait révéler une potentielle nouvelle thérapie", formulation entièrement conditionnelle face à une souffrance sévère certaine.
Objectifs
Le Leucettinib-21, un inhibiteur de la kinase DYRK1A, a démontré des effets prometteurs sur la cognition et l'inflammation dans des modèles précliniques de la trisomie 21 et de la maladie d'Alzheimer. Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) demeurent une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde, entraînant souvent des déficits neurologiques significatifs dus aux lésions cérébrales et à une inflammation persistante. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet neuroprotecteur du Leucettinib-21 dans un modèle murin d'AVC et de déterminer sa capacité à améliorer la récupération fonctionnelle post-AVC. Ce projet se déroule dans deux établissements différents.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait révéler une potentielle nouvelle thérapie innovante pour réduire les déficits neurologiques et améliorer la qualité de vie des patients victimes d'un AVC.
Procédures
Les procédures expérimentales (chirurgie, imagerie, comportement, administration du traitement) sont réalisées dans un premier établissement utilisateur. L’hébergement des animaux, le suivi clinique post-procédural et la surveillance quotidienne sont assurés dans un second établissement utilisateur, situé à proximité immédiate et relié par un accès interne Pour tous les animaux : EU 1/2 : Induction de l’ischémie (J0 ; 60 minutes) Imagerie IRM de la lésion ischémique (J1 ; 10 minutes) Traitement oral (J2 à J11 ; 2 minutes par jour) Tests comportementaux (J-2, J2, J7, J13 ; 30 minutes par jour) Imagerie du débit sanguin cérébral et de la connectivité fonctionnelle par ultrasons (fUS) (J14 ; 60 minutes) Perfusion intracardiaque - (J14 ; 15 minutes) EU 2/2 : Hébergement, suivi post opératoire, surveillance quotidienne (5 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et de la désorientation à la suite de l’AVC.
Devenir
L'ensemble des animaux de la procédure seront mis à mort afin de prélever les boites craniennes pour de futures analyses.
Remplacement
Les procédures expérimentales prévues pour la réalisation du projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants, car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La physiopathologie du modèle, globalement établie, nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra de mieux comprendre la physiopathologie de l’accident vasculaire cérébral et de ce fait améliorer la récupération des patients.
Réduction
Notre projet ne permettant pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux conformément au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes mises en œuvre, de la littérature scientifique et de nos travaux antérieurs. Pour chaque phase du projet, le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour permettre une analyse robuste des résultats. Les effectifs ont été définis à partir d’analyses préalables basées sur des données issues de modèles comparables déjà utilisés au sein de l’unité et décrits dans la littérature. Les tailles de groupes ont également été ajustées afin de prendre en compte les contraintes liées au modèle expérimental utilisé, notamment la variabilité interindividuelle et la mortalité associée à l’âge des animaux et au modèle d’AVC. Le nombre d’animaux pourra être ajusté à la baisse en fonction de l’expérience acquise au cours du projet. Enfin, l’ensemble des échantillons biologiques prélevés pourra être partagé et exploité pour plusieurs analyses, contribuant ainsi à une réduction supplémentaire du nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun comportement de maladie. Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (échelle de grimace de la souris) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle malgré les soins apportés. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra en un simple coup d’oeil d’identifier et de surveiller particulièrement les animaux les plus « à risque ». Durant les chirurgies prévues dans la procédure, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l’endroit à inciser. Les yeux des souris seront couverts par du gel ophtalmique afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris sont placées dans des enceintes de réveil chauffées, avant d’être remises dans leur cage respective, où elles disposeront de croquettes humides ou de diet gel auxquels elles auront été habituées sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Le déplacement des animaux entre les deux établissements utilisateurs se fait exclusivement entre deux bâtiments adjacents reliés par un couloir interne. Les cages sont transportées sur un chariot dédié, sans sortie extérieure, sans rupture de conditions environnementales. La durée du déplacement est inférieure à 2 minutes. Cette organisation permet de limiter au strict minimum le stress lié au transport, les variations thermiques et les manipulations supplémentaires.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature, et les techniques employées sont bien maîtrisées. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont similaires chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. La procédure implique l’utilisation d’animaux âgés de 16 mois, correspondant à un stade adulte âgé. Cela permettra de fournir un modèle pertinent et de reproduire la variabilité liée à l’âge dans l’inflammation et la récupération post-ischémique.
Dynamique des activités neuronales dans le cortex cérébral et les noyaux à sérotonine au cours d’un arrêt de l’oxygénation cérébrale et lors d’une réanimation chez le rat-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Électrodes implantées dans le cerveau sous anesthésie de deux heures, puis maintien sous anesthésie pendant dix-huit heures d'enregistrements pendant l'arrêt de l'oxygénation du cerveau: 448 rats subissent des variantes de ce protocole d'anoxie et de réanimation. Le RNT en classe 98 en souffrance sévère, 50 en modérée et 300 sans réveil. Le projet cherche des marqueurs de la mort cellulaire et un corrélat neuronal des expériences de mort imminente, rapprochées des effets de drogues psychédéliques. Tous seront tués à l'issue pour l'étude histologique de leur cerveau.
Objectifs
Un arrêt de l’apport en oxygène au cerveau total et prolongé, consécutif à un arrêt cardiaque et/ou respiratoire, est souvent responsable de graves lésions neurologiques et demeure l’une des principales causes de décès. Les processus neuronaux à l’origine des lésions et ceux accompagnant la récupération des fonctions cérébrales lors d’une réanimation réussie restent aujourd’hui mal connus. L'élucidation de ces processus représente un enjeu majeur en neurosciences puisqu’elle pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients. Les récentes recherches sur des modèles animaux reproduisant les conditions d’une privation en oxygène au cerveau ont cependant permis des avancées dans notre compréhension des changements électriques du cortex cérébral qui surviennent successivement dans l'électroencéphalogramme (EEG) lors d’une privation d’oxygène : une première bouffée d'activités rapides, suivie d’un ralentissement et une atténuation des activités qui finissent par s’annuler et être remplacées par un EEG plat. Survient alors une onde de grande amplitude, qui marque l’arrêt d’activité des neurones du cortex et le début des processus de mort cellulaire. Si le cerveau est rapidement réoxygéné, les neurones récupèrent leur activité. Cette restauration des activités du cortex se traduit par la survenue d’une deuxième onde EEG appelée « onde de réanimation ». Les activités rapides au début de l’arrêt de l’apport en oxygène que l’on retrouve chez les patients ressemblent à celles observées au cours de l’éveil alors que les patients sont visiblement inconscients. Il a donc été suggéré qu’elles pourraient constituer un corrélat neuronal pour les expériences de mort imminente (EMI), qui sont souvent associées à de vives perceptions sensorielles et un sentiment de bien-être profond. Il a par ailleurs été montré de fortes similitudes entre les EMI et les effets hallucinatoires des drogues psychédéliques agissant sur un des grands systèmes de neuromodulation, le système à sérotonine. L’ensemble de ces observations nous a conduit à émettre l’hypothèse d’une participation du système à sérotonine aux EMI et aux changements séquentiels d’activité dans le cortex. MODIFICATION : Le protocole a été ajusté pour intégrer la stimulation et l'enregistrement des systèmes de communication chimique (neuromodulation). L'objectif est de mesurer leur influence sur l'activité cérébrale durant le cycle complet de l'anoxie-réoxygénation (avant, pendant et après l'arrêt de l'oxygène).
Bénéfices attendus
L'anoxie cérébrale globale consécutive à un arrêt cardio-respiratoire ou à un accident vasculaire cérébral, est une cause majeure de décès et 57 pourcent des patients conservent des déficits neurologiques permanents de degrés divers, principalement causés par des lésions ischémiques/anoxiques corticales. Ce projet permettra tout d’abord de mieux comprendre les mécanismes cérébraux conduisant à la mort cellulaire lors d’une anoxie cérébrale et ceux qui sous-tendent la récupération des activités et fonctions cérébrales lors d’une réanimation. Nous espérons trouver des nouveaux marqueurs électriques permettant de prédire la capacité du cerveau à récupérer après une anoxie. Dans ce contexte, nos travaux de recherche fondamentale devraient ainsi permettre à plus long terme une meilleure prise en charge des patients qui arrivent à l’hôpital après un arrêt cardiaque. Notre étude nous permettra également de faire progresser nos connaissances sur les mécanismes neuronaux à l’origine des sensations et perceptions qui accompagnent les expériences de mort imminente. Nous déterminerons plus particulièrement le rôle d’un des grands systèmes de neuromodulation cérébrale dans ces phénomènes qui demeurent pour le moment mystérieux.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale (une fois par animal, durée environ 2h), avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées, permettant la mise en place d’électrodes d’enregistrement au niveau de différentes régions cérébrales et la mise sous respiration artificielle. Les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant (MODIFICATION : 18h supplémentaires maximum), pendant lesquelles des enregistrements intracérébraux seront réalisés puis ils seront euthanasiés par une méthode règlementaire. Une autre partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées (une fois par animal, durée environ 1h30) durant laquelle une injection intracérébrale de traceurs sera réalisée pour colorer certains neurones. Les animaux seront gardés en vie une semaine puis seront euthanasiés selon une méthode règlementaire. MODIFICATION : Enfin, la dernière partie des animaux sera soumise à une première procédure chirurgicale avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées (une fois par animal, durée environ 2h) durant laquelle une à deux injections intracérébrales seront réalisées, et des dispositifs d’enregistrements ou de stimulation de l’activité cérébrale seront mis en place. Trois à quatre semaines après, une seconde procédure chirurgicale sera réalisée (une fois par animal, durée environ 2h), avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptées, permettant la mise en place d’électrodes d’enregistrement au niveau de différentes régions cérébrales, et la mise sous respiration artificielle. Les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant 18h supplémentaires maximum, pendant lesquelles des enregistrements intracérébraux seront réalisés en parallèle des stimulations et enregistrements via les dispositifs préimplantés, puis ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les interventions chirurgicales peuvent entraîner certains effets indésirables : un stress lié aux manipulations avant l'opération, de la douleur suite à l'acte chirurgical, ainsi qu'un risque rare de complications (saignements ou infections). L'anesthésie peut également impacter les fonctions vitales de l'animal, provoquant une baisse de la température corporelle (hypothermie), un ralentissement du cœur et de la respiration, ou encore une sécheresse oculaire. MODIFICATION : L’implant sur la tête des animaux pourra générer un inconfort et présentera un risque de perte et, ou, d’infection. une partie des animaux seront hébergés seuls pendant 4 semaines maximum, s’agissant d’animaux sociaux cela impliquera un stress.)
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de réaliser des études histologiques sur leur cerveau.
Remplacement
Nous prévoyons de tester une partie de nos hypothèses en réalisant sur ordinateur un modèle biophysique des neurones enregistrés ce qui permet de remplacer en partie les expériences chez l’animal. Cependant, ce projet de recherche fondamental, qui vise à comprendre les évènements électriques cérébraux survenant pendant l’arrêt de l’oxygénation cérébrale mais aussi lors de sa restauration, requiert de réaliser des enregistrements électrophysiologiques à différentes échelles (extracellulaires et intracellulaires) chez le rat pour être mené à son terme. En effet, ce type de préparation in vivo est la seule permettant de maintenir intacte les propriétés des neurones individuels et des réseaux neuronaux, condition absolument nécessaire à la survenue spontanée des évènements électriques cérébraux produits lors d’un arrêt transitoire de l’apport en oxygène au cerveau.
Réduction
Une stratégie expérimentale méthodique a été mise en place pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous combinerons également différents protocoles d’enregistrements cellulaires (différents tests sur l’activité et les propriétés des neurones à l’échelle unitaire, enregistrements de longue durée et si possible de plusieurs neurones/animal) au sein d’une même expérience, ce qui nous permettra de n’utiliser que les animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et reproductibles. Enfin, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance (448 animaux au total) et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une à deux semaines à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. Avant chaque expérience, une phase d’acclimatation de 30 à 40 minutes est observée, durant laquelle les animaux, placés seuls dans leur cage dans la salle d’expérimentation, ne sont pas manipulés afin de limiter le stress. Les animaux bénéficient d’un accès à la nourriture et à l’eau à volonté, ainsi que d’un environnement enrichi. Lors des enregistrements de l’activité cérébrale des animaux anesthésiés, une attention particulière est portée à la réduction de l’inconfort, de la douleur et du stress grâce à une surveillance continue des paramètres physiologiques (activité cérébrale, fréquence cardiaque, température, pression artérielle, saturation en oxygène). Des protocoles d’intervention adaptés, incluant l’utilisation appropriée d’anesthésiques généraux ou locaux et de myorelaxants, sont appliqués. MODIFICATION : Pour les injections intracérébrales et les implantations de dispositifs d’enregistrement ou stimulation chez des animaux anesthésiés, un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). La chirurgie sera réalisée avec une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée. La profondeur de narcose sera contrôlée tout au long de la chirurgie. La température de l’animal sera maintenue à partir de l’induction de l’anesthésie et jusqu’à son réveil complet (tapis chauffant puis chambre réveil chauffée à 37 degrés Celsius). Du gel oculaire sera appliqué pour prévenir toute sécheresse oculaire et du sérum physiologique sera injecté par voie sous-cutanée pour éviter toute déshydratation. Les zones d’incisions et de chirurgie seront préalablement aseptisées. Après la chirurgie, l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil puis il sera transféré dans sa cage. Un suivi quotidien sera assuré en post-chirurgie pendant 3 jours minimum puis 2 fois par semaine jusqu’à la fin de procédure. Si la procédure nécessite un hébergement individuel, l’enrichissement sera complété et cet hébergement limité à 4 semaines. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées chez des rats. Le rat constitue une espèce de choix pour les enregistrements intracellulaires in vivo en raison de leur taille et d’une très bonne cartographie anatomique de leur cerveau permettant un positionnement précis des électrodes d’enregistrement dans les différentes structures cérébrales. Nous utiliserons des rats adultes (âgés de deux à trois mois). Ces critères nous permettent d’effectuer nos expériences sur des rats ayant terminé leur développement cérébral. Les rats adultes fournissent une représentation plus fiable des conditions cérébrales observées chez les adultes humains. Etant donné que la plupart des cas d‘anoxie cérébrale (par arrêt cardiaque) touchent des adultes, étudier les dynamiques cérébrales survenant lors de l’arrêt et la reprise de l’oxygénation cérébrale sur des rats adultes permettra de mieux comprendre ses mécanismes et ses conséquences au sein de cette population.