Procédures sévères
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant l’étude de l’évolution de la maladie rénale et l’évaluation du risque de cancers du rein associés à une maladie rare, la glycogénose de type Ia : EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Biopsiées à l'oreille à sept jours, les souris subissent ensuite jusqu'à vingt prises de sang et vingt prélèvements d'urine, des trajets mensuels en voiture vers un second établissement et des IRM sous anesthésie d'une trentaine de minutes, jusqu'à l'âge de quinze mois. 1 008 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 608, modéré pour 240 et sévère pour 160. Seules 400 suivront le protocole complet : les 408 restantes, nées sans le bon profil génétique, seront tuées pour "régulation de population", 100 seront gardées pour la reproduction des lignées et 100 autres utilisées pour entraîner les zootechniciens aux prises de sang. Le porteur affirme que le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être des animaux non-humains, et décrit dans le même paragraphe une perte de poids, une prostration, une baisse du toilettage et des douleurs liées aux tumeurs du rein.
Objectifs
La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie génétique rare qui touche environ 150 à 200 patients en France. Contrairement au diabète, caractérisé par des hyperglycémies (trop de sucre dans le sang) liées à une production excessive de glucose, la GSD1a entraîne des hypoglycémies sévères et potentiellement fatales. Bien que ces deux maladies soient opposées sur le plan de la régulation de la glycémie, elles partagent des complications rénales remarquablement similaires. Les patients peuvent développer une maladie rénale chronique pouvant évoluer vers une insuffisance rénale terminale. Des analyses cellulaires ont révélé que, dans ces contextes pathologiques, le rein adopte un métabolisme favorisant la prolifération cellulaire, comparable à celui observé dans les cancers. Un point commun majeur entre les reins de patients diabétiques, GSD1a et les cancers du rein est l’accumulation excessive de glycogène et de lipides dans les cellules rénales. À ce jour, seuls deux cas de cancer du rein ont été rapportés chez des patients GSD1a en France. Toutefois, grâce à l’amélioration de la prise en charge nutritionnelle depuis les années 1980, l’espérance de vie de ces patients a considérablement augmenté, ce qui pourrait conduire à une augmentation de l’incidence des complications rénales liées au vieillissement. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant à la formation de kystes rénaux et à évaluer le risque de cancer dans des reins soumis à un environnement métabolique favorable au développement de cancer. Pour cela, un modèle murin de GSD1a reproduisant fidèlement les atteintes rénales humaines sera utilisé. Dans ce modèle, les chercheurs inactiveront totalement ou partiellement un gène suppresseur de tumeur fréquemment altéré dans les cancers du rein. L’impact de cette inactivation sur la progression de la maladie rénale sera étudié, avec l’hypothèse d’une accélération de la formation de kystes et de tumeurs rénales. Ce modèle inédit permettra d’explorer les liens entre déséquilibres métaboliques, formation de kyste et de cancer du rein. À terme, ce travail pourrait démontrer un risque accru de cancer du rein chez les patients GSD1a, justifiant la mise en place d’un suivi médical spécifique. Il offrira également un outil unique pour étudier les cancers du rein associés à l’accumulation de graisse, comme chez les diabétiques, mais de façon indépendante de toute perturbation alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles connaissances sont essentielles, car aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou ralentir efficacement la dégradation progressive des reins chez les patients GSD1a, mais également chez les patients diabétiques. Pourtant, cette complication est fréquente puisque 70 et 80 % des patients atteints de GSD1a développer une maladie rénale chronique, qui peut nécessiter une transplantation rénale ou une dialyse. Mieux comprendre les étapes de cette évolution permettra à terme de concevoir des traitements plus ciblés et efficaces pour préserver la fonction rénale et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes à l’âge de 7-10 j. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Au cours du temps, les souris atteintes de GSD1a vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les mois à partir de 2 mois. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 6 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine après immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, au maximum 20 prélèvements d’urine et 20 prélèvements de sang seront réalisés. Également, les souris seront transférées, à partir de 6 mois, tous les mois dans le 2ème établissement situé à moins de 30 min en voiture du 1er. Leurs reins seront analysés par imagerie IRM. Les souris seront anesthésiées pendant environ 30 minutes, puis ramenées à l’établissement d’origine après leur réveil. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie réalisée au bord de l’oreille entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. Le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être animal. Au stade avancé de la maladie, caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois), les souris atteintes de GSD1a commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être, comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Le développement de lésions du rein, comme les cancers, peut également être à l’origine de douleurs et d’une gêne. Pour suivre le développement de la maladie, les prélèvements urinaires réalisés de façon spontanée peuvent provoquer un très léger stress. Les prises de sang réalisées après immobilisation de l’animal peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. La mise à jeun pendant 6h peut entrainer un léger stress.
Devenir
Sur ce projet, seuls les 400 animaux qui subiront l’ensemble des procédures seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin et du foie afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires. Une partie des animaux générés lors des reproductions seront utilisés pour la reproduction et le maintien des lignées (environ 100 animaux) ; une autre partie, estimée à 100 souris de phénotype non dommageable, pourra être réutilisée pour l’apprentissage de gestes sur animaux comme la réalisation de prise de sang ; ces souris seront comptabilisées dans le projet de tutorat des zootechniciens et des expérimentateurs de l’établissement en charge de la reproduction des animaux. Les autres animaux (408) seront mis à mort pour régulation de population.
Remplacement
Même si on sait aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petits organes miniatures appelés organoïdes, qui reproduisent en partie la structure du rein, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution d’une maladie rénale sur plusieurs mois. Or, pour comprendre le développement d’une maladie chronique ou l’apparition de cancers, il est essentiel de suivre ce qui se passe dans un organisme vivant sur le long terme. C’est pourquoi une approche chez l’animal, en particulier chez la souris, reste indispensable. Le modèle de souris atteintes de GSD1a utilisé ici est unique : il est viable et reproduit fidèlement les atteintes rénales observées chez les patients atteints, grâce à une technique de modification génétique spécifique à l’espèce. De plus, la souris a un métabolisme très proche de celui de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale et les reins présentant des kystes ont été menées chez la souris, ce qui offre une base solide de données scientifiques et de matériel pour ce projet
Réduction
Le but de ce projet est d’étudier comment certaines modifications génétiques favorisent l’apparition de cancers du rein liés à la maladie GSD1a. Pour cela, deux nouvelles lignées de souris ont été créées. Le projet sera réalisé en 2 temps, sur des groupes de souris étudiées à long terme (1ère étude) et à court terme (2ème étude). La première étude permettra à la fois de vérifier si les animaux développent des signes importants de souffrance dès la naissance et jusqu’à 15 mois ; et de caractériser la maladie rénale grâce au suivi de marqueurs biologiques et l’imagerie par IRM des reins. Si un mal-être important est observé, le projet pourra être arrêté rapidement et les animaux prévus pour la 2ème étude ne seront pas produits. Les chercheurs compareront plusieurs groupes de souris ayant différentes combinaisons de mutations génétiques. Cela permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour réaliser la 2ème partie des expériences. Pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, l’évolution des lésions rénales sera suivie au cours du temps grâce à des techniques d’imagerie non invasives. Le nombre de souris nécessaires a été calculé à partir de données déjà disponibles (études précédentes et littérature scientifique). Une analyse statistique (test de puissance) a montré qu’il fallait au minimum 10 souris par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est doublé (soit 20 souris par groupe) afin d’avoir suffisamment de tissu pour les analyses biologiques et histologiques. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées. Au total, au maximum 400 souris transgéniques seront utilisées pour l’étude. Leur production entrainera la naissance de 1 008 souris car toutes les souris n’auront pas le bon profil génétique. Celles qui ne sont pas utilisées dans les expériences pourront servir être pour de la reproduction et l’entretien des lignées (environ 100 souris) ou être réutilisées dans un projet de formation aux gestes techniques réalisés sur les animaux, comme les prises de sang (environ 100 souris). Ce projet de tutorat est autorisé dans l’établissement de production des souris et permet au personnel technique de se former et de vérifier les compétences de chaque utilisateur. Enfin, les lignées de souris sont conservées sous forme congelée (cryoconservées), ce qui permet de les préserver sans devoir les maintenir leur reproduction en permanence
Raffinement
Les biopsies seront réalisées chez les souriceaux à 7-10 jours après la naissance, une période durant laquelle les terminaisons nerveuses ne sont pas encore complètement développées, ce qui permet de limiter la douleur. Pour réduire le stress lié à la manipulation, les gants du technicien seront imprégnés de l’odeur de la litière, et les animaux seront manipulés à l’aide d’un petit tunnel. La GSD1a sera induite uniquement dans les reins des souris, ce qui permettra d’éviter les fortes baisses de sucre dans le sang grâce à la fonction préservée du foie, qui continue de produire du glucose. Le bien-être des nouvelles lignées de souris créées (nombre de souris par portée;courbe de croissance…) sera suivi dès la naissance.Les prises de sang seront réalisées dans le respect des volumes de prélèvement selon les recommandations internationales. Une légère pression sera appliquée après la piqûre pour stopper le saignement. Les souris seront habituées à la contention au préalable.L’urine sera récupérée naturellement, sans avoir à isoler les animaux dans des cages spécifiques. L’imagerie médicale par IRM permettra de détecter très tôt les éventuelles atteintes des reins. Pendant les examens sous anesthésie,la fréquence respiratoire sera surveillée et la température corporelle sera maintenue grâce à un circuit de réchauffement des souris dans l’appareil.Le comportement des animaux (posture, mobilité, etc.) sera observé régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si des douleurs apparaissent, notamment en lien avec la formation de kystes ou de tumeurs, des traitements anti-douleurs et antispasmodiques adaptés seront administrés. L’état de santé sera également surveillé grâce au suivi du poids (quasi journalier en période de sevrage, puis hebdomadaire ou mensuel), à des tests urinaires mensuels, et à l’analyse de marqueurs biologiques. Si une souris montre des signes de mal-être (perte de poids ou posture anormale, lésions trop importantes, etc.), elle sera prise en charge avec des soins renforcés : nourriture posée au sol, gel hydratant et nutritif. Si son état ne s’améliore pas ou si l’animal atteint un seuil critique, l’animal sera euthanasié dans le respect des protocoles pour permettre l’analyse des reins. Enfin, les souris devront être transportées lors de chaque IRM entre deux lieux d’expérimentation situés à moins de 10 km. Ce transfert se fera en voiture, avec leur litière et leur matériel habituel pour éviter le stress
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans l’organisme. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, le modèle de souris atteintes de GSD1a est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatales. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement. Aucun symptôme n’est observé pendant plusieurs mois avant d’atteindre la dégradation importante du fonctionnement des reins. Des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes seront réalisées pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole (15 mois au maximum).
Compréhension des mécanismes anti-tumoraux de la testostérone dans un modèle de corticosurrénalome chez la souris et recherche de cibles thérapeutiques alternatives
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 384 d'entre elles et sévère pour 192. Toutes subissent l'amputation d'une phalange pour le génotypage, puis reçoivent sous anesthésie un implant de testostérone, de dihydrotestostérone ou un placebo, avant un suivi échographique du corticosurrénalome qu'elles développent par construction génétique, jusqu'au stade métastatique à 18 mois. Le bénéfice avancé pour les patients, de nouvelles pistes contre un cancer dont la survie médiane reste de quinze mois, tient à des mécanismes moléculaires encore à établir. Sur le remplacement, le porteur écrit vouloir éviter les manipulations in vivo autant que possible, puis conclut que les lignées cellulaires disponibles ne répondent pas aux androgènes et que la "nécessité" du recours aux animaux se justifie.
Objectifs
Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif, caractérisé par un pronostic défavorable. À son diagnostic, près de 50 % des patients présentent des métastases, ce qui explique un faible taux de survie à 5 ans. Actuellement, l’unique option curative pour les patients non métastatiques repose sur une exérèse complète de la tumeur primaire. Cependant, le risque de récidive est élevé (30 à 70 %), constituant la principale cause de décès. Pour les patients métastatiques, la chirurgie est inenvisageable, et les traitements existants, bien que lourds, n’améliorent pas la survie globale médiane, qui demeure autour de 15 mois. Les essais d’immunothérapie dans le carcinome corticosurrénalien ont donné des résultats décevants, probablement en raison de l’immunosuppression induite par l’hyperactivité endocrine observée dans environ 50 % des cas. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il a été récemment montré dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien, que la testostérone produite au moment de la puberté induit un recrutement de macrophages chez les souris mâles, ce qui conduit à une régression de la tumeur. De façon similaire, le traitement des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens avec de la testostérone conduit aussi à un recrutement de macrophages et à une diminution de la taille de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la testostérone possède un fort potentiel en tant qu’agent antitumoral dans le contexte du carcinome corticosurrénalien. Dans cette étude, l’objectif est d’approfondir la compréhension du rôle antitumoral de la testostérone dans le carcinome corticosurrénalien et d’identifier les mécanismes de réponse en aval, en utilisant des implants de testostérone ou de dihydrotestostérone chez des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens. L’objectif global de ces expériences est de comprendre l’importance de la testostérone et de comprendre également comment la testostérone est capable d’avoir un puissant effet antitumoral. Finalement ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité d’une modulation hormonale ciblée comme stratégie thérapeutique innovante. La compréhension des mécanismes d’action en aval de la testostérone permettra également de proposer différentes approches thérapeutiques pour les patients atteint de carcinomes corticosurrénalien.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de confirmer le rôle de la testostérone dans la régression du carcinome corticosurrénalien. Elle contribuera à identifier les mécanismes moléculaires antitumoraux impliqués dans cet effet protecteur. Les résultats attendus permettront d’améliorer la compréhension des voies de signalisation impliquées dans la réponse à la testostérone, ouvrant la voie au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Ces approches pourraient reposer sur l’utilisation de la testostérone elle-même ou sur le ciblage des mécanismes moléculaires identifiés grâce à cette étude, dans le but d’améliorer la prise en charge des patients atteints de carcinomes corticosurrénaliens.
Procédures
576 souris seront soumises à une phalangectomie (durée 2 min, 1 fois). 288 souris femelles recevront des implants de testostérone ou de dihydrotestostérone sous anesthésie générale et 288 souris femelles recevront des placebos sous anesthésie générale. L'intervention sera pratiquée 1 seule fois et dure environ 7 minutes.
Impact sur les animaux
La phalangectomie, nécessaire à l’identification et au génotypage des individus, peut entraîner une douleur légère et de courte durée. Cependant, cette procédure n’induit aucune complication durant le développement des animaux et n'affecte pas leur comportement, ni celui des individus de la portée ni de leur mère. L’implantation des implants hormonaux peut entraîner une douleur modérée, localisée et transitoire au site d’insertion. L’insertion des implants pourrait également entrainer une infection locale. L’échographie, réalisée sous anesthésie générale, ne provoque pas de douleur mais peut générer un léger stress lié à la manipulation. Les modèles murins de carcinomes corticosurrénaliens présentent un développement tumoral et éventuellement des métastases.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer le rôle de la testostérone et de ses mécanismes sous-jacents dans le développement du carcinome corticosurrénalien et ainsi pouvoir potentiellement identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du carcinome corticosurrénalien.
Remplacement
Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cependant, l’ensemble des lignées de carcinome corticosurrénalien actuellement disponibles ne répondent pas aux androgènes, ce qui limite leur pertinence pour l’étude du rôle de la testostérone. De plus, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous mettons en œuvre plusieurs mesures. Nous planifions, lorsque c’est possible, plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque animal soient utilisées. De même, le sang des animaux mis à mort sera systématiquement recueilli pour réaliser des dosages. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration scientifique convaincante, basée sur des arguments statistiques valides et la variabilité biologique attendue. Les groupes expérimentaux comprendront au maximum 12 souris. Une phase préliminaire de mise au point des expériences sera conduite sur un petit nombre d’animaux pour valider la faisabilité des expériences. Les analyses complètes ne seront engagées qu’après validation de cette phase. Pour les souris présentant un carcinome corticosurrénalien avancé, les implants seront maintenus pendant 2 mois afin d’évaluer un effet sur la régression tumorale et la dissémination métastatique. Si des effets anti-tumoraux sont constatés, un groupe supplémentaire sera traité pendant 2 semaines, afin d’évaluer si un traitement court ralenti la croissance tumorale et permettra de caractériser les mécanismes d’action en aval sur des stades de carcinome corticosurrénalien avancés.
Raffinement
Tout au long des procédures, des mesures spécifiques seront mises en place afin d’assurer le bien-être des animaux et de minimiser toute source de stress ou d’inconfort. Du coton sera ajouté dans les cages pour favoriser le maintien de la température corporelle. Pendant la phase de réveil post-anesthésie, les cages seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie. De la nourriture et du gel d’hydratation seront disposés au sol pour faciliter l’accès à l’alimentation et à l’hydratation sans effort. La réalisation de toutes les procédures sera effectuée par du personnel qualifié afin de réduire au maximum la durée de la procédure. Durant toute la procédure, les animaux seront hébergés en cages transparentes et munies d’une grille, qui permettront de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre les congénères, limitant ainsi l’isolement social dû à l’hébergement individuel. Les implants seront insérés avec du matériel stérile ce qui réduit fortement l’apparition d’infection chez les animaux. Une surveillance approfondie au niveau du site d’insertion des implants sera réalisée tous les jours pendant 1 semaine. Afin de limiter les nuisances associées aux implants, aux manipulations et les nuisances associés au développement tumoral (inconfort, douleur), les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé et expérimenté. Tout animal présentant des signes de souffrance ou atteignant un point limite précis défini sera retiré de l’expérimentation et mis à mort, si nécessaire, conformément aux procédures établies.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant le cancer de la cortico-surrénale. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Au cours de ce projet, une lignée de souris est utilisée. Cette lignée est un modèle préclinique murin de corticosurrénalome reposant sur l’invalidation de gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients. Nous réaliserons nos analyses aux 3 stades de développement tumoral identifiés chez les femelles dans ce modèle murin. Un stade d’hyperplasie à 6 semaines, un stade de corticosurrénalome avancé à 16 mois et un stade de corticosurrénalome métastatique à 18 mois.
Réalisation d’une preuve de concept sur la résorption et la tolérance d’un renfort de suture à base d’alginate sur des exérèses partielles d’organes tel que le poumon, l’estomac, le foie et la rate chez le modèle porcin (EU 3/3)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
44 porcs vont subir chacun l'ablation d'un fragment de 8 centimètres sur 3 de poumon, d'estomac, de foie ou de rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous seront tués. L'opération, à thorax ou abdomen ouvert, dure jusqu'à une heure et demie, suivie d'une analgésie de trois à cinq jours puis, à six, sept et neuf mois, de séances de scanner sous anesthésie d'environ deux heures. Le porteur décrit un risque de détresse respiratoire si le vide pleural se rompt et une douleur importante liée à l'incision des muscles abdominaux. Le bénéfice annoncé est un pansement hémostatique résorbable qui serait fabriqué en France plutôt qu'aux États-Unis ou au Japon, argument industriel autant que médical.
Objectifs
Le pansement idéal n'existe pas, mais il doit avoir certaines caractéristiques importantes : 1/Garder la plaie humide et chaude, 2/Être changé selon les étapes de la cicatrisation, 3/Laisser passer l'air mais pas les bactéries, 4/Absorber l'excès de liquide de la plaie, 5/Ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller rapidement, 6/Être facile à appliquer et confortable, 7/Ne pas être toxique et être hypoallergénique, 8/Protéger des chocs, 9/Être transparent pour voir la plaie sans retirer le pansement, 10/Être le moins cher possible et réduire le temps de traitement. Les pansements à base d'alginate de calcium répondent à ces critères, mais ils sont principalement utilisés pour les plaies cutanées et très peu pour les organes internes lors de chirurgies. Pour contrôler les saignements, les chirurgiens utilisent différentes techniques. Si ces techniques ne suffisent pas, surtout en cas de saignements continus et étendus, ils utilisent des produits hémostatiques résorbables. Ces produits sont synthétiques et mettent du temps à se résorber. Nous voulons tester un produit naturel qui devrait se résorber plus rapidement. Enrichi en calcium, zinc et magnésium, il favorise la coagulation. Ce produit est un renfort de suture utilisé avec un système d'agrafage et sera suivi par imagerie scanner à différents moments. L'objectif est de vérifier son efficacité pour arrêter les saignements, suivre sa résorption et son impact sur les tissus. La preuve de concept de ce nouveau dispositif médical hémostatique pourrait mener à un nouveau produit pour gérer les saignements lors de sutures par agrafage en chirurgie. De plus, ce produit serait fabriqué en France, contrairement aux autres dispositifs fabriqués aux États-Unis et au Japon. La biocompatibilité de ce dispositif a été testée en laboratoire. Il y aura 4 groupes de 11 porcs opérés. Chaque groupe sera divisé en 3 sous-groupes de 3 porcs, correspondant à des périodes de suivi post-opératoire de 6, 7,5 et 9 mois. Deux porcs supplémentaires par groupe sont prévus en cas de décès pendant la chirurgie ou à cause d'une mise à mort liée à un point limite. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs (EU) : 1 pour la chirurgie, 1 pour l'hébergement post opératoire longue durée et 1 pour l'imagerie.
Bénéfices attendus
Le projet vise à vérifier l'efficacité d'un nouveau pansement naturel pour arrêter les saignements lors de chirurgies. Ce pansement sera utilisé avec des agrafes pour renforcer les sutures après l'ablation partielle d'un organe. Nous voulons aussi observer comment le pansement se dissout et s'intègre dans le corps au fil du temps. L'objectif est de développer un pansement hémostatique naturel, fabriqué en France, pour remplacer les produits synthétiques actuels.
Procédures
EU 1 : Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour permettre l’accès à l’organe d’intérêt tout en préservant les autres organes dans les cavités respectives. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie appropriées. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès à l’organe, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutané). L’animal n’aura qu’une seule intervention chirurgicale. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le retrait des points prendra quelques minutes (5 minutes) et se fera 15 jours minimum post-chirurgie. EU 3 : A différents temps post-opératoires, l’animal aura une imagerie pour évaluer le taux de résorption : transport, anesthésie et acquisition environ 2 h à chaque temps. EU 2 : Pour l’hébergement à long terme, les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés régulièrement. Cet acte ne dure que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Pour les chirurgies thoraciques, il est important de maintenir le vide pleural, qui permet au poumon de se gonfler et de se dégonfler correctement. Si ce vide est rompu, le poumon ne peut plus fonctionner correctement, ce qui peut entraîner une détresse respiratoire. Pour éviter cela, l'incision sera refermée hermétiquement et l'excès d'air sera aspiré de la cage thoracique pendant que le poumon est progressivement remis sous ventilation. La chirurgie sera réalisée sur le lobe accessoire droit du poumon, et la résection d'une partie de 8 cm de long sur 3 cm de large n'affectera pas la fonction respiratoire. Pour les chirurgies abdominales, comme celles impliquant l'estomac, le foie et la rate, l'incision des muscles peut causer une douleur importante. De plus, une ablation partielle d'un organe digestif peut perturber le transit intestinal. La résection des organes aura une taille de 8 cm de long sur 3 cm de large, mais cela n'affectera pas leur fonctionnalité. Des analyses biochimiques seront effectuées pour détecter toute perturbation à moyen ou long terme. C'est pourquoi un groupe d'animaux sera dédié à chaque type d'organe d'intérêt. Les procédures peuvent être douloureuses pour les animaux en post-opératoire, et des analgésiques seront administrés en fonction de leur état clinique. Après trois semaines, les animaux aptes au transport seront transférés dans une autre structure (EU 2) pour un hébergement de longue durée. À différents moments postopératoires, les animaux seront transférés vers un centre d'imagerie pour passer des scanners (EU 3). Le transport et les différentes manipulations peuvent générer du stress pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort soit parce qu’ils auront atteint un point limite soit qu’ils ont atteint le temps d’observation (J+6 mois, J+7,5 mois, J+9 mois). Une étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée donc cela nécessite le prélèvement de l’organe et donc la mise à mort au prélable de l'animal.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu réséqué et de suivre sa résorption à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements lors de résection d’organe en cours de chirurgie. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.
Réduction
Nous utiliserons 44 animaux : 4 groupes de 11 animaux (9 animaux opérés et 2 animaux supplémentaires). Les animaux supplémentaires par groupe sont prévus pour compléter un groupe si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Étant donné que c’est une preuve de concept, nous n’avons pas besoin de plus 3 animaux par lot pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et nécessite une intervention chirurgicale pour l’arrêter, nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé et raffiné la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux mise à mort, issus de procédures antérieures.
Raffinement
La chirurgie ouverte a été retenue, avec un abord le long des côtes au niveau du 9ème espace intercostal. L’extrémité du lobe pulmonaire accessoire droit extériorisée permettra la mise en place de part et d’autre, des mors du système d’agrafage équipés du renfort. Cette résection volontairement limitée, n’empêchera pas le poumon de fonctionner correctement et n'impactera pas significativement la respiration de l'animal au réveil. Pour l’abord abdominal, choix d’une incision en suivant le bord sous costal d’une petite longueur à droite ou gauche suivant l’organe d’intérêt (estomac, foie ou rate) pour n’avoir à sortir à l’aide d’une pince atraumatique que l’extrémité de l’organe d’intérêt. Réduction taille incision : garder au maximum les autres organes dans la cavité et donc empêcher la perte de chaleur corporelle et le dessèchement des organes. Chirurgie : intubation puis ventilation avec un anesthésique gazeux, sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. Veille de chirurgie : injection analgésique d'action longue pour anticiper la sensation de la douleur. Jour chirurgie : anesthésie avec un hypnotique couplé à un analgésique. La plaie sera protégée à l’aide d’un pansement. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil complet. L’animal couvert sera remis dans l’enclos et recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit. Maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours selon les besoins de l'animal. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans l’enclos des légumes frais pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. L’état général de l’animal et de la cicatrice seront suivis quotidiennement pendant 1 semaine, puis toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Les animaux seront hébergés collectivement. Pour le suivi post-opératoire, l’animal sera seul dans un délai de 3 à 4 jours en gardant un contact visuel et/ou olfactif avec d’autres congénères et aura de l'enrichissement compensatoire. Suivi quotidien des animaux pour détecter rapidement toute anomalie qui sera rapportée au vétérinaire pour déterminer la marche à suivre (examen clinique approfondi, soins, traitement...). La surveillance sera renforcée le temps nécessaire. Les conditions d'hébergement seront également suivies quotidiennement.
Choix des espèces
Toute étude en vue du marquage CE d’un dispositif médical existant sous plusieurs formats doit être réalisée sur le format de taille maximale, correspondant ici à un dispositif de 8 cm. Il n’existe que 2 espèces animales sur lesquelles nous pouvons trouver des organes capables d’accepter un dispositif de cette taille, le porc et le mouton. Les études initiales pour le dispositif actuellement commercialisé ayant été réalisées sur le porc, nous avons donc retenu cette espèce pour ce projet. Le modèle lapin utilisé dans le cadre d’autres projets semblables ne peut être utilisé pour ce projet car la taille des organes d’intérêt ne permet pas de faire la résection nécessaire, sous peine d'handicaper gravement l'animal en post-opératoire. Le fait que nous ne travaillons pas sur des minipigs mais sur des porcs en croissance permettra de visualiser la résorption et le comportement du dispositif à long terme. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Les organes font approximativement : -poumon : 26 cm de hauteur et 15 cm de diamètre, la résection représente 3% du volume. -estomac : 25 cm de longueur, 12 cm de largeur et 8 cm d’épaisseur, la résection représente 1% du volume. -foie : 28 cm transversale et 16 cm de hauteur, la résection représente 3% du volume. -rate : 12 cm de longueur, 7 cm de largeur et 4 cm d’épaisseur, la résection représente 2% du volume. Le volume de résection de l’organe reste inférieur à 50%. En effet, pour des organes comme le foie et les poumons, nous pouvons vivre avec 50% en moins. Pour les organes tel que l’estomac, la rate, il possible de vivre sans avec un suivi médical plus méticuleux (vaccination, poche d’alimentation). De plus, ce sont des organes de grandes tailles et qui sont très souvent impliqués dans les plaies traumatiques ou les pathologies comme le cancer. Ces tailles sont similaires à celles retrouver chez l’Homme. Il s'agit de jeunes animaux de trois à quatre mois. Le fait que nous ne travaillons pas sur des minipigs mais sur des porcs en croissance permettra de visualiser la résorption et le comportement du dispositif à long terme.
Evaluation de l’impact des microbiotes intestinaux « sauvage » et de « laboratoire » sur les phénotypes de la souris domestique en conditions contrôlées
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
Des mâles sauvages sont vasectomisés puis accouplés avec des femelles, chez qui des embryons de souris de laboratoire sont ensuite transférés par chirurgie. Sur les 510 souris du projet, 240 relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 150 d'un niveau modéré et 120 d'un niveau léger, toutes tuées à l'issue des expériences d'infection pour prélever leurs organes. Elles sont hébergées seules trois semaines pour que leur activité sur roue soit mesurée, puis infectées par un parasite intestinal et une bactérie administrés dans l'eau de boisson. Le porteur range parmi les bénéfices attendus une amélioration des conditions de vie des souris en animalerie et une baisse de leur anxiété.
Objectifs
L’apport de souris porteuses de microbiotes intestinaux sauvages dans les expériences étudiant l’immunité des souris est incontestable notamment en vaccinologie, et aujourd’hui la question est posée d’utiliser ce type de modèle lors des essais précliniques. Notre projet permettra de tester l’impact de ces microbiotes sur d’autres phénotypes cruciaux dans d’autres domaines de recherche (comportements, activité physique, métabolisme) ainsi que sur la résistance aux parasites et pathogènes et aux co-infections. D’un point de vue fondamental, l’étude des microbiotes intestinaux sauvages en laboratoire devrait permettre de mieux comprendre leur rôle dans l’adaptation des rongeurs à leur environnement. D’un point de vue bien-être animal, nous nous attendons à ce que ces microbiotes améliorent certains phénotypes comme la résistance aux pathogènes, et la diminution de l’anxiété. Ainsi ce projet pourrait permettre d’améliorer les conditions de vies des souris en animalerie, de limiter les épidémies au sein de ces infrastructures, et potentiellement d’améliorer certains résultats pour lesquels l’anxiété des souris ou la faible résistance aux pathogènes représente une nuisance ou un biais expérimental. Notre projet est donc conçu comme la première étape vers une utilisation plus large des microbiotes intestinaux sauvages, au sein des animaleries.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont : - Comme expliqué dans la partie « objectif du projet », plus on progresse le long du gradient d’urbanisation, plus la diversité du microbiote intestinal des souris sauvages diminue. Cette dégradation est suspectée 1. d’altérer les fonctions assurées par le microbiote intestinal au sein de son hôte, et 2. de favoriser la transmission des agents zoonotiques. Notre projet permettra d’évaluer les conséquences de la perte de diversité du microbiote intestinal de la souris domestique liée à l’artificialisation environnementale créée par l’urbanisation. - De comparer les performances des souris porteuses de microbiotes intestinaux sauvages avec celle porteuses de microbiote de laboratoire. Plusieurs articles font état de l’apport des microbiotes intestinaux sauvages dans les expériences étudiant l’immunité des souris, notamment en vaccinologie. L’utilisation de souris porteuses de microbiote sauvages est aujourd’hui posée lors des essais précliniques. Notre projet permettra de tester l’impact de ces microbiotes sur d’autres phénotypes cruciaux dans d’autres domaines de recherche (comportements, activité physique, métabolisme) ainsi que sur la résistance aux parasites et pathogènes et aux co-infections. Si, nos résultats montrent effectivement une différence entre microbiotes intestinaux sauvages et de laboratoire, ils pourront également nous permettre de comprendre si la diversité du microbiote intestinal est impliquée dans ces performances et si certaines espèces ou groupes d’espèces bactériennes sont impliquées dans ces gains de performances.
Procédures
Sur les souris sauvages un maximum de 3 prélèvements sanguins sera réalisé sur animaux vigiles. Les mâles seront stérilisés chirurgicalement avant d’être accouplés avec des femelles. Des embryons de souris de laboratoire seront transférés par chirurgie chez ces femelles. Ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale et ne dépassent pas 30 minutes. Les animaux subiront des tests non invasifs d’activité motrice (3 fois 5 minutes) et de comportement (3 fois 5 minutes). Ils seront ensuite hébergés individuellement pendant 3 semaines pour l’étude de leur activité physique spontanée sur roues. En fin d’expérience, un parasite intestinal et/ou une bactérie seront administrés oralement par abreuvement spontané des souris au biberon contenant les bactéries. Un prélèvement sanguin sera réalisé (30 secondes) une fois par semaine sur ces souris infectées afin d’évaluer l’intensité de la réponse immunitaire soit 3 prélèvements au total.
Impact sur les animaux
La méthode de transfert de microbiote utilisée nécessite des interventions chirurgicales sur quelques individus sauvages, notamment la vasectomie, et le transfert d’embryons de souris de laboratoire. Ces procédures peuvent entrainer des nuisances post opératoires (douleur, et dans de très rares cas fièvre, infection). Les expériences de phénotypage des comportements, de l’activité physique, et du métabolisme peuvent induire un léger stress. L’infection par un parasite intestinal semble être sans réel effet sur le bien-être des souris d’élevage. En revanche, l’infection par ingestion d’un pathogène bactérien, peut induire des nuisances plus importantes. De plus, lors des expériences d’infections, des prises de sangs seront réalisées régulièrement afin de mesurer l’efficacité de la réponse immunitaire, ce qui induit des souffrances légères de courte durée aux animaux.
Devenir
Durant la dernière expérience du protocole, les souris sont infectées par un pathogène et/ou un parasite intestinal, et des prélèvements d'organes devront être réalisés sur ces individus. Ces individus devront donc être euthanasiés.
Remplacement
Le projet vise à étudier l’impact des Microbiotes intestinaux sauvages sur les phénotypes de la souris hôte. Le remplacement n’est pas possible car il n’est pas possible d’utiliser un modèle in vitro ou informatique capable de modéliser des interactions biologiques aussi complexes.
Réduction
Nous avons pour objectif de réaliser ce projet en suivant la recommandation d’étudier les deux sexes, tout en réduisant au maximum le nombre d’individus utilisés et cela sans compromettre la puissance statistique de nos analyses. La personnalité des individus, l’effet du sexe et l’effet du microbiote intestinal, sont des facteurs qui augmentent la variabilité des résultats. Selon des données préliminaires, réaliser nos expériences avec des groupes de 12 individus, permettra d’avoir des données suffisamment robustes pour être exploitées statistiquement. Par ailleurs, le fait d’étudier les mêmes individus dans l’ensemble des expériences (mesure du comportement, de l’activité physique, de l’efficacité du métabolisme et de la résistance aux infections), plutôt que des individus différents pour chacune des expériences, permet de réduire considérablement le nombre d’individus utilisés.
Raffinement
Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expérimentations. Une grille de score/suivi sera mise en place. Concernant l’accueil des souris sauvages en conditions d’élevages, elles recevront un enrichissement supplémentaire au sein des cages (batônnets de bois à ronger, igloos en carton pour permettre la nichée que les individus sauvages affectionnent particulièrement), afin de prendre en compte leur caractère sauvage / non habitué aux conditions d’élevage. Pour les chirurgies décrites dans le projet, les animaux seront placés sur tapis chauffant dès l’endormissement (anesthésie) et jusqu’au réveil. Une analgésie est prévue avant la chirurgie et pendant le post-opératoire. De l’onguent ophtalmique sera déposé sur les yeux afin d’éviter le dessèchement de la cornée. Le suivi post opératoire permettra de prendre en charge les douleurs potentielles subies par l’animal. Une surveillance accrue de la souffrance des animaux sera également réalisée pendant l’expérience d’infection expérimentale. En cas de souffrance trop importante (estimée grâce à grille d’évaluation), les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Le modèle souris est choisi car il est le modèle de prédilection pour l’étude du microbiote intestinal en conditions contrôlées. C’est également le modèle biologique utilisé par les différents membres du consortium de laboratoires amenés à exploiter les données de ce projet. Enfin, les MI sauvages préalablement collectés sont des MI de souris. Des mâles et femelles juvéniles (4 semaines) seront utilisées pour le transfert de microbiote par gavage. Après 6 semaines supplémentaires, ces femelles porteuses du MI greffé, seront mises en présence d’un mâle de manière à produire une descendence. Ainsi à la naissance des petits, la composition du MI greffé sera stabilisée et le MI transmis dès leur naissance. Dans toutes les autres procédures, seuls des individus adultes seront utilisés (à partir de 12 semaines).
Évaluation du risque à long terme de l’utilisation d’opioïdes chez les adolescents pour traiter la douleur induite par la chimiothérapie, dans un modèle rongeur. MODIFICATION.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Traitées par chimiothérapie puis par morphine pendant leur adolescence, à partir de cinq semaines, 920 souris reçoivent vingt injections quotidiennes sur animal vigile, dont une injection sous la plante de la patte que le porteur décrit comme aiguë et inflammatoire. 600 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 320 d'un niveau sévère, et toutes sont tuées pour analyse post-mortem. Il s'agit de mesurer, une fois adultes, leur sensibilité à la douleur, leur humeur et leurs comportements de dépendance, la morphine induisant l'état de dépendance physique que le protocole cherche précisément à provoquer. Les tests comportementaux sont annoncés par grandes catégories, seuils nociceptifs, anxiété, récompense, sans qu'aucun soit nommé.
Objectifs
Environ 70 % des jeunes patients souffrant de cancers pédiatriques rapportent également des douleurs sévères. Ces dernières peuvent être le résultat des traitements destinés à éliminer les cellules cancéreuses. En effet, la plupart des agents chimiothérapeutiques détruisent les microtubules dans les nerfs périphériques, favorisent les processus inflammatoires et le dysfonctionnement axonal, provoquant ainsi des douleurs neuropathiques et des douleurs musculaires ou osseuses qui sont fréquemment décrites 4 à 5 jours après les cycles de traitement. Pour soulager ces douleurs, pour l’heure, les opioïdes tels que le tramadol ou la morphine restent le traitement de référence. Cependant, nous ne savons que peu de choses sur les effets à long terme de l'utilisation répétée d'opioïdes à un stade précoce de la vie. Il est donc urgent de mieux comprendre les effets à long terme de l'utilisation d'opioïdes chez les enfants atteints de cancer et ce sous différents angles. Il semble notamment crucial de comprendre les effets sur la sensibilité à la douleur, l'humeur et l'utilisation abusive d'opioïdes une fois que ces jeunes enfants atteignent l’âge adulte. Ainsi, ce projet pilote, réalisé sur un modèle murin, sera développé autour de deux objectifs principaux : (i) évaluer l'impact de l'utilisation répétée d'opioïdes au début de la vie (adolescence), suite à des traitements chimiothérapeutiques, sur la nociception, l'humeur et les comportements d’addiction à l'âge adulte ; (ii) identifier les régions du cerveau affectées par l'utilisation d'opioïdes au début de la vie (adolescence) en se concentrant particulièrement sur les structures impliquées dans la matrice de la douleur et le traitement de la récompense.
Bénéfices attendus
Ce projet, validé par un comité d’évaluation scientifique, a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur les effets comportementaux à long terme d’une traitement anti-cancéreux combiné à la prise de morphine à un stade précoce de la vie. De plus, ce projet apportera les premières informations permettant de comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans ces effets et permettra de mettre en évidence de potentielles différences sexuelles, souvent sous-estimées dans les études axées sur les adolescents. A long-terme, ce projet permettra d’améliorer le soin des cancers pédiatriques et surtout la gestion de la douleur associée aux traitements utilisés.
Procédures
Le but de ce projet est d’étudier l’effet à long terme d’un traitement anti-cancéreux combiné à des morphiniques effectué lors de l’adolescence. Nous évaluerons les effets nociceptifs, émotionnels et en lien avec les comportements d’addiction. Ainsi des groupes de souris seront traitées avec ce traitement [20 injections au total (1/jour), sur animal vigile; durée d'une injection ~10sec]. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des tests comportementaux (de 5 min à 30 min de test) évaluant les seuils nociceptifs, les comportements anxiodépressifs et les en lien avec la récompense. Un seul test sera réalisé par jour et un délai minimal de 24h sera respecté entre chaque test. MODIFICATION : UNE INJECTION SUR ANIMAL VIGILE D'UNE DUREE DE 10 SECONDES SERA EFFECTUEE. Des chirurgies sur animal anesthésié seront nécessaires (1 chirurgie d'une heure maximum / animail). La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures nécessitent un traitement anti-cancéreux qui peut provoquer une douleur modérée aux animaux. L’administration aigue ou répétée de morphine peut induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies sur animal anesthésié (1 chirurgie d'une heure maximum / animal) pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. MODIFICATION : L'INJECTION SOUS CUTANEE AU NIVEAU PLANTAIRE induit UNE DOULEUR AIGUE AINSI QU’UNE POTENTIELLE INFLAMMATION AU NIVEAU DU SITE D’INJECTION nécessaires à l'étude réalisée. La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de réponses nociceptives, de comportement émotionnels et de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement et 10 pour les analyses immunohistologiques. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet et que les deux sexes soient utilisés, les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour notre projet et les approches sur cerveau entier permettront d’identifier un grand nombre de cibles potentielles sans avoir à répéter les expériences.
Raffinement
Tout au long des expériences, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), et observées quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Pour le suivi du bien-être animal lors du traitement à la vincristine, une grille de score sera utilisée permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Cette grille de score visera également à évaluer la zone d’injection et d’ainsi vérifier l’absence d’inflammation locale, d’induration ou de dommages cutanés. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, en complément de la grille de score du suivi, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.
Choix des espèces
Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’humain, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Par ailleurs, d’autres expérimentations portant sur les conséquences d’une douleur neuropathiques ont déjà été réalisées par notre équipe sur des souris mâles et femelles. De ce fait, par soucis de cohérence et reproductibilité, nous souhaitons conserver la même souche de souris pour ce projet. Des animaux adolescents seront utilisés (début des procédures à 5 semaines pour le traitement anti-cancéreux/morphine) car l’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet à long terme des traitements subis à un stade précoce de la vie.
Identification des neurones impliqués dans le contrôle volontaire de la respiration
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
- Système respiratoire
895 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour que leur cerveau soit prélevé, 386 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 509 d'un niveau modéré. À partir du sevrage, à vingt et un jours, ils apprennent pendant six semaines à nager en apnée, puis subissent une ou deux chirurgies cérébrales ou spinales d'une heure et demie à deux heures et demie, la dernière sans réveil. Des diodes implantées dans le crâne servent à déclencher ou bloquer des apnées, pour identifier les neurones du contrôle volontaire de la respiration. Le porteur décrit l'entraînement à la nage comme un exercice ludique adapté au comportement naturel du rat, et qualifie d'"indispensables" les avancées que garantirait le caractère novateur de l'étude.
Objectifs
La respiration permet le renouvellement indispensable de l’oxygène dans l’organisme et l’élimination du dioxyde de carbone. L’activité respiratoire automatique est générée par des réseaux neuronaux du tronc cérébral dont la localisation ainsi que les mécanismes de fonctionnement sont à présent bien connus. En revanche, les réseaux situés dans les régions supérieures du cerveau qui permettent de contrôler volontairement la respiration ou de l’adapter à nos comportements ou émotions restent largement méconnus. Notre projet vise à identifier chez le rat les neurones impliqués dans la commande volontaire de la respiration, en particulier ceux responsables de l’apnée volontaire. Le premier objectif aura pour but de localiser les neurones des régions cérébrales supérieures qui envoient directement des connexions vers les neurones contrôlant les muscles respiratoires. Pour cela nous utiliserons des traceurs injectés dans la moelle épinière ou le tronc cérébral. Le second objectif consistera à stimuler ou bloquer sélectivement ces neurones identifiés dans les expériences précédentes pour comprendre leur rôle dans la respiration. Les réponses respiratoires et cardiaques seront analysées chez l’animal anesthésié ou éveillé tandis que les neurones seront activés ou désactivés. D'autres expériences viseront à identifier les neurones activés lors de la nage en apnée, grâce à un marqueur d’activité cellulaire. Pour cela, les rats suivront un entraînement progressif et non contraignant à la nage, puis à l’apprentissage de l’apnée volontaire, sous forme d’un exercice ludique et adapté à leur comportement naturel. Ensuite, il s'agira de moduler l’activité des neurones activés lors de la nage en apnée. Nous devrions ainsi pouvoir déclencher des épisodes d’apnée suite à l’activation sélective de certains neurones, ou inversement, bloquer l’apnée suite à l’inhibition de ces mêmes neurones. L'originalité et la force des expériences proposées résident ainsi dans leur capacité à caractériser, de manière inédite, le réseau neuronal impliqué dans le contrôle volontaire de la respiration, tant dans son organisation structurelle que dans ses mécanismes fonctionnels.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche proposé vise à améliorer nos connaissances sur le contrôle nerveux de la respiration. Il a précisément pour but d’identifier les neurones impliqués dans la commande volontaire de la respiration. De plus, les explorations fonctionnelles réalisées dans ce projet permettront pour la première fois d’établir une relation de cause à effet entre l’activité des neurones identifiés et les paramètres respiratoires et cardiovasculaires. La tâche comportementale sélectionnée, l’apnée associée à la nage en immersion, est particulièrement intéressante. En effet, une baisse du rythme cardiaque (ou bradycardie) est observée lors de l’apnée chez presque toutes les espèces animales étudiées ainsi que chez l’homme. Ainsi, les découvertes effectuées dans le cadre de ce projet pourraient permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles et de lutter plus efficacement contre le stress chronique, l’anxiété ou l’hypertension artérielle. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront également de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Procédures
Ce projet expérimental sera mené exclusivement sur des rats. Les animaux seront répartis en plusieurs groupes selon les procédures prévues. Groupe 1 : Apprentissage de la tâche comportementale d’apnée pendant 6 semaines, suivie d’une chirurgie terminale sans réveil d’une durée moyenne de 20 minutes chez l’animal anesthésié. Groupe 2 : Première intervention chirurgicale sous anesthésie d’une durée variant entre 1h30 et 2h30, suivie d’un réveil. Après un délai de 3 à 6 semaines nécessaire à l’apprentissage de la tâche comportementale d’apnée, seconde chirurgie sans réveil, sous anesthésie, de même durée (1h30 à 2h30). Ces interventions pourront inclure des manipulations préparatoires, la mesure des paramètres cardiorespiratoires et des procédures terminales.
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à la mise en œuvre de plusieurs protocoles décrits dans le présent projet. L’anesthésie, en soi, génère un stress. Les procédures chirurgicales invasives, dont les chirurgies cérébrales et spinales, sont susceptibles d’occasionner des douleurs locales, des démangeaisons et des irritations cutanées lors de la cicatrisation. La pose d’implants sous-cutanés ou cérébraux peut également occasionner une gêne mécanique. Les expériences d’optogénétique prévues dans ce projet nécessitent une illumination transcrânienne ou intracrânienne via des diodes électroluminescentes. Cette illumination sera effectuée avec une faible puissance sans effet thermique et n’entrainera donc aucune conséquence néfaste pour l’animal. Une réduction transitoire, plus ou moins marquée de l'activité locomotrice est observée pendant 12 à 24h environ suivant la chirurgie, et pendant cette période d’isolement post-opératoire, un stress peut être lié à la diminution des interactions sociales. La cicatrisation complète des plans cutanés suturés est observée dans les 5 à 7 jours qui suivent la chirurgie. L’apprentissage progressif de la tâche comportementale de nage, en particulier lors des premières interactions avec le milieu aquatique et la découverte du nouvel environnement, peut être une source de stress temporaire pour les animaux et de fatigue musculaire transitoire. Une légère hypothermie, induisant un inconfort thermique, peut être attendue à la sortie de l’eau. Enfin, l’activation des neurones potentiellement impliqués dans la génération de l’apnée volontaire chez un animal respirant à l’air libre pourrait provoquer une brève apnée sèche, limitée à quelques cycles respiratoires (quelques secondes), tandis que leur inactivation pourrait entraîner un refus de se lancer dans la phase de nage en apnée lors de la tâche comportementale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, le cerveau doit être prélevé pour localiser précisément les neurones d'intérêt et/ou circonscrire les régions cérébrales ciblées.
Remplacement
Ce projet a pour but d'identifier les neurones impliqués dans la commande volontaire de la respiration. Pour l’instant, les connaissances incomplètes sur le sujet ne permettent pas d’envisager d’approches autres que l’expérimentation animale pour répondre à ces questions (comme une étude in silico par exemple). En effet, il s'agit de mécanismes physiologiques fondamentaux pour lesquels il n'existe que très peu ou pas de résultats antérieurs. Cette absence de connaissances a priori sur ces mécanismes explique donc l'incapacité actuelle à modéliser le fonctionnement des réseaux respiratoires centraux. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Réduction
Le présent projet repose sur l’utilisation de techniques modernes, encore jamais employées pour identifier les neurones impliqués dans la commande volontaire de la respiration. L'aspect novateur de l'étude garantit des avancées majeures et indispensables sur la physiopathologie de ces systèmes. Les combinaisons de technique d’enregistrement des activités cardiorespiratoires et de manipulation des neurones par optogénétique permettront de fournir des résultats fonctionnels précis, et ainsi, répondre à de nombreuses questions grâce à la mise en œuvre des protocoles expérimentaux envisagés. Cela sert le double objectif d’optimisation des aspects scientifiques et éthiques. De plus, une analyse de puissance statistique sera réalisée systématiquement avant chaque expérimentation afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à la question expérimentale. Une fois les expérimentations réalisées, des tests statistiques appropriés permettront de valider ou non la question initiale posée. Les différentes stratégies expérimentales proposées ici nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour servir les objectifs scientifiques de cette étude en utilisant les outils et les approches techniques les plus appropriés à chaque partie de l’étude. En particulier l'usage de souches transgéniques chez le rat, combiné aux approches opto- ou pharmacogénétiques, permet de cibler beaucoup plus spécifiquement les neurones d'intérêt par rapport aux autres techniques existantes, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle où la température est contrôlée et les cages munies d'un environnement enrichi. Le nombre optimal d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards concernant les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Une analgésie locale et systémique permettra de couvrir la douleur induite par ces interventions. La température corporelle sera maintenue par un monitorage rectal associé à un tapis chauffant. Un onguent ophtalmique permettra de protéger les yeux des animaux pendant l’intervention. Un suivi post-opératoire rigoureux d’une durée minimale de 7 jours sera effectué, une fiche individuelle de suivi sera remplie et les points limites seront respectés. Lorsque différents dispositifs seront implantés pour effectuer des mesures physiologiques chroniques (2 à 3 semaines), le suivi individuel des animaux sera réalisé pendant toute la durée des expériences en respectant les points limites. Les implants thoraciques et crâniens utilisés sont miniaturisés et dépourvus de batterie interne et sont donc plus légers que les dispositifs télémétriques classiques. Cette conception réduit la charge supportée par l’animal et limite la gêne potentielle lors des déplacements ou de la nage. Dans le cadre de la tâche comportementale, l’apprentissage débutera chez de jeunes animaux afin de limiter le stress. L’entraînement se fera progressivement, avec d'abord une simple mise en contact avec l’eau, puis une nage en surface sur des distances progressivement allongées, puis un apprentissage de l’apnée sur des distances croissantes. L’eau du bassin sera thermostatée à 32 °C (zone de thermoneutralité du rat) afin d’éviter tout inconfort thermique. Après chaque session, les animaux seront séchés et frictionnés dans une serviette douce pour limiter l’inconfort lié à l’humidité. Cette manipulation constitue également une interaction sociale positive pouvant être assimilée à une récompense. Une récompense alimentaire appétente sera proposée à chaque réussite afin de renforcer la motivation et de compenser la dépense énergétique associée à l’effort.
Choix des espèces
Le rat sera la seule espèce d’animaux utilisée. L’intérêt général de ce modèle repose essentiellement dans la proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats), la reproduction rapide des animaux, et les conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes. Le rat est aussi plus robuste physiologiquement que la souris et permet de recueillir davantage de paramètres physiologiques, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux utilisés (car moins de perte expérimentale) dans chacun des protocoles envisagés. Des rats adultes seront utilisés comme reproducteurs. Les expériences seront exclusivement réalisées sur la descendance. Les expériences débuteront chez les animaux sevrés, c’est-à-dire à l’âge de 21 jours (P21). Ces animaux seront identifiés individuellement par implantation d’une puce (1.25 x 7mm) sous-cutanée stérile. Ce début commun à P21 des procédures garantit l’homogénéité des conditions expérimentales entre les différentes parties du projet. Selon les groupes expérimentaux, les animaux seront âgés d’un mois et demi environ pour les plus jeunes jusqu’à trois mois pour les plus âgés lors de l’étape terminale. Ce calendrier expérimental permettra d’atteindre notre objectif qui est d’identifier les neurones impliqués dans le contrôle volontaire de la respiration chez l’adulte, c’est-à-dire lorsque le développement du système nerveux central est achevé.
Étude du rôle du système lymphatique dans la régulation du sommeil chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six heures de chirurgie crânienne pour implanter le matériel d'enregistrement, après une première opération d'une heure et demie trois semaines plus tôt: 24 souris subissent ces deux interventions, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées ensuite pour prélever leurs tissus. À partir de la seconde opération, chacune vit seule pendant dix-sept jours au plus, isolement dont le porteur reconnaît qu'il génère du stress chez un animal social. La question posée est de savoir si les vaisseaux lymphatiques des méninges interviennent dans la structure du sommeil, et le RNT présente l'ensemble comme des données préliminaires à un projet ultérieur plus ambitieux. La souris est retenue parce que les techniques chirurgicales y sont maîtrisées et que la croissance de la boîte crânienne est achevée à six semaines, ce qui facilite la pose des implants.
Objectifs
Des vaisseaux lymphatiques ont récemment été identifiés dans la dure-mère, l’enveloppe la plus externe du cerveau. Ils contribuent au drainage du liquide céphalorachidien (LCR), un liquide clair qui entoure le cerveau et la moelle épinière, transporte les nutriments et aide à éliminer certains déchets produits par les cellules cérébrales. Ce processus de circulation du LCR, appelé système glymphatique, est particulièrement actif pendant le sommeil, lorsque le cerveau échange davantage de substances entre le LCR et les tissus cérébraux. En revanche, le rôle exact du drainage lymphatique de la dure-mère dans certaines phases du sommeil et dans la circulation et l’élimination des déchets cérébraux reste mal compris. L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication des vaisseaux lymphatiques méningés dans la structure du sommeil. Pour cela, une approche expérimentale sera mise en œuvre chez la souris : – une modulation de l’activité des vaisseaux lymphatiques sera réalisée par injection de substances dans le LCR qui soit amplifieront soit feront disparaitre les vaisseaux lymphatiques. – la structure du sommeil et l’activité cérébrale et vasculaire seront ensuite évaluées par enregistrements via des ultrasons captant le flux sanguin et des électrodes captant l’activité électrique des neurones. Les données obtenues permettront de mieux caractériser comment les vaisseaux lymphatiques sont impliqués dans les fonctions réparatrices du sommeil et la circulation du LCR dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des liens entre sommeil, circulation du liquide cérébral (lymphatique et glymphatique) et élimination des déchets du cerveau. Plusieurs maladies neurodégénératives montrent des troubles précoces du sommeil ainsi que des dysfonctionnements des systèmes lymphatique et glymphatique comme la maladie de Parkinson ou d’Alzheimer représentant plus de 60 millions de personnes dans le monde. En modulant l’activité des vaisseaux lymphatiques et en étudiant leurs effets sur le sommeil et l’activité cérébrale, ce projet pourrait permettre d’identifier des mécanismes clés de ces interactions. Les résultats fourniront des données préliminaires pour un futur projet plus ambitieux, visant à approfondir ces mécanismes et à étudier leur pertinence chez l’humain.
Procédures
Chaque souris subira deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée : la première consistant en une injection dans le liquide entourant le cerveau (1,5h maximum), puis, 21 jours plus tard, la deuxième permettant l’implantation du matériel nécessaires aux enregistrements (6h maximum). Après la deuxième chirurgie, les animaux bénéficient de 7 jours de repos, 2 à 5 jours d’habituation au matériel, puis 3 heures continues d’enregistrements quotidiens sur 5 jours consécutifs. A partir de la deuxième chirurgie les animaux devront être hébergés seuls (17 jours maximum).
Impact sur les animaux
Certaines interventions chirurgicales prévues dans ce projet peuvent entraîner un inconfort ou des douleurs temporaires, surtout dans les deux jours suivant les opérations. Des signes comportementaux inhabituels, comme agitation, prostration ou mobilité réduite, peuvent également être observés. L’anesthésie générale nécessaire pour les chirurgies comporte des risques tels que baisse de la température corporelle, une sécheresse oculaire ou des difficultés cardio-respiratoires. Après la chirurgie de mise en place du matériel pour les enregistrements, les animaux sont hébergés seuls pour protéger les implants et les animaux de blessures potentielles, s’agissant d’animaux sociaux cela génèrera un stress. Le matériel implanté sera associé à un inconfort pour l’animal et un risque rare de fragilisation voire perte du matériel et un risque d’infection. Le matériel d’enregistrement peut entraîner une petite gêne temporaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses pour répondre à notre objectif scientifique.
Remplacement
L’étude des mécanismes physiopathologiques, en particulier les interactions biologiques entre le système neurovasculaire, le drainage des fluides cérébraux, et le sommeil nécessite un modèle vivant pour reproduire de manière réaliste ces processus complexes. La circulation active des fluides cérébraux, ainsi que les dynamiques fonctionnelles du système neurovasculaire, sont des éléments essentiels qui ne peuvent être correctement modélisés par des organoïdes ou des systèmes in vitro. Les organoïdes, bien qu’utiles dans certains contextes, ne permettent ni la reproduction des mécanismes de régulation dynamique du flux veino-lymphatique, ni l’étude des réponses physiologiques du sommeil. Par conséquent, le recours à des modèles animaux est indispensable pour analyser les réactions physiologiques complexes, comprendre les mécanismes sous-jacents à l’atteinte de certaines fonctions, et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Il n'existe actuellement aucune méthode alternative aux modèles animaux permettant d'atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
L’étude nécessitera 24 souris, avec 6 animaux par groupe expérimental (3 groupes) et un risque de pertes évalué à 6 animaux (30 pourcent). Ce nombre a été déterminé par des calculs statistiques. Cette taille permettra d’assurer la puissance statistique nécessaire pour l’analyse des données obtenues.
Raffinement
Les procédures mises en œuvre dans ce projet sont conçues pour réduire au maximum le stress, la douleur et l’inconfort des animaux. À leur arrivée, les souris bénéficient d’une période d’acclimatation d’une semaine dans une animalerie agréée, avec un hébergement en groupe, un environnement enrichi (nids, objets à ronger) et un accès libre à l’eau et à la nourriture. Tous les animaux sont observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci est transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, avec l’administration systématique d’antalgiques avant et après l’opération. Pendant la chirurgie, la température corporelle est maintenue, les yeux sont protégés et l’hydratation assurée. Après chaque intervention, les animaux font l’objet d’une surveillance rapprochée, permettant d’adapter les soins si nécessaire. Après la chirurgie d’implantation destinée aux enregistrements du sommeil, les animaux sont hébergés individuellement afin de protéger à la fois l’implant et la souris, en évitant toute blessure liée aux interactions avec les congénères. Une période de récupération d’une semaine est respectée, suivie d’une phase d’habituation de 2 à 5 jours, durant laquelle les animaux s’adaptent progressivement au port de l’implant et aux conditions d’enregistrement. Tout au long de cette période, un enrichissement adapté est maintenu afin de préserver le bien-être des animaux.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les systèmes veineux et lymphatiques participent à l’élimination naturelle de certains composés du cerveau. Ces mécanismes reposent sur des interactions complexes entre la circulation des fluides cérébraux, l’activité neuronale et le sommeil, qui ne peuvent pas être étudiées de manière intégrée chez l’être humain ni à l’aide de modèles in vitro, tels que les organoïdes cérébraux, qui ne reproduisent ni la vascularisation ni la circulation des fluides du cerveau intact.La souris a été choisie comme modèle expérimental car elle est particulièrement adaptée à ce type de recherche : les techniques chirurgicales permettant de manipuler le système vasculaire cérébral sont maîtrisées chez cette espèce, tout comme les implantations chirurgicales permettant des enregistrements de l’activité électrophysiologique. L’utilisation combinée de modèles chirurgicaux permettra d’analyser de manière complémentaire le rôle de ces systèmes dans le fonctionnement cérébral. Les procédures seront réalisées chez des souris adultes âgées de 6 à 12 semaines. À cet âge, la croissance de la boîte crânienne est achevée, ce qui permet une meilleure précision chirurgicale et réduit les risques liés aux implants. Cette tranche d’âge correspond également à une période où les systèmes impliqués dans la circulation des fluides cérébraux sont pleinement fonctionnels.
Evaluation de l’effet de candidats médicaments sur l’insuffisance rénale lors d’une septicémie chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 400
Tous tués pour que des tissus soient collectés, 400 rats et 400 souris subissent une ligature et une vidange du caecum, opération de quinze à vingt minutes qui déclenche une septicémie puis une insuffisance rénale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance sévère et les animaux présentent fièvre, prostration, fatigue et diarrhées, avec un retentissement attendu sur le cœur et les reins. Jusqu'à vingt administrations par animal sur dix jours, six prélèvements sanguins, des séjours de vingt-quatre heures en cage à métabolisme et des vidanges manuelles de vessie complètent le protocole. Le porteur teste des molécules de clients dont il indique ne connaître ni la nature ni les effets secondaires possibles, et précise qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les effectifs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de candidats médicaments sur l’insuffisance rénale (quantifications de marqueurs biologiques, mesure de la vitesse de filtration du sang par le rein, histologie du rein) suite à une septicémie induite par une lésion du caecum chez le rongeur.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’insuffisance rénale due à une septicémie.
Procédures
Les animaux vont subir une chirurgie (ligature et vidange du caecum, environ 15-20 min d’intervention) induisant le développement d’une septicémie qui induira en suivant une insuffisance rénale. Les animaux vont recevoir des administrations de composés à tester. Ces gestes seront très rapides (moins d’1 minute) et seront réalisés par du personnel compétent pour diminuer tout stress pendant 10 jours maximum (certains traitements pourront se faire 2 fois par jours donc un nombre maximum de 20 administrations par animal). Les animaux seront mis dans des cages à métabolisme et isolés temporairement de leurs congénères (24H maximum 2 fois par semaine maximum pendant 10 jours) afin de récolter de l’urine. Une vidange manuelle de la vessie pourra aussi être réalisée (environ 30 secondes pour ce geste sans douleur) 2 à 3 fois par semaine pendant 10 jours. Les animaux auront une anesthésie gazeuse afin de pouvoir leur « scotcher » un capteur afin d’évaluer la filtration glomérulaire pendant 2 heures et seront remis avec leurs congénères ensuite. Cette procédure non invasive se fera avant l’induction de la pathologie et au cours du suivi de l’étude 2 à 3 fois par semaine (les animaux pourront avoir ce protocole au maximum 5 fois). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés au cours de l’expérimentation (geste durant 1 minute, 6 fois maximum au cours de l’étude).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, chirurgies, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une douleur (douleur de l’aiguille, douleur post-opératoire). Le modèle utilisé mime une septicémie, par conséquent les animaux vont avoir les mêmes symptômes que ceux observés chez l’Homme (fièvre, recroquevillement, fatigue, diarrhées…) pouvant avoir ensuite un impact sur d’autres organes comme le cœur, les reins….
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et des tissus seront collectés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’insuffisance rénale liée à une septicémie. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) de par l’utilisation d’une méthode non invasive (mesure de la filtration glomérulaire). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 4-5 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée et application de gel oculaire. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Si un animal présentait un symptôme amenant à un point limite, il serait dans un premier temps hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état se dégradait rapidement, l’animal serait surveillé de façon plus attentive (au moins 2 fois par jour) et mis à mort si besoin.
Choix des espèces
Ce modèle est bien décrit chez le rongeur dans la littérature internationale. Classiquement, les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures. Toutefois selon la demande des clients, des animaux âgés de 4 semaines minimum pourront être utilisés
Mise en place et évaluation du développement des anévrismes de l’aorte thoracique par imagerie non invasive
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour provoquer puis suivre un anévrisme de l'aorte, 512 souris subissent l'ouverture puis la fermeture de la cage thoracique sous anesthésie, une opération d'environ vingt-cinq minutes. 432 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 80 d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélever le cœur. Chacune reçoit ensuite des injections deux fois par semaine pendant six mois au plus et passe jusqu'à treize échographies sous anesthésie gazeuse. Le porteur écrit que la dilatation de l'aorte ne provoque généralement pas de symptômes, tout en indiquant qu'elle peut comprimer les organes voisins et se rompre en hémorragie interne.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre comment certaines cellules des vaisseaux sanguins se comportent et interagissent lors du développement d’un anévrisme de l’aorte, une maladie caractérisée par une fragilisation et une dilatation de l’aorte. Plus précisément, ce projet vise à : 1-Mettre en place un modèle expérimental de l’anévrisme de l'aorte thoracique chez la souris à l’aide de techniques chirurgicales de précision guidées par l’imagerie. 2- Identifier les premiers signes biologiques associés à l’apparition et à l’évolution de l’anévrisme. 3-Tester et valider de nouvelles cibles pouvant conduire à de futurs traitements. 4- Développer des « jumeaux numériques » de souris, c’est-à-dire des modèles informatiques combinant les données d’imagerie et les informations biologiques, afin de mieux prédire l’évolution de la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de certaines cellules dans la fragilisation de l’aorte lors d’un anévrisme. En identifiant les mécanismes moléculaires responsables du durcissement et de l’affaiblissement de la paroi du vaisseau, ces travaux pourront contribuer à mieux évaluer le risque de rupture de l’aorte, une complication grave et potentiellement mortelle. Les connaissances obtenues aideront à orienter le développement de nouveaux traitements visant à réduire la gravité de la maladie et à améliorer la survie des patients. Par ailleurs, l’utilisation de techniques d’imagerie avancées permettra d’identifier de nouveaux indicateurs mesurables de la maladie, ouvrant la voie à un diagnostic plus précoce, un meilleur suivi de l’évolution de l’anévrisme et une évaluation plus précise de l’efficacité des traitements.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale d’une durée approximative de 25 minutes, réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptées, permettant l’induction d’un anévrisme de l’aorte. Un suivi non invasif par imagerie échographique, d’une durée d’environ 20 minutes, sera réalisé sous anesthésie gazeuse deux fois par mois, pour un maximum de 13 examens par souris. Les animaux recevront des traitements expérimentaux administrés par voie orale dans l’eau de boisson et par injections, à raison de deux injections par semaine pendant une période maximale de six mois. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé. À l’issue des procédures, les animaux seront euthanasiés conformément aux recommandations réglementaires afin de permettre la collecte des organes destinés aux analyses histologiques et moléculaires.
Impact sur les animaux
L’intervention chirurgicale, impliquant l’ouverture puis la fermeture de la cage thoracique, est susceptible d’entraîner une douleur post-opératoire au réveil des animaux, ainsi qu’une perte de poids légère et transitoire et une augmentation temporaire du stress. L’anévrysme de l’aorte thoracique correspond à une dilatation anormale de la principale artère du corps. Cette anomalie ne provoque généralement pas de symptômes. Elle peut toutefois entraîner des douleurs ou une gêne lorsqu’elle compresse les organes voisins. Dans les cas les plus graves, l’anévrysme peut se rompre et provoquer une hémorragie interne. Le suivi par imagerie échographique constitue une approche non invasive et non douloureuse ; le stress associé à cet examen est limité à une courte phase de manipulation par l’expérimentateur, suivie d’une anesthésie, pour une durée totale d’environ 20 minutes par animal. Les injections réalisées chez des animaux vigiles peuvent entraîner une gêne ou une douleur légère et transitoire au niveau du site d’injection.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de procéder au prélèvement du coeur pour des analyses histologiques et moléculaire
Remplacement
Le développement de modèles murins de pathologies cardiovasculaires, telles que l’anévrisme de l’aorte, joue un rôle essentiel en recherche préclinique pour la compréhension des fonctions physiologiques intégrées, en particulier lorsque les méthodes substitutives ne permettent pas d’obtenir des informations équivalentes. Le suivi de processus physiologiques tels que le métabolisme, la perfusion tissulaire, la fonction d’organes complexes ou les effets des médicaments sur l’organisme fournit des informations précieuses sur le fonctionnement global des systèmes biologiques, qui ne peuvent être reproduits fidèlement par des modèles cellulaires. Par ailleurs, les données fonctionnelles issues de l’imagerie échographique seront utilisées et partagées afin de développer, à terme, des jumeaux numériques de souris. Ces modèles informatiques, combinant les données d’imagerie et les informations biologiques, permettront de simuler les perturbations du flux sanguin avant, pendant et après traitement, offrant ainsi un outil prédictif avancé pour optimiser les stratégies thérapeutiques et améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents.
Réduction
La procédure chirurgicale induisant l’anévrisme de l’aorte sera guidée, en amont, par des données échographiques précises, permettant ainsi de réduire la mortalité opératoire et périopératoire, ce qui contribue à diminuer le nombre d’animaux nécessaires. L’imagerie non invasive en temps réel permettra d’évaluer l’apparition des premiers signes de dysfonction aortique, évitant ainsi l’euthanasie prématurée des animaux pour confirmer le succès de la procédure. Chaque animal servira de témoin à lui-même, ce qui optimise le nombre total d’animaux requis grâce à des mesures répétées sur le même individu.
Raffinement
La procédure chirurgicale destinée à induire un anévrisme de l’aorte sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie appropriée, et guidée par des données échographiques précises afin de limiter la durée et le caractère invasif de l’intervention. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne assurée par du personnel formé, avec une évaluation rigoureuse de leur bien-être fondée sur des grilles standardisées de points limites. Les mesures d’analgésie seront adaptées en fonction de cette évaluation, en étroite collaboration avec l’équipe de zootechnie.
Choix des espèces
Le modèle d’anévrisme de l’aorte thoracique chez la souris jeune adulte (mâles et femelles) est un modèle de référence largement utilisé dans de nombreuses études précliniques. La souris représente un organisme particulièrement pertinent pour l’étude de cette pathologie en raison de la forte conservation des mécanismes moléculaires, cellulaires et physiopathologiques impliqués dans les maladies vasculaires entre la souris et l’Homme, ainsi que de la disponibilité de nombreux outils génétiques permettant un ciblage cellulaire précis.
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées de cellules humaines par injection dans la veine de la queue, ou dans le cœur pour les souriceaux de deux jours, 450 souris immunodéficientes subissent ensuite des prises de sang toutes les deux semaines, des greffes de tumeurs et parfois des traitements anti-lymphocytaires. Quatre cents d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, cinquante d'un niveau modéré, et toutes sont tuées pour prélever rate et ganglions. L'objectif est de faire fabriquer un anticorps antitumoral par des lymphocytes B humains, dans des souris dépourvues de défenses immunitaires et donc exposées à tout pathogène de leur environnement. Le porteur annonce que peu de nuisances sont à attendre, tout en listant la maladie du greffon contre l'hôte, la fièvre, les vomissements, les diarrhées et les tremblements liés aux traitements.
Objectifs
L'objectif de ce projet est la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B humains ou leurs précurseurs puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer la capacité antitumorale de nos anticorps.
Bénéfices attendus
L'utilisation des souris immunodéficientes est un excellent modèle pour notre projet. En effet, ces souris ne possèdent plus de lymphocytes et ne peuvent alors plus détruire les cellules étrangères injectées. Elles sont donc capables de recevoir différentes cellules humaines, comme des lymphocytes B qui produiront des anticorps ou même des cellules précurseuses des lymphocytes, qui pourront alors produire des lymphocytes B humains dans les souris. Avec ce projet, nous testerons donc la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé (essai clinique de phase I) et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
La greffe des cellules sera unique et se fera soit par injection intraveineuse dans la veine de la queue chez les souris adultes soit par injection intracardiaque chez les souriceaux nouveau-nés. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Ensuite, des immunisations et des greffes de cellules tumorales pourront être appliquées sur les animaux si la reconstitution immunitaire a été jugé optimale. Des Lipid NanoParticules pourront également être injectés aux souris reconstituées afin d'explorer la possibilité de modifier le génome de nos cellules d'intérêt directement in vivo. Enfin, des traitements anti-lymphocytaire pourront être administrés aux animaux en cas d'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse de cellules. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les autres nuisances attendues viendront de l'injection intracardiaque du nouveau-né. En effet, la mère pourrait ne pas vouloir récupérer son souriceau si celui a été trop manipulé. Des efforts afin de masquer les odeurs liées à la manipulation seront réalisés pour favoriser la réadoption des souriceaux par leur mère. Des effets indésirables pourront également survenir après les greffes de tumeurs, des points limites concernant la taille des tumeurs seront mis en place afin d'éviter trop d'inconfort et de souffrance aux souris. Des nuisances pourraient aussi survenir après l'injection de LNP par voie intraveineuse (perte de poid essentiellement) mais aussi après l'administration de traitements anti-lymphocytaires (fièvre, frissons, vomissements, flush, diarrhées et tremblements).
Devenir
A l'issue de chaque expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution du système immunitaire humain dans la souris ainsi que sur le développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules précurseuses du système immunitaire. Ces dernières sont en effet capables de se différencier dans la moelle osseuse de la souris après injection et de fabriquer dans ces souris diverses populations immunitaires humaines, dont les lymphocytes B. Il est actuellement possible de différencier ces précurseurs in vitro mais uniquement vers quelques voies données, et non vers la différenciation en lymphocyte. Aucun modèle in vitro ne permet une différenciation complète vers toutes les lignées du système immunitaire. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon des critères généraux permettant de quantifier le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes, ce qui permet donc d'éviter le rejet des cellules humaines. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé de prise de xénogreffes, que ce soit des lymphocytes B humains ou leurs précurseurs. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de contamination par divers pathogènes car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Dans un premier temps, l’expérimentation sera commencée chez des animaux de 4 à 6 semaines. En effet, une meilleure prise de greffe des cellules humaines a lieu chez les animaux jeunes, en particulier pour les lymphocytes. Dans un second temps, l’expérimentation sera commencée chez les souriceaux nouveau-nés de 2 jours. En effet, il est maintenant démontré que la prise de greffe des cellules humaines est meilleure quand les cellules sont injectées chez les nouveau-nés, ceci rendant nos expérimentations plus faciles à réaliser et nos résultats plus faciles à analyser (plus de cellules humaines dans la souris donc des effets plus facilement monitorables).
Mise au point d’un modèle de pneumonie expérimentale à Klebsiella pneumoniae produisant des Metallo-Bêta-Lactamases chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Rendues immunodéprimées par deux injections de cyclophosphamide, 120 souris sont infectées par une Klebsiella pneumoniae multirésistante instillée dans le nez sous anesthésie. Cent d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, vingt un niveau sévère, et toutes sont tuées pour que la rate et les poumons soient prélevés. Elles peuvent présenter des difficultés respiratoires douze à dix-huit heures après l'inoculation, sans recevoir d'antalgique ni d'anti-inflammatoire, le porteur indiquant que ces produits interféreraient avec l'infection ou resteraient sans effet sur ses symptômes. Aucun médicament n'est évalué à ce stade: l'étude sert à caler un modèle de pneumonie destiné à tester ensuite des composés anti-infectieux.
Objectifs
La résistance des bactéries aux antimicrobiens (AMR) représente actuellement un problème majeur de santé publique, et menace notre capacité à traiter des infections potentiellement mortelles telles que les pneumonies acquises à l’hôpital, dont le taux de mortalité peut atteindre 50 %. Klebsiella pneumoniae est une espèce bactérienne fréquemment retrouvée en milieu hospitalier et le traitement de ces infections requiert souvent l’usage d’antibiotiques de dernière ligne. Toutefois, l’activité de ces antibiotiques est largement compromise par le fait que les bactéries produisent des facteurs (appelés MBL pour certains) et capables de détruire ces antibiotiques, les rendant ainsi inefficaces. Dans ce cadre, des stratégies thérapeutiques innovantes sont attendues. Certains laboratoires s’intéressent au développement de médicaments capables de s’attaquer aux mécanismes de résistance des bactéries et ainsi de restaurer l’activité des antibiotiques disponibles. Aussi, de façon à évaluer ultérieurement l’activité in vivo de ces médicaments, il convient, dans un premier temps, de développer le modèle d’infection optimal permettant de répondre à la question. Pour cela, l’objectif de la présente étude consiste à développer un modèle prédictif d’infection pulmonaire à Klebsiella pneumoniae multi-résistante chez la souris. Ce modèle servira, par la suite, à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux composés anti-infectieux en développement.
Bénéfices attendus
Les pneumonies bactériennes dues à des espèces multi-résistantes comme K. pneumoniae constituent un challenge pour les professionnels de santé, en raison de leur capacité à produire des facteurs capables de détruire les antibiotiques. L’étude de ces infections est donc primordiale. Le projet permettra de mettre à disposition un modèle de pneumonie à K. pneumoniae précieux, utile à l’évaluation de l’efficacité de composés anti-infectieux en développement, particulièrement attendus en thérapeutique.
Procédures
- Deux injections d’immunosuppresseur (5 secondes maxi) - Une instillation nasale sous anesthésie (temps d’infection 15 secondes maximum)
Impact sur les animaux
Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées selon un protocole bien défini (150 mg/kg de cyclophosphamide à J-4 et 100 mg/kg à J-1). Ce protocole a déjà été utilisé dans plusieurs études et n’a montré aucun effet indésirable sur les animaux (injection de 5 secondes maximum en intrapéritonéal). A J0, l’administration intranasale de la suspension bactérienne sera réalisée par du personnel compétent et expérimenté (temps d’infection 15 secondes maximum, sous anesthésie volatile). La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection pulmonaire ; les souris pourront présenter des signes de difficulté respiratoire environ 12-18h après l’inoculation et une altération de l’état général. Elles seront donc surveillées plus fréquemment sur la période 12h-24h. Sur des modèles similaires (utilisant des souches de Klebsiella pneumoniae exprimant d’autres mécanismes de résistance), aucune mortalité précoce et aucune atteinte des points limites n’avait été rapportée. Cela étant, s’agissant ici d’une phase pilote utilisant de nouvelles souches, une surveillance très rapprochée sur les 24h d’infection sera réalisée selon une grille de score précise.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mise à mort ; la rate et les poumons des animaux seront prélevés, de façon à quantifier la charge bactérienne
Remplacement
Actuellement, le recours au modèle murin est justifié par l’absence d’alternatives expérimentales capables de reproduire de manière pertinente la complexité des infections pulmonaires, intégrant la physiologie pulmonaire, l’infection et la diffusion intratissulaire des antibiotiques. Même si d’autres essais in vitro dynamiques sont en cours, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes, tout en respectant la variabilité biologique inhérente à ce genre d’étude. Aussi, des expériences précédentes sur des modèles similaires nous permettent de dire que 5 animaux par groupe (au lieu de 10) et par temps sont suffisants pour cette phase de mise au point de modèle.
Raffinement
Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile. Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 5 par cage. La principale nuisance sera liée à l’installation et à la progression de l’infection pulmonaire. D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, ce qui risquerait même de faire flamber l’infection. L’administration d’antalgiques n’aurait par ailleurs aucune action sur les symptômes liés à l’infection. Une surveillance accrue (toutes les 2-4h, selon le score clinique) sera réalisée à compter de 12h post-infection.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de choix pour la mise au point de ces modèles d’infection pulmonaire (largement décrit dans la littérature) ainsi que pour l’évaluation de thérapies antibiotiques ultérieures. Des souris de 8 semaines seront utilisées de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédents modèles).
Rôle des canaux astrocytaires Kir4.1 dans la douleur neuropathique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le nerf sciatique de 540 souris est serré par une ligature chronique, ce qui provoque pendant environ six semaines une douleur modérée à sévère accompagnée de troubles anxio-dépressifs. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 320 d'entre elles et sévère pour 220, et toutes sont tuées pour prélever leur moelle épinière et leurs ganglions rachidiens. L'objet est de déterminer ce que fait, dans cette hypersensibilité au toucher, une protéine des astrocytes appelée Kir4.1. Le porteur annonce que 280 souris seront testées chaque semaine pour évaluer leur comportement, sans dire lesquels de ces tests seront employés, et affirme qu'aucune procédure du projet n'induit de déficit locomoteur sévère.
Objectifs
Les causes des douleurs chroniques restent encore mal comprises. L’un des symptômes les plus fréquents est l’allodynie, c’est-à-dire le fait que des contacts normalement indolores deviennent douloureux. Dans ce phénomène, certaines fibres nerveuses qui devraient transmettre des informations tactiles normales envoient finalement des signaux à des neurones responsables de la douleur. Cela entraîne l’activation de différents types de cellules dans la moelle épinière. Parmi elles, on trouve les astrocytes, des cellules qui soutiennent le fonctionnement des neurones. On sait qu’ils jouent un rôle important dans l’apparition de l’allodynie. Notre projet consiste à comprendre plus précisément comment ces astrocytes, et en particulier une protéine qu’ils fabriquent appelée Kir4.1, participent à l’apparition de cette hypersensibilité au toucher chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'évaluer une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de douleurs chroniques.
Procédures
Dans ce projet, 540 souris subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. Ces interventions sont maîtrisées par le laboratoire et dureront moins d’une heure chacune. Parmis elles, 280 souris seront testées chaque semaine afin d’évaluer leur comportement avant et après induction de la neuropathie, ou après blocage de la protéine Kir4.1. Chaque séance d’analyse comportementale dure moins de 2 heures. À la fin du projet, tous les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés après sédation, afin de prélever leurs organes pour analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Le modèle de douleur neuropathique consiste à réaliser une constriction chronique du nerf sciatique et entraine une douleur modérée à sévère et des comorbidités anxiodépressives durant environ 6 semaines. Les injections aigues de substances entrainent une douleur légère à modérée
Devenir
La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever la moelle épinière et les ganglions rachidiens dorsaux : les animaux seront donc mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. De plus, une partie du projet nécessite l'utilisation de souris transgéniques qui n'existent que chez cette espèce animale.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été défini à partir de test statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets avec une différence statistiquement significative entre les groupes). De plus, lorsque cela sera possible, les mêmes animaux seront utilisés pour répondre à différentes questions scientifiques, notamment en réalisant des études comportementales et histologiques au sein d'une même procédure. La répartition des groupes d'animaux est indiquée en annexe. Nous utiliserons un nombre équivalent d'animaux mâles et femelles en respect de la règle des trois "R" et des directives sur la Recherche Animale.
Raffinement
Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie selons les conditions d'hébergements règlementaires. De plus, nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h) pour réduire le niveau stress lié à une perturbation du cycle circadien des animaux nocturnes. L'enrichissement pourra être supplémenté par des plateformes ou des roues d'exercice si des comportements agressifs sont observés. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des procédures décrites dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur et a été choisi pour comparer nos résultats avec les données de la littérature. Les animaux seront âgés de 3-10 semaines pour comparaison avec les autres données de la littérature.