Procédures sévères

Pesées tous les jours pendant dix semaines, injectées environ dix-huit fois, opérées une première fois pour déclencher un état de mal épileptique puis une seconde pendant deux heures pour implanter des électrodes crâniennes, 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur activité cérébrale est enregistrée en continu, jour et nuit, pendant qu'elles font trois à quatre crises par jour et vivent seules en cage. Vient ensuite un transport de huit heures en camion entre les deux établissements, puis une anesthésie gazeuse de cinq minutes. Toutes sont tuées pour découper leur cerveau en tranches et y mesurer l'effet de molécules antiépileptiques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mesurer l’efficacité de molécules antiépileptiques dans un modèle d’épilepsie chez la souris. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs différents pour la création du modèle (EU1/2) et la collection de datas (EU1/2) et (EU2/2). Des données récentes de la littérature scientifique indiquent que certains récepteurs neuronaux de l’hippocampe sont impliqués dans les mécanismes d’épilepsie temporale. L’hypothèse est que ces molécules anti-épileptiques que nous testerons vont alors cibler ces récepteurs afin de diminuer la fréquence et la sévérité des crises.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments antiépileptiques dans ce modèle. Nos techniques mise en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation des effets pharmacologiques sur le système nerveux central et sur ces explants de tissus vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie une analyse des crises focales partielles ; - D’obtenir des enregistrements sur animal vigile lors des crises et du repos, des crises épileptiques ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.

Procédures

Les animaux sont manipulés tous les jours pendant 10 semaines pour les pesées. (EU1/2) Ils sont injectés tous les quatre jours en SC soit environs 18 injections sur 10 semaines (EU1/2) et (EU2/2) Ils subissent deux chirurgies : *Induction d’épilepsies de 15 à 20 min et une heure post opératoire (EU1/2) *Implantation des électrodes d’enregistrement environ deux heures (EU1/2) Une période d’enregistrement de l’activité électrique cérébrale (sans fil) synchronisée à un enregistrement vidéo 24h/24, 7j/7. (EU1/2) Un transport entre les deux sites (camion spécialisé, 8h de trajet en une seule journée) Et enfin une anesthésie gazeuse durant 5 min maximum. (EU2/2)

Impact sur les animaux

Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables : La procédure peut par : *-l’hébergement individuel des animaux génère du stress ; *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables de types inflammation induration au site d’injection, *- des conséquences des chirurgies avec des déshydrations, des infections possibles ; *- L’implantation des électrodes peut provoquer de l’inconfort*- l’état épileptique provoques des crises épileptiques à une fréquence de 3 à 4 par jour, de courte durée inférieure à 2 minutes en temps cumulé et par jour.

Devenir

Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des antiépileptiques sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle..

Remplacement

Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car les modèles informatiques actuels ne nous permettent pas d’appréhender la complexité de ces connexions anormales observées lors des crises épileptiques.

Réduction

Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 165 animaux pour la réalisation de ce protocole. Pour la partie ex vivo, nous réalisons des enregistrements multiples sur tranches de cerveau après mise à mort des animaux. Le même tissu étant utilisé pour plusieurs expériences d'électrophysiologie sur tranche, cela réduit le nombre d'animaux total nécessaire.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de la Procédure seront habitués, dès le départ aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Les sites d’injection seront légèrement modifiés pour éviter tout problème d’inflammation lors des traitements répétés. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à ces doubles chirurgies. Des traitements analgésiques permettant une gestion de la douleur post-opératoire seront appliqués. Le système d’enregistrement de l’activité cérébrale utilise un dispositif sans fil permettant à l’animal de se déplacer librement.

Choix des espèces

Le développement de ce modèle inductible d’épilepsie et la grande quantité d’informations scientifiques disponibles sur le fonctionnement du cerveau des souris, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de techniques d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour la préparation de tissu nerveux et l’évaluation pharmacologique de molécules. Pour ces raisons, nous n’utilisons que ces rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés de notre partenaire.

Injectées jusqu'à trois fois par semaine, saignées une fois par semaine et irradiées à deux reprises, 8 344 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, leur cerveau et leurs poumons. L'objet déclaré est de comprendre comment se mettent en place les réponses anticorps, pour améliorer des vaccins et bloquer des réactions auto-immunes. Les atteintes annoncées dépassent largement ces trois gestes : une encéphalomyélite qui imite la sclérose en plaques, avec une douleur tardive décrite comme modérée à importante, des tumeurs pouvant se nécroser et métastaser au poumon, de la léthargie, un dos arqué, une perte de poids. Le porteur écarte les analgésiques au motif qu'ils pourraient "interférer avec le cours de notre expérimentation", sans décrire nulle part comment la tumeur est greffée ni comment l'encéphalomyélite est déclenchée.

Objectifs

Une des caractéristiques du système immunitaire est sa remarquable capacité à développer des réponses appropriées à des stimuli très divers tout en préservant une intégrité tissulaire. Ce fin calibrage des réponses immunitaires est essentiel car une réponse éffectrice inappropriée ne permet pas un contrôle efficace des pathogènes et inversement, une réponse incontrôlée peut conduire à l’auto-immunité ou à certains types de cancers comme les lymphomes. Une population de lymphocyte T CD4 particulière, les lymphocytes T Folliculaires, contrôlent les réponses anticorps en interagissant et régulant les cellules productrices de ces anticorps que sont les lymphocytes B (LB). L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les interactions cellulaires in vivo entre les différentes sous-populations du système immunitaire qui participent à la réponse immunitaire. Cette étude sera réalisée dans différents contextes pour: 1) promouvoir les réponses immunologiques physiologiques pour obtenir des réponses protectrices et durables dans un contexte vaccinal contre des pathogènes infectieux (virus, parasite...) ou dans le but de développer des réponses anti-tumorales efficaces. 2) bloquer ces réponses immunologiques lorsqu'elles sont déregulées et deviennent pathogènes comme dans le cas de certaines maladies autoimmunes. Ces interactions cellulaires se mettent en place dans des zones précises des organes lymphoides et à des temps précis après vaccination, infection ou lors du développement des maladies autoimmunes. De ce fait, il est possible de mimer la différenciation des cellules effectrices in vitro mais pas d'étudier les interactions de ces cellules avec les lymphocytes B ni le développement de ces cellules mémoires. Des études in vivo caractérisant les dynamiques de ces interactions sont donc nécessaires. Les objectifs sont : Comprendre les mécanismes de différenciation de ces cellules après vaccination ; Améliorer la réponse immunitaire en modifiant les adjuvants vaccinaux, afin d’induire une protection efficace contre différents pathogènes ; Étudier les dérèglements des interactions cellulaires dans des contextes autoimmuns ; Étudier le rôle des cellules effectrices en immunothérapie anti-cancéreuse.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine d'une réponse humorale de qualité pour la promouvoir dans des contextes vaccinaux ou l'inhiber dans des contextes pathologiques. Ces mécanismes pourraient être exploités pour les thérapies de nouvelle génération.

Procédures

Les animaux pourront subir des injections (durée moins de 1 min) au maximum 3 fois par semaine, des prélèvements veineux de sang (durée moins de 1 min) au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure et deux irradiations de moins de 4 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées que nous utiliserons, et dont nous disposons d’ores et déjà au laboratoire dans ce projet n’ont pas de phénotype dommageable hormis les souris immunodéficientes qui seront utilisées dans la procédure 3. Ces souris dépourvues de système immunitaire sont plus sujettes aux infections. Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires au point d’injection. Après induction d'une encéphalomyélite qui mime la maldie de la sclérose en plaque, la douleur est absente ou faible initialement et modérée/importante plus tardivement. Une grille de score quotidien d’état clinique est mis en place et à partir d'un score élevé, de la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée sont placées dans la cage pour permettre aux souris qui se déplacent plus difficilement de se nourrir. L’utilisation d’analgésiques, d’antalgiques ou d’anti-inflammatoires pourrait interférer avec le cours de notre expérimentation. La croissance des tumeurs primaires peut induire des difficultés de déplacement. La croissance tumorale peut aussi être associée au développement de nécrose caractérisée par une invagination au centre de la tumeur s’accompagnant parfois de légers saignements et de rougeur sur le pourtour de la tumeur. Le lieu préférentiel de métastase de la tumeur utilisée est le poumon et peut donc être accompagnée de troubles respiratoires. Globalement, la pousse tumorale et le développement de métastases peuvent être associés à une altération de l’état général (absence de nidification, absence de toilettage, asthénie, léthargie, tremblement, dos arqué) et à une perte de poids. Ces effets indésirables apparaissent généralement en fin d'expérience, autour de J20-30. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors de la mesure du volume tumoral).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer différents tissus (les organes lymphoïdes, rate, cerveau, poumon) pour des analyses cytométriques, transcriptomiques et histologiques.

Remplacement

Les réponses humorales misent en place sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (ganglions lymphatiques drainant, non drainants, tissus cibles). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées/reproduites in vitro.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons aussi interrogé des chercheurs maitrisant ces modèles et leur robustesse. Nous en avons conclu que le nombre minimal d’animaux est de 10 par groupe. Le calcul d'effectif a été déterminé par une approche statistique. Les expériences seront reproduites 2 fois. Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal : étude longitudinale de mesure de la pousse tumorale ou suivi d'encephalomyelite autoimmune et étude cytométrique/transcriptomique/histologique sur les tissus post-mortem

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite. Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, en particulier les animaux immunodéficients, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (igloos, sizzelnest pour la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du serum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les acteurs de la réponse immunitaire et, plus précisméent, humorale chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse humorale qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée (DC), plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative (Lymphocytes B et T)) et dans l'espace (dans les organes lymphoïdes et les tissus cibles). Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux agés de 8-30 semaines. Le système immunitaire atteint sa maturité fonctionnelle aux alentours de 8 semaines, puis commence à décliner à partir d’environ 30 semaines. Ces éléments justifient le choix de l’âge des animaux utilisés pour les expérimentations.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou atteignent le score clinique maximal sont mises à mort. 1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient prélevés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'encéphalomyélite auto-immune induite fait perdre la tonicité de la queue dès le septième jour, puis affaiblit et paralyse les membres postérieurs, les membres antérieurs pouvant être touchés au point de compromettre l'alimentation et l'hydratation, avec des nécroses au site d'immunisation. Chaque expérience est répétée trois fois sur des groupes de sept, pour comprendre comment une protéine régule les lymphocytes B, le porteur affirmant que le système immunitaire de la souris est semblable à celui de l'être humain.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC). Elle est généralement diagnostiquée entre 20 et 40 ans, touche environ 80 000 personnes en France et affecte deux fois plus de femmes que d'hommes. La SEP est la première cause de handicap non traumatique chez les jeunes adultes et à de lourdes conséquences sociales et économiques. Elle se caractérise par l'infiltration de cellules immunitaires dans le SNC et la destruction des fibres nerveuses. Les traitements qui éliminent les cellules B peuvent être bénéfiques, mais leurs mécanismes d'action sont mal compris et le risque d'infections accru a été observé. Les cellules B jouent en effet un rôle complexe : elles peuvent soit aggraver l’inflammation en produisant des anticorps et des cytokines pro-inflammatoires, soit la réguler grâce à des cytokines anti-inflammatoires. Dans le cadre de ce projet, nous utilisons un modèle expérimental d'inflammation du système nerveux central (SNC) chez la souris, appelé encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), qui constitue le modèle de référence pour étudier la SEP. Notre objectif est de comprendre comment la protéine HuR régule l’activité des lymphocytes B en contrôlant la production de cytokines. Une meilleure compréhension de ce mécanisme pourrait permettre de mettre au point de nouveaux traitements plus sûrs pour la SEP et d’autres maladies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre comment certaines cellules du système immunitaire peuvent influencer l’inflammation chronique du cerveau et de la moelle épinière au cours de l’EAE. Alors que de nombreux travaux se sont concentrés sur d’autres aspects de la maladie, le rôle précis des cellules immunitaires reste encore mal connu. À plus long terme, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension des maladies auto-immunes et pourrait contribuer au développement de nouvelles stratégies pour mieux contrôler l’inflammation du système nerveux central et ralentir la progression de la sclérose en plaques.

Procédures

Au totale, une souris pourrait être soumise à entre 4 et 10 interventions (si elle est immunisée), chacune durant entre 2 et 10 minutes. En détail, premièrement, tous les animaux sont soumis à un prélèvement de tissu ou du sang pour le génotypage. Après, l'induction d'un modèle expérimental d'inflammation du système nerveux central (SNC) chez la souris, appelé encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), sera réalisée en administrant un traitement spécifique par voie sous-cutanée (une fois) et voie intraveineuse (deux fois) pendant deux jours. Dans certains cas, les animaux recevront le jour avant l’induction de la maladie des cellules immunitaires, soit par voie intraveineuse, soit par voie intrapéritonéale. Finalement, Certains animaux seront vaccinés par voie intrapéritonéale toutes les semaines pendant 4 semaines avant l'induction de la maladie et une fois après. Toutes les souris seront euthanasiées avant le prélèvement des organes le jour du point d’analyse.

Impact sur les animaux

L’induction de l’EAE entraîne une série de signes cliniques progressifs liés à la démyélinisation et à l’inflammation du système nerveux central. Les premiers symptômes apparaissent généralement entre J7 et J9, avec une perte de tonicité de la queue, suivie d’une faiblesse des membres postérieurs pouvant évoluer vers une paralysie partielle ou complète. Ces atteintes s’accompagnent de troubles locomoteurs, d’une réduction de la mobilité, de problèmes d’équilibre et d’une perte de poids modérée à sévère au cours des phases aiguës. Dans les cas les plus avancés, les membres antérieurs peuvent également être touchés, ce qui compromet l’alimentation et l’hydratation. Des nécroses localisées au site d’immunisation (base de la queue) peuvent également apparaître. Le suivi clinique sera assuré tous les jours au moyen d’une grille de score EAE validée. Pour limiter les nuisances liées à la maladie, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place : mise à disposition de nourriture et d’eau au sol en cas de paralysie, accès facilité à de la pâtée humide, et définition de points limites stricts. Les animaux atteignant d’une perte de poids supérieure à 20 %, score clinique maximal atteint ou avec un autre signe de souffrance évidente seront examiné par le vétérinaire et immédiatement euthanasiés conformément aux recommandations éthiques. Enfin, les autres procédures expérimentales comportent également des nuisances : les injections de substances ou de cellules, les prélèvements sanguins et les biopsies pour le génotypage entraînent des désagréments légers. Toutes ces interventions seront réalisées exclusivement par du personnel formé et qualifié afin de réduire au minimum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux.

Devenir

Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés à la fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Les réponses immunitaires au cours de l’EAE sont des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains et permettent l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents pour étudier la maladie chez l’humain.

Réduction

Nous suivons des directrices reconnues afin de garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d’animaux. La stratégie d’élevage produit des souris tests et contrôles à un rythme mendélien, si possible. Les souris sont classées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d’animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistique. Sur la base de nos données préliminaires, avec un niveau de signification bilatérale de 0,05, pour une différence de 2 fois entre les groupes et une puissance de 0,85, nous aurons besoin de 7 souris par groupe. Pour la reproductibilité de résultats concluants, nous répéterons chaque expérience 3 fois pour permettre un test statistique et une bonne reproductibilité.

Raffinement

Les souris sont hébergées par 5 maximum dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. Les souris ne seront jamais laissées seules dans leur cage. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. De l’essuie-tout, des copeaux et du rouleau en carton et une maison en plastique rouge sont rajoutés en tant qu’enrichissements pour permettre aux souris de se détendre. Les animaux sont suivis au quotidien par les zootechniciens dès leur naissance. Les animaux disposent d'une semaine d'acclimatation avant le début du protocole. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Dans chaque procédure, nous avons mis en place des points limites (perte de poids supérieure à 20 %, score clinique maximal, signes de souffrance manifestant par une activité, posture, aspect et/ou respiration anormale). Si l’un de ces critères est atteint, et en consultation avec les zootechniciens ou le SBEA, les souris seront euthanasiées. Les utilisateurs ont reçu des formations spécialisées et officielles qui leur permettent l’évaluation des souris et le raffinement des procédures. Les zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que les grimaces, l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage. L’anesthésie sera utilisée pendant l’injection des substances ou cellules pour réduire le stress et la douleur.

Choix des espèces

Les mécanismes immunitaires étudiés dans ce projet sont conservés chez la souris et chez l'humain. Grâce à des modèles murins, nous pouvons comprendre comment la réponse immunitaire est régulée dans le contexte d'une inflammation du système nerveux. Plus précisément, nous pouvons observer le maintien et la fonction des cellules immunitaires dans le cerveau, un environnement complexe et difficile à reproduire en laboratoire. Toutes les expériences seront réalisées sur des souris âgées de 3 à 20 semaines, présentant un système immunitaire encore jeune et fonctionnel.

Aucun antalgique ni analgésique systématique n'est administré, parce qu'il fausserait la mesure de la douleur étudiée. 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, par groupes de vingt. Elles reçoivent le microbiote intestinal de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, subissent une arthrite induite avec gonflements et rougeurs des pattes, puis des tests de sensibilité au toucher et au froid et des tests d'anxiété et de dépression, avant que leur cerveau et leur intestin soient prélevés. Le porteur écrit vouloir "éviter toute douleur inutile" et annonce qu'il n'interviendra pas tant que les niveaux de douleur observés resteront dans les seuils attendus.

Objectifs

Chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde, 20 à 30 % continuent d’avoir des douleurs même si leur maladie est bien traitée. Leur corps réagit plus facilement à la douleur que celui de personnes non malades, et elles ont aussi souvent plus d’anxiété et de dépression. La flore intestinale, c'est-à-dire les bactéries présentes dans nos intestins, joue un rôle dans la maladie, et on sait qu'un lien important existe entre l’intestin et le cerveau. Nous pensons donc que les modifications de la flore intestinale des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde favorisent la douleur chronique et la dépression, notamment chez les patients qui ont des symptômes qui persistent après traitement. Pour mieux comprendre comment tout cela fonctionne, nous allons étudier l’impact de leur flore intestinale en la transférant à des souris. Ensuite, nous observerons ces souris avec différents tests permettant d’évaluer leur sensibilité au toucher ou au froid, mais aussi des tests qui permettent d’évaluer l’anxiété ou la dépression. Nous testerons l’effet des microbiotes dans deux situations : chez des souris saines pour évaluer les effets déclencheurs des microbiotes, et en conditions pathologiques, c’est à dire chez des souris avec de l’arthrite pour évaluer cette fois les effets aggravateurs des microbiotes. Une fois prouvé le rôle du microbiote, nous identifierons quels éléments issus du microbiote intestinal sont responsables pour pouvoir les cibler et tenter de bloquer les mécanismes qui déclenchent ou aggravent la maladie. L’objectif final est d’identifier des composés du microbiote pouvant réduire la douleur ou les troubles anxio dépressifs, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.

Bénéfices attendus

La douleur chronique et de la dépression restent difficiles à traiter chez certains patients, ce qui impacte fortement leur qualité de vie. Il est donc essentiel de comprendre l'origine de l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression pour permettre le mieux les soigner. Une fois prouvé rôle de la flore intestinale, nous analyserons et comparerons les différents microbiotes pour identifier quelles sont les bactéries ou quelles sont les molécules produites pourraient expliquer l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression. Ceci nous permettra ainsi de tester leur rôle protecteur chez les souris avant de les tester en clinique chez les patients. Ce projet permettra donc une véritable recherche translationnelle, du laboratoire au patient, avec pour objectif d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de douleurs chroniques ou de dépression.

Procédures

Nous réalisons des greffes de microbiote intestinal en donnant aux souris par voie orale des préparations de microbiote de patients une fois par semaine pendant 4 semaines. Suite à la greffe de microbiote, les souris seront suivies chaque semaine grâce à des tests comportementaux pour mesurer les seuils de sensibilité (réaction au toucher par filaments de Nylon ou réaction à la température) et caractériser les comportements anxieux ou dépressifs. Chaque test dure entre 5 et 20 min. Dans certains cas, nous examinons aussi si le microbiote modifie la perméabilité de l’intestin ou le passage de substances vers le cerveau, en administrant des traceurs fluorescents par voie orale ou par injection. Ces expériences sont menées chez des souris saines mais aussi dans différents modèles d’inflammation (polyarthrite aiguë ou chronique, inflammation locale de la patte). Les inflammations sont induites par l’injection de molécules inflammatoires, toujours sous anesthésie légère par inhalation. Enfin, lorsque des molécules produites par le microbiote auront été identifiées (comme des dérivés du tryptophane, de la sérotonine, des métabolites de fibres ou des acides biliaires), nous les ajouterons dans l’eau de boisson des souris pour tester leur effet bénéfique dans les modèles les plus pertinents.

Impact sur les animaux

La sensibilité tactile et thermale et les comportements anxio-dépressifs étant les paramètres étudiés dans nos procédures, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne peuvent être appliquées car ils fausseraient nos résultats. Les principaux désagréments pour les animaux seront liés aux modèles inflammatoires utilisés pour induire l’arthrite ou l’inflammation locale. Ces inflammations provoqueront des douleurs articulaires, des gonflements et des rougeurs au niveau des pattes. L’arthrite aiguë sera de courte durée (maximum 2 semaines), avec retour à un état normal. L’arthrite chronique durera plus longtemps, mais la durée de suivi sera limitée à 5 semaines après l’apparition des premiers symptômes d’arthrite pour éviter des souffrances prolongées. Les animaux subiront également des piqures d’aiguilles, un stress léger passager lié aux manipulations. Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie légère par inhalation, d’une durée d’environ 5 minutes, afin de réduire au maximum la douleur et l’inconfort.

Devenir

La douleur étant étudiée, et donc induite, chez certains animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement l’euthanasie afin de ne pas générer de douleur inutile. De plus, L’euthanasie permet également de réaliser les analyses post mortem nécessaires, notamment sur le cerveau et l’intestin, afin de compléter les données comportementales et d’approfondir la compréhension des mécanismes reliant microbiote, douleur et comportements anxio dépressifs.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre comment le microbiote intestinal influence la douleur et les comportements associés dans la polyarthrite rhumatoïde. A ce jour, il n'existe pas de modèle de substitution permettant d'étudier les interactions complexes entre microbiote, système immunitaire, système nerveux et comportement. Par ailleurs, la perception de douleur, ainsi que les réponses anxieuses ou dépressives, sont des phénomènes appréhendés par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Tout sera mis en œuvre pour réduire la variabilité interindividuelle dans nos groupes et assurer qu’un nombre minimal de souris sera utilisé pour démontrer un effet (animaux du même âge, mâles et femelles, période d’habituation à l’environnement et à l’expérimentateur). Un grand soin est apporté aux animaux afin de limiter au maximum le stress qui pourrait entraîner des biais importants dans la détermination du seuil de sensibilité tactile. Le nombre de de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées, ce qui nous a permis de déterminer qu’un nombre de 20 souris par groupe (10 males et 10 femelles) est nécéssaire pour observer une différence statistique et biologique. Ainsi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour observer des différences statistiques entre les groupes, afin que les tests effectués soient pertinents mais sans sur-utilisation d’animaux.

Raffinement

Notre objectif étant d’étudier l’hypersensibilité à la douleur, nous n’interviendrons pas tant que les niveaux de douleur observés restent dans les seuils attendus pour les modèles utilisés. En revanche, toutes les procédures sont conçues dans le respect de l’animal et avec pour objectif constant de réduire au maximum le stress et l’anxiété, afin de limiter l’inconfort à ce qui est strictement nécessaire au protocole et d’assurer le bien être des animaux. Cela passe par une étape d’habitation progressives des animaux (1 semaine à l’arrivée pour les locaux, puis 1 semaine pour les pièces d’expérimentation) et une manipulation douce par du personnel formé, avec là aussi une période d’habituation quotidienne des animaux aux expérimentateurs. L’enrichissement fourni comprend les matériaux réglementaires de nidification, auxquels est ajouté un igloo rouge, contribuant à améliorer leur confort et leur sentiment de sécurité. Tout au long du projet, l’objectif reste de limiter l’angoisse et la souffrance. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi clinique régulier, plusieurs fois par semaine (et chaque jour en période inflammatoire), pour identifier rapidement toute douleur excessive, perte de poids, difficulté locomotrice ou comportement anormal. Une grille d’évaluation clinique, accompagnée des actions à mettre en œuvre, permettra une prise en charge immédiate et adaptée, afin d’éviter toute douleur inutile. De plus, la durée des expériences est volontairement limitée pour réduire l’exposition aux modèles inflammatoires et minimiser la souffrance.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de greffe de microbiote chez l’animal. Elle permet d’évaluer les effets d’un microbiote donné sur le comportement, la douleur, l’inflammation et les interactions neuro immunes de manière intégrée, ce qui n’est pas possible chez des espèces plus simples. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 8 et 21 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.

Un cathéter est posé chirurgicalement dans la veine jugulaire de chaque animal, qui subit ensuite cinq prélèvements de l'intestin grêle sous endoscopie et un régime riche en graisses et en sucres, avec ou sans émulsifiants. 70 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, l'hébergement en loges individuelles étant reconnu comme une source de stress. L'objectif déclaré est de suivre l'intestin grêle du mini-porc Yucatan pendant l'installation de l'obésité, puis pendant une perte de poids obtenue par un régime de type méditerranéen. Le porteur annonce une prise de poids, une dyslipidémie, un contrôle glycémique perturbé et une hypertension chez les animaux nourris au régime obésogène, en précisant que ces atteintes "font partie des objectifs du projet".

Objectifs

La prévalence actuelle de l’obésité et du surpoids, qui touchent plus de 40% de la population mondiale, et des pathologies associées comme le diabète de type 2, nécessite d’accentuer les efforts de recherche pour comprendre les liens entre alimentation et santé. La composition de l’aliment, notamment riche en lipides et en sucres mais aussi la présence d’émulsifiants dans l’alimentation sont des facteurs clés du développement de l’obésité. De nombreux travaux ont montré le rôle joué par le microbiote intestinal et l’intestin distal dans le développement du surpoids et de l’obésité. Alors que la plupart des travaux se sont focalisés sur le microbiote fécal chez l’Homme, des travaux récents suggèrent que le microbiote du petit intestin pourrait aussi jouer un rôle. Cependant, les données actuelles chez l’Homme ne permettent pas de bien comprendre ce rôle lors de l’installation de l’obésité ou au contraire lors d’une prise en charge diététique pour perdre du poids. Or, ces connaissances sont nécessaires pour pouvoir proposer des stratégies pertinentes pour prévenir ou atténuer les conséquences du surpoids et de l’obésité L’objectif de ce projet est de suivre l’évolution de différents paramètres au niveau du petit intestin chez le mini-porc Yucatan rendu obèse via la consommation d’un régime hyperénergétique riche en lipides et en sucres et contenant ou non des émulsifiants puis lors d’une perte de poids induite par la réduction des apports énergétiques et un régime de type Méditerranéen. Ce régime est en effet connu chez l’Homme pour ses effets protecteurs sur la santé.

Bénéfices attendus

Ce projet ayant recours à l’expérimentation animale est complémentaire d’une étude clinique menée chez l’Homme. Ce projet mené chez le mini-porc apportera des connaissances plus fines sur la cinétique des interactions entre le microbiote du petit intestin et les modifications du métabolisme et du comportement alimentaire dans la mise en place de l’obésité et la perte de poids. Nos analyses permettront d’identifier des espèces bactériennes et/ou des métabolites bactériens d’intérêt et leurs liens avec la composition de l’aliment. Ces données pourront être comparées aux données obtenues chez l’Homme. Ces connaissances seront utiles pour, à terme, proposer des régimes alimentaires préservant la santé chez l’homme via leur action sur la composition ou le métabolisme bactériens et pour développer des probiotiques à partir des souches bactériennes identifiées.

Procédures

Endoscopie sous anesthésie générale pour prélèvement de biopsies mucosales : 1 endoscopie sur 20 porcs conventionnels et 5 endoscopies sur une période de 16 semaines sur 50 mini-porcs Pose chirurgicale d’un cathéter jugulaire sous anesthésie générale : 50 mini-porcs, 1 seule fois, possibilité de répéter si problème de fonctionnement du cathéter Tests de comportement alimentaire : validation du dispositif sur 20 porcs conventionnels, tests de préférence et motivation, 50 mini-porcs, répété 5 fois en 16 semaines Tests de tolérance au glucose nécessitant le prélèvement de 40 mL de sang en 2h, 50 mini-porcs, répété 5 fois en 16 semaines Hébergement en cages individuelles : 50 mini-porcs pendant 18 semaines et 20 porcs conventionnels pendant 2 semaines Mise à jeun nocturne de 18h à 8h : 50 mini-porcs pendant 18 semaines et 20 porcs conventionnels pendant 2 semaines

Impact sur les animaux

Un développement de perturbations du métabolisme avec des signes cliniques tels qu’une augmentation du poids, un profil lipidique plasmatique perturbé (triglycéridémie, cholestérolémie, LDL-cholestérol augmentés), une perturbation du contrôle glycémique lors d’une hyperglycémie provoquée et une hypertension, est attendu chez les animaux recevant le régime riche en lipides et en sucres additionné ou non d’émulsifiant mais font partie des objectifs du projet. Une perte de poids pour les groupes recevant un régime moins riche en énergie que le régime obésogène est attendue mais fait partie des objectifs du projet. La chirurgie pour la pose de cathéter peut engendrer de l’inconfort transitoire au réveil et des douleurs post-opératoires. La répétition des prélèvements sous endoscopie (5 prélèvements par animal) peut entrainer de l’inconfort transitoire au réveil. L’hébergement en loges individuelles peut engendrer du stress.

Devenir

Les animaux utilisés en procédure 1 seront mis à mort. Il s’agit d’animaux dit de réforme qui ne seraient pas rentrés dans la chaine alimentaire. Cette mise à mort sera suivie de divers prélèvements afin de constituer une banque de tissus. Les animaux de la procédure 2 seront mis à mort afin de pouvoir prélever divers organes et tissus et analyser les effets des différents traitements sur des paramètres physiologiques et métaboliques.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de mettre en relation des données issues de la composition de l’aliment, du microbiote intestinal et de l’intestin en regard de perturbations du métabolisme et du comportement alimentaire. Ces derniers font intervenir de nombreux organes (tissu adipeux, foie, cerveau, muscle). Le manque de connaissances actuel et la complexité de ces interactions rend difficile leur modélisation in vitro ou in silico, justifiant le recours à l’animal pour les étudier..

Réduction

Le projet prévoit l’utilisation de 20 porcs conventionnels et 50 mini-porcs. Le nombre de porcs conventionnels utilisés permettra d’observer l’ensemble des comportements alimentaires individuels (4 profils type sont décrits chez le porc) et de travailler sur des animaux de poids différents. Un nombre de minimal de 8 mini-porcs par groupe a été calculé sur la base de nos expériences précédentes sur le développement de l'obésité chez ce modèle animal. Afin de s’affranchir de difficultés liées notamment au fonctionnement du cathéter jugulaire, un nombre de 10 mini-porcs par groupe a été décidé. Le choix de procéder à des prélèvements duodéno-jéjunaux sous endoscopie permet d’éviter de mettre à mort des animaux à chaque point de la cinétique choisie et donc de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et expérimenté. La surface des loges et les interactions visuelles, tactiles et auditives entre animaux permettront aux mini-porcs d’avoir des interactions avec les congénères. Des jouets (chaine, ballon) permettront d’enrichir le milieu et aux animaux d’avoir de l’activité physique. Ils seront régulièrement remplacés pour limiter l’ennui. La pose d’un cathéter jugulaire à demeure permettra d’éviter les prises de sang répétées lors de certains tests. La procédure chirurgicale de pose de ce cathéter sera faite sous anesthésie générale avec mise en place d’une analgésie per-opératoire. La procédure de prélèvements sous endoscopie sera réalisée sous anesthésie et analgésie pour éviter stress et inconfort. Une pesée hebdomadaire des animaux et une surveillance quotidienne de leur état clinique et de leur comportement ainsi que la mesure de leur consommation alimentaire quotidienne sera mise en place afin de détecter tout signe de mal-être ou inconfort. Des points limites ont été définis et seront scrupuleusement suivis pendant les expérimentations.

Choix des espèces

Le mini-porc est un modèle pertinent pour l’étude de la mise en place de l’obésité car il reproduit les signes cliniques du syndrome métabolique (augmentation de poids et d’adiposité, notamment viscérale, perturbations du bilan lipidique plasmatique, augmentation de la pression artérielle, perte de la sensibilité à l’insuline) lorsqu’il consomme de façon chronique un régime riche en lipides et en sucres. Des altérations du microbiote intestinal et de la fonction de barrière intestinale sont aussi décrites comme chez l’Homme. L’utilisation de porcs conventionnels pour une partie du projet est liée à des raisons de disponibilité au sein de l’établissement utilisateur. L’anatomie oro-gastrique des deux races est identique. Nous utiliserons des porcs conventionnels de poids corporels variés (entre 45 et 90 kg). Les porcs conventionnels utilisés seront des animaux de réforme de 3 à 6 mois d’âge afin que la gamme de poids soit proche de celle des mini-porcs utilisés dans le reste du projet. Les mini-porcs utilisés seront de jeunes adultes (12 à 14 mois d’âge) afin de travailler sur des animaux avec un microbiote stable au début de l’expérience et s’affranchir d’une variabilité liée au vieillissement.