Procédures sévères
Etude des effets de nouvelles molécules sur les dyskinésies induites par la L-DOPA chez le rat parkinsonien
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Un rat dont l'état dévie sur trois critères sans correction possible est mis à mort, selon une fiche de bien-être de trente points remplie chaque semaine. 1 040 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie intracérébrale de trente minutes détruit une partie de leurs neurones dopaminergiques, puis un traitement chronique de quatre semaines à la L-DOPA leur provoque les mouvements involontaires et les postures anormales que le projet veut corriger, observés jusqu'à quatre heures d'affilée deux fois par semaine. Le porteur indique un taux d'échec des lésions de 30 %, ce qui l'amène à opérer quatorze animaux par groupe pour en garder dix, et rattache l'ensemble au développement de candidats médicaments avant un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative progressive avec destruction des neurones dopaminergiques. Les patients ne présentent pas de symptômes jusqu'à ce que 50 à 70% des neurones à dopamine soient détruits. Les principaux symptômes engendrés par cette perte neuronale sont des tremblements, des difficulté dans les mouvements fins, des rigidité des membres. A ce jour le traitement le plus efficace de ces symptômes moteurs est la L-DOPA. Mais un traitement continu à la L-DOPA engendre l'apparition de dyskinésies (mouvements involontaires, positions aberrantes, torsions....) chez approximativement 40% des patients après 4 à 6 ans de traitement et jusqu'à 90% des patients après 10 ans de traitement. Un des objectifs thérapeutiques majeurs dans le cadre la maladie de Parkinson est de maintenir le plus longtemps possible le traitement à la L-DOPA tout en retardant l'apparition des dyskinésies ou en corrigeant les dyskinésies déjà en place. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouvelles molécules ayant pour cible le système nerveux central. L'objectif du projet sera donc d'évaluer sur un modèle de rat parkinsonien les effets de nos nouveaux composés sur des dyskinésies déjà en place suite à un traitement au préalable à la L-DOPA ou vérifier les effets d'une coadministration de nos composés avec la L-DOPA sur l'apparition des dyskinésies.
Bénéfices attendus
Les procédures mises en oeuvre permettront d’évaluer la capacité de nouvelles entités pharmacologiques à moduler/corriger les dyskinésies induites par la L-DOPA chez des rats parkinsoniens. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests cliniques chez l'homme.
Procédures
-Administration intracérébrale d’un composé : procédure chirurgicale sous anesthésie d’une durée maximale de 30 minutes, effectuée une seule fois. -Traitement unique ou chronique d'un traitement de référence de la maladie de Parkinson ou de nouvelles molécules à tester, pendant une durée maximale de 4 semaines. -Les effets des traitements seront évalués par des observations comportementales (locomotion, mouvements, postures) pouvant durer jusqu’à 4 heures, 2 fois par semaines maximum.
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la chirurgie : douleur liée à l’incision, stress lié à la contention, à la manipulation avant introduction dans la boite d’induction de l’anesthésie. Stress lié à l’hébergement individuel lors de la phase de réveil post chirurgical. Nuisances liées à la lésion : difficultés à se mouvoir ou à se nourrir, perte de poids transitoire. Nuisances liées à l’administration chronique de composés pouvant entrainer le développement de comportements, de postures aberrentes et d'altérations du contrôle des mouvements. Problèmes de tolérance à ces nouveaux produits, stress lié à la contention lors de l’administration de ces produits, douleurs liées aux injections. Nuisances liées aux tests comportementaux : stress lié aux observations dans des enceintes confinées. Impossibilité d’exprimer un comportement naturel pendant une durée limitée.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. En effet la lésion intracérébrale ne permettra pas une réutilisation des animaux dans d'autres procédures. De plus les traitements pharmacologiques ou les tests comportementaux pourraient interragir avec d'autres expérimentations.
Remplacement
L'objectif du projet est d'évaluer les effets de nouvelles molécules sur un animal présentant des symptômes de la maladie de parkinson. Installer un modèle de parkinson et évaluer des comportements ne peuvent se faire que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 10 animaux par groupe est nécessaire pour la robustesse des tests statistiques. Il existe un taux d'échec des lésions de l'ordre de 30%. Ainsi afin d'avoir un nombre suffisant d'animaux pour les tests statistiques, 14 animaux par groupe au moment de la chirurgie seront nécessaires. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant qu'un seul groupe recevant une molécule de référence.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) groupés par 2 à 4 par cage. Une période de 5 jours d'acclimatation après livraison est prévue avant toute expérimentation. Tout au long des études les animaux sont hébergés dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu (tunnel, balle, aspen bricks à ronger, graines de tournesol...) et avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. Avant la chirurgie, pendant la phase d'acclimatation, une phase d'habituation à l'expérimentateur sera réalisée. Une fois par semaine, les rats seront placés dans une enceinte plus grande avec des aménagements types échelles, plateformes, roue d’activité… Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu'aucune action puisse corriger ces déviations alors la mise à mort de l'animal sera envisagée. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec administration d'analgésiques en local et en systémique. Dans le suivi postopératoire est prévue une administration d'antidouleur de manière systématique jusqu'à 5 jours suivant la chirurgie. Des croquettes humidifiées seront placées sur le sol de la cage pendant la récupération post-opératoire. Cependant si 3 jours après le réveil, l'animal présente des signes de mal-être (non reprise de poids, poil hérissé, absence de toilettage, prostration, absence de fèces...) alors il sera euthanasié. Si nous constatons une réouverture de la plaie dans les 3 jours qui suivent la fin de la chirurgie, des soins et des sutures pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. Lors d'une co-administration de plusieurs composés, une injection unique sera privilégiée et les sites d'injection seront alternés afin d'éviter l'apparition de lésions cutanées.
Choix des espèces
Le modèle parkinson après destruction partielle de neurones chez le rat ainsi que le développement de mouvements aberrants suite à l'administration du traitement de référence de la maladie, est largement caractérisé dans la littérature. Le cerveau du rat est suffisamment volumineux pour avoir une neuroanatomie particulièrement bien détaillée et documentée permettant de cibler des zones précises. Les rats ont un système nerveux suffisamment évolué pour extrapoler certains résultats à l'homme. Les rats seront utilisés à l'âge adulte. En effet, la maladie de parkinson ne concerne que des personnes adultes.
Evaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique par imagerie isotopique après administration intra-artérielle de mannitol dans un modèle murin de gliome – BARRAGE
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
263 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 237 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 26 dans des procédures menées sous anesthésie, tués avant tout réveil. Ils subissent une greffe de tumeur cérébrale par chirurgie, une procédure de radiologie interventionnelle pour injecter un produit directement dans une artère du cerveau, et jusqu'à cinq séances d'imagerie en trois semaines, l'une d'elles durant une heure. La progression tumorale entraîne perte d'appétit, malnutrition et perte de poids. Le porteur annonce une technique qui permet selon lui une efficacité thérapeutique supérieure à ce qui est proposé aujourd'hui, avant même de l'avoir testée, et conclut qu'aucune autre méthode ne pourrait se substituer à l'expérimentation animale dans ce domaine.
Objectifs
Le glioblastome est la tumeur du cerveau la plus agressive. Même avec les meilleurs traitements disponibles aujourd’hui, l’espérance de vie dépasse rarement 18 mois. L’une des raisons principales est que le cerveau est protégé par une sorte de « mur biologique », appelé barrière hémato-encéphalique. Cette barrière empêche la plupart des médicaments d’atteindre la tumeur. Le projet BARRAGE cherche à contourner cet obstacle. Il s’agit d’un programme de recherche innovant qui combine nouvelles technologies et modèles animaux pour trouver un moyen sûr d’ouvrir temporairement cette barrière et vérifier son ouverture grâce à des images réalisées directement chez l’animal. L’objectif principal est de montrer, pour la première fois en conditions réelles, qu’on peut ouvrir brièvement cette barrière en injectant un produit directement dans une artère menant au cerveau. Cette ouverture sera ensuite visualisée grâce à une technique d’imagerie médicale avancée. Si cette étape est validée, la méthode pourra servir à tester de nouveaux traitements contre le glioblastome, en leur permettant d’atteindre la tumeur plus efficacement.
Bénéfices attendus
Ce projet comporte plusieurs bénéfices attendus: 1) Validation d'une technique de radiologie interventionnelle chez le petit animal se rapprochant des conditions humaines. 2) Démonstration de la possibilité de rompre temporairement la barrière hémato-encéphalique par injection d'un produit directement dans l'artère du cerveau. 3) Suivi de la rupture de la barrière par imagerie médicale. 4) Cette technique permettra aux traitements de mieux atteindre la tumeur et permettra une diminution des effets secondaires des traitements. 5) Cette technique permet une efficacité thérapeutique supérieure à ce qui est proposé aujourd'hui.
Procédures
Les animaux subiront : 1) une intervention chirurgicale pour réaliser la greffe tumorale (durée de 30 minutes max) ; 2) une procédure de radiologie interventionnelle (durée de 30 minutes max). 3) sessions d'imagerie. Les animaux auront au maximum 5 sessions d'imagerie sur 3 semaines (30min max). Les animaux de la procédure 3 destinée à la cinétique d'action du produit auront une acquisition d'imagerie d'1h. Certains animaux recevront également un traitement médicamenteux par voie orale ou en injection en fonction du traitement à tester.
Impact sur les animaux
Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe, l'administration de traitements par gavage ou injection et la douleur liée aux actes chirurgicaux. La manipulation, contention des animaux, les injections répétées d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. La progression tumorale provoque a terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale. Les analyses des cerveaux étant nécessaires pour confirmer l'effet du traitement sur les tumeurs (par imagerie IRM et histologiques).
Remplacement
L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse des traitements innovants véhiculant des médicaments pour le glioblastome. Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes expérimentales sur la base des résultats obtenus préalablement. L'étape de validation de l'efficacité du traitement in vivo est indispensable avant toute évaluation clinique chez le patient. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose, de tunnels autoclavables et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge de la douleur, de plus de la nourriture humidifiée sera mise à disposition des animaux à volonté pour anticiper des difficultés de mobilité de l'animal. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. L'état des animaux fera l'objet d'une surveillance quotidienne par du personnel qualifié et formé, toute atteinte de points limites amènera à la mise en place d'actions adaptées.
Choix des espèces
Le modèle rat (avec le modèle souris) représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Nous avons choisi un modèle de rat pour tester nos traitements locaux par rapport au modèle souris car il représente un modèle plus grand et qui permettra donc d'obtenir une meilleure localisation in vivo de la tumeur, de la distribution du traitement dans le parenchyme cérébral et d'administrer des volumes plus importants de traitement selon une procédure intra-artérielle, ce qui nous rapproche davantage de la clinique. Le type de tumeur étudié est un modèle bien connu et largement utilisé en recherche. Il a déjà permis de mieux comprendre comment les médicaments traversent la barrière hémato-encéphalique, une barrière naturelle qui protège le cerveau mais complique l’accès des traitements. Enfin, ce modèle permet d’analyser ce qui se passe après le traitement, notamment les modifications de la barrière protectrice du cerveau et l’efficacité des injections de médicaments directement dans la tumeur.
Etude du rôle des jonctions serrées dans la progression du cancer du pancréas dans un modèle murin génétique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
180 souris développent un cancer du pancréas déclenché dès la naissance par modification génétique, dont 102 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie est gavée cinq jours de suite, moins d'une minute par jour. Le porteur indique que le modèle peut entraîner stress et souffrance au stade terminal, avec pertes de mobilité et variations de poids importantes, et que certains animaux seront conservés jusqu'à douze mois. Toutes sont tuées, celles utilisées pour les croisements plus tôt afin de limiter le développement de la maladie, les autres pour prélever leurs tumeurs, au bénéfice d'une étude que le porteur présente comme une référence pour d'autres projets à venir.
Objectifs
Le cancer du pancréas est la 7ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde. Malgré l’émergence de nouveau traitements au cours des dernières années, le cancer du pancréas demeure incurable à l’heure actuelle. Nos travaux précédents ont mis en évidence le rôle d’une protéine présente à la membrane des cellules cancéreuses dans plusieurs cancers et nous avons de bonnes raisons de croire que cette protéine joue également un rôle clé dans le cancer du pancréas. Notre objectif est d’évaluer ce rôle dans un modèle génétique de cancer du pancréas de la souris.
Bénéfices attendus
L’étude du rôle de notre protéine d’intérêt permettra de mettre en évidence des mécanismes important impliqués dans la progression tumorale. De plus, ce projet servira d’étude de référence, en complément d’autres projets visant à étudier l’effet de traitements ciblant notre protéine d’intérêt dans des modèles plus simples.
Procédures
Une partie des animaux seront traités pendant 5 jours. Les traitements seront réalisés par gavage sur animaux vigiles, une fois par jour, ce qui prend moins d’une minute à être réalisée.
Impact sur les animaux
Le traitement peut entrainer du stress lié à la contention. Le traitement peut engendrer une toxicité susceptible de causer de la douleur. Le modèle génétique de cancer peut entrainer du stress et de la souffrance au stade terminal de la maladie, associées à des prises ou des pertes de poids importante ou des pertes de mobilité.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort. Les animaux utilisés à des fins de croisement seront mis à mort précocement, pour limiter de développement de la maladie. Les animaux utilisés pour l’étude seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les études portant sur la genèse du cancer dans un organe spécifique nécessitent des études sur animal vivant afin de reproduire l’interaction complexe entre toutes les cellules au cours du temps. Des modèles plus simples (culture cellulaire, organoïdes) ne peuvent pas être utilisés pour modéliser totalement des processus aussi complexes que la carcinogénèse.
Réduction
Notre projet permet de générer uniquement le nombre minimal d’animaux nécessaire . Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.. Avant les procédures le nécessitant, les souris seront puis habituées à la contention et aux méthodes d’administration.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle génétique proposé est très proche du cancer humain en termes de mutations de l’ADN. Il s’agit d’un modèle de référence du cancer du pancréas qui permet une pousse tumorale au site naturel de la maladie dans des animaux présentant un système immunitaire complet.,. Les femelles gestantes nécessaires au modèle seront gardées jusqu’à l’âge de 8 mois. Les mutations seront induites dès la naissance, en accord avec des études précédentes utilisant le même modèle et les animaux pourront être conservés jusqu’à un âge avancé de 12 mois.
Etude des effets d’une nouvelle méthode de radiothérapie
- Formation professionnelle
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Issues de sept lignées génétiquement modifiées, les souris de ce projet reçoivent jusqu'à cinq injections de tamoxifène pour activer leurs mutations avant d'être irradiées. Elles sont 7 548 au total, dont 3 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 180 dans des procédures menées sous anesthésie, tuées avant tout réveil. L'irradiation du thorax peut provoquer une inflammation pulmonaire puis une fibrose avec difficultés respiratoires, celle de l'abdomen du sang dans les selles, et l'injection de cellules tumorales des tumeurs suivies par imagerie sous anesthésie jusqu'à six fois. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem. Interrogé sur le remplacement, le porteur recopie mot pour mot son argumentaire de réduction du nombre d'animaux, sans citer une seule méthode sans animaux.
Objectifs
De nouvelles méthodes de radiothérapie permettent de réduire ces effets secondaires tout en préservant une efficacité contre les tumeurs comparable aux traitements actuels. Afin de définir les meilleures conditions cliniques de ces nouveaux traitements de radiothérapie , il est nécessaire de i) poursuivre l’étude de la compréhension des mécanismes de ces nouvelles modalités de radiothérapie et ii) réaliser les études précliniques pour définir les meilleures conditions cliniques d’utilisation de ces nouveaux traitements. Pour cela, nous nous intéresserons aux effets de ces nouvelles méthodes de radiothérapie sur du tissu sain comme les poumons et l’intestin. Nous chercherons également à caractériser sur des tumeurs l’impact de ces nouvelles modalités de radiothérapie.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons défini les conditions cliniques optimales d’une nouvelle méthode de radiothérapie. En cas de résultats positifs, ces paramètres d’irradiation seront intégrés aux futures machines de radiothérapie et permettront une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires, meilleure contrôle de la tumeur) pour les patients atteints de cancer.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des animaux vigiles issus de sept lignées de souris génétiquement modifiées seront injectés par voie intrapéritonéale avec du tamoxifène. En fonction des lignées, les animaux recevront entre une et cinq injections de tamoxifène (durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite irradiés avec une nouvelle modalité de radiothérapie. Lors de l’irradiation, les animaux seront anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience pendant une durée de 3 à 5 min) puis placés en contention sur un support d’irradiation. Les animaux seront ensuite suivis par imagerie scanner pour petit animal, à partir du 4ème mois après l’irradiation. Lors des séances d’imagerie, les animaux seront anesthésiés pendant une durée de 5 à 10 min. Chaque animal recevra, au maximum, 4 séances d’imagerie. Dans un deuxième lot, des animaux vigiles issus de quatre lignées génétiquement modifiées seront injectés avec un traitement. En fonction des lignées, les animaux recevront entre une et cinq injections de ttraitement (durée du geste inférieure à 10 sec). Dans un troisième lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience - durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite irradiés et suivi par imagerie pour petit animal. Lors des séances d’imagerie, les animaux seront anesthésiés pendant une durée de 5 à 10 min. Chaque animal recevra, au maximum, 6 séances d’imagerie. Dans un quatrième lot, des injections seront réalisées sur des animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience - durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Lors de l’injection du produit, il est possible de ressentir une légère douleur ou une gêne pendant un court moment. Une petite perte de poids peut aussi survenir dans les 5 à 10 jours suivant le traitement. Trois rythmes d’injection seront testés : une seule injection, trois injections par semaine (par exemple lundi, mercredi et vendredi) et cinq injections par semaine. Chez les animaux recevant plusieurs injections, une perte de poids peut apparaître dans la semaine qui suit la fin du traitement. Pour l’étude de la toxicité sur les tissus sains : • Après une irradiation du thorax, les animaux peuvent présenter une inflammation des poumons entre 1 et 3 mois après le traitement. Si la toxicité est forte, cela peut évoluer vers une fibrose (envahissement du tissu pulmonaire) après 4 à 5 mois. Dans ce cas, une perte de poids et des difficultés à respirer peuvent apparaître. • Après une irradiation de l’abdomen, une perte de poids peut être observée dans les 10 à 15 jours suivants, ainsi que la présence possible de sang dans les selles. Pour étudier l’efficacité du traitement contre les tumeurs, les animaux recevront une injection de cellules tumorales. Ces cellules provoqueront le développement de tumeurs dans les poumons, dont la croissance sera suivie régulièrement par imagerie. Selon le degré d’envahissement du poumon, des difficultés respiratoires et une perte de poids peuvent apparaître. L’injection peut entraîner une douleur passagère. Pendant les séances d’irradiation, les souris seront anesthésiées avec de l’isoflurane, un gaz anesthésiant. Cela peut causer une gêne temporaire et sans conséquence durable. À court terme, des irritations de la peau (rougeurs, plaies, nécroses) peuvent survenir à cause du traitement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études antérieures ont été réalisées au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour caractériser les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie. De la même manière, des études antérieures utilisant l’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse ont permis de déterminer la quantité de cellules à injecter, le délai de prise tumorale ainsi que l’évaluation de la pertinence des méthodes de suivi de la progression tumorale. 2-Les temps des prélèvements seront adaptés en fonction de la croissance tumorale et de la radiosensibilité de chaque lignée tumorale. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé par un test de puissance statistique lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications par imagerie (scanner ou bioluminescence) permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 5-Les deux sexes seront étudiés ce qui permettra de réduire, dans le cas de lignées transgéniques, le nombre d’animaux à produire.
Réduction
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études antérieures ont été réalisées au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour caractériser les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie. De la même manière, des études antérieures utilisant l’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse ont permis de déterminer la quantité de cellules à injecter, le délai de prise tumorale ainsi que l’évaluation de la pertinence des méthodes de suivi de la progression tumorale. 2-Les temps des prélèvements seront adaptés en fonction de la croissance tumorale et de la radiosensibilité de chaque lignée tumorale. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé par un test de puissance statistique lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications par imagerie (scanner ou bioluminescence) permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 5-Les deux sexes seront étudiés ce qui permettra de réduire, dans le cas de lignées transgéniques, le nombre d’animaux à produire.
Raffinement
Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En particulier, nous évaluerons le poids de façon hebdomadaire, les difficultés respiratoires, le sang dans les fèces et l’isolement. Le suivi par imagerie sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires et du suivi de la progression tumorale. Nous pourrons ainsi décider d’augmenter la surveillance et minimer les gênes respiratoires chez les animaux. En particulier, le nombre et la taille des tumeurs seront des éléments importants et déterminants pour assurer le bien-être de l’animal. Pour les procédures incluant une irradiation, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée seront réalisées au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Ces mesures permettront de minimiser le stress de l’animal induit par les traitements d’irradiation. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions.
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 12 mois. Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.
Evaluation de traitements antiépileptiques dans le context de crises réfractaires chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Injection d'acide kaïnique directement dans le cerveau, implantation d'électrodes cérébrales pendant deux heures, parfois d'une canule pendant une heure de plus : 574 souris vont être utilisées, dont 568 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les crises focales induites peuvent conduire à un état épileptique permanent, avec hypersalivation, mouvements de la tête et des pattes avant et pertes d'équilibre. Il s'agit de tester des candidats médicaments contre les épilepsies pharmacorésistantes, sur un modèle recommandé par l'Epilepsy Therapy Screening Program. Six souris utilisées pour la mise au point d'une méthode d'anesthésie pourront être réutilisées, les 568 autres sont tuées, une mise à mort que le porteur justifie par la souffrance durable que les procédures elles-mêmes provoquent.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer de nouveaux candidats-médicaments pour lutter contre les épilepsies partielles, qui prennent naissance dans une région localisée du cerveau, chez la souris. À l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité de vie et l'espérance de vie des patients. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Chez l'homme, elles peuvent inclure des fourmillements, des picotements, des secousses musculaires involontaires, des mouvements anormaux de la tête ou des yeux, ainsi que des symptômes émotionnels tels que la peur ou le rire. Le projet consiste à évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques en développement, par l'utilisation de tests dans des modèles de crises épileptiques induites par des substances chimiques connues pour leurs propriétés convulsivantes. Le modèle d'induction de crises focales par l'acide kaïnique, reconnu par l'Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP), est utilisé pour son caractère prédictif et sa pertinence dans l'étude des mécanismes physiopathologiques de l'épilepsie ainsi que dans l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le modèle d'épilepsie induit par l'injection d'acide kaïnique administré par voie intracérébrale, reproduisant l'épilepsie temporale médiale (MTLE), est recommandé pour identifier et évaluer l'efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. À l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30 % des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou de l'inefficacité des traitements (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet stoppant ou limitant le développement de crises épileptiques. À ce jour, il n’en existe aucun, alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux sont soumis à une anesthésie d'une durée maximale de 2 heures, durant laquelle l'expérimentateur évalue la profondeur de l'anesthésie par des tests de réflexe (type pincement de la queue de l'animal). Pour les 3 autres procédures décrites, une phase chirurgicale (sur des animaux anesthésiés) est nécessaire pour l'injection de la substance réactive (2 à 5 minutes, une fois) et l'implantation d'électrodes cérébrales (2 heures, une fois) ou l'implantation d'une canule cérébrale (60 minutes, une fois) et l'implantation d'électrodes cérébrales (2 heures, une fois). L'administration d'un médicament candidat peut également être réalisée pendant la phase chirurgicale (2 à 5 minutes, une fois). Pour la quatrième procédure, une substance réactive est administrée durant une à deux minutes, suivie d'une substance antépileptique chez l'animal vigile, environ une semaine après la chirurgie. Le comportement de l'animal sera évalué pendant 30 minutes à 2 heures. Le médicament candidat pourra être injecté par bolus rapide, une fois par semaine sur plusieurs semaines (1 injection de quelques secondes, une fois par semaine pendant 5 semaines) ou quotidiennement pendant 2 à 3 semaines sur animal vigile. Deux à quatre semaines après la phase chirurgicale, les mesures électroencéphalographiques sont réalisées sur des animaux vigiles et sur plusieurs jours consécutifs, en fonction du design de l'expérience. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés pendant l'étude (maximum une fois par semaine pendant 2 mois) ou en fin d'étude pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques. Les prélèvements d'organe sont réalisés à la fin de l'expérience.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment en raison de la contention. Les crises focales, prenant naissance dans une région localisée du cerveau, peuvent conduire à l'apparition d'un état épileptique permanent et sont caractérisées par une hypersalivation, des mouvements de la tête et des pattes avant, un redressement de l'animal et une perte d'équilibre dans certains cas. Chez les animaux opérés, des problèmes de cicatrisation peuvent être observés, notamment lorsque l'animal se gratte.
Devenir
Les animaux issus de la procédure de développement d’une méthode d’anesthésie pourront être maintenus en vie et réutilisés. Les animaux issus des autres procédures (sévères) seront euthanasiés afin de garantir l’absence d’une souffrance (les procédures concernées entraînant une épilepsie) qui se prolongerait à l’issue de l’étude. De plus, dans un grand nombre de cas, des structures nerveuses (notamment cerveau) seront collectés en fin d’étude, ce qui n’est pas compatible avec un maintien en vie.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales, afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux), permettant ainsi l’observation des effets des substances pharmacologiques sur l'activité cérébrale des animaux et le comportement associé, le cas échéant.
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude, en fonction des analyses statistiques effectuées. Un lot d'animaux sera utilisé sur plusieurs semaines et recevra les différents traitements d'une même expérience, limitant ainsi le nombre total d'animaux par expérience. Il est également envisagé de diminuer le lot d'animaux si le nombre d'animaux répondeurs est supérieur à nos attentes.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie chimique ou gazeuse, en parallèle d'un protocole d'analgésie avant le début de la chirurgie et pendant les 48 heures suivant l'opération. Une solution anesthésique locale est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire, et une couverture chauffante est placée sous l'animal anesthésié pour maintenir sa température corporelle pendant la chirurgie. Les animaux seront pesés une fois par jour pendant 2 jours après la chirurgie pour évaluer leur récupération. Suite à la chirurgie, les animaux sont placés par deux dans leur cage d’hébergement, en présence d'un enrichissement adapté. Des points limites stricts, prédéfinis et spécifiques au projet seront appliqués afin de prévenir toute douleur, souffrance ou détresse non justifiée scientifiquement.
Choix des espèces
Les modèles de crises convulsives induites par l'administration intracérébrale d'une substance chimique sont largement décrits dans la littérature chez la souris et sont recommandés par l'Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Ces modèles présentent un intérêt translationnel notable et permettent d’évaluer des candidats médicaments pour le traitement des crises réfractaires. Chez l’Homme, l’épilepsie est une affection neurologique pouvant survenir à tout âge. Les souris sont testées une fois sevrées. L'âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux articles scientifiques et en fonction de la population ciblée par le traitement.
Détermination de l’activité antivirale de deux molécules contre le virus Hazara
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Immunodéficientes et porteuses d'une maladie du foie létale tenue en échec par un médicament dans l'eau de boisson, 1 010 souris voient leur foie repeuplé par des cellules hépatiques humaines après retrait progressif de ce médicament. La greffe passe par une incision du flanc d'un centimètre et demi et une injection dans la rate, suivie de prélèvements sanguins toutes les trois semaines pendant treize semaines, puis d'une infection par le virus Hazara et de sept jours d'injections d'antiviraux. 920 souris relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 90 d'un niveau modéré, toutes sont tuées à l'issue pour évaluer l'activité des deux molécules testées. Le porteur écrit que ces conditions "n'entrainent aucun effet négatif sur la santé ou le bien-être des animaux".
Objectifs
Les infections virales transmises par les tiques sont en nette augmentation depuis le début du XXIe siècle. En effet, les changements climatiques et les pratiques humaines favorisent leur expansion, preuve en est, les récentes incursions dans le sud de l’Europe du virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV). Le virus CCHF est responsable de graves fièvres hémorragiques associées à une létalité élevée (10-40%) et sa manipulation nécessite un laboratoire de niveau de biosécurité 4 (BSL-4). Outre les piqûres de tiques, la transmission interhumaine se fait par la manipulation de sang ou de tissus d'animaux infectés. Pour contourner le problème de l'exigence d'un laboratoire BSL-4, le virus Hazara (HAZV), un virus transmis également par les tiques appartenant au même sérogroupe que le CCHFV, mais non responsable de maladies humaines, est couramment utilisé comme modèle de substitution pour étudier le CCHFV dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2. L’objectif du projet est donc de tester deux molécules antivirales contre HAZV et dont l’efficacité a déjà été montré en cellules primaires en laboratoire, dans un modèle murin humanisé pour le foie et infecté par le virus HAZV.
Bénéfices attendus
Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV) présentant une menace pour la santé publique et est responsable de graves fièvres hémorragiques associées à une létalité élevée (10-40%), avec une transmission interhumaine possible et une absence d'options thérapeutiques approuvées ou de vaccins homologués. Alors que CCHFV est un virus de classe 4 et reste très difficile à étudier chez la souris, le virus HAZARA, non pathogène pour l’homme, représente un modèle alternatif pour tester et calibrer l’efficacité de molécules antivirales . Ainsi, avec ce projet, nous espérons valider chez la souris l’efficacité de molécules ayant déjà montré une forte activité antivirale contre ces pathogènes en cellules primaires au laboratoire. Ceci représente la première étape en vue de leur développement pré-clinique.
Procédures
Lors de l’étape d’humanisation du foie : - Injection par voie intraveineuse sous anesthésie gazeuse (durée : 2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Injection sous cutanée sur animaux vigiles d’un analgésique postopératoire 30 minutes avant l’intervention (durée : moins d'1 minute) - Incision sur le flanc gauche (max 1-1,5cm), un anesthésique local sera appliqué, juste avant l’intervention, au niveau du site d'incision. - Injection dans la rate d’hépatocytes humains et suture par agrafe, sous anesthésie gazeuse (induction 3 ou 3,5%, maintien 3%) (durée : moins de 15 minutes) - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (100 µl max.) toutes les 3 semaines à partir de 7 semaine post greffe pendant 13 semaines environs. Les prélèvements se feront sous anesthésie locale (durée : moins d'1 minute) - Les animaux seront pesés 2 fois par semaine (environ 1 minute) pendant 9 à 15 semaines. Lors de l’étape d’infection : - Injection du virus sur animaux vigiles du virus HAZARA (durée : moins d'1 minute) - Dans le cas où le modèle validé est celui avec injection d’anticorps : Injection d’anticorps sur animaux vigiles (durée : moins d'1 minute) à J1 et J6 post infection -Prélèvement sanguin, 1 fois par semaine, sous anesthésie locale (moins d'1 minute) pendant 14 jours. - Injection de molécules antivirales sur animaux vigiles (durée : moins d'1 minute) pendant 7 jours
Impact sur les animaux
Le modèle murin humanisé pour le foie, infecté par le virus HAZARA n’est pas décrit dans la littérature, mais sur la base des données sur l’infection par ce virus , certaines nuisances et effets indésirables sont attendus. -Effets liés à l’infection : Augmentation des enzymes du foie suggérant une atteinte du foie transitoire, signes cliniques généraux liés à l’infection (fièvre, animal isolé, réflexe pilo-moteur, perte de poids modérée (jusqu’à 10-15 %), réduction de la prise alimentaire). -Effets liés à la procédures expérimentales associées : Les injections peuvent engendrer un stress léger et de la douleur temporaire au point d’injection. -Modèle de souris : Aucune nuisance ou effet indésirable attendu dans les conditions prévues. -Greffe : La chirurgie et les points de suture peuvent engendrer de la douleur temporaire -Administration antiviraux : Aucune nuisance ou effet indésirable attendu dans les conditions prévues. -Administration anticorps : Aucune nuisance ou effet indésirable attendu dans les conditions prévues.
Devenir
Les reproducteurs seront euthanasiés. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, pour évaluer le modèle d'infection par le virus et pour évaluer l’effet anti viral des molécules testées.
Remplacement
Malgré le développement de nouvelles conditions pour remplacer l’utilisation de modèles animaux, les conditions de culture des cellules de foie sont encore aujourd’hui sous-optimales car elles ne permettent pas d’étudier l’activité antivirale d’une molécule thérapeutique ainsi que ces effets indésirables dans l’organisme. Les résultats obtenus en laboratoire doivent donc être impérativement confirmés dans un modèle de souris.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Les taux de prise de greffe et de mortalité/morbidité propre à cette souche ont également été pris en compte. Afin de limiter le nombre de conditions, nous avons fait le choix de ne tester qu’une seule voie d’administration qui est la plus à même de permettre une infection du tissu du foie. Deux doses d’antiviraux seront successivement testées, mais nous ne réaliserons la dose forte qu’en cas d’absence de résultats sur la dose faible. Enfin, afin d’éviter de tester les molécules sur deux modèles différents (avec et sans anticorps) nous avons fait le choix de dédier une procédure à l’évaluation du modèle le plus pertinent puis de conduire les expérimentations sur un modèle seulement.
Raffinement
Les manipulations des souris dont le système immunitaire est déficient, seront effectuées dans un environnement complètement stérile. Ces souris ont une maladie du foie létale mais l’administration d’un médicament en continue via l’eau de boisson stérile permet de prévenir cette maladie. Ces conditions n’entrainent aucun effet négatif sur la santé ou le bien-être des animaux.Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. En cas de signe de douleur, un analgésique sera administré. Une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des expériences pour permettre aux animaux de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour limiter le stress, et une maisonnette en carton sera ajoutée si un animal se retrouve isolé. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie locale. Les prélèvements terminaux seront réalisés sous anesthésie profonde.
Choix des espèces
Cette lignée de souris a été choisi du fait de son système immunitaire déficient ce qui va permettre d’introduire des cellules humaines sans que l’animal les rejette. Ces souris ont également une maladie du foie létale mais l’administration d’un médicament en continue via l’eau de boisson stérile permet de la prévenir. C'est cette maladie qui va permettre la repopulation du foie de l’animal par des cellules de foie humain, en remplacement des cellules de foie de l’animal qui vont être éliminée après le retrait progressif du médicament. Les animaux seront greffés dès l’âge de 5 semaines, âge à partir duquel ils supportent bien la chirurgie (poids > 13-15g). L’humanisation du foie dure entre 4 à 5 mois, les animaux seront donc infectés à partir de 21 semaines.
Etude des récupérations sensorimotrices chez le rat après lésion de la moelle épinière et implantation d’un hydrogel contenant des cellules issues de la fraction vasculaire stromale.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués à l'issue de trois mois de tests pour que leur moelle épinière soit prélevée, 50 rats mâles subissent une contusion de la moelle épinière au niveau thoracique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après une chirurgie d'une heure, ils passent une semaine hébergés seuls, puis un test sensorimoteur par semaine pendant trois mois et une heure d'enregistrements électrophysiologiques. Le porteur annonce des déficits sensorimoteurs sous la lésion, des troubles de la miction imposant des massages pour vider la vessie, des douleurs pouvant persister trois semaines, et rarement de l'automutilation. Il écrit que l'utilisation de mammifères est "absolument indispensable et nécessaire", et retient le rat plutôt que le primate, le bovin, le porc, le chien ou le chat parce que son équipe n'a d'expertise et d'équipement que pour les rongeurs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité des cellules issues de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux et incorporées dans un hydrogel à base d’acide hyaluronique. Il s’agira d’étudier chez le rat Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après une contusion spinale thoracique, à réparer ou préserver la moelle épinière traumatisée. L’objectif principal étant de réduire les déficits post-traumatiques et d’entraîner une récupération sensori-motrice la plus complète possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subi des dommages de la moelle épinière. L’évaluation qui portera sur la récupération sensorimotrice et l’activité électrophysiologique (réflexe H : réflexe spinal monosynaptique entre les fibres afférentes proprioceptives Ia et les fibres motrices efférentes issues des motoneurones-α, activité des fibres nerveuses, ajustements ventilatoires) sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.
Bénéfices attendus
Dans le domaine de la réparation de la moelle épinière, malgré une recherche intensive depuis les cinquante dernières années, à ce jour aucune stratégie thérapeutique n’a été proposée afin de limiter la progression des déficits fonctionnels post-lésionnels et d’entraîner des récupérations sensori-motrices suffisantes permettant une récupération de l’autonomie des patients. Des études récentes très prometteuses ont montré que les cellules issues de la fraction vasculaire stromale du tissu graisseux semblent entraîner une récupération fonctionnelle, une neurogenèse et une neuroprotection après lésion de la moelle épinière. Ces cellules apparaissent comme une alternative prometteuse pour préserver et réparer la moelle épinière endommagée. Toutefois, bien que prometteurs, nous pensons que les récupérations sensorimotrices observées chez les animaux implantés pourraient être davantage amplifiées si une concentration plus importante de cellules de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux pouvait être maintenue au niveau du site de lésion. Notre nouvelle étude pré-clinique, qui s’inscrit dans la continuité des études précédentes, vise à tester l’efficacité thérapeutique de cellules de la fraction vasculaire stromale incorporées à un hydrogel à base d’acide hyaluronique en vue de proposer une thérapie transférable à l’Homme. Elle représente donc une étape supplémentaire très importante avant un transfert vers la clinique humaine.
Procédures
Chirurgie lésionnelle : n=1, durée : 1h; Hébergement individuel post-chirurgie : 1 semaine; Test sensorimoteurs : 1 fois par semaine pendant 3 mois, durée : 15 min; Enregistrements électrophysiologiques (à 3 mois) : n=1, durée : 1h
Impact sur les animaux
La contusion spinale thoracique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels, ainsi que des troubles végétatifs, notamment en ce qui concerne la miction. Des douleurs peuvent également être présentes, ainsi qu’une perte de poids, une déshydratation ou une dénutrition. La littérature scientifique et notre expérience indiquent que les troubles végétatifs et les douleurs liées à la chirurgie peuvent persister jusqu’à 3 semaines selon le type et l’importance de la lésion spinale, ce qui nécessite une évaluation quotidienne des animaux. Toutefois, il faut noter que les lésions nerveuses centrales peuvent rarement conduire à de l’automutilation. Les autres nuisances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs liées aux injections intrapéritonéales, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux.
Devenir
A l'issu de la procédure expérimentale, les animaux seront euthanasiés et les moelles épinières seront prélevées pour une étude histologique.
Remplacement
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Les études in vivo n’utilisant pas des mammifères ou celles in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité́ infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise donc à proposer une nouvelle stratégie de préservation et/ou réparation de la moelle épinière directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière.
Réduction
Afin de mener à bien notre projet, nous devrons comparer 5 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g (environ 2 mois d’âge) lors de la chirurgie initiale. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous réutiliserons les résultats issus de nos études précédentes pour ce qui concerne 3 groupes expérimentaux. Ainsi, seuls 2 groupes seront réalisés. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus dans ce type de recherche sur les lésions de la moelle épinière. Par ailleurs, dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques, nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 animaux, soit un total de 50 animaux pour les 2 groupes. Ainsi, nous enrôlerons, dans un premier temps, 5 animaux par groupe, soit un total de 10 animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, avec un test statistique approprié, les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre les groupes traités et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement ou qu’aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et conclurons à l’inefficacité du traitement thérapeutique, au regard des résultats précédemment obtenus.
Raffinement
Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection d’antalgique sera réalisée avant les chirurgies et une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique, ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne (7j/7) de l’état de santé des animaux (à l’aide de la grille d’évaluation adaptée) et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures destinées à réduire la douleur et le stress. En cas de trouble de la miction, des massages seront réalisés afin de vidanger la vessie jusqu’à reprise d’une miction naturelle. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés. Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux opérés seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénères. Toutefois, même si les animaux sont placés seuls dans leur cage enrichie avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois…), ils ne seront pas à l’isolement. Leurs cages seront placées sur des portoir de cages à côté des cages des autres animaux. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénères dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire dont la température des locaux est aux environs de 22°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h. Nous nous efforcerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins et des gestes adaptés.
Choix des espèces
Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre chez les mammifères après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière et dont la littérature scientifique est très pauvre en ce qui concerne l’utilisation de ces genres. De plus, nous disposons de plateformes d’analyse du mouvement et des dispositifs d’enregistrement électrophysiologiques uniquement destinés aux genres Mus et Rattus. Les animaux seront des jeunes adultes de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ. Afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes.
Evaluation de candidats-médicaments contre les troubles dépressifs induits par défaite sociale répétée chez la souris MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
4 080 souris vont être utilisées, chacune hébergée seule jusqu'à douze semaines d'affilée. Les souris "test" subissent jusqu'à dix défaites sociales face à une souris dominante, deux à dix minutes d'affrontement suivies de vingt-quatre heures à vue et à l'odeur du dominant. Viennent ensuite 28 jours de traitement, cinq séries de tests portant sur l'interaction sociale, l'anxiété, l'anhédonie, l'activité spontanée et la cognition, et une ponction de liquide céphalorachidien sous anesthésie. 2 280 souris relèvent d'un niveau de souffrance sévère et sont tuées, 1 800 sont réutilisées dans deux autres études au maximum, et le porteur inscrit parmi les bénéfices attendus ceux qui reviendraient à l'animal, sous la forme d'une "acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée".
Objectifs
Les troubles dépressifs sont des affections très répandues chez l’homme, touchant environ 5 % de la population adulte (4 % des hommes et 6 % des femmes), soit environ 280 millions de personnes dans le monde. Bien qu’il existe des traitements antidépresseurs, environ 30 % des patients y sont peu ou pas sensibles, ce qui souligne la nécessité de découvrir de nouveaux médicaments. De plus, les antidépresseurs traditionnels présentent de nombreux effets secondaires qui apparaissent parfois avant les effets bénéfiques, ce qui limite l'observance thérapeutique. L’objectif de ce projet est de modéliser un stress social chronique chez la souris afin d’évaluer les effets de candidats-médicaments destinés au traitement des troubles dépressifs chez l’homme. Ce modèle comportemental permet d’induire chez les animaux un état proche de la dépression, caractérisé notamment par une diminution des interactions sociales, une anhédonie (perte de la sensation de plaisir) et un état anxieux. Ces symptômes persistent dans le temps, plusieurs semaines après la fin du protocole. Tout comme chez l’homme, ces symptômes peuvent être améliorés par l’administration chronique (sur plusieurs semaines) d’antidépresseurs. Ce modèle constitue donc un outil pertinent pour l’étude des troubles dépressifs chez l’homme et permet d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouveaux candidats-médicaments. La découverte d'antidépresseurs avec un effet rapide et sans effets secondaires constitue un enjeu majeur de santé publique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter les troubles dépressifs et anxieux, qui touche plus de 280 millions de personnes dans le monde dont environ 30% qui ne répondent pas aux traitements actuels. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.
Procédures
MODIFICATION Pour la bonne induction du stress social et favoriser l'interaction des animaux, l'ensemble des animaux seront hébergées individuellement durant toute la durée du protocole. Au maximum l'hébergement individuel sera de 12 semaines : habituation, défaites sociales, traitement chronique avec candidats médicaments / antidépresseurs de référence et tests de comportement. Au maximum, les souris "test" subiront 10 défaites sociales (entre 2 et 10 minutes d'interaction avec une souris dominante suivi de 24h à vue et odeur de la souris dominante), 28 jours de traitements par le candidat-médicament ou un antidépresseur de référence (1 à 2 administrations/jour maximum, 2 min par administration) et 5 tests de comportement visant à évaluer l'interaction sociale (15 min par animal), l'anxiété (10 minutes par animal), la sensation de plaisir (test effectué dans la cage d'hébergement pendant plusieurs jours), [AJOUT:] l'activité spontanée (60 min par animal), le comportement de type dépressif (10 min et 6 minutes) et la cognition (8 min et 20 minutes par animal). Ces tests pourront être répétés deux fois maximum, une fois avant et une fois après traitement. Les tests cognitifs ne seront réalisés qu'une seule fois. Un à deux prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l'expérience (2 min maximum par prélèvement) ainsi qu'un prélèvement de liquide céphalo rachidien sous anesthésie et analgésie (maximum 1h). Les souris "témoins" subiront les mêmes contraintes mais sans défaites sociales. Les souris "dominantes" réaliseront 3 défaites sociales (maximum 10 minutes chacune) suivies de 3 séries de 10 défaites sociales au maximum (24h maximum chacune).
Impact sur les animaux
MODIFICATION Les animaux seront hébergés individuellement durant l'ensemble du protocole (mais toujours en contact visuel et olfactif avec un animal). Les animaux « test » subiront jusqu’à 10 défaites sociales entrainant un stress chronique (base du modèle). L’administration des composés à l'essai ou de référence pourra entrainer un stress mineur de courte durée et une douleur équivalente à la piqure d’une aiguille. Les tests de comportements permettant d'évaluer [AJOUT] l'interaction sociale, l'anxiété, la sensation de plaisir, l'activité spontanée, le comportement de type dépressif et la cognition induiront un stress léger à modéré de courte durée lié à la nouveauté de l’environnement et aux conditions de luminosité. Lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. Dans le cas d’une anesthésie pour un prélèvement, celle-ci peut induire un stress à l’endormissement. Les effets potentiellement indésirables des produits testés font l’objet d’échanges réguliers avec le responsable bien-être animal afin d’adapter les outils d’observation et d’anticiper au mieux d’éventuels signes cliniques. L’impact négatif sur les animaux sera minimisé en définissant avec précision la durée d’exposition et le nombre d’interactions nécessaires pour induire un stress social, tout en évitant de grandes blessures.
Devenir
Euthanasie des animaux à la fin des expériences pour les animaux avec degré de sévérité "sévère" et/ou euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal et/ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables éventuels provoqués par le(s) produit(s) à l'essai (candidats médicaments). Les animaux avec degré de sévérité "modéré" pourront être réutilisés au maximum sur deux autres études comme décrit dans la littérature scientifique sur ce modèle.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le comportement dépressif, ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 12 / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux conditions expérimentales, • le ré-emploi d'animaux (souris mâles reproducteurs employés comme dominants), • Le recours à des procédures d'anesthésie et d'analgésie pour le prélèvement de LCR en ante-mortem.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales la plus pertinente et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur la dépression car elle présente un comportement de territorialité vis-à vis d'un intrus qui entre sur son territoire. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Etude du rôle d’une protéine importante dans la guérison de la leucémie aiguë promyélocytaire (cancer du sang).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
La rate des souris est palpée chaque jour, et son grossissement déclenche une surveillance renforcée puis, selon le score obtenu, la mise à mort. 3 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules leucémiques leur sont injectées dans la veine de la queue sur animal éveillé, puis une molécule leur est injectée dans l'abdomen chaque jour pendant 21 jours, avec une capsule implantée sous la peau du dos et jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse dans le fémur. L'objet est de déterminer quelle partie d'une protéine permet aux deux médicaments déjà utilisés en clinique d'éliminer les cellules leucémiques, les traitements eux-mêmes étant acquis.
Objectifs
Notre projet s’intéresse à un sous-type de cancer du sang appelé leucémie. Cette maladie est causée par une modification génétique présente dans les cellules à l’origine des globules rouges et blancs. On observe chez les patients atteints d’une leucémie un blocage de la production de globules blancs fonctionnels, qui s’accumulent dans la moelle osseuse. Les études menées sur des modèles souris de leucémie ont permis d’identifier le rôle essentiel d’un élément cellulaire (on parle de protéines) dans la réponse au traitement. En effet, en absence de traitement, cette protéine est déréglée dans les cellules leucémiques et ne contrôle donc plus leur survie et leurs fonctions. Deux médicaments permettent l’élimination de ces cellules leucémiques notamment en redonnant à cette protéine son rôle de régulateur de la survie des cellules. Nous cherchons maintenant à déterminer quelle partie de cette protéine permet d’éliminer les cellules leucémiques en réponse au traitement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples. En premier lieu, ce projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires liés à la protéine d'intérêt et comprendre comment la dégradation ciblée de la protéine modifiée contribue à l’éradication de la maladie. L’identification des mécanismes pourra ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques améliorées ou complémentaires, augmentant potentiellement le taux de rémission et la survie des patients. Ce projet devrait donc renforcer l’efficacité, la sécurité et la durabilité des traitements actuels, avec un impact direct sur la prise en charge clinique et la qualité de vie des malades atteints de cette leucémie.
Procédures
Dans ce projet, nous utilisons un modèle de souris pour étudier la leucémie. Pour cela, nous injectons à des souris des cellules leucémiques (injection par voie intra-veineuse dans la veine de la queue sur souris éveillée; durée de l'injection : 1 minute), ce qui permet de reproduire la maladie chez l’animal. Une fois la leucémie installée, nous testons différentes stratégies thérapeutiques en utilisant une combinaison de médicaments couramment utilisés pour traiter ce type de cancer. Cela correspond en l'administration quotidienne d'une molécule thérapeutique par injection dans l'abdomen de la souris éveillée (durée de l'injection : 10 secondes) pendant 21 jours maximum, pouvant être combiné à l’implantation sous la peau du dos de la souris d'une capsule permettant la libération continue du second médicament (réalisée sous anesthésie générale, l’opération dure une dizaine de minutes). Dans certaines expériences, d’autres traitements seront évalués en parallèle, ils seront administrés par injection intra-veineuse (1 à 2 injections dans la veine de la queue à 3 jours d'intervalle; durée de l'injection 1 minute). Le développement du cancer pourra être suivi par un prélèvement de la moelle osseuse au niveau du fémur. Pour cela les souris seront anesthésiées et recevront un traitement anti-douleur préventif (durée 3 minutes). Le prélèvement sera réalisé 2 fois maximum durant la vie des animaux (avant et après traitement, à au moins 2 semaines d’intervalle). Pour la production de cellules murines à l’origine de toutes les cellules du sang, et utilisées dans des tests in vitro (réalisés en dehors d'un organisme vivant entier), les souris recevront une unique injection lente par voie intraveineuse (veine de la queue sur souris éveillée ; durée : 3 minutes) d’un produit permettant de stimuler la production de cellules du sang au niveau de la moelle osseuse.
Impact sur les animaux
Dans les modèles de souris développant une leucémie, des signes cliniques de la maladie peuvent apparaître durant sa progression. Ces signes incluent des modifications de l’apparence (manque de toilettage, yeux clos…) ou du comportement (mobilité, agitation) et une augmentation de la taille de la rate. Les prélèvements de la moelle osseuse avant et après traitement peuvent induire une douleur pendant quelques heures après l’intervention. Les traitements médicamenteux utilisés dans ce projet peuvent induire du stress lié à la manipulation de la souris et des douleurs. L’implantation de la capsule sous la peau du dos peut entraîner une gêne dans le déplacement. Ensuite, les injections dans l'abdomen sont réalisées quotidiennement jusqu’à 21 jours consécutifs, pouvant générer une douleur localisée au site d'injection et un stress lié à la manipulation quotidienne des souris. Enfin, les différents traitements peuvent conduire à une perte de poids des animaux (poids regagné aussitôt le traitement terminé) pour les souris dont la survie est étudiée après la fin du traitement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever un maximum d’organes et ainsi évaluer les mécanismes d'action des molécules thérapeutiques dans le cas des cancers du sang.
Remplacement
Un grand nombre de tests a déjà été effectué sur des cultures de cellules. Mais ces modèles sont limités car ils ne reproduisent pas la complexité d'un organisme vivant (absence d'interaction entre cellules saines et cancéreuses). De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux. Enfin, les souris disposent d’un système immunitaire proche de celui de l’humain qui permet d’étudier les interactions entre les cellules immunitaires et la leucémie. Toutefois, le développement de modèle cellulaire en culture pour certains aspects de notre projet devrait nous permettre, à terme, de diminuer le nombre d’animaux engagés dans des procédures expérimentales.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au maximum tout en nous assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger) et un suivi quotidien (par les zootechniciens et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Une fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant d’évaluer les points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. Dès la détection, par palpation quotidienne de la rate, des premiers signes de maladie (augmentation de la taille de la rate comme critère d'alerte), nous renforcerons cette surveillance (scoring 2 à 3 fois/semaine). Une anesthésie et un traitement anti-douleur seront administrés avant chaque geste pouvant générer une douleur (prélèvement de la moelle osseuse dans le fémur). De plus, le développement de modèle cellulaire en culture pour certains aspects de notre projet devrait nous permettre de minimiser le nombre de procédures pouvant induire de la souffrance.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l’angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant. De plus, la souris et l’homme partagent 99 % de leurs gènes. Ainsi, les résultats des expériences réalisées chez la souris pourront être facilement transposables à l'être humain et donc améliorer l'étude des pathologies humaines et leurs traitements. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes afin de reproduire le plus fidèlement possible la pathologie humaine et d’analyser l'effet des traitements.
Développement de modèles murins humanisés de lupus pour l’évaluation préniclinique de nouvelles thérapies
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 150 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées de système immunitaire puis greffées de cellules humaines, elles reçoivent du pristane qui déclenche un lupus, et subissent jusqu'à 51 injections, 25 prélèvements urinaires et 9 prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur décrit ce qui les attend à partir du deuxième mois : ganglions gonflés, douleurs articulaires gênant le déplacement, dos voussé, mise à l'écart des congénères, puis dermite avec perte de poils et insuffisance rénale à partir du quatrième mois. Après avoir listé les cultures de cellules humaines déjà utilisées en amont, il conclut qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour observer les réponses immunitaires dans un "organisme entier".
Objectifs
Le lupus érythémateux systémique (LES) est une maladie autoimmune grave dans laquelle le système immunitaire s’attaque à l’organisme. Cette réaction est causée par des anticorps anormaux (appelés autoanticorps) produits par des cellules appelées lymphocytes B. Les traitements actuels réduisent l’inflammation mais ne guérissent pas la maladie et peuvent avoir des effets secondaires importants. Une approche prometteuse serait d’éliminer uniquement les lymphocytes B responsables de la maladie, sans toucher au reste du système immunitaire. Pour mettre au point ce type de thérapie, il faut un modèle expérimental qui reproduise fidèlement le lupus humain. Des recherches récentes ont permis de développer des souris « humanisées », c’est-à-dire dépourvues de leur système immunitaire et greffées avec des cellules humaines. Après traitement par deux molécules (estradiol et pristane), ces souris présentent des signes proches de ceux observés chez les patients lupiques : production d’anticorps pathologiques et atteintes de la peau et des reins. Le projet consiste à développer ce modèle de souris humanisées présentant un lupus, et de tester de nouvelles thérapies dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à établir et caractériser un modèle de lupus chez une souris développant un système immunitaire humain. Il permettra de mieux comprendre le rôle des cellules pathogènes dans le développement du lupus, et de tester de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement ces cellules. Ce modèle ouvrira ainsi la voie à des traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients atteints de lupus.
Procédures
Dans certaines procédures, les souris immunodéficientes seront injectées avec des cellules humaines pour développer un système immunitaire humain (humanisation). De plus, dans certaines procédures, les souris seront injectées avec une molécule (pristane) qui induit le développement d'un lupus. Plusieurs prélèvements sanguins (9 maximum) seront réalisés sous anesthésie. Plusieurs prélèvements urinaires (25 maximum) seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ. Certains animaux seront soumis à des injections (51 maximum) sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les souris traitées par du pristane développent une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une faible perte d'appétit et donc une perte de poids. D’après la littérature, les souris injectées avec du pristane développent, à partir de 2-3 mois post-injection, un gonflement des ganglions, ainsi que des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement, une mise à l'écart du/des individus et un dos voussé. A partir de 4 mois post-injection, les souris développent une dermite, entrainant une dépilation, ainsi qu’une insuffisance rénale, matérialisée par une augmentation de la protéinurie mesurable à l'aide de bandelettes urinaires. Les prélèvements sanguins répétés peuvent potentiellement générer une anémie (pâleur des muqueuses), une respiration plus rapide ainsi qu'une plaie éventuelle au site de prélèvement. Les nuisances liées aux anesthésies répétées (léger stress) sont inhérentes à toute anesthésie (l'anesthésie est cependant ici de courte durée pour un prélèvement sanguin). Les effets indésirables pendant le processus d'humanisation (jusqu'à la reconstitution complète d'un système immunitaire) des souris peuvent comprendre une sensibilité accrue aux infections liée à l’immunodéficience.
Devenir
Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvement de tissus (ou s’ils atteignent les points limites justifiant leur mise à mort).
Remplacement
Des approches in vitro sont utilisées en amont de ce projet pour évaluer l’efficacité et la sécurité des molécules thérapeutiques, notamment sur des cellules humaines isolées et des systèmes de culture. Toutefois, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions cellulaires et des réponses immunes systémiques impliquant la moelle osseuse, le thymus, la rate et les tissus cibles de l’inflammation lupique. Un modèle in vivo est donc indispensable pour étudier la dynamique des réponses immunitaires et l’impact global des traitements dans un organisme entier. La souris est l’espèce la plus appropriée pour ces études, car son système immunitaire et sa physiologie sont bien caractérisés, et son utilisation est largement validée dans la littérature.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment dans des publications utilisant des modèles expérimentaux similaires et/ou sur des outils statistiques pour estimer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages comportant des enrichissements (bâtons, frisures de kraft, tunnels), dans des conditions les empêchant de développer des infections. Le phénotype des animaux sera examiné de façon bi-hebdomadaire à l'aide de grilles de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. A la livraison des souris, les animaux seront acclimatés aux nouvelles conditions d'hébergement pendant une semaine. Pour les procédures pouvant conduire au développement d’une atteinte cutanée type dermite, une pommade cicatrisante sera administrée.
Choix des espèces
En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. De plus, la souris est un modèle adapté pour la reconstitution d’un système immunitaire humain suite à l’injection de cellules souches hématopoïétiques humaines, modèle pertinent pour le projet présenté dans cette demande. En ce qui concerne le stade de développement, les souris seront étudiées entre un âge de 8 à 10 semaines (âge minimum de début de l'expérimentation) et de 12 mois (âge maximum de fin de lexpérimentation).
Étude du rôle d’une protéine d’intérêt dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
7 009 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 439 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 4 060 un niveau léger. Elles subissent une biopsie de queue pour génotypage, deux prélèvements sur animal vigile, deux anesthésies et sept injections, et celles chez qui l'encéphalomyélite auto-immune est induite développent une paralysie partielle que le porteur qualifie de transitoire. Le bénéfice annoncé tient à la compréhension du rôle d'une protéine et au développement d'approches thérapeutiques fondées sur sa biologie, sans traitement curatif de la sclérose en plaques en vue. Le porteur affirme que les migrations de cellules immunitaires vers le système nerveux central ne sont pas étudiables in vitro et conclut qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'expérimentation animale.
Objectifs
L'objectif du projet est de caractériser l'effet protecteur d'une protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaque chez la souris. La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central. Elle est la première cause de déficit neurologique chez le jeune adulte. Les femmes sont atteintes deux fois plus que les hommes et le coût socio-économique de la sclérose en plaques est le second après les traumatismes dans ce groupe d’âge. Il n’y a actuellement pas de traitement curatif pour la sclérose en plaques qui est donc une maladie chronique persistant tout au long de la vie du patient. Certains traitements permettent d’en ralentir la progression chez certains patients. La sclérose en plaques implique des cellules du système immunitaire qui attaquent le système nerveux central. Il y a un grand espoir que la protéine d'intérêt, qui module le système immunitaire, puisse contribuer à l’amélioration de cette maladie. La sclérose en plaques peut être modélisée chez la souris. En utilisant un modèle de sclérose en plaques chez la souris, ce projet analysera le mode d'action de la protéine d'intérêt en prenant en compte sa production par différents types cellulaires au cours de cette maladie. Il testera également des approches thérapeutiques basées sur la biologie de cette protéine d'intérêt.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la compréhension du rôle de la protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris, et le développement de nouvelles aproches thérapeutiques basées sur la biologie de cette protéine. Le modèle de sclérose en plaques utilisé dans ce projet est prédictif de la sclérose en plaques, et a déjà servi à la mise en place des traitements principaux aujourd'hui utilisés pour cette maladie chez l’homme.
Procédures
biopsie à la queue (génotypage invasif) pour prélèvement de la biopsie: ~10 secondes. Prélèvements (x2 sur animaux vigiles): 1x~5 secondes + 1x~15 secondes. Anesthésie (x2): ~15 minutes/anesthésie. Injections: ~30 secondes (x2 sur animaux anesthésiés) + ~10 secondes (x4 sur animaux vigiles) + ~45 secondes (x1 sur animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Injection = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement = douleur légère à moyenne, de courte durée et localisée. Biopsie à la queue (génotypage invasif) pour prélèvement de la biopsie = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle encéphalomyélite auto-immune expérimentale=paralysie partielle et transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.
Remplacement
Ce projet vise à caractériser l’effet de la protéine d'intérêt dans un modèle de sclérose en plaques. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires entre différents organes qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du systèmes nerveux central impliquent également la migration des cellules du système immunitaire dans le système nerveux central, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du système nerveux central. Ces processus ne sont actuellement pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez l'animal.
Réduction
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec un programme d'analyse de puissance statistique. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission après un court épisode de paralysie afin de réduire la souffrance des animaux. Nous avons établi des points limites adaptés qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable et inutile des souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal ainsi que par le/les expérimentateur(s). La gravité des symptômes et le poids sont mesurés quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux et dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Le modèle expérimental de sclérose en plaques chez la souris a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients. Il s'agit donc d'un modèle pertinent pour le développement et la compréhension de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. Utilisation de souris à partir de l’âge de 10 jours pour effectuer les gestes d'identification ainsi que la biopsie. Utilisation des souris à partir de 4 semaines pour effectuer un prélèvement pour génotypage. Cet âge est requis afin de s’assurer que les souris aient une taille appropriée et suffisante pour effectuer ces gestes sans porter atteinte à leur intégrité physique. A partir de 6 semaines d’âge et jusqu'à 16 semaines d’âge, les souris pourront être immunisées pour induire l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale parce que cela correspond à l'âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est adaptée pour étudier la pathogenèse de la maladie. Ce modèle permet l'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées qui sont nécessaires pour définir de manière robuste le rôle de chaque type cellulaire dans les processus étudiés et pour conduire les études mécanistiques.
Modèle murin de maltraitance physique infantile : syndrome du bébé secoué
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux de 7 jours sont séparés de leur mère, anesthésiés, puis secoués horizontalement, une première fois seuls puis à dix reprises à 24 heures d'intervalle. 1 306 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, seule gravité déclarée pour ce projet. Le porteur annonce des douleurs cérébrales, des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et de développement psychomoteur, une rigidité corporelle, des mouvements convulsifs et des troubles respiratoires, et écrit par ailleurs que les animaux "ne ressentiront aucune souffrance supplémentaire, car toutes les analyses seront effectuées après leur euthanasie". Les cerveaux et les rétines sont prélevés après la mise à mort pour y chercher des hémorragies, l'objet étant de reproduire chez la souris nouveau-née le syndrome du bébé secoué.
Objectifs
Le syndrome du bébé secoué, forme grave de maltraitance, provoque des lésions cérébrales sévères et des séquelles durables (troubles moteurs, cognitifs, langagiers ou comportementaux). Malgré son impact, ses mécanismes biologiques restent mal connus, freinant le développement de traitements ciblés. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes cérébraux et biologiques impliqués dans le syndrome du bébé secoué, en développant un modèle expérimental chez la souris nouveau-née, dont le développement cérébral présente des similarités avec celui du nourrisson humain. Ce modèle est nécessaire car les phénomènes étudiés impliquent des interactions complexes entre le cerveau, le système vasculaire et les réponses inflammatoires, qui ne peuvent pas être reproduites par des méthodes alternatives in vitro. La procédure expérimentale consistera à appliquer des secouements contrôlés et standardisés, réalisés une première fois de manière isolée, puis répétés à intervalles de 24 heures, pour un total de dix secouements. Cette approche vise à reproduire, de façon reproductible et encadrée, des conditions compatibles avec celles décrites chez les nourrissons victimes de ce syndrome. Les conséquences de ces secouements seront étudiées à différents stades du développement. Les analyses porteront sur le cerveau et la rétine afin d’identifier d’éventuelles lésions, notamment des hémorragies, à l’aide de techniques d’imagerie et d’analyses histologiques. Les réponses inflammatoires et certaines modifications biologiques seront également évaluées. Le développement et le comportement des animaux seront analysés à l’aide de tests adaptés à l’âge, permettant d’évaluer la motricité, la communication précoce, l’activité, l’anxiété et les interactions sociales. Ces évaluations permettront de relier les lésions cérébrales observées à d’éventuelles altérations fonctionnelles. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive tout au long du projet, et toutes les procédures seront réalisées en appliquant strictement les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) afin de limiter le nombre d’animaux utilisés et de minimiser les contraintes qui leur sont imposées. À terme, ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité de traitements existants et d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des enfants victimes.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une compréhension détaillée et intégrée des mécanismes cellulaires, moléculaires et comportementaux liés au traumatisme crânien non accidentel du syndrome du bébé secoué. En analysant les altérations cérébrales à différents stades du développement, de l’enfance à l’âge adulte, il permettra d’identifier les périodes clés de vulnérabilité et les moments les plus favorables à des interventions thérapeutiques ciblées. Ces résultats seront essentiels pour développer des approches adaptées aux enfants et adolescents victimes, et contribueront à mettre au point des stratégies de prévention secondaire efficaces, personnalisées et basées sur des données biologiques objectives.
Procédures
Après le traumatisme, des groupes d’animaux d’âges différents seront euthanasiés par surdosage d’anesthésiant. Une fois l’anesthésie confirmée (absence de réaction au pincement), les cerveaux sont prélevés en vue des analyses (lot 4 et 7 = 288 animaux). Pour certains animaux, une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie permettra de réaliser des mesures d’imagerie cérébrale (durée : 1 heure). Ces animaux seront euthanasiés sans réveil (lot 5= 100 animaux)
Impact sur les animaux
Le jour du traumatisme crânien par secouement : • Séparation d’avec la mère lors de l’anesthésie par inhalation. • Risque d’hypothermie lié à l’isolement maternel. • Application du traumatisme par secouement horizontal. Conséquences post-traumatiques : • Douleurs cérébrales dues aux lésions provoquées par le secouement. • Difficultés d’alimentation entraînant un retard de croissance pondérale. • Retard du développement psychomoteur. • Tension musculaire anormalement élevée, rigidité corporelle, mouvements anormaux ou convulsifs. • Troubles respiratoires. • Altérations du comportement. Lors des tests de comportement : • Le stress de manipulation et la séparation temporaire du groupe peuvent induire une anxiété passagère ou une agitation motrice. • Fatigue transitoire lors du test du niveau d’anxiété ou l’évaluation motrice Test IRM (photo détaillée du cerveau) et fUS (vidéo de l’activité cérébrale en direct) : • Une injection d’anesthésiant sera réalisée pour permettre ces deux tests. Les animaux ne ressentiront aucune souffrance supplémentaire, car toutes les analyses seront effectuées après leur euthanasie. • Les prélèvements seront réalisés après la mise à mort
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral après le traumatisme, ainsi que l’inflammation cérébrale.
Remplacement
Dans le domaine de l’étude des traumatismes crâniens non accidentels et de leurs conséquences sur le développement cérébral et comportemental, plusieurs alternatives aux modèles animaux ont été explorées, notamment les cultures cellulaires, les organoïdes cérébraux, mini-cerveaux sans pensée ni conscience crées en laboratoire à partir de cellules souches humaines, et les modèles informatiques. Les cultures cellulaires permettent d’étudier certains mécanismes moléculaires et cellulaires, comme l’inflammation ou les hormones, mais elles ne reproduisent pas la complexité de l’architecture cérébrale, des réseaux neuronaux et des interactions entre différents types de cellules dans un cerveau en développement. Les organoïdes cérébraux offrent une approche tridimensionnelle plus proche de l’organisation du cerveau humain, mais ils ne permettent pas de modéliser des fonctions comportementales, les interactions sociales ou les réponses du cerveau à un traumatisme physique. Les modèles informatiques et les simulations sont utiles pour tester des hypothèses ou analyser des données, mais ils reposent sur des informations expérimentales obtenues sur des modèles animaux vivant et ne permettent pas de prédire de manière fiable l’impact d’un traumatisme crânien sur le développement cérébral et comportemental.
Réduction
Pour mettre au point le modèle, nous utiliserons le moins d’animaux possible. Si le nombre minimal de secouements nécessaire pour provoquer les lésions caractéristiques est atteint, les expérimentations seront arrêtées. Les cerveaux des animaux participant aux analyses de la connexion entre les neurones et aux tests comportementaux seront également utilisés pour les analyses du tissus cérébral. Cette approche permet d’optimiser l’utilisation de chaque animal et de réduire le nombre total nécessaire. Toutes les mesures seront mises en œuvre pour réduire au maximum l’utilisation d’animaux. Grâce aux méthodes expérimentales régulièrement appliquées dans les laboratoires, nous disposons déjà de données préliminaires solides. Celles-ci nous permettent de calculer précisément le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs entre les groupes. Les comparaisons entre groupes seront réalisées à l’aide de tests statistiques. Le plan expérimental a été optimisé afin de garantir la robustesse et la reproductibilité des résultats, tout en respectant strictement le principe de réduction, le nombre d’animaux étant limité au strict nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Raffinement
L’environnement des animaux sera enrichi avec du papier doux absorbant permettant la fabrication de nids, reproduisant ainsi un comportement naturel de nidification. Lors des manipulations (secouements), les souriceaux seront maintenus au chaud à l’aide d’une lampe chauffante pour éviter toute hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement à l’aide d’un arbre décisionnel, permettant une observation attentive au sein de la portée sans perturber la relation mère-petits, essentielle à leur développement. Principe de l’arbre décisionnel : Un animal en difficulté est rapidement repéré grâce à des signes cliniques caractéristiques. En cas de détresse physiologique (troubles respiratoires, hypothermie sévère, variation importante de la fréquence cardiaque), la procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal euthanasié. Enfin, avant les prélèvements de tissus cérébraux, les animaux recevront un analgésique.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est scientifiquement pertinent en raison de la reproductibilité des résultats, de la connaissance approfondie de sa biologie, et de son cycle de reproduction court, qui permet des études développementales efficaces. Le protocole de secouement sera appliqué à 7 jours de vie, stade qui correspond au début de la petite enfance chez l’humain en termes de développement cérébral. L’objectif étant d’étudier les interactions cellulaires dans un cerveau en développement, dans un contexte de traumatisme crânien, il est essentiel d’utiliser une espèce dont le système nerveux central présente des similarités structurales et fonctionnelles avec celui de l’humain. La souris répond à ces critères et constitue un modèle validé pour les études en neurosciences. Le modèle murin est ici particulièrement adapté : sa robustesse face aux manipulations, la richesse des données précliniques disponibles, et la possibilité d’explorer les effets du secouement sur des périodes développementales bien définies justifient pleinement son utilisation. Le traumatisme crânien par secouement sera induit à 7 jours de vie, âge correspondant au début de l’enfance chez l’humain, afin de mimer la survenue précoce de lésions cérébrales. L’évolution des lésions et l’analyse des différents types de cellules du système nerveux seront étudiées à plusieurs étapes importantes du développement: • 8 et 9 jours de vie : stades précoces correspondant à l’enfance, • 14 et 21 jours de vie : stades intermédiaires évoquant l’adolescence, • 1 mois 1/2 et 6 mois : stades tardifs correspondant à l’âge adulte.