Procédures sévères
Etude de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules pour la délivrance d’ARN chez un modèle murin d’inflammation intestinales aigüe et chronique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
591 souris vont être utilisées, dont 555 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir jusqu'à six administrations intra-rectales sous anesthésie et six gavages. Un agent chimique leur provoque une inflammation intestinale qui se traduit par une perte de poids, des selles anormales et du sang dans les selles, l'état de chaque animal étant noté chaque jour sur une grille de 0 à 4. Toutes sont tuées, à la fin de l'étude ou à des points intermédiaires, pour des analyses post mortem. Les bénéfices annoncés, une nouvelle génération de traitements ciblés contre la maladie de Crohn et la rectocolite, sont renvoyés au long terme et au conditionnel, quand l'inflammation infligée aux souris est le point de départ du protocole.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de vérifier si des nanoparticules biodégradables à base d’ARN peuvent atténuer efficacement l’inflammation intestinale, un problème majeur dans des maladies comme la colite. En induisant artificiellement une inflammation chez la souris, puis en administrant ces nanoparticules, nous pourrons mesurer leur impact sur les symptômes et l’évolution de l’inflammation. Si les résultats sont positifs, cela ouvrira la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les personnes souffrant de maladies inflammatoires de l’intestin. Les maladies inflammatoires de l’intestin sont des troubles auto-immuns caractérisés par une inflammation sévère et récurrente de la paroi du tube digestif. Ces maladies, en augmentation dans les sociétés modernes, sont graves et les traitements actuels peinent à offrir une efficacité durable, entraînant souvent des effets secondaires pour les patients. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques nouvelles et mieux ciblées. Ce projet de recherche a pour but de mettre au point une approche thérapeutique innovante, utilisant une nanoparticule capable d’améliorer la prise en charge de ces pathologies inflammatoires. Ce projet d’expérimentation sur un modèle animal vise précisément à étudier l’efficacité thérapeutique de nanoparticules à base d’ARN, biodégradables et biocompatibles, dans un modèle de maladie intestinale inflammatoire (comme celles de type Crohn et colite ulcéreuse). Le projet s’inscrit dans une démarche scientifique et médicale visant à répondre aux interrogations suivantes : 1. Déterminer si les nanoparticules à base d’ARN, administrées par voie orale, sont capables de réduire efficacement l’inflammation intestinale. 2. Comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les nanoparticules à base d’ARN modulent la réponse inflammatoire dans l'intestin.
Bénéfices attendus
À court terme, le projet apportera des réponses sur l’efficacité des nanoparticules à base d’ARN pour traiter l'inflammation intestinale dans des modèles murins, tout en améliorant la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués. Il jettera également les bases pour de futures applications thérapeutiques en médecine humaine. À long terme, ces nanoparticules pourraient représenter une nouvelle génération de traitements ciblés pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, avec moins d'effets secondaires et un potentiel pour des thérapies personnalisées. Ainsi, ce projet pourrait significativement faire progresser les connaissances scientifiques tout en ayant un impact majeur sur le développement de nouvelles thérapies cliniques pour les maladies inflammatoires.
Procédures
Dans les différentes procédures : - les animaux seront rasées sur une petite zone du dos (1,5x1,5cm, une seule fois en début de procédure, 1 minute) - les animaux recevront une ou plusieurs (6 maximum) administrations intra-rectale (5 minutes maximum pour l’ensemble du geste), sous anesthésie et plusieurs administrations (6 maximum) par gavage oral (moins d’une minute pour le geste), sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux (contention, pesée et anesthésie) pourra entraîner un état de stress. La rasage (tondeuse) nécessaire à la pré-sensibilisation au produit peut créer une légère irritation. L’injection d’un agent chimique va induire une inflammation au niveau de l’intestin peut se traduire par une perte de poids, une consistance des selles particulière et une présence de sang dans les selles. L’administration par voie orale est un geste rapide (moins d’une minute). Toutefois, cela pourrait éventuellement provoquer une légère irritation au niveau de l’œsophage.
Devenir
Pour chacune des procédures : Tous les animaux seront mis à mort soit à la fin de l’étude soit à différents points temporels afin de réaliser des études ex-vivo post mortem.
Remplacement
Bien que les tests en laboratoire (in vitro) soient utiles pour des études préliminaires, ils ne peuvent pas simuler toute la complexité des interactions biologiques qui existent dans un organisme complet. Ces études en laboratoire nous ont déjà permis de démontrer que nos nanoparticules sont stables dans des conditions physiologiques variées (milieux qui simulent les fluides gastrique et intestinal) et qu'elles sont compatibles avec des cellules immunitaires et intestinales. Cependant, pour évaluer efficacement notre traitement dans le cadre de l’inflammation intestinale, il est indispensable d’avoir recours à des tests sur organisme vivant (in vivo). 1. Tolérance et sécurité globales : Pour garantir que le traitement ne déclenche pas de réactions indésirables ou toxiques dans un organisme entier, un modèle vivant est essentiel. 2. Interaction avec le microbiote intestinal : Le microbiote joue un rôle clé dans l’inflammation intestinale. Un modèle in vivo permet d’examiner comment les nanoparticules interagissent avec cette communauté complexe de micro-organismes, un élément qui ne peut être simulé de manière fiable en laboratoire. 3. Réalité des conditions de maladie : Les organismes vivants reproduisent les conditions pathologiques réelles, permettant ainsi de tester la réponse au traitement dans des conditions proches de celles rencontrées par les patients. 4. Effets dynamiques dans l’intestin : L’inflammation intestinale modifie des processus comme la perméabilité de l’intestin et son activité motrice, qui influencent directement l’efficacité des traitements oraux. Un modèle in vivo est donc nécessaire pour vérifier si nos nanoparticules parviennent à atteindre la cible thérapeutique. En somme, l’utilisation d’un modèle vivant permet de recréer un environnement biologique complet et complexe, essentiel pour confirmer l’efficacité, la biocompatibilité, et la sécurité de notre traitement dans des conditions proches de celles de l’humain.
Réduction
Dans l’ensemble de notre projet, le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.
Raffinement
Pour préparer les souris au projet, nous les acclimaterons pendant une semaine pour réduire leur stress. Pendant tout le protocole, nous veillerons à leur bien-être et prendrons des précautions pour minimiser toute souffrance ou stress. Dans leurs cages, elles auront des objets comme des petites maisons et du paillage pour les distraire, et seront placées en groupes de cinq car elles sont sociables. Les souris seront transportées en toute sécurité dans des boîtes fermées et isolées du bruit. Toutes les souris seront observées pendant chaque pesée (tous les jours) afin de détecter une éventuelle apparition de signes de souffrance. Quand cela sera nécessaire, des experts montreront les techniques spécifiques pour minimiser le stress des souris. Si elles perdent trop de poids, nous ajouterons de la nourriture humide et de l'eau gélifiée pour les aider à s'alimenter. Si le rasage (tondeuse) provoque une irritation, la litière pourra être adoucie. Avant l’administration intra-rectale, les souris recevront une anesthésie légère, et nous humidifierons leurs yeux pour les protéger. Les points limites seront évalués quotidiennement à partir de l’induction de la pathologie, selon une grille de score : il varie de 0 à 4. De plus les critères comportementaux et apparences seront également pris en compte. Un traitement palliatif sera mis en place dès lors que la situation nécessaire et possible laissant une possibilité de rémission et non mise à mort systématique après 24h.
Choix des espèces
Le développement de nouvelles thérapies types nanoparticules nécessite une évaluation chez le petit animal en complément des études in vitro pour déterminer leur devenir et leur efficacité in vivo. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour mimer la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales. Le modèle d’inflammation intestinale induite par l’agent chimique d’intérêt est déjà bien établi et mime la pathologie humaine que nous ciblons. Le modèle choisi est décrit dans la littérature pour être sensible à l’induction d’une inflammation intestinale, contrairement à d’autres. Ce modèle nous permettra donc d’acquérir les données nécessaires pour démontrer l’efficacité thérapeutique notre nanoparticule. Les animaux utilisés auront environ 6 semaines au début des procédures, conformément aux données de la littérature indiquant que les souris de cet âge sont plus réceptives au développement d'une inflammation intestinale après administration de l’agent chimique. Au-delà de cet âge, l'induction d'une inflammation intestinale devient plus difficile.
Etude cinétique et comportementale de l’exposition à différents sels de lithium chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavés une à quatorze fois, opérés vingt minutes pour la pose d'un cathéter porté soixante-douze heures, puis saignés neuf fois en vingt-quatre heures alors qu'ils sont éveillés, 118 rats reçoivent différents sels de lithium dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 76 d'entre eux et sévère pour 42. Certains sont isolés quatre fois vingt-quatre heures en cage métabolique, d'autres enfermés huit heures dans un cylindre de plexiglas pour permettre les prélèvements. Une partie passe des tests d'activité locomotrice d'une heure et demie et des tests d'exploration et d'anxiété de cinq minutes, répétés deux jours de suite à trois reprises. Tous sont tués au terme du protocole, par perfusion intracardiaque pour certains, ou plus tôt s'ils atteignent un point limite, leurs organes servant aux analyses de distribution du lithium et de toxicité rénale.
Objectifs
Le lithium est aujourd’hui l’un des traitements les plus efficaces pour stabiliser l’humeur chez les personnes atteintes de trouble bipolaire. Le lithium existe sous plusieurs formes chimiques et permet de réduire le risque de rechute. Cependant, son utilisation doit être très bien contrôlée, car la dose efficace est proche de la dose toxique. Cela peut entraîner des effets secondaires importants, notamment au niveau des reins et du cerveau. Des études d’imagerie réalisées chez l’être humain ont montré que le lithium ne se répartit pas de la même façon dans toutes les zones du cerveau, et que cette répartition varie d’une personne à l’autre. Cela remet en question l’idée selon laquelle le lithium se diffuserait uniformément dans le cerveau. Ces résultats amènent à se demander si différents sels de lithium pourraient se comporter différemment dans le corps et le cerveau. Parmi eux, l’orotate de lithium (LiOr) est une forme encore peu étudiée. Certaines données en laboratoire suggèrent qu’il pourrait être mieux absorbé et mieux atteindre le cerveau. Si cela se confirme, il pourrait être possible d’utiliser des doses plus faibles tout en limitant les effets secondaires, notamment ceux qui touchent les reins. Dans ce contexte, le but de ce projet est d’étudier comment différents sels de lithium se comportent dans le sang, comment ils se répartissent dans le cerveau, quelle est leur efficacité et quels risques ils présentent pour les reins. Ces tests seront d’abord réalisés chez le rat après une seule dose de chaque forme de lithium administrée par voie orale. Par la suite, les mêmes analyses seront faites après 14 jours d’administration continue. L’objectif final est de mieux comprendre pourquoi certaines personnes répondent mieux que d’autres au lithium, et d’identifier des formes de lithium plus efficaces et mieux tolérées.
Bénéfices attendus
Cette étude constituera une première étape pour vérifier, avant les essais chez l’Homme, si l’orotate de lithium permet au lithium de mieux atteindre le cerveau et d’être plus efficace. Si ces résultats se confirment, cela pourrait, à long terme, permettre d’utiliser des doses plus faibles de lithium. Des doses réduites seraient potentiellement mieux tolérées et pourraient diminuer les effets secondaires, améliorant ainsi le confort et la sécurité des patients sous traitement.
Procédures
L’ensemble des animaux subiront entre 1 et 14 gavages (durée < 30 secondes). L’anesthésie et l’analgésie seront réalisées par injection intrapéritonéale et sous-cutanée respectivement (moins d’une minute chacune 1 à 2 fois maximum). Certains animaux subiront un isolement 4 fois 24 h. Une partie des animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie liquide profonde (15 mins). Une autre partie des animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie liquide (20 mins) + port d’un cathéter (72h) + prélèvements de sang sur animaux vigiles (9 prélèvements ; 30 secondes/ prélèvement sur 24h). Une autre partie des animaux sera soumise à une série de 2 tests comportementaux, répartis sur 2 jours successifs. Les tests incluent l’évaluation de l’activité locomotrice (1h30), de l’exploration et de l’anxiété (5 min) (2 jours consécutifs de tests réalisés 3 fois).
Impact sur les animaux
Stress de courte durée lors des injections, gavage et prélèvements sanguins. Stress induit par l’hébergement individuel du rat pendant 24 heures. Isolement du rat dans un cylindre de plexiglas pendant 8h pour réaliser les prélèvements sanguins.
Devenir
Les rats seront mis à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem ou suite à l'atteinte d'un point limite requérant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Des premières expériences réalisées en laboratoire, sur des cellules, ont montré que les différentes formes de lithium n’entrent pas dans les cellules à la même vitesse ni de la même manière. Pour vérifier ces observations, il est essentiel de réaliser des tests chez l’animal. Cela permettra de mieux comprendre comment le lithium circule dans l’organisme après avoir été ingéré, et de voir si ces différences ont un impact réel sur le comportement, la distribution dans l'organisme et l’apparition éventuelle d’effets secondaires, notamment au niveau des reins.
Réduction
Les effectifs ont été determinés comme nécessitant 6 à 10 rats par groupe à l’aide de tests statistiques permettant une analyse des résultats obtenus adaptée. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, les procédures seront réalisées de manière séquentielle. Ainsi, l’étude pharmacocinétique ainsi que l’étude comportementale n’auront lieu que si une différence d’exposition significative au niveau sanguin et/ou cérébrale est observée entre les différents sels de lithium.
Raffinement
L’ensemble des procédures sont réalisés par un personnel compétent. Pour améliorer leur bien-être, les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages contenant de l’enrichissement. La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période périopératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Par ailleurs, lors de la mise en cage métabolique pour 24h des rats, des tunnels en polycarbonate et/ou des batons à ronger seront ajoutés à ces cages pour enrichissement en vue de réduire le stress induit par l’isolement.
Choix des espèces
Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est le modèle de choix dans le domaine de la toxicité rénale, notamment du fait de sa physiologie qui est très proche de la physiologie humaine. De plus, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera les études pharmacocinétiques. Des rats âgés de 7 à 9 semaines seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec les expériences déjà faites au sein du laboratoire et les articles publiés dans la littérature, puisqu’il s’agit de la période à laquelle est le plus souvent diagnostiquée le trouble bipolaire et donc initiés les traitements.
Développement de nouveaux traitements pour prévenir un cancer du sang (leucémie myéloïde aiguë) MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
La mise à mort intervient dès l'apparition d'une paralysie des pattes arrière ou d'une chute des plaquettes. 652 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Greffées de cellules leucémiques par la veine de la queue, elles subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires dans la joue et reçoivent jusqu'à deux administrations quotidiennes de médicaments par gavage, par la veine ou dans le ventre, tous ces gestes étant faits sans anesthésie pendant quatre à douze semaines. Le porteur annonce que la greffe fera développer aux souris une perte de poids et une paralysie des membres postérieurs, tout en écrivant que les traitements ne causent pas de problèmes importants.
Objectifs
Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de divers médicaments déjà existants, administrés seuls ou en combinaison, sur des souris atteintes de leucémie myéloïde aiguë, un type de cancer du sang, afin d’explorer de nouvelles associations thérapeutiques. L'objectif est de voir comment ces traitements peuvent aider à combattre la maladie chez ces modèles de souris, ce qui pourrait éventuellement nous aider à mieux comprendre leur impact sur les patients humains.
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles souris pour étudier et tenter de guérir la leucémie myéloïde aiguë (LMA), un type de cancer du sang, afin de tester des traitements, offre plusieurs avantages. Elle permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie, d'évaluer l'efficacité des traitements, d'optimiser les doses et les schémas thérapeutiques, d'étudier les résistances aux traitements et de réduire les risques pour les patients. Ces modèles de souris constituent une étape cruciale pour sélectionner et affiner les stratégies thérapeutiques avant leur mise en application clinique, ce qui contribue à accélérer le développement de traitements plus efficaces contre la leucémie myéloïde aiguë.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules malades dans la veine de la queue (sans anesthésie; durée: 1 min), suivie de prélèvements sanguins hebdomadaires pendant 4 semaines pour certaines et 12 semaines pour d’autres (prélèvement dans la veine de la joue; durée: 1 min sans anesthésie). Elles seront ensuite traitées avec cinq médicaments différents, administrés une ou deux fois par jour (tous les deux jours pendant 4 ou 12 semaines selon le médicament), selon le protocole (chaque groupe de souris recevra un médicament parmi ces cinq et parfois une combinaison de deux médicaments). Les traitements seront délivrés dans la veine de la queue (sans anesthésie, durée: 1 min), par gavage (à l'aide du sonde métallique de taille adaptée à la souris, sans anesthésie; durée: 1 min) ou par injection dans le ventre (sans anesthésie; durée: 30 secondes). À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées, et leurs organes seront prélevés pour des analyses approfondies.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des souris sont greffées avec des cellules leucémiques, ce qui leur fera développer des symptômes comme la perte de poids et la paralysie des pattes arrières quelques semaines ( 4 semaines pour les souris non traitées et jusqu’à 12 semaines si avec traitements) après la greffe. Les traitements ne causent pas de problèmes importants, mais les méthodes d'administration, comme les injections ou le gavage, peuvent provoquer de légers effets secondaires, comme des blessures légères au site d'injection ou des saignements. Les souris peuvent aussi ressentir un inconfort temporaire lors des injections ou des prélèvements sanguins.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées dès l’apparition des signes de la paralysie des membres inférieurs ou si elles présentent une quantité faible de plaquettes pour éviter leur souffrance. L’euthanasie des animaux en fin d’expérience est nécessaire afin de récupérer leurs organes en post-mortem pour effectuer des analyses.
Remplacement
Pour réaliser notre projet, l’utilisation d’animaux vivants est nécessaire, car c’est uniquement dans un organisme vivant que l’on peut observer les interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et les autres éléments du corps. Ces interactions sont cruciales pour tester de façon précise l’efficacité des traitements, en tenant compte de leur distribution dans l’organisme, de leurs effets secondaires et de l’évolution de la maladie au fil du temps.
Réduction
Pour déterminer combien de souris sont nécessaires dans chaque groupe de l’étude, nous avons utilisé un test statistique, qui est une méthode mathématique permettant de vérifier si les différences observées entre les traitements sont significatives. Dans cette étude, certains groupes de souris ne recevront pas de traitement, ce sont les groupes témoins. Ces groupes sont composés des mêmes souris (même fond génétique) que celles des groupes expérimentaux, ce qui permet de les comparer plus facilement. En testant plusieurs traitements en même temps, on peut utiliser un seul groupe témoin pour plusieurs expériences, ce qui permet de réduire le nombre de souris. Les expériences seront menées de manière très similaire pour réduire les différences entre les groupes et ainsi obtenir des résultats fiables.
Raffinement
En plus de la surveillance quotidienne, qui permettra de détecter rapidement toute anomalie liée au geste technique de la greffe, un suivi clinique hebdomadaire sera réalisé. Pour cela, l'analyse sanguine permettra aussi de vérifier le taux de plaquettes, une baisse progressive étant associée avec l'apparition la maladie. En dessous d'une certaine valeur, de la nourriture sera ajoutée dans la cage et lorsque cette faible valeur est associée à d'autres signes cliniques (affaiblissement avec paralysie des pattes arrières), la souris sera immédiatement euthanasiée. L'évaluation clinique prendra également en compte le comportement des souris et leur poids. L'ensemble des paramètres permettra de mettre en place rapidement des actions adaptées. Un enrichissement des cages sera également fait (buchette en bois à ronger, papier pour faire un nid/cachette).
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 6 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Etudes des interactions entre les cellules nerveuses mutantes et le système immunitaire à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
4 195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, certaines passant jusqu'à trente-sept jours seules en cage après une chirurgie et trois sessions de cinq jours consécutifs d'enregistrement cérébral en continu. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 471 d'entre elles, modéré pour 3 624 et sévère pour 100. Des femelles gestantes sont opérées quarante-cinq minutes pour qu'une injection soit faite dans le cerveau de chacun de leurs embryons, au risque d'un arrêt prématuré de la gestation, et les souris porteuses de la mutation développent des crises d'épilepsie dès l'âge de vingt jours. Le porteur attend de ce travail des cibles d'immunothérapie contre les gliomes, hypothèse formulée au conditionnel, quand l'implant crânien, l'isolement social et les crises convulsives sont, eux, programmés.
Objectifs
Les gliomes sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives. Les traitements actuels n’ont qu’un effet limité sur la survie des patients, et ces tumeurs sont souvent résistantes aux traitements, ce qui les rend rapidement mortelles. Il est donc urgent de trouver de nouvelles solutions pour les traiter. On retrouve peu de cellules immunitaires dans les gliomes, car les cellules tumorales et certaines cellules immunitaires créent un environnement qui empêche le système immunitaire de combattre la tumeur efficacement. Dans le cerveau, il existe des cellules spécialisées appelées microglies, qui jouent un rôle important dans le maintien de la santé du tissu cérébral. Cependant, leur rôle dans les gliomes n’est pas encore bien compris. Étudier comment les cellules tumorales et la microglie interagissent pourrait nous aider à trouver des moyens de stimuler le système immunitaire pour mieux lutter contre ces tumeurs. Nous étudions des gliomes avec une mutation particulière qui provoque de l’épilepsie et qui, contrairement aux autres gliomes, présente une forte présence de cellules immunitaires appelées lymphocytes. Dans ces tumeurs, les microglies sont également modifiées. Nous pensons que la communication entre les cellules tumorales et la microglie favorise le recrutement des lymphocytes, qui pourraient aider à combattre la tumeur. Précédemment, un modèle a été développé chez la souris pour étudier cette mutation et a montré qu’elle est nécessaire au développement des tumeurs et est responsable de l’épilepsie liée à ces tumeurs. Ce projet a pour but d’étudier l’effet des cellules mutées sur les cellules immunitaires (microglie) du cerveau en développement chez la souris. L’objectif est de suivre l’évolution de ces microglies au fil du temps et de comprendre comment elles interagissent avec les cellules mutées. Nous utiliserons des enregistrements de l’activité électrique du cerveau pour observer l’apparition de l’épilepsie liée à cette mutation et l’impact des changements dans les microglies.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre comment une mutation génétique spécifique affecte la microglie, modifie la communication entre la microglie et les cellules tumorales et comment elle influence la réponse immunitaire. Cela pourrait également permettre d’identifier comment ces changements dans la microglie pourraient être liés à l’épilepsie qui accompagne ces tumeurs. Nous analyserons également les profils génétiques des microglies afin de pouvoir les comparer avec ceux des patients atteints de gliomes avec cette même mutation d’intérêt. Cela nous aidera à comprendre comment ces changements se produisent au fil du temps et à identifier les mécanismes responsables de la modification des microglies et du recrutement des cellules immunitaires, appelées lymphocytes. Le projet fournira des informations cruciales sur l'évolution des réponses immunitaires et des cellules cérébrales dans le cadre de cette mutation génétique d’intérêt. Il permettra aussi de créer une base de données génétiques pour mieux comprendre l’infiltration des cellules immunitaires et aidera à concevoir des tests et des traitements pour l’avenir. En outre, les résultats offriront un aperçu du rôle des modifications du système immunitaire cérébral dans l’apparition de l’épilepsie liée à cette mutation. Ce projet pourrait aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour générer de nouveaux traitements d’immunothérapie et pourrait donc amener à améliorer les soins pour les patients atteints de gliomes.
Procédures
Pour obtenir nos animaux génétiquement modifiés d’intérêt, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur une partie des souriceaux produits pour connaitre leur patrimoine génétique. Cet acte se fera une seule fois sur animal vigile et durera moins de 1 minute par animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (45minutes maximum) et analgésie adaptée afin de réaliser une injection intracérébrale dans le cerveau de chaque embryon. Une partie de ces femelles recevra 3 semaines après une injection quotidienne pendant 5 jours d’une molécule permettant de mettre en place notre modèle (vigile, durée inférieure à 1 minute par injection). Pour une autre partie des souris, une chirurgie sous anesthésie générale (1h maximum) et analgésie adaptée sera pratiquée afin de mettre un implant au niveau de leur tête permettant ensuite d’enregistrer l’activité électrique du cerveau. Cette activité sera enregistrée pendant 3 sessions de 5 jours consécutifs (24 heures sur 24), espacées de 5 jours minimum, sur les animaux vigiles via une connexion indolore et leur permettant de se déplacer librement. Tous les animaux ayant eu une chirurgie seront hébergés seuls au maximum 37 jours. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin des procédures.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux peut générer une légère et brève douleur et un léger stress chez l’animal. Il existe un risque de léger saignement. Les chirurgies génèreront un risque de douleurs post-opératoires. L’anesthésie générale nécessaire à leur réalisation entrainera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire, et de difficultés cardio-respiratoires. La chirurgie sur les femelles gestantes impliquera également un risque d’arrêt prématuré de la gestation. Le dispositif implanté sur la tête des animaux pour enregistrer l’activité du cerveau impliquera une gêne pour l’animal. Tous les animaux qui auront eu une chirurgie seront ensuite hébergés individuellement, s’agissant d’animaux sociaux cela génèrera un stress. Les injections de la molécule permettant de mettre en place notre modèle génèreront un stress lié à la contention et une légère et brève douleur au point d’injection. Cette molécule peut parfois provoquer une perte de poids chez la souris. La mutation génétique de l’animal (modèle de la maladie étudiée) peut, après activation, générer des crises épileptiques à partir de l’âge de 20 jours.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés soit pour réaliser des prélèvements pour répondre à notre question scientifique soit parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
L’impact de la mutation d’intérêt sera étudié dans des cellules tumorales issues de patients et dans des modèles d’organoïdes créés à partir de cellules souches. Ces modèles nous permettront d'étudier l’interaction entre les cellules mutées et la microglie dans un environnement en trois dimensions qui ressemble davantage à celui du cerveau humain. Cependant, bien que ces modèles soient utiles pour étudier les mécanismes d’action de la mutation, ils ne peuvent pas reproduire toute la complexité du microenvironnement immunitaire du cerveau. De plus, ils ne permettent pas d’observer l’évolution temporelle, en particulier pendant le développement embryonnaire. C’est pourquoi il sera nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier l’impact des cellules mutées sur la microglie dans un cerveau en développement. Ce modèle permettra d’observer les interactions complexes entre différents types de cellules sur une période de temps et dans un espace précis, ce qui n’est pas possible dans des cultures de cellules en laboratoire. De plus, pour étudier comment une mutation affecte le développement cérébral et la survenue de pathologies, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal, qui reflètera la complexité du cerveau en développement et des maladies qui y sont associées. Bien que les organoïdes soient proches du cerveau en termes de structure, ils ne permettent pas d’étudier comment la microglie se développe et interagit avec les autres cellules du cortex cérébral. Nos analyses exigent l’utilisation de modèles animaux, et dans le cadre de ce projet de souris génétiquement modifiées, car elles permettent d’étudier l’évolution des cellules mutées et leur impact sur la microglie dans un environnement en développement, ce qui ne peut pas être fait en laboratoire. Enfin, pour comprendre comment les changements du système immunitaire du cerveau influencent l’apparition de l’épilepsie, il est essentiel de mener cette étude dans un modèle vivant, donc chez la souris.
Réduction
Le nombre total d’animaux maximum utilisés dans ce projet sera de 4195. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte les lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à l'étude et en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée et optimiserons nos choix de croisement afin d’obtenir un maximum d’animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt, diminuant ainsi le nombre d’animaux produits et le nombre impacté par le prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique. Toutes les données obtenues seront analysées avec des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils seront observés quotidiennement et en cas d’anomalie un processus déclaratif à la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et au vétérinaire sera mis en place afin qu’ils apportent conseils et recommandations à l’équipe de recherche pour une prise en charge adaptée de l’animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Il sera de la plus petite taille possible et sera réalisé à l’aide de matériel propre et désinfecté entre chaque animal. Les animaux sont replacés rapidement avec leur mère après le geste afin de leur redonner un environnement réconfortant. Nous vérifierons l’absence de saignement et la bonne prise en charge par la mère immédiatement après le geste puis après environ 30 minutes. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique adaptée. Elles seront réalisées le matin afin de pouvoir observer les animaux sur la journée et administrer les médicaments nécessaires. La température des animaux sera maintenue tout au long de l’anesthésie (chambre d’induction et de réveil chauffées et tapis chauffant pendant la chirurgie). Le maintien de l’hydratation sera assuré également et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux pour éviter toute sécheresse oculaire. Nous surveillerons le réveil des animaux et leur mettrons à disposition de l’eau sous forme gélifiée ainsi que de la nourriture dans le fond de la cage afin de favoriser leur récupération. Nous ajouterons également une maisonnette en carton en plus du nid en coton et du bâtonnet de bois mis en routine dans les cages afin d’améliorer leur bien-être, notamment pour les femelles gestantes et les animaux hébergés seuls. Après les chirurgies les animaux bénéficieront d’un suivi renforcé, ils seront ensuite examinés de manière spécifique une fois par jour minimum pendant deux jours minimum, et plus si nécessaire. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Le modèle murin nous permet un travail sur le génome car il est bien connu et nous possédons des outils moléculaires bien développés pour travailler sur le génome de cette espèce et le modifier. Ainsi, les lignées génétiquement modifiées d’intérêt pour ce projet n’existent que chez la souris. Enfin, les lignées choisies sont nécessaires pour l'étude des tumeurs malignes humaines et reproduisent de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux sera réalisé sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Nous génèrerons des modifications génétiques sur des embryons de 14,5 jours embryonnaires lors d’une chirurgie impliquant donc une femelle gestante. Cette femelle sera âgée d’au moins 7 semaines afin d’être mature sexuellement. Sachant que le but de ce projet est de suivre le développement du système immunitaire cérébral de ces embryons, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : stade embryonnaire tardif (18,5 jours embryonnaires), à une semaine post natale (phase de croissance, maturation en cours) puis aux stades de 21 et 60 jours, lorsque le cerveau devient mature. L’implantation du dispositif pour l’enregistrement de l’activité du cerveau a lieu sur un animal sevré de plus de 23 jours, période qui correspond à l’apparition des crises épileptiques dans ce modèle et permet de faciliter la prise en charge péri-opératoire ainsi que leur hébergement individuel suite à la chirurgie.
Comprendre les bases structurales, moléculaires et cellulaires du processus réplicatif et neuro-invasif de l’alpha synucléine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie stéréotaxique injecte dans le cerveau de chaque souris des fibrilles d'alpha-synucléine, la protéine qui s'agrège dans l'atrophie multisystématisée. 1 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère. Le porteur décrit pourtant des produits dont l'impact sur le comportement serait "très limité" et la symptomatologie "très réduite", les effets attendus étant présentés comme moléculaires et ne concernant que peu de neurones. Après l'opération, les animaux sont maintenus en vie pour laisser la maladie progresser, parfois vingt-quatre mois, avant d'être tués par vagues successives pour le prélèvement de leur cerveau.
Objectifs
L’atrophie multisystématisée (AMS) est une maladie rare et grave du cerveau. Elle apparaît généralement chez des personnes âgées de 50 à 60 ans et entraîne rapidement une détérioration de la santé, avec un décès souvent en moins de 10 ans. Malheureusement, on ne connaît pas encore son origine et il n’existe pas de traitement curatif aujourd’hui. Dans l’AMS, une protéine appelée alpha-synucléine s’accumule anormalement dans le cerveau. Au début, ces dépôts se forment dans les neurones. Plus tard, ils s’accumulent surtout dans des cellules de soutien du cerveau, qui normalement n’ont pas d’alpha-synucléine. Ces dépôts sont spécifiques à l’AMS et sont liés à la destruction progressive des neurones. Une forme particulière d’alpha-synucléine, appelée fibrille 1B a été synthétisée. Cette forme reproduit très fidèlement les anomalies observées dans le cerveau des patients. Quand ces fibrilles 1B sont injectées à des souris, elles déclenchent les mêmes dépôts d’alpha-synucléine que dans l’AMS, et ce dans les neurones et les cellules de soutien. Dans notre étude, nous cherchons à comprendre d’une part comment les neurones prennent en charge cette protéine anormale. Pourquoi et comment elle change de forme pour devenir toxique. De plus, nous espérons comprendre comment elle se propage d’un neurone à l’autre et finit par atteindre les cellules de soutien. L’objectif final est de mieux comprendre l’AMS pour, à terme, ouvrir la voie à de futurs traitements.
Bénéfices attendus
Les résultats de nos études apporteront probablement un éclairage moléculaire sur les mécanismes pathologiques de la MSA, pouvant expliquer la propagation des fibrilles et la destruction des fonctions cellulaires. Ces résultats pourraient être transférables à d’autres pathologies semblables, telles que la maladie de Parkinson et la démence à corps de Lewy.
Procédures
Les animaux subiront des injections cérébrales par chirurgie stéréotaxique. Une chirurgie sera réalisée par animal. L'intervention dure 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables peuvent être causées par les chirurgies réalisées sur les animaux. Ces nuisances peuvent être l'hypothermie (pendant la chirurgie, l'animal est profondément endormi, ce qui réduit son métabolisme). On pourrait observer des douleurs locales du fait des injections de médicaments, et aussi un stress du fait des manipulations. Néanmoins, les produits injectés ont un impact très limité sur le comportement (moteur par exemple) et ont une symptomatologie très réduite, car les effets attendus sont moléculaires, concernent peu de neurones et sont liés à la mécanistique de la pathologie. De plus, les injections de médicaments sont réduites (l'anesthésie est faite au gaz isoflurane), la chirurgie est faite sur tapis chauffant, l'animal est mis au réveil dans une cage chauffée.
Devenir
Après les chirurgies, les animaux sont maintenus en vie afin de laisser progresser la maladie moléculairement. Ensuite, à différents stades, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus (essentiellement le cerveau), dans le but de réaliser différentes analyses.
Remplacement
Nous souhaitons étudier et caractériser des modèles mimant la pathologie chez l’humain nécessitant ainsi l’utilisation de modèles animaux. L'intérêt du projet est d'étudier et d'évaluer la circulation de fibrilles au sein du cerveau, afin de déterminer comment se propage la pathologie chez l'humain. Ainsi, bien que les modèles de culture cellulaire soient des outils très performants ils ne permettent pas de mimer l'organe, (ici le cerveau) dans sa totalité avec tous les échanges qui s'y opèrent. Ainsi, les animaux sont requis afin de mener à bien le projet.
Réduction
La souris a été choisie car nos études antérieures ont montré une bonne stabilité et reproductivité, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux pour réaliser ces études. De plus, le statut sanitaire des animaux étant maîtrisé, la stabilité du modèle est éprouvée. Le nombre d’individu sera ajusté au minimum afin d’obtenir une réponse statistique robuste. Le maximum de tissu sera récupéré par animal afin de servir aux différents projets de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en collectivité afin de réduire le stress et répondre au besoin de sociabilisation de l’espèce. Chaque procédure chirurgicale sera précédée de médication (anesthésique et analgésique). Un suivi post opératoire de plusieurs jours sera effectué afin d’évaluer le rétablissement post chirurgical et s’assurer de l’absence de douleur. Si présence de douleur, un antalgique sera administré. Si l’animal ne présente pas de signe d’améliorations dans les deux jours suivant la procédure chirurgicale, une mise à mort sera effectuée. De plus, des points limites ont été mises en place et seront vérifiés tout au long de la vie de l'animal. Dès lors que ces points limites sont atteints, l'animal est euthanasié.
Choix des espèces
Nous avons besoin des animaux afin d'obtenir du matériel biologique, base de nos études. Les stratégies utilisant des modèles synthétiques ne répondent pas à des exigences d'études de mécanismes cellulaires et pathologiques. Seule une approche in vivo permet la modélisation de la progression de la maladie et l’étude des interactions entre les acteurs moléculaires clés qui interviennent dans les mécanismes physiopathologiques. C'est pourquoi, les expériences débuteront sur des animaux adultes (âgés d’au moins 8 semaines), qui seront étudiés ensuite jusqu'au stade "animal âgé" (3 semaines, 6 semaines, 6 mois, 8 mois, 12 mois, 18 mois et 24 mois après les injections). Cela nous permettra de mimer la progression cellulaire de la pathologie qui s’exprime à l’âge adulte chez l’humain.
Caractérisation de l’acclimatement à l’oxygène hyperbare chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour savoir si les nageurs de combat de l'armée française peuvent s'acclimater à l'oxygène pur sous pression, 82 rats mâles sont enfermés dans un caisson hyperbare, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Tous sont tués à l'issue, pour le prélèvement de sang et de tissus. Après des séances d'acclimatement de trente à cent dix minutes, ils subissent une plongée simulée en oxygène pur jusqu'à quatre, cinq ou six atmosphères, pression à laquelle se déclenchent des convulsions comparables à celles d'une crise d'épilepsie. Le porteur qualifie ces crises d'indolores en s'appuyant sur l'expérience humaine, et indique que le protocole en limite la durée en décomprimant les animaux dès les premiers symptômes.
Objectifs
Dans le cadre de ses opérations, l’armée française demande à ses nageurs de combat d’effectuer des plongées à l’oxygène pur, or ce gaz lorsque respiré à une pression supérieure à 1.7 atmosphère peut provoquer des crises hyperoxiques susceptibles de compromettre la mission et faisant courir un risque de noyade au plongeur. Les effets neurologiques de l’oxygène hyperbare sont connus depuis la fin du XIX siècle et les travaux de Paul Bert ; ils se traduisent par l’apparition de convulsions similaires à celles observées lors de crises épileptiques. Ces crises, indolores, se résolvent rapidement si la pression d’oxygène est réduite. Elles ont été caractérisées chez l’homme et l’animal (sans que le mécanisme en soit clairement identifié) mais la question de l’acclimatement à de fortes pression d’oxygène reste non étudiée. L‘hypothèse d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare a été suggérée dans quelques articles scientifiques sans qu’aucune étude n’ait encore permis de le confirmer. Si elle s’avérait fondée, elle pourrait constituer une avancée pour améliorer la sécurité des nageurs de combat. La présente étude a pour objectif de déterminer, chez le rat, : 1- si un acclimatement à l’oxygène hyperbare est possible et 2- d’étudier les mécanismes physiologiques à l’origine des crises hyperoxiques.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de vérifier l’existence d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la crise hyperoxique. Ces travaux pourront être bénéfiques pour les forces armées françaises dans le cadre opérationnel de la plongée à l’oxygène pur. Il aura aussi un intérêt en santé humaine dans le cadre de l’oxygénothérapie hyperbare utilisée en clinique humaine. L’oxygénothérapie hyperbare consiste à faire respirer de l’oxygène pur à un patient placé dans une chambre où la pression est supérieure à celle atmosphérique normale (généralement entre 2 et 3 atmosphères). Dans ces conditions il existe un risque de déclenchement de crise hyperoxique chez le patient, or l’oxygénothérapie hyperbare est indiquée dans de nombreuses pathologies. Une meilleure compréhension du déclenchement de la crise hyperoxique permettrait une meilleure prise en charge de ces patients.
Procédures
Les rats seront manipulés une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Dans la seconde partie du projet, les animaux seront acclimatés à l’oxygène en étant placés dans le caisson hyperbare pour des durées de 30 à 110 minutes à des pressions partielles d’oxygène comprises entre 0.21 (Pression d’oxygène dans l’air ambiant) et 3.5 atmosphères selon les groupes expérimentaux. Trois groupes de rats seront soumis à une plongée simulée en oxygène pur jusqu’à des pressions de 4, 5 ou 6 atmosphères (selon les groupes). A 14 semaines, tous les animaux seront exposés à une plongée simulée en caisson hyperbare en oxygène pur après 30 min d’acclimatement au caisson.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 1-2 min/pesée). (2) : le stress lié à la réalisation des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 1-2 minutes, réalisé 1 fois sur l’ensemble du projet à l’âge de 12 semaines) (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée simulée (acte de gravité légère, d’une durée totale maximale de 2h30 correspondant au temps de l’exposition hyperbare) (4) : La désorientation induite par l’apparition de la crise hyperoxique (cette nuisance sera sévère mais brève, moins de 10 minutes, et l’expérience humaine nous apprend que les crises sont indolores et n’induisent pas de lésion neurologique après une seule crise).
Devenir
Les 82 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Notre travail cherche à déterminer s’il existe une possibilité d’acclimatement à la crise hyperoxique hyperbare. Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité à la crise hyperoxique
Réduction
Dans un premier temps, l'objectif est de déterminer le couple pression - durée qui sera utilisé par la suite, le nombre d’animaux par groupe a été réduit à 6 animaux par groupe. Ensuite, les comparaisons de sensibilité des animaux (acclimatés ou non acclimatés à l’oxygène) seront effectuées en utilisant des tests statistiques adaptés. Les effectifs nécessaires pour obtenir une puissance statistique suffisante ont été calculés ; 16 animaux par groupe sont nécessaires pour mettre en évidence une différence de résistance de 50 % à la crise hyperoxique (il faudrait 61 animaux pour mettre en évidence une différence de 30 %).
Raffinement
Tout au long des procédures le remplissage quotidien d’une grille de score et l’identification de points limites prédictifs et spécifiques au projet permettront de satisfaire au bien-être de l’animal. Avant de démarrer le protocole d’exposition hyperbare, les animaux seront maintenus pendant 30 minutes dans le caisson hyperbare afin de les habituer à l’environnement et de réduire le stress. Le protocole utilisé limite au maximum la durée des crises hyperoxiques en décomprimant les animaux dès l’apparition des premiers symptômes.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des effets de l’oxygène hyperbare. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données nous permettant de cibler les pressions et temps d’exposition et ainsi de réduire le nombre de groupes utilisés. Nous possédons en outre des données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ces résultats. Le contexte de cette étude est le maintien opérationnel des nageurs de combat en condition de plongée à l’oxygène pur. Les plongeurs concernés sont de jeunes adultes. Nous souhaitons donc utiliser des animaux mâles au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.
Réalisation d’une preuve de concept sur la résorption et la tolérance d’un renfort de suture à base d’alginate sur des exérèses partielles d’organes tel que le poumon, l’estomac, le foie et la rate chez le modèle porcin (EU 2/3)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Vingt-cinq minutes de saignement provoqué et mesuré, sur une chirurgie d'une heure trente : 44 porcs subissent l'ablation d'un morceau de poumon, d'estomac, de foie ou de rate de huit centimètres sur trois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Tous sont mis à mort, soit à l'atteinte d'un point limite, soit au terme des six, sept mois et demi ou neuf mois d'observation, pour que l'organe opéré soit prélevé et analysé. Le travail vise le marquage CE d'un renfort de suture à base d'alginate, présenté comme fabriqué en France face à des dispositifs concurrents produits aux États-Unis et au Japon. Le porteur retient le porc parce que la réglementation impose de tester le format le plus grand du dispositif et que seuls le porc et le mouton ont des organes de taille suffisante, en précisant que des porcs en croissance, et non des minipigs, permettent d'observer la résorption sur la durée.
Objectifs
Le pansement idéal n'existe pas, mais il doit avoir certaines caractéristiques importantes : 1/Garder la plaie humide et chaude, 2/Être changé selon les étapes de la cicatrisation, 3/Laisser passer l'air mais pas les bactéries, 4/Absorber l'excès de liquide de la plaie, 5/Ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller rapidement, 6/Être facile à appliquer et confortable, 7/Ne pas être toxique et être hypoallergénique, 8/Protéger des chocs, 9/Être transparent pour voir la plaie sans retirer le pansement, 10/Être le moins cher possible et réduire le temps de traitement. Les pansements à base d'alginate de calcium répondent à ces critères, mais ils sont principalement utilisés pour les plaies cutanées et très peu pour les organes internes lors de chirurgies. Pour contrôler les saignements, les chirurgiens utilisent différentes techniques. Si ces techniques ne suffisent pas, surtout en cas de saignements continus et étendus, ils utilisent des produits hémostatiques résorbables. Ces produits sont synthétiques et mettent du temps à se résorber. Nous voulons tester un produit naturel qui devrait se résorber plus rapidement. Enrichi en calcium, zinc et magnésium, il favorise la coagulation. Ce produit est un renfort de suture utilisé avec un système d'agrafage et sera suivi par imagerie scanner à différents moments. L'objectif est de vérifier son efficacité pour arrêter les saignements, suivre sa résorption et son impact sur les tissus. La preuve de concept de ce nouveau dispositif médical hémostatique pourrait mener à un nouveau produit pour gérer les saignements lors de sutures par agrafage en chirurgie. De plus, ce produit serait fabriqué en France, contrairement aux autres dispositifs fabriqués aux États-Unis et au Japon. La biocompatibilité de ce dispositif a été testée en laboratoire. Il y aura 4 groupes de 11 porcs opérés. Chaque groupe sera divisé en 3 sous-groupes de 3 porcs, correspondant à des périodes de suivi post-opératoire de 6, 7,5 et 9 mois. Deux porcs supplémentaires par groupe sont prévus en cas de décès pendant la chirurgie ou à cause d'une mise à mort liée à un point limite. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs (EU) : 1 pour la chirurgie, 1 pour l'hébergement post opératoire longue durée et 1 pour l'imagerie.
Bénéfices attendus
Le projet vise à vérifier l'efficacité d'un nouveau pansement naturel pour arrêter les saignements lors de chirurgies. Ce pansement sera utilisé avec des agrafes pour renforcer les sutures après l'ablation partielle d'un organe. Nous voulons aussi observer comment le pansement se dissout et s'intègre dans le corps au fil du temps. L'objectif est de développer un pansement hémostatique naturel, fabriqué en France, pour remplacer les produits synthétiques actuels.
Procédures
EU 1 : Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour permettre l’accès à l’organe d’intérêt tout en préservant les autres organes dans les cavités respectives. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie et analgésie appropriées. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès à l’organe, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutané). L’animal n’aura qu’une seule intervention chirurgicale. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le retrait des points prendra quelques minutes (5 minutes) et se fera 15 jours minimum post-chirurgie. EU 3 : A différents temps post-opératoires, l’animal aura une imagerie pour évaluer le taux de résorption : transport, anesthésie et acquisition environ 2 h à chaque temps. EU 2 : Pour l’hébergement à long terme, les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés régulièrement. Cet acte ne dure que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Pour les chirurgies thoraciques, il est important de maintenir le vide pleural, qui permet au poumon de se gonfler et de se dégonfler correctement. Si ce vide est rompu, le poumon ne peut plus fonctionner correctement, ce qui peut entraîner une détresse respiratoire. Pour éviter cela, l'incision sera refermée hermétiquement et l'excès d'air sera aspiré de la cage thoracique pendant que le poumon est progressivement remis sous ventilation. La chirurgie sera réalisée sur le lobe accessoire droit du poumon, et la résection d'une partie de 8 cm de long sur 3 cm de large n'affectera pas la fonction respiratoire. Pour les chirurgies abdominales, comme celles impliquant l'estomac, le foie et la rate, l'incision des muscles peut causer une douleur importante. De plus, une ablation partielle d'un organe digestif peut perturber le transit intestinal. La résection des organes aura une taille de 8 cm de long sur 3 cm de large, mais cela n'affectera pas leur fonctionnalité. Des analyses biochimiques seront effectuées pour détecter toute perturbation à moyen ou long terme. C'est pourquoi un groupe d'animaux sera dédié à chaque type d'organe d'intérêt. Les procédures peuvent être douloureuses pour les animaux en post-opératoire, et des analgésiques seront administrés en fonction de leur état clinique. Après trois semaines, les animaux aptes au transport seront transférés dans une autre structure (EU 2) pour un hébergement de longue durée. À différents moments post-opératoires, les animaux seront transférés vers un centre d'imagerie pour passer des scanners (EU 3). Le transport et les différentes manipulations peuvent générer du stress pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort soit parce qu’ils auront atteint un point limite soit qu’ils ont atteint le temps d’observation (J+6 mois, J+7,5 mois, J+9 mois). Une étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée donc cela nécessite le prélèvement de l’organe et donc la mise à mort au prélable de l'animal.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu réséqué et de suivre sa résorption à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements lors de résection d’organe en cours de chirurgie. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.
Réduction
Nous utiliserons 44 animaux : 4 groupes de 11 animaux (9 animaux opérés et 2 animaux supplémentaires). Les animaux supplémentaires par groupe sont prévus pour compléter un groupe si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Étant donné que c’est une preuve de concept, nous n’avons pas besoin de plus 3 animaux par lot pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et nécessite une intervention chirurgicale pour l’arrêter, nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé et raffiné la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux mise à mort, issus de procédures antérieures.
Raffinement
La chirurgie ouverte a été retenue, avec un abord le long des côtes au niveau du 9ème espace intercostal. L’extrémité du lobe pulmonaire accessoire droit extériorisée permettra la mise en place de part et d’autre, des mors du système d’agrafage équipés du renfort. Cette résection volontairement limitée, n’empêchera pas le poumon de fonctionner correctement et n'impactera pas significativement la respiration de l'animal au réveil. Pour l’abord abdominal, choix d’une incision en suivant le bord sous costal d’une petite longueur à droite ou gauche suivant l’organe d’intérêt (estomac, foie ou rate) pour n’avoir à sortir à l’aide d’une pince atraumatique que l’extrémité de l’organe d’intérêt. Réduction taille incision : garder au maximum les autres organes dans la cavité et donc empêcher la perte de chaleur corporelle et le dessèchement des organes. Chirurgie : intubation puis ventilation avec un anesthésique gazeux, sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. Veille de chirurgie : injection analgésique d'action longue pour anticiper la sensation de la douleur. Jour chirurgie : anesthésie avec un hypnotique couplé à un analgésique. La plaie sera protégée à l’aide d’un pansement. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil complet. L’animal couvert sera remis dans l’enclos et recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit. Maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours selon les besoins de l'animal. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans l’enclos des légumes frais pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. L’état général de l’animal et de la cicatrice seront suivis quotidiennement pendant 1 semaine, puis toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Les animaux seront hébergés collectivement. Pour le suivi post-opératoire, l’animal sera seul dans un délai de 3 à 4 jours en gardant un contact visuel et/ou olfactif avec d’autres congénères et aura de l'enrichissement compensatoire. Suivi quotidien des animaux pour détecter rapidement toute anomalie qui sera rapportée au vétérinaire pour déterminer la marche à suivre (examen clinique approfondi, soins, traitement...). La surveillance sera renforcée le temps nécessaire. Les conditions d'hébergement seront également suivies quotidiennement.
Choix des espèces
Toute étude en vue du marquage CE d’un dispositif médical existant sous plusieurs formats doit être réalisée sur le format de taille maximale, correspondant ici à un dispositif de 8 cm. Il n’existe que 2 espèces animales sur lesquelles nous pouvons trouver des organes capables d’accepter un dispositif de cette taille, le porc et le mouton. Les études initiales pour le dispositif actuellement commercialisé ayant été réalisées sur le porc, nous avons donc retenu cette espèce pour ce projet. Le modèle lapin utilisé dans le cadre d’autres projets semblables ne peut être utilisé pour ce projet car la taille des organes d’intérêt ne permet pas de faire la résection nécessaire, sous peine d'handicaper gravement l'animal en post-opératoire. Le fait que nous ne travaillons pas sur des minipigs mais sur des porcs en croissance permettra de visualiser la résorption et le comportement du dispositif à long terme. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Les organes font approximativement : -poumon : 26 cm de hauteur et 15 cm de diamètre, la résection représente 3% du volume. -estomac : 25 cm de longueur, 12 cm de largeur et 8 cm d’épaisseur, la résection représente 1% du volume. -foie : 28 cm transversale et 16 cm de hauteur, la résection représente 3% du volume. -rate : 12 cm de longueur, 7 cm de largeur et 4 cm d’épaisseur, la résection représente 2% du volume. Le volume de résection de l’organe reste inférieur à 50%. En effet, pour des organes comme le foie et les poumons, nous pouvons vivre avec 50% en moins. Pour les organes tel que l’estomac, la rate, il possible de vivre sans avec un suivi médical plus méticuleux (vaccination, poche d’alimentation). De plus, ce sont des organes de grandes tailles et qui sont très souvent impliqués dans les plaies traumatiques ou les pathologies comme le cancer. Ces tailles sont similaires à celles retrouver chez l’Homme. Il s'agit de jeunes animaux de trois à quatre mois. Le fait que nous ne travaillons pas sur des minipigs mais sur des porcs en croissance permettra de visualiser la résorption et le comportement du dispositif à long terme.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’hypertension artérielle pulmonaire MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 920 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, chacun passant trois semaines enfermé dans un caisson d'hypoxie où l'humidité dépasse 80 %, avec accumulation possible d'ammoniaque et de gaz carbonique. Une injection sous-cutanée déclenche l'hypertension artérielle pulmonaire, puis viennent jusqu'à six semaines de traitements quotidiens par gavage ou injection, une pompe implantée sous la peau, des prélèvements à la jugulaire et une thoracotomie finale pour cathétériser le ventricule droit. Le porteur indique que la pathologie s'aggrave et devient irréversible, que les rats prennent 50 % de poids en moins qu'en hébergement classique, et qu'ils peuvent mourir de la maladie. Les effectifs par groupe intègrent d'avance une perte de 15 % à 40 % des animaux, morts en cours de protocole.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire et pulmonaire rare et grave : sa prévalence dans la population générale en France est estimée à 15 cas par million et la survie médiane sans traitement après diagnostic est inférieure à 3 ans. Elle se caractérise par l’augmentation des résistances artérielles pulmonaires, responsable d'une hypertension, et aboutit à une insuffisance cardiaque. Cette maladie peut survenir de cause inconnue, dans un contexte familial ou compliquer l’évolution de certaines pathologies (insuffisance cardiaque). En identifiant et en traitant les patients le plus tôt possible, il est possible de retarder la progression de l'HTAP. Malheureusement, cette maladie est souvent mal diagnostiquée et traitée, car les symptômes initiaux sont légers et peu spécifiques (essoufflements, lipothymie et asthénie). Si les options thérapeutiques ont progressé ces dix dernières années et ont permis d'améliorer les conditions de vie des malades, la prise en charge de l'HTAP demeure incomplète car ne prolonge pas significativement le durée de vie après diagnostic. Ainsi, la recherche de médicaments ciblant de nouveaux mécanismes physiopathologiques reste un enjeu majeur pour les années à venir. Les tests de nouvelles molécules doivent se réaliser sur des modèles animaux suffisamment prédictifs de la maladie, afin d’optimiser la sélection des candidats médicaments qui entreront en phase clinique. Le modèle présenté d'HTAP chez le rat, induit conjointement par l’administration d'un composé diminuant la formation de vaisseaux sanguins et par une hypoxie (diminution des apports en oxygène) chronique, est un modèle qui reproduit l'ensemble des caractéristiques physiopathologiques décrites chez l'Homme, à savoir une atteinte vasculaire qui est associée à long terme avec le développement d'une insuffisance cardiaque droite. De plus, les traitements actuellement proposés chez l'Homme montrent des résultats bénéfiques significatifs dans ce modèle. Ainsi, ce modèle d'HTAP représente un modèle préclinique de choix pour l’étude de l’HTAP. Ce modèle nous permettra d’évaluer, chez le rat, l’efficacité de nombreux candidats médicaments qui s’intéressent à des mécanismes d’actions connus (atteintes vasculaires) et des cibles thérapeutiques nouvelles (atteintes cardiaques). Ce modèle nous permettra également une meilleure compréhension des mécanismes mise en jeu dans la maladie afin d’améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
L’HTAP est une maladie rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitements curatifs efficaces. Si les traitements prescrits actuellement, essentiellement des vasodilatateurs, permettent une amélioration de la qualité de vie des patients et une prolongation de la survie en freinant l’évolution de la pathologie, la moitié des patients décèdent dans les sept ans qui suivent le diagnostic. Compte-tenu de l’évolution de l’HTAP dans ce modèle animal qui mime fidèlement la maladie humaine, la réalisation d’études précliniques utilisant des candidats médicaments novateurs apparait primordiale pour mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.
Procédures
Une injection sous-cutanée (S.C.) du composé diminant la formation des vaisseaux est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines avant de retourner en condition de normoxie (conditions d'hébergement classique) durant 0 à 6 semaines. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). [MODIFICATION Les animaux pourront subir une chirurgie sous anesthésie générale afin de placer sous la peau une pompe contenant des substance, permettant la diffusion continue de candidats médicaments et dont la durée d'intervention est d'environ 15-25min]. Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Durant la normoxie, des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. A la fin du protocole, une chirurgie sous anesthésie gazeuse et analgésie est réalisée afin de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à une anesthésie gazeuse et reçoivent une injection sous-cutanée pour induire une hypertension artérielle pulmonaire. Ils sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines. L’humidité dans l’enceinte est supérieure à 80%. En hypoxie, les animaux présentent une prise de poids ralentie de 50% par rapport à une stabulation conventionnelle à cause du stress et de l’asthénie provoqués par la déplétion en oxygène. De plus, le confinement dans l'enceinte d'hypoxie génère un inconfort, indépendamment de l'hypoxie elle même, via une humidité élevée et un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2. De plus, le niveau sonore est plus élevé dans les caissons hypoxiques que dans les salles d'hébergements classiques pouvant engendrer du stress et de l'inconfort pour les animaux.A la fin de ces 3 semaines d’hypoxie, ils retournent dans la pièce d’hébergement conventionnelle pendant 0 à 6 semaines, période pendant laquelle la pathologie va s’aggraver et devenir irréversible. A long terme, les animaux peuvent mourir de la pathologie. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Ces administrations répétées peuvent êtres associées à des risques de fausses route, d'irritation ou de lésions de l'oesophage (PO), et d'irritations (I.P., S.C.). [MODIFICATION Une chirurgie d’implantation de pompe contenant les composés pourra être réalisée après ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou d'une gêne avec la présence de la pompe et de la diffusion des subtances]. Des injections intraveineuses sous anesthésie pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Des anesthésies gazeuses seront potentiellement réalisées au cours du protocole afin de réaliser des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi. A la fin du protocole, les animaux sont anesthésiés afin de réaliser un acte chirurgical qui permet de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux HTAP seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (cœurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du cœur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux. Un prélèvement de tissu sur les animaux Sham (non porteurs d'un HTAP) est nécessaire pour comparer aux conséquences cardiovasculaires des animaux porteurs de la maladie.
Remplacement
S'il existe un certain nombre de modèles de culture de cellules musculaires lisses, ces modèles in vitro sont utilisés en première intention (modèles de screening) et sont utilisés uniquement pour tester des activités moléculaires et identifier des voies de signalisation. Ces modèles cellulaires in-vitro ne permettent pas de tester l'efficacité d'un candidat médicament sur l'aspect de la restauration hémodynamique et morphologique mais sont utilisés en amont afin de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur nos modèles in vivo. La validation de la formation aux techniques de mesures de pressions nécessite d’avoir recours à des animaux vivants car les phases critiques de l’approche chirurgicale reposent sur les risques hémorragiques qui peuvent entraîner des mesures de pression faussées, voir la mort de l’animal.
Réduction
Pour chaque groupe avec une HTAP, le nombre d'animaux nécessaire par groupe est fixé à 11. Ce nombre a été déterminé par un calcul de N, sur la base de données obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Basés sur les données historiques dans ce modèle d’HTAP, un pourcentage de perte de 15% est attendu jusqu’à 3 semaines de normoxie, correspondant aux animaux qui meurent au cours du protocole à cause du développement de la pathologie. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe en début d’étude est donc de N=13. Lorsque le protocole inclus une période de normoxie supérieure à 3 semaines (jusqu’à 6 semaines), le nombre d’animaux par groupe est fixé à N=18 car le développement de la pathologie entraîne une mortalité plus importante des animaux (jusqu’à 40% de perte). Généralement, le groupe contrôle négatif (non malade) n’est composé que de 6 animaux car il y a peu de variabilité des paramètres cardiovasculaires étudiés. Ainsi, 1800 rats HTAP sont prévus dans le cadre de cette procédure et 120 rats Sham. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus d'animaux sont prélevés à l'issue de certaines séries expérimentales et conservés pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). L'utilisation de ces banques de tissus pour d'autres projets de recherches permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés car il permet de réduire le nombre de séries expérimentales réalisées.
Raffinement
l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. L'administration du composé induisant la pathologie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Pendant les 3 semaines d'hypoxie, les animaux sont hébergés dans des grandes cages en plexiglass prévues à cet effet avec une sciure particulièrement absorbante (8 animaux par cages). Les caissons d’hypoxie sont ouverts et nettoyés tous les jours. De la chaux sodée est placée dans le caisson pour absorber le C02 et changée tous les jours, de l'acide borique permet d'absorber l'ammoniaque générée par les urines et est remplacé toutes les semaines ; et des absorbeurs d'humidité sont présents pour absorber l'humidité assurant des conditions correctes pour les animaux. La ventilation des caissons peut également être adaptée à l’aide d’aérations présentes sur les caissons dont l’ouverture et la fermeture peut être ajustée pour diminuer une humidité excessive. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Des points limites spécifiques au protocole sont également établis (présence de plaies cutanées, fausse route…) Si des prélèvements de sang sont réalisés au cours du protocole, les animaux sont anesthésiés. Une anesthésie locale est également réalisée. Les rats sont placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température, et une réhydratation est réalisée en injectant en S.C. 3 fois le volume prélevé en NaCl ou Ringer Lactate. Si des injections en voie I.V. sont réalisées, les animaux sont anesthésiés avec une analgésie locale et contôle de la température corporelle. Les mesures hémodynamiques réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'analgésiant au minimum 30 minutes avant la première incision. Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux [MODIFICATION-Les pompes osmotiques sont implantées en s.c. sous anesthésie générale et analgésie locale. Un massage de la zone d'implantation de la pompe est effecuté pour limiter la fibrose des tissus et optimiser son fonctionnement].
Choix des espèces
Même si de nombreuses espèces animales sont concernées, la majorité des modèles d’HTAP ont été développés chez le rat adulte parce qu’il permet d’obtenir, après induction de la pathologie, des données hautement reproductibles. De plus, les rats présentent des modifications cardiovasculaires similaires à l’homme : modifications des pressions, remodelage vasculaire et cardiaque, perte de fonction. Finalement, ce modèle d'HTAP développé chez le rat représente un modèle de référence pour l’étude de l’HTAP car la progression de la pathologie est continue au cours du temps et mime ainsi l’évolution délétère de la maladie observée chez l’homme. Des rats de 4/6 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
Utilisation d’un microARN inhibiteur pour le traitement de l’Ostéogénèse Imparfaite [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
190 souris porteuses de la mutation de l'ostéogenèse imparfaite vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. À sept jours, un fragment d'oreille est prélevé pour les génotyper, puis chaque souris retenue reçoit huit injections intraveineuses hebdomadaires sous anesthésie, chacune suivie d'une radiographie au scanner. Le porteur qualifie ces mesures de non invasives et sans douleur, tout en indiquant que ces souris subissent en moyenne dix fractures spontanées à dix-huit semaines. 186 sont tuées pour analyser os, sang et organes, quatre gardées vivantes pour de futurs projets, et le porteur conclut que les études in vivo restent "indispensables" malgré les résultats déjà obtenus sur cellules osseuses.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement potentiel pour une maladie rare appelée l'ostéogenèse imparfaite (OI), communément connue sous le nom de "maladie des os de verre". Cette maladie héréditaire rend les os très fragiles et sujets à des fractures, même avec des traumatismes mineurs, et cause des déformations du squelette. Elle est due à une mutation génétique qui affecte la production de collagène de type 1, une protéine essentielle à la solidité des os. Il n’existe actuellement aucun traitement ayant fait solidement preuve de son efficacité sur la réduction du risque de fracture. Le traitement que nous testons utilise un inhibiteur de microARN, appelé AntagomiR, qui est administré par injection dans la veine. Les microARNs sont de petites molécules qui régulent l'activité des gènes, et dans le cas de l'OI, ils sont dérégulés, contribuant à l'aggravation des symptômes de la maladie. Au laboratoire, nous avons observé que cet inhibiteur stimule la production de collagène et d'autres composants importants pour la formation des os par les cellules osseuses. Cette étude se déroule sur des souris qui présentent les mêmes mutations génétiques que les personnes atteintes de la maladie des os de verre et des fractures sur faible traumatisme tout comme les patients atteints. L'objectif est de voir si ce traitement peut renforcer les os et réduire les déformations squelettiques et fractures. Nous espérons développer de nouvelles thérapies pour les patients atteints de cette maladie, ou améliorer les traitements existants, qui sont actuellement très limités, surtout chez les enfants.
Bénéfices attendus
Bénéfices Scientifiques : Compréhension des mécanismes de la maladie : Cette étude vise à approfondir notre compréhension du rôle d'un microARN, qui influence la formation et le remodelage des os. En étudiant comment ce microARN agit, nous pourrions découvrir des mécanismes fondamentaux liés à la fragilité des os chez les personnes atteintes de la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite et mieux comprendre la complexité des interactions biologiques impliquées dans cette maladie. . Identification de nouvelles cibles pour les traitements : Si cette recherche démontre que le traitement à base d'un AntagomiR est efficace, cela pourrait confirmer que le microARN est une cible valable pour de futurs médicaments. Le mécanisme étudié pourrait être applicable pour un futur traitement pharmaceutique. Cette étude mènerait à la mise en place de nouveaux traitements pour la maladie des os de verre, mais aussi pour d'autres maladies où les os sont anormalement fragiles. Progrès technologiques : En menant cette étude, nous allons également perfectionner des techniques avancées pour administrer des traitements basés sur les microARNs, comme cet AntagomiR, directement dans les organismes vivants. Bénéfices Cliniques : Amélioration des traitements disponibles : Si le traitement avec cet AntagomiR s’avère efficace, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie des os de verre, une maladie pour laquelle les traitements actuels sont limités. Un tel traitement pourrait non seulement renforcer les os et réduire les fractures, mais aussi améliorer de manière significative la qualité de vie des patients en diminuant les risques liés aux dommages osseux et des autres tissus comprenant du collagène. Réduction des effets secondaires : Comparé aux traitements existants, comme les bisphosphonates, qui peuvent entraîner des effets secondaires parfois difficiles à gérer, surtout chez les enfants, cet AntagomiR pourrait offrir une alternative mieux tolérée
Procédures
[Modif. du 22/12/2025 : A 7j les souriceaux sont sélectionnés par analyse d’ADN sur une biopsie de 1mm d’un bout d’oreille au cours d’une anesthésie gazeuse courte] Les injections seront hebdomadaires pendant 8 semaines dans chaque procédure et réalisées au cours de l'anesthésies gazeuse des radiographies. Pour connaitre l’efficacité du traitement, les souris sont anesthésiées pour une durée de 15 minutes pour avoir une injection intraveineuse du traitement suivie d’une radiographie par scanner afin d’évaluer la qualité osseuse et le nombre de fractures. Ces mesures sont non-invasives, ce qui signifie qu'elles ne causeront pas de douleur ou de dommage aux animaux. Cette intervention permet : > la surveillance de l'apparence et de la santé générale : Chaque semaine, nous examinerons les souris pour suivre leur croissance, si leur poids change et si elles subissent des fractures. > radiographies hebdomadaires et recherche de fracture. > Une analyse détaillée des os par imagerie : permet de voir l’aspect 3D des os et de mesurer plusieurs éléments importants, comme la densité des os, le volume osseux par rapport au volume total, l'épaisseur des petites structures osseuses (trabécules), leur nombre, et l'espace entre elles. Cette intervention sera donc répétée 8 fois par souris pour une durée estimée de 15 minutes par souris.
Impact sur les animaux
[Modif. du 22/12/2025 : La biopsie d’oreille peut entrainer une douleur légère chez le souriceau (7-10 jours) avec administration d’antalgiques. Elle est précédée d’une désinfection et elle est suivie d’une compression douce d’un retour au nid immédiat et d’une surveillance rapprochée pour limiter le risque d’infection, de saignement, de stress et de complication respectivement] Au cours de cette étude, les souris pourraient éprouver certains inconforts en raison des manipulations fréquentes et des injections répétées du traitement ou des fractures. Les effets possibles incluent une perte de poids, une diminution de l'appétit, et des difficultés à se déplacer. En raison de leur mutation génétique spécifique, les souris sont également plus susceptibles de subir des fractures osseuses spontanées, ce qui peut causer de la douleur. Les souris présentent des fractures spontanées sur de faible traumatisme, en moyenne 10 fractures à 18 semaines, sans mortalité associée. Les signes de douleur ou de stress que nous pourrions observer chez les souris incluent un frottement ou un léchage excessif, une agressivité ou prostration inhabituelle, ou une posture anormale. Elles pourraient également montrer un malaise général, une réduction de leur activité, et un pelage qui semble mal entretenu. Conformément à la littérature scientifique, il n’existe pas d’effet attendu du traitement sur le plan de la tolérance viscérale ou comportementale au-delà de l’effet thérapeutique recherché.
Devenir
[Modif. du 22/12/2025 A l’issue de la procédure de croisement les souriceaux sont sélectionnés pour la procédure d’élevage pour être orientés vers la phase expérimentale lorsqu’ils sont porteurs de deux copies de la mutation invalidante ou pour être gardés comme animaux reproducteurs lorsqu’ils sont porteurs d’une seule copie de la mutation. Les souris qui ne sont pas gardées pour ces procédures (d’élevage ou d’expérimentation) sont retirés du projet de manière indolore par injection de produit euthanasiant sous anesthésie générale. 4 souris disposant d’une seule copie de la mutation seront maintenues en vie à l’issue du projet en animalerie sécurisé en vu de futurs projets à moyen terme (
Remplacement
Pour trouver de nouvelles solutions de traitement pour la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite, OI), il est crucial de mener des études sur des souris. Ces études sont nécessaires car elles permettent de recréer un environnement qui se rapproche le plus possible de celui des patients atteints d’OI. Les souris utilisées dans ces expériences présentent des altérations génétiques et physiques similaires à celles des personnes atteintes par la maladie, c’est-à-dire une mutation du collagène qui se traduit par une fragilité osseuse et des fractures. Ceci rend les résultats plus pertinents pour le développement de nouveaux traitements. Ces projets sont basés sur les résultats obtenus par nos études cliniques chez l’homme qui montrent que de petites séquences d’ARN (miRNAs) excrétés des tissus, notamment du tissu osseux sont dérégulés chez les patients. Avant de passer à ces études in vivo, nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules osseuses de souris, montrant que l'inhibiteur de l’un de ces miRNAs, appelé AntagomiR, a des effets bénéfiques sur la fragilité osseuse. Ces tests nous ont permis d'affiner notre approche et de nous préparer pour les essais plus complexes sur des souris. Bien que nous ayons déjà effectué des tests en laboratoire sur des cellules osseuses, ces modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire toutes les interactions complexes présentes chez la souris notamment en termes de tolérance et efficacité phénotypique. Par conséquent, les études in vivo sur des souris restent indispensables pour obtenir des données cliniquement pertinentes. Les souris OIM constituent le modèle le moins sensible reproduisant le plus fidèlement sur le plan physiopathologique et sur le plan clinique l’atteinte humaine.
Réduction
[Modif. du 22/12/2025 Concernant l’étape de reproduction, nous constituerons 2 trios à partir de souris d’un élevage agréé. L’orientation précoce des souris est assurée par un génotypage réalisé à j7–j10 ce qui évite d’élever inutilement des animaux non inclus. Les reproducteurs ne présentent pas de phénotype dommageable]. Les protocoles d'injection seront optimisés au cours d’une première étape pilote sur 10 animaux avec 5 régimes d’injection différents, garantissant que le rythme d'injection le mieux toléré et le plus efficace sera utilisé dans les étapes suivantes. L’innocuité et la durée du traitement seront précisés par absence d’effets secondaires et le rythme d’injection le mieux toléré par les souris, sera déterminé en observant la réaction des animaux à l’issue de la première administration et les signes pertinents de mal être. L’efficacité du traitement sera également prise en compte par le jugement du critère principal d’amélioration fonctionnelle, c’est-à-dire une diminution de la fragilité osseuse et du nombre de fractures, en fin de procédure. Cela permettra de minimiser les variations et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires par la suite, avec l’injection chez 10 souris de l’antagomiR et 10 souris de l’antagomiR-contrôle. Enfin dans une dernière phase, en cas d’échec de la phase 2, l’utilisation de 10 souris avec cette fois l’injection unique d’un antagoniste du microARN sous forme de particules lentivirales qui conduirait à une antagonisation stable et continue du microARN. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats statistiquement significatifs, nous avons défini des critères précis de réduction basés sur l'incidence des fractures. Nous anticipons une diminution de 30% des fractures par rapport au groupe contrôle. Cette estimation nous conduit à un échantillon de 10 souris par groupe expérimental. L'utilisation de cette approche statistique rigoureuse permet de minimiser le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus. La collecte de données longitudinales sur les mêmes animaux à différents points de temps maximisera les informations recueillies et réduira le besoin d'augmenter la taille des groupes pour les analyses de fin d'étude.
Raffinement
Pour leur confort, les souris bénéficieront d’un environnement enrichi avec des matériaux de nidification et des structures souples pour limiter le stress et les traumatismes, particulièrement chez les souris à fragilité osseuse accrue. Les manipulations seront effectuées à l’aide de tunnels pour éviter les traumatismes et réduire le stress, toute manipulation autre que par main en coupe étant proscrite. Le personnel recevra une formation continue sur les meilleures pratiques de soins et de manipulation. Les conditions d’hébergement seront adaptées : les souris seront logées en groupes réduits pour minimiser les risques d’agressivité et bénéficier d’un suivi qualitatif renforcé. Les cages seront équipées de matériaux non abrasifs et d’une litière épaisse, avec de la nourriture et de l’eau gélifiée disposées au fond pour faciliter l’accès, même en cas de douleur ou de boiterie. Une évaluation du bien-être et de la douleur de manière standardisée permettra une intervention rapide. Des anti-douleurs seront mis dans l’eau de boisson pour la gestion autonome des douleurs, et en cas de douleur ou de fracture, de l'anti-inflammatoire ou un anti-douleur plus puissant sera administré. Si un animal atteint un état de stress important ou un point limite de bien-être, il sera euthanasié après une sédation gazeuse pour une fin de vie sans douleur. Tous les équipements ou fournitures entrant en contact avec les souris seront stérilisés pour éviter toute contamination. Les expérimentations auront lieu dans un environnement confiné et sécurisé. En cas de plaies mineures, une crème apaisante sera appliquée pour faciliter la cicatrisation. [Modif. du 22/12/2025 Les effets indésirables du prélèvement d’oreille du souriceau sont minimisés par la rapidité du geste réalisées sous anesthésie gazeuse avec compression du tissu et remise immédiate de l’animal dans le nid. Pour les procédures d’élevage et d’expérimentation l’ensemble des souris, y compris celles qui ne présentent pas de signe clinique de la maladie et qui ne sont donc pas exposes aux procédures expérimentales bénéficient des mêmes conditions de raffinement en élevage.]
Choix des espèces
L'utilisation de souris dans cette étude est justifiée par leur capacité à mimer la maladie humaine, en particulier les souris oim+/+, qui présentent un phénotype très proche de celui observé chez les patients atteints d’ostéogenèse imparfaite (OI). Âge des Souris : 6 Semaines à J0 : Développement Osseux Critique : À 6 semaines, les souris sont en pleine croissance rapide, ce qui est essentiel pour étudier l'effet des traitements sur le développement osseux et la fragilité liée à l'OI. Les manifestations de l'OI, telles que les fractures et les dommages osseux, sont déjà présentes à cet âge, permettant une évaluation claire des effets thérapeutiques. Homogénéité et Comparabilité : Utiliser des souris du même âge assure une cohérence dans les données, réduisant les variations dues à des différences de développement entre individus. Cette approche soigneusement planifiée permet d'assurer que les résultats obtenus seront significatifs et utiles pour envisager des interventions thérapeutiques chez les patients humains souffrant d'OI.
Evaluation de combinaisons de traitements pour prévenir les récidives du glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
66 souris vont être utilisées dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère, et toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Une tumeur cérébrale leur est greffée, puis retirée par craniotomie, avant l'implantation d'un traitement au contact des bords de l'exérèse, avec des hémorragies locales et des douleurs post-opératoires que le porteur dit atténuer par des antalgiques. La progression tumorale finit par leur ôter l'appétit et provoquer une dénutrition et une perte de poids. Le RNT constate lui-même qu'aucun traitement local testé ces quinze dernières années n'a donné de résultats cliniques cohérents malgré des résultats précliniques prometteurs, et propose de poursuivre par la même voie.
Objectifs
Le glioblastome est une tumeur cérébrale très agressive, avec une survie médiane de 15 mois malgré les traitements combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Deux principaux obstacles limitent l’efficacité de ces traitements : la barrière cérébrale, qui empêche aux médicaments d’atteindre la tumeur, et les cellules tumorales résistantes aux traitements. Après l’opération, la majorité des récidives surviennent près des bords chirurgicaux, où le microenvironnement favorise la croissance des cellules cancéreuses. Une stratégie thérapeutique prometteuse est l’implantation intracérébrale des médicaments anticancéreux ou antinflammatoires. Cet approche permet de contourner la barrière cérébrale et d’administrer les traitements de manière ciblée et prolongée. Cependant, bien que les résultats précliniques soient prometteurs, aucun traitement local testé ces 15 dernières années n’a donné de résultats cliniques cohérents. Il est donc essentiel d’identifier des cibles thérapeutiques dans le contexte post-opératoire et tester de nouvelles approches thérapeutiques afin de prévenir la formation de récidives.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de proposer de nouveaux traitements pour le glioblastome. Les retombées de ce projet pourraient répondre à un besoin médical non satisfait dans le traitement des gliomes de haut grade, pour lesquels aucune innovation thérapeutique majeure n’a été introduite depuis 2005 (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie au témozolomide). Ces tumeurs restent associées à un très mauvais pronostic, avec une espérance de vie médiane limitée à environ 15 mois après le diagnostic.
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1) acte chirurgical permettant la greffe tumorale ; 2) excision chirurgicale de la tumeur; 3) traitement post-chirurgical. La durée approximative des chirurgies ou tout acte nécessitant une anesthésie générale ne dépassera pas les 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances anticipées dans ce projet sont de courte durée et concernent la greffe, la pousse tumorale, l'excision chirurgicale de la tumeur et la douleur liée aux actes chirurgicaux. La manipulation, contention des animaux, les injections répétées d'anesthésiques, d'analgésiques et de traitements sont générateurs de stress de courte durée pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. L'excision de la tumeur peut induire des hémorragies locales et avec la craniotomie elles peuvent générer des douleurs post-opératoires minorées par l'administration d'antalgiques. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des analyses post-mortem.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique des nouvelles combinaisons de traitements pour le glioblastome. Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes expérimentales sur la base des résultats obtenus préalablement qui ont permis de définir des fenêtres temporelles auxquelles effectuer les analyses. Cette étape de caractérisation in vivo est indispensable afin de pouvoir mieux comprendre l’effet de la chirurgie dans les patients atteints de glioblastome. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’études similaires déjà publiées et d’un calcul statistique permettant d’assurer environ 80 % de chances de détecter une différence réelle entre les groupes. Sur cette base, 11 animaux par groupe expérimental, pour un total de 66 animaux, seront nécessaires pour l’ensemble du projet, un nombre suffisant pour garantir des résultats fiables.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupes de 5 par cage, avec des mesures d'enrichissement de leur environnement pour assurer leur bien-être. Cela inclut l'utilisation de litière à base de cellulose, de petits dômes stérilisables, et des morceaux de bois à ronger dans chaque cage. Les souris feront l’objet d’une observation quotidienne de leur état général, et leur poids sera contrôlé deux fois par semaine. Une échelle d'évaluation de la souffrance sera utilisée pour mesurer leur niveau de douleur ou de détresse, en tenant compte de critères comme la perte de poids, les changements physiques ou comportementaux, la réaction aux stimuli, et l'apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score obtenu, des mesures seront prises pour soulager la détresse (comme fournir de l'eau gélifiée, de la nourriture dans la cage ou des enrichissements supplémentaires) et pour gérer la douleur, notamment avec des analgésiques.
Choix des espèces
Le modèle souris représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Les modèles de tumeur que nous étudions vont nous permettre de mimer des mécanismes cellulaires et moléculaires des tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7-8 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.
Impact des cellules tolérogènes dans la glomérulonéphrite extra-membraneuse induite chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vingt prélèvements d'urine sous contention manuelle, cinq prises de sang et vingt-une instillations dans le nez sur sept semaines, c'est le protocole décrit pour 492 souris chez qui une maladie auto-immune du rein est déclenchée. Les procédures sont classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour l'analyse histologique et biochimique de leurs organes. Le porteur énumère les atteintes possibles, mauvaise cicatrisation, saignement, infection, chute de tension et accumulation de liquide dans l'abdomen dans les formes sévères de la maladie. Il écrit pourtant, dans le même paragraphe, qu'en l'absence de complication le développement de cette glomérulonéphrite n'est pas douloureux pour l'animal.
Objectifs
Notre projet vise à étudier l’efficacité d’une thérapie à base de cellules anti-inflammatoires dans le traitement d'une maladie auto-immune rénale.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra le développement et la validation préclinique d’une thérapie cellulaire anti-inflammatoire dans une maladie rénale auto-immune (glomérulonéphrite extra-membraneuse), de façon à contrôler l’activité de la maladie et éviter les rechutes.
Procédures
- 5 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 20 Prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement.- pour les animaux de la procédure 3 : 21 instillations intranasales (7 semaines de traitement X 3 instillations par semaine). 15 secondes par instillations.
Impact sur les animaux
Lors des manipulations, les souris pourraient être sujettes à stress et angoisse voire des douleurs liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections, de prélèvements d’urine et de sang. Des complications éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure d’immunisation, d’injection ou du prélèvement sanguin, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement ou stress lié à la contention. Une chute de la tension artérielle. En l'absence de complication, le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse n'est pas douloureux pour l'animal. De l’ascite peut survenir dans les formes sévères de la maladie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement et analyse histologique et biochimique
Remplacement
Nos résultats in vitro suggèrent que le rétablissement d’un environnement immunitaire tolérogène serait efficace pour contrôler l’activité de la maladie. Le modèle animal et nécessaire pour la validation in vivo de l’efficacité et de la sécurité de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été établi grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les groupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis qui pourront entrainer le cas échéant l'euthanasie de l‘animal. Une attention particulière sera portée au point d’injection abdominal (rougeur) et au poids (recherche d’une ascite).
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. De plus, ce modèle murin de maladie auto-immune rénale est déjà publié et développé par notre équipe. Les souris seront âgées de 12 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).
Charactérisation optogénétique du control moteur dans les ganglions de la base
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 120 souris vont être utilisées, chacune passant par deux chirurgies cérébrales de quatre-vingts et soixante minutes, vingt jours d'injections quotidiennes, puis une à deux heures de tests moteurs par jour pendant quatorze semaines. La moitié des procédures est classée au niveau de souffrance sévère, l'autre au niveau modéré, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau ou d'autres tissus. Une partie subit une lésion unilatérale reproduisant la maladie de Parkinson, avec la réduction d'activité et le comportement rotatoire qui l'accompagnent, et des enregistrements cérébraux tête bloquée dans un dispositif de contention. Le porteur annonce des critères d'arrêt "précoces" pour détecter toute souffrance incompatible avec le projet, sans dire lesquels.
Objectifs
Les ganglions de la base sont un ensemble de structures du cerveau qui jouent un rôle essentiel dans le contrôle de nos mouvements du quotidien, comme marcher, écrire ou parler. Pourtant, on connaît encore mal leur fonctionnement précis lorsqu’un mouvement est en cours. Quand ce réseau ne fonctionne plus correctement, cela entraîne de graves maladies motrices. C’est le cas par exemple de la maladie de Parkinson, où il devient difficile d’initier un geste, ou des dyskinésies, qui se traduisent par des mouvements involontaires impossibles à contrôler. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces structures cérébrales participent à la fois à la réalisation normale d’un mouvement et à l’apparition de troubles moteurs. Pour cela, nous allons étudier deux situations opposées : la maladie de Parkinson et les dyskinésies. Grâce à une technologie innovante, appelée optogénétique, il est désormais possible d’agir directement sur certaines cellules du cerveau : une lumière laser permet d’activer ou d’inhiber temporairement et de façon réversible l’activité de neurones précis. Cette approche permettra de mieux comprendre leur rôle et, à terme, d’ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet original permettra d’amener des connaissances nouvelles et fondamentales sur le mode de fonctionnement normal et pathologique des ganglions de la base. Il permettra de définir les circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs et ainsi de mieux comprendre le mode d’action de stratégies thérapeutiques utilisées quotidiennement en clinique.
Procédures
Procédure chirurgicale réalisée 1 fois, durée 80 min avec implantation et injection intracérébrale, sous anesthésie gazeuse, deuxième procédure chirurgicale, réalisée 1 fois, 60 min, injection intrapéritonéale : 20 jours 1 fois/jour, quelques secondes Comportement: le test de comportement moteur (durée 1 à 2 h/ Par jour pendant 14 semaines) et enregistrement de l'activité cerebrale sur animal anesthésié ou éveillé (durée 1h/jour)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux enregistrements électrophysiologiques. 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. 4/ des effets indésirables moteurs unilatéraux inhérents à l'induction de la maladie de Parkinson (réduction de l'activité locomotrice et comportement rotatoire).
Devenir
À l’issue des procédures les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre la physiologie et physiopathologie du réseau des ganglions de la base dans le contrôle de la motricité volontaire. La seule manière d'aborder ces questions est d'utiliser des approches in vivo mises en place chez l'animal se comportant, cela nécessite donc le recours à l'utilisation d'animaux. A l'heure actuelle, aucunes méthodes "in vitro" ou "in silico" ne peuvent reproduire la complexité et le mode de fonctionnement des ganglions de la base.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés.
Raffinement
À chaque étape du projet, le bien-être des animaux sera une priorité. (1) Conditions d’hébergement Les animaux naîtront et seront hébergés dans une animalerie à haut statut sanitaire. Ils seront maintenus en cages collectives ventilées, avec litière adaptée favorisant le fouissage. Des enrichissements seront systématiquement fournis : nids végétaux, tubes en carton, matériaux manipulables, afin de permettre l’expression de comportements naturels (construction de nids, exploration, jeu, rongement). (2) Soins et suivi quotidien L’entretien et la surveillance seront assurés par un personnel qualifié et expérimenté. Un suivi quotidien standard est assuré, renforcé lors des périodes sensibles (ex. récupération après intervention). (3) Procédures et gestion de la douleur Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale adaptée, avec administration systématique d’analgésiques validés par le vétérinaire référent. Les expérimentateurs impliqués disposent d’une solide expérience, garantissant des procédures maîtrisées et rapides, réduisant ainsi le stress et la douleur. (4) Points limites et mesures correctives Des critères d’arrêt précoces sont définis pour détecter toute souffrance non compatible avec le projet. Des mesures de soutien seront appliquées dès les premiers signes d’altération de l’état général : réhydratation, maintien au chaud, nourriture enrichie ou pâte molle. Si nécessaire, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié de façon éthique, afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle privilégié car l’organisation de leurs ganglions de la base est très proche de celle de l’être humain, ce qui permet d’extrapoler les résultats et de mieux comprendre le rôle de ces circuits dans les troubles moteurs comme la maladie de Parkinson. Leur large disponibilité en souches transgéniques en fait également un outil essentiel pour l’optogénétique, car elles permettent de manipuler de manière sélective des populations neuronales cibles. Enfin, elles sont adaptées aux études comportementales, ce qui en fait un modèle complet et précieux pour nos recherches. Les expériences seront menées sur des animaux âgés de plus de 6 semaines. À ce stade, leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène, garantissant une bonne reproductibilité des sites d’injection.