Procédures sévères
Evaluation de l’effet thérapeutique de la cytokine IL-34 humaine dans des modèles de maladies inflammatoires chroniques chez la souris NSG humanisée
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dépourvues de système immunitaire fonctionnel par construction génétique, les souris NSG utilisées ici reçoivent des cellules humaines qu'elles ne peuvent pas rejeter. 280 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Irradiation sur animal vigile, injection intraveineuse de cellules humaines, prélèvements sanguins derrière l'orbite de l'œil toutes les deux semaines, instillation intra-rectale d'un mélange de produits, pose de mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale, le suivi courant de la cinquième à la vingtième semaine de vie. Le porteur conclut que le passage à ces animaux dits humanisés est "indispensable" pour évaluer une molécule dont les essais sur cellules humaines ont déjà donné, selon lui, des résultats prometteurs.
Objectifs
L'objectif est d’étudier l’effet thérapeutique d’une molécule régulatrice afin d'approfondir notre compréhension des mécanismes d’action de cette molécule sous sa forme native et de les comparer à des formes modifiées dans des modèles de maladies inflammatoires, dont la composante immunitaire est bien décrite. Ce projet fait suite à de précédents travaux au sein de notre équipe et vise ici à tester la meilleure molécule modifiée et ses versions améliorées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule humaine dans de nouveaux modèles de maladies inflammatoires, ainsi que de confirmer les résultats obtenus précédemment par l’équipe en testant notre molécule modifiée favorite ainsi que ses formes améliorées et optimisées pour une possible utilisation en clinique.
Procédures
Irradiation des souris vigiles (1 fois, 3 minutes/souris) ; Injection des cellules humaines par voie intraveineuse sur souris vigiles (1 fois, 5 minutes/souris) ; Prélèvements sanguins des souris sous anesthésie gazeuse (2 fois les 3-4 premiers mois puis tous les deux semaines, 5 minutes/souris) ; Instillation de mélange de produits en intra-rectal sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes/souris) ; Injection des traitements en intraveineuse (1 fois, 5 minutes/souris) ou en intra-péritonéale (1 fois/jour pendant 10 jours, 2 minutes/souris) sur souris vigiles ; Mise en place des mini-pompes osmotiques dans la cavité péritonéale sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes/souris)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés 1. À l'injection de cellules humaines (douleur) ; 2. A l’injection intra-rectale d’un mélange de produits (douleur) ; 3. Intervention chirurgicale pour la mise en place de mini-pompes sous la peau (douleur, saignement) 4. Injection des traitements en intraveineuse ou intra-péritonéale ; 5. Au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l'œil (douleur, saignement). Ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) et/ou analgésie (pré et post-opératoire pour les mini-pompes) pour pallier aux différentes douleurs rencontrées par les animaux, même si elles peuvent néanmoins conduire à une douleur légère et de courte durée, ainsi qu'à un stress.
Devenir
A la fin de l’expérience, tous les animaux seront autopsiés afin d’effectuer des prélèvements d’organes/tissus ce qui justifie l’euthanasie de chaque souris.
Remplacement
Malgré des résultats prometteurs dans les études fonctionnelles in vitro de la molécule native et des molécules modifiées sur cellules humaines, ceux-ci sont limités par l'absence de contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire. Le passage aux modèles in vivo chez des animaux dit « humanisés » (proche de l’homme, car mimant le système immunitaire humain) est indispensable pour évaluer l’effet de cette molécule humaine et de ces nouvelles formes modifiées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimum d’animaux sera utilisé et analysé par le biais de tests statistiques, permettant d’obtenir des résultats robustes et significatifs. Nous prévoyons d’utiliser au maximum 280 animaux répartis sur 3 protocoles différents. Si nous n’observons pas d’effet in vivo lors de premiers tests (groupe de 3 à 4 souris par expérience), les expériences ne seront pas reproduites et la totalité des souris ne sera donc pas utilisée.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux maximum et auront des formes d’enrichissements à leur disposition (Sizzle nest, tube, dôme) afin de réduire leur stress. Dans tous les protocoles mis en œuvre, les interventions invasives et les interventions chirurgicales plus longues seront effectuées sous anesthésie gazeuse et analgésie ou sous anesthésie générale associée à une analgésie pré et post-opératoire. Les animaux seront suivis quotidiennement dès le début du protocole, au niveau du poids et de l’apparition de signes cliniques. Enfin, des points limites ont été mis en place et seront appliqués en cas de souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d’étudier une molécule humaine dans une perspective thérapeutique. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal capable d’accueillir des cellules humaines. Nous avons choisi la souris car certaines lignées particulières n’ont pas de système immunitaire fonctionnel, ce qui permet d’y greffer des cellules humaines sans qu’elles soient rejetées. La souris est également un animal couramment utilisé en recherche, car elle se reproduit facilement, son hébergement est bien maîtrisé et sa manipulation est relativement simple. Les souris recevront les cellules humaines lorsqu’elles auront 4 à 5 semaines, un âge où elles sont assez robustes pour supporter la procédure. Elles seront ensuite suivies jusqu’à environ 16 à 20 semaines, âge auquel leur croissance est terminée et leur poids est stable. Cela facilite les manipulations, comme l’injection des traitements ou les prélèvements d’échantillons, tout en assurant un suivi attentif de leur bien-être.
Modulations pharmacologiques des mécanismes communs dans les différents types d’accidents vasculaires cérébraux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 980
Soixante minutes d'interruption de la circulation dans une artère cérébrale, sans qu'aucun analgésique ne soit administré ensuite. 1 260 souris et 980 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, une partie étant opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil. D'autres subissent une hémorragie intracérébrale provoquée chirurgicalement, une injection intra-artérielle destinée à créer des microhémorragies, ou un drainage d'hématome, auxquels s'ajoutent des traitements quotidiens, des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes, des prélèvements sanguins mensuels et des tests de mémoire, d'anxiété et de motricité étalés sur plusieurs semaines. Le recours à deux espèces de rongeurs, le porteur l'appuie sur les recommandations STAIR, un ensemble de critères établis par des experts du domaine.
Objectifs
L’objectif global du projet est de moduler pharmacologiquement les mécanismes communs entre les différents types d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral) afin d'en contrer les effets néfastes ou les complications, à court terme ou à long terme.
Bénéfices attendus
Concernant les hémorragies cérébrales, à la phase aiguë (c’est-à-dire jusqu’à 7 jours), ce projet permettra de proposer plusieurs pistes thérapeutiques pour l’évacuation de l’hématome. Au-delà de 7 jours, ce projet permettra de proposer une piste anti-inflammatoire pour contrer les effets délétères de l’œdème présent autour de l’hématome résiduel. En ce qui concerne les ischémies cérébrales, des modulations pharmacologiques à court et et à long terme par des médicaments aux multiples effets permettra d'évaluer les bénéfices de ces traitements sur les troubles de la mémoire et la récupération fonctionnelle post AVC.
Procédures
Les animaux vont être soumis respectivement et de manière unique à - une intervention chirurgicale afin d'induire un accident vasculaire ischémique (interruption de la circulation sanguine dans une artère cérébrale d'une durée de 60 min) - une intervention chirurgicale afin d'induire d'une hémorragie intracérébrale (d'une durée de 30 minutes) - une injection intra-artérielle de molécules permettant la constitution de microhémorragies cérébrales (d'une durée de 10 minutes) - une intervention chrirugicale post hémorragique et drainage de l'hématome (d'une durée de 60 min). Pour l'ensemble de ces procédures, les animaux recevront des traitements pharmacologiques innovants quotidiennement (par voie orale ou par injection d'une durée de 5 minutes par administration), en parrallèle d'évaluations comportementales visant à tester la mémoire, l'anxiété et la motricité (tests s'étalant de quelques heures à plusieurs semaines), de séances d'imagerie (d'une durée de 45 minutes/séance) et de prélèvements sanguins mensuels (5 minutes/prélèvement).
Impact sur les animaux
L'induction des AVC ischémiques et des HIC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De plus, la principale nuisance attendue dans le modèle d'AVC ischémique repose sur le fait qu'aucun analgésique ne sera administré et que cela peut entrainer une douleur. Une perte de mobilité transitoire peut également être observée dans les 72h qui suivent l'intervention. De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés, même si les doses sont non toxiques (troubles digestifs, nuisance liée à la piqure). Une douleur peut être générée lors du prélèvement rétro-orbital. Aucune nuisance n'est attendue lors des tests comportementaux, hormis la légère restriction alimentaire lors d'un test comportemental. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gênes potentielles (voir document associé).
Devenir
A la fin des protocoles, les animaux seront mis à mort après différents temps d'intérêt, entre 24h et 6 mois post chirurgie, pour des études du tissu cérébral qui nécessitent d'avoir accès à l'organe.
Remplacement
L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqués dans la survenue d'un accident vaculaire cérébral. Il s’agit de l’étude d’un trouble physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 2240 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.
Raffinement
Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au mieux (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les mesures spécifiques seront la mise à disposition de gel nutritif enrichi lors d'une perte importante de poids, de la désinfection en cas de plaies et d'un ajout d'enrichissement en cas de comportement aggresif anormal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure du bien-être animal ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.
Choix des espèces
En accord avec les données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité et la fiabilité des résultats obtenus, nous avons choisi de travailler sur des animaux (rats et souris) jeunes adultes nous permettant d'envisager des études à long terme. Le choix de 2 espèces de rongeurs repose sur les recommandations STAIR (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) qui rassemblent des critères expérimentaux définis par des experts internationaux et adaptés à l’évaluation expérimentale.
Efficacité in vivo de nouveaux composés dérivés des flavonoïdes dans le glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Quinze gavages par animal et une greffe de cellules tumorales directement dans le cerveau, opération de trente minutes : 61 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées, dans le cadre d'études de survie, pour l'analyse histologique des cerveaux ou à l'issue de la recherche de dose maximale tolérée. Il s'agit de tester des dérivés de flavonoïdes contre le glioblastome, la croissance de la tumeur entraînant perte d'appétit, dénutrition et perte de poids, et la craniotomie des douleurs après l'opération. Les souris utilisées sont des nude immunodéficientes, choisies pour accepter la greffe de cellules humaines, et le décompte annonce 45 animaux greffés et 61 recevant le composé par voie orale pour un effectif total de 61.
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer le potentiel anti-tumoral de nouveaux dérivés de flavonoïdes sur un modèle murin de glioblastome. Des études in vitro dans nos équipes ont montré l’efficacité de ces nouveaux composés sur la croissance des cellules tumorales de glioblastome, ainsi que sur des modèles ex vivo (tumoroïdes de glioblastome). La validation in vivo de l'efficacité de ces composés sur la progression de la tumeur pourrait permettre la mise en place d’une nouvelle stratégie thérapeutique contre le glioblastome.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur cérébrale dont le pronostic est sombre. Il n’existe aucun traitement curatif et la survie médiane des patients est de un an environ avec un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. La validation in vivo de l'efficacité antitumorale de ces nouveaux composés permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le glioblastome.
Procédures
Les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales (45 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). La greffe intracérébrale est une procédure chirurgicale. Des animaux recevront une administration orale de composé anticancéreux ou de solvant (61 animaux, intervention de 30 secondes environ, 15 interventions/animal).
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La craniotomie peut générer des douleurs post-opératoires. La progression tumorale provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids. Des souris seront traitées par gavage. Les souris nude sont immunodéficientes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, pour les analyses histologiques (prélèvement de cerveaux) et à la fin de l'étude de dose maximum tolérée (une semaine après la dernière administration).
Remplacement
L'efficacité thérapeutique de ces nouveaux dérivés de flavonoïdes sur la croissance tumorale de tumeurs cérébrales nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique de ces tumeurs. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenus in vitro et ex vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au strict minimum requis pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Des cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée. Les animaux seront anesthésiés avant l’intervention chirurgicale. Avant chirurgie et en post- opératoire, une analgésie est prévue. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples. Un anesthésique local sera injecté sur le site d’incision et appliqué aux points de pression de l’appareil stéréotaxique. Du sérum physiologique préchauffé sera injecté pour hydrater et réchauffer l’animal. Un onguent ophtalmique sera appliqué sur les yeux durant la chirurgie pour assurer leur hydratation. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples pour éviter la moindre irritation ou blessure. Des croquettes imbibées d’eau et de la gelée nutritive seront déposées dans la cage après la chirurgie pour faciliter la prise alimentaire. La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.
Étude des altérations du protéome de manière pathologie-spécifique dans des modèles murins de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Établir quelles protéines des neurones et des astrocytes se modifient dans la maladie d'Alzheimer conduit à utiliser 978 souris, dont des modèles transgéniques et des porteuses du facteur de risque ApoE. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Elles reçoivent une injection sous anesthésie vers quatre ou cinq mois, puis une injection quotidienne pendant deux semaines, et la moitié passe un mois sous régime modifié destiné à supprimer les cellules immunitaires du cerveau. Paralysie des membres postérieurs, épilepsie, hydrocéphalie et malocclusion sont annoncées comme phénotypes possibles. Le porteur n'utilise que des mâles, en indiquant que le recours aux deux sexes exigerait un nombre d'animaux "bien trop important d'un point de vue éthique", tout en reconnaissant que ce serait un atout scientifique.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle aucun remède n’existe à ce jour. Les pathologies Alzheimer dans le cerveau, ainsi que la neuroinflammation, sont des caractéristiques de la MA qui entraînent une perte synaptique et neuronale, constituant la base du déclin cognitif. Certains gènes sont connus pour contribuer à la neurodégénérescence, à la neuroinflammation, aux pathologies Alzheimer, mais les mécanismes restent encore mal compris. Nos études suggèrent que les microglies (cellules immunitaires du cerveau) et les astrocytes (cellules nourricières des neurones) pourraient être des médiateurs de cette toxicité génétique, mais des études sont nécessaires pour confirmer ou infirmer cette hypothèse. L'investigation des changements protéomiques des neurones et des astrocytes causés par les pathologies Alzheimer, ainsi que le rôle de certains gènes pro-Alzheimer et des microglies dans ces processus, est donc essentielle pour comprendre la MA et développer des traitements efficaces. Le projet vise à dévoiler comment 1) les pathologies Alzheimer, 2) les facteurs de risques génétiques, et 3) les microglies modifient les protéines des neurones et des astrocytes, conduisant à la neurodégénérescence. Nous utiliserons des souris : 1) contrôles (saines), 2) modèles Alzheimer, en présence ou en absence de microglies. Nous utiliserons également des souris exprimant le principal facteur de risque génétique (ApoE) de la MA. Cette étude nous permettra d'identifier avec précision les changements protéomiques émergents induits par la MA dans les neurones et les astrocytes.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence neuronale dans la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des effets néfastes des pathologies Alzheimer et des microglies pour préserver les neurones et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
Tous les animaux subiront une anesthésie gazeuse afin de recevoir une injection unique à 4/5 mois. Tous les animaux vigiles subiront une injection quotidienne (environ 30 secondes) pendant 2 semaines avant la fin du protocol. Un mois avant l'euthanasie et la collecte des tissus pour les 2 cohortes, la moitié des souris seront traité avec une diète modifiée afin de supprimer les cellules immunitaires dans le cerveau pendant un mois (soit à 6 ou à 9 mois).
Impact sur les animaux
L'injection unique à 4/5 mois peut générer une douleur, un saignement ou une inflammation. Les injections quotidienne pendant 2 semaines peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée et un risque d'infection. Un de nos modèles de la maladie d'Alzheimer peut développer une paralysie des membres postérieurs qui pourra à la longue les empêcher d'accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Ces souris peuvent aussi faire de l'épilepsie, de l’hydrocéphalie et de la malocclusion (mauvais alignement des dents) qui pourront générer de la souffrance, du stress et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence neuronale ainsi que les pathologies alzheimer sont très/assez difficiles à obtenir in vitro. Les souris modèles de la maladie d'Alzheimer du projet représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence neuronale et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte neuronale ainsi que les pathologies tau et amyloïde, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Pour analyser comment les différentes pathologies alzheimer et les cellules immunitaires du cerveau modifient les protéines des neurones et des astrocytes (cellules nouricières du cerveau), nous utiliserons des mâles et des femelles. Concernant le rôle de certaines prédisposition génétiques, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Les mâles et les femelles ne peuvent pas être analyser ensemble car les souris alzheimer ont une variabilité pathologique importante entre mâles et femelles. Nous utiliserons les mâles car ils développent une pathologie plus tôt par rapport aux femelles. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les mécanismes découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages enrichies. Une observation quotidienne sera effectuée afin de s’assurer de leur bien-être. Lors des injections, chaque souris sera anesthésiée et recevra un anesthésiant. Une attention particulière sera portée aux souris lors des observations pour détecter d’éventuels effets indésirables. Comme un des modèles peut développer des phénotypes dommageables, des points limites stricts ont été définis et seront appliqués afin de réduire les nuisances causées aux animaux.
Choix des espèces
Les souris modèles Alzheimer constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, les pathologies cérébrales, ainsi que la neurodégénérescence progressive responsable des troubles cognitifs dans la maladie Alzheimer sont très difficilement modélisables in vitro et nécessites des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. - Une cohorte sera utilisée à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la maladie sans neurodégénérescence mais avec pathologies Alzheimer. - Une cohorte sera utilisée à 10 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la maladie avec neurodégénérescence résultant des pathologies Alzheimer.
Influence du sexe et du cycle hormonal sur l’efficacité thérapeutique de la neurostimulation transcrânienne dans la migraine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
928 rats vont être utilisés dans des procédures relevant toutes d'un niveau de souffrance sévère, chacun subissant au minimum une chirurgie d'implantation de vis crânienne. Certains subissent en plus une ablation des ovaires, une pose de canules pour l'injection d'une soupe inflammatoire, puis une intervention finale de huit heures sous anesthésie profonde sans réveil, comprenant trachéotomie, canulation de la carotide et de la jugulaire et craniotomie. Une hypersensibilité douloureuse est attendue après l'induction du modèle de migraine, et les mesures de seuil de réaction cutanée se répètent toutes les trente minutes pendant trois heures, puis une fois par jour pendant cinq jours. Tous les animaux sont tués pour prélever sang et tissus nerveux, et le porteur, qui décrit ces tests comme peu douloureux, annonce à long terme des traitements de la migraine mieux adaptés au sexe et au cycle hormonal.
Objectifs
La migraine, qui se manifeste par des maux de tête récurrents, touche environ 15 % de la population, en majorité des femmes. Une méthode prometteuse pour soulager cette douleur est la neurostimulation, en particulier la stimulation transcrânienne à courant continu, qui consiste à appliquer un faible courant électrique sur certaines zones du cerveau. Cependant, on connaît encore peu son efficacité réelle contre la migraine et les mécanismes par lesquels elle agit. Dans nos recherches précédentes, nous avons utilisé un modèle animal de la migraine et observé que : 1) La douleur n’est pas ressentie de la même manière chez les mâles et les femelles ; 2) Les neurones impliqués dans la transmission de la douleur réagissent différemment selon le sexe et le cycle hormonal des femelles. L’objectif de notre projet est donc de mieux comprendre comment la stimulation transcrânienne à courant continu agit sur la migraine, en tenant compte des différences entre les sexes et des variations hormonales chez les femelles. Ce projet se divise en trois grandes étapes : 1. Identifier les meilleurs protocoles de stimulation (préventive vs curatif) 2. Tester l’efficacité de la stimulation selon le sexe et le cycle hormonal chez les femelles et comparer les résultats avec des femelles opérées pour ne plus produire d’hormones sexuelles. 3. Explorer les mécanismes cellulaires à l’origine de ces effets, afin de mieux comprendre comment la stimulation modifie l’activité des neurones liés à la douleur.
Bénéfices attendus
Bien que la migraine touche plus souvent les femmes que les hommes et soit liée aux variations hormonales, la plupart des recherches ont été faites uniquement chez les mâles. Ce projet va donc nous aider, à moyen terme, à mieux comprendre comment le cerveau perçoit la douleur liée à la migraine et comment la neurostimulation agit, aussi bien chez les hommes que chez les femmes, en prenant en compte les changements hormonaux. À plus long terme, ces connaissances pourraient permettre de créer des traitements mieux adaptés à chacun, en tenant compte du sexe et du cycle hormonal. L’objectif est d’apporter des solutions plus personnalisées et efficaces pour soulager les personnes souffrant de migraine.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 6 : • ovariectomie. L'opération durera 10 minutes sous anesthésie générale. • chirurgie d'implantation de vis pour réaliser des neurostimulations (1 par animal,
Impact sur les animaux
Certains animaux subiront une ablation des ovaires sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux auront au minimum une chirurgie pour implanter une vis. Ces interventions peuvent entraîner une douleur passagère après l’opération. Nous prévoyons également une hypersensibilité à la douleur après l’induction des modèles de migraine. Les tests de sensibilité cutanée sont peu douloureux : ils consistent à mesurer le seuil de réaction à un stimulus, et l’animal peut s’en soustraire à tout moment.
Devenir
A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever le sang et les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser des analyses immunohistochimiques, protéiques ou électrophysiologiques.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui aucune méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Pour bien comprendre comment la douleur est traitée par le corps, il est essentiel de faire des études chez l’animal vivant, car cela fait intervenir plusieurs zones du cerveau et du système nerveux en même temps. Travailler avec des animaux permet aussi de prendre en compte leurs variations hormonales naturelles, ce qui est très important, notamment pour mieux comprendre la migraine chez les femelles. À ce jour, aucune autre méthode ne permet d’évaluer l’efficacité d’un traitement anti-douleur potentiel de façon aussi complète. Même sous anesthésie, un animal avec un système nerveux intact est indispensable pour mener des recherches fiables dans ce domaine. Les études comportementales sur l’animal vivant restent donc nécessaires pour progresser dans la recherche sur la mise au point de nouveaux traitements liés aux effets thérapeutiques de la neurostimulation contre la migraine.
Réduction
Le nombre de rats utilisés par groupe a été déterminé à partir de nos expériences précédentes, en tenant compte des éventuelles difficultés pouvant survenir au cours des différentes étapes de l’étude. Nos données montrent que 8 rats par groupe sont généralement suffisants pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Toutefois, certaines étapes (comme l’habituation, les injections, les tests comportementaux ou les prélèvements de tissus) peuvent poser problème. C’est pourquoi nous prévoyons, à titre préventif, jusqu’à 10 rats par groupe dans certaines procédures. De plus, nous allons combiner deux phases du cycle hormonal : un niveau élevé et un niveau bas d’œstrogènes. Pour chaque phase de l’étude, nous adapterons nos analyses en fonction des données recueillies, afin d’obtenir des résultats solides, avec une puissance statistique d’au moins 70 %. Si nous constatons que 8 animaux suffisent, nous n’en utiliserons pas davantage. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, les études seront réalisées par étapes. Si ces premières expériences ne montrent pas de résultats significatifs, les étapes suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Pour garantir le bien-être des rats, un enrichissement de leur environnement sera mis en place : des rouleaux seront placés dans les cages pour stimuler leur comportement naturel et améliorer leur confort. Les différentes interventions prévues seront réalisées sous anesthésie générale, afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Selon le type de procédure, différents produits anesthésiques seront utilisés. De plus, avant et après les interventions, une prise en charge de la douleur sera assurée. Les animaux seront étroitement surveillés, quotidiennement, par du personnel formé, en respectant les règles légales en vigueur. Nous serons particulièrement attentifs à tout signe de souffrance ou de mal-être, comme : un mauvais état général (poils hérissés, absence de toilette, amaigrissement), des difficultés à bouger, à se nourrir ou à se relever, une température corporelle anormale, des signes de douleur ou d’agressivité inhabituelle, ou encore des lésions visibles (sur la peau, les yeux ou la queue). Si un animal montre des signes de souffrance trop importants (par exemple, s’il perd plus de 20 % de son poids après une chirurgie ou présente des tumeurs), il sera retiré immédiatement de l’étude et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le rat de la souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux adultes entre 8-12 semaines. Des animaux adultes sexuellement matures sont requis pour étudier l'influence du cycle hormonal.
Evaluation de l’efficacité de candidats vaccins contre la parvovirose canine par suivi de la réponse immunitaire et possible épreuve chez le chien 1/2
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Vaccinés sous la peau, puis soumis à des prises de sang une à deux fois par semaine pendant jusqu'à vingt-quatre semaines, 80 chiots relèvent du volet sérologique d'un essai de vaccins contre la parvovirose canine. 72 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 8 un niveau sévère, 59 étant gardés vivants pour réutilisation ou adoption, les autres tués. L'essai vise à démontrer qu'un vaccin déclenche une réponse immunitaire chez des chiots dont les anticorps maternels bloquent l'immunisation, ce qui suppose de les vacciner dès quatre semaines. La phase d'épreuve, où le virus est administré par voie oro-nasale sous anesthésie, n'est déclenchée que "si besoin", et le RNT ne dit ni combien de chiots y passeront ni ce qui fera basculer l'essai vers cette étape.
Objectifs
Le projet sera réalisé sur 2 sites. Un site d'élevage où se déroulera partie efficacité sérologique (EU1) et un autre site (EU2) pour la partie efficacité par épreuve. Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité immédiate vis-à-vis des anticorps maternels de candidats vaccins contre la parvovirose canine chez le jeune chien. Chez le jeune animal, la réaction immunitaire après une vaccination peut être freinée par la présence des anticorps maternels transmis par la mère (elle-même vaccinée), ce qui entraine une mauvaise immunisation des chiots contre la maladie. Ce projet vise à évaluer la capacité de candidats vaccin à entrainer une production d’anticorps efficace et suffisante contre la maladie chez des jeunes chiens conventionnels (dont les mères ont été vaccinées contre la maladie). Cette efficacité sera évaluée par suivi de la réponse immunitaire et si besoin, par une phase d’épreuve après administration du vaccin. L’épreuve consiste en l’administration de l’agent pathogène contre lequel sont dirigés les candidats vaccins. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation.
Bénéfices attendus
La finalité de cette étude est de permettre le développement d’un vaccin efficace précocement contre la parvovirose canine, qui reste une pathologie majeure/sévère sur des chiots de jeunes âges.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 fois sur tous les animaux vigiles des groupes vaccinés en vigile par voie sous cutanée, acte inférieur à 1 minute. (EU1) - Administration de l’agent pathogène : en oro-nasale sous anesthésie, 1 sur tous les animaux de la procédure 2, acte inférieur à 5 minutes (EU2) - Prélèvements sanguins : acte inférieur à 1 minute, sur animaux vigiles (EU1 et EU2) o Pendant la procédure 1 : 1 à 2 (cas exceptionnel) par semaine pendant maximum 10 semaines (jusqu’à obtention des intervalles d’anticorps maternels souhaités) (EU1) o Pendant la procédure 2 : 1 à 2 fois par semaine, pendant maximum 24 semaines (jusqu’à ce que le groupe contrôle soit sensible à l’épreuve) (EU1) o Pendant la procédure 3 : 1 à 4 fois par semaine pendant 3 semaines (1 semaine baseline + 14 jours épreuve) (EU2) - Ecouvillons rectaux : 1 par jour pendant 14 jours sur tous les animaux de la procédure 3, sur animauxen vigiles, acte inférieur à 1 minute. (EU2)
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement une douleur légère et transitoire au point d’introduction de l’aiguille. - Stress lié au transport. - L’administration oro-nasale peut provoquer des éternuments et/ou une gêne respiratoire momentanée. - Les écouvillons rectaux peuvent provoquer une gêne pour l’animal. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (diarrhées, vomissements) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Les animaux non sélectionnés, du fait d'un taux antiparvovirose trop bas, seront gardés en vie et pourront être réutilisés et/ou adoptés. Dans le cas où certains animaux doivent être utilisés pour la phase d'efficacité par épreuve, ceux-ci devront être euthanasiés pour des raisons de biosécurité après administration d’un agent pathogène ARG2.
Remplacement
La première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats, ce qui permet une première sélection, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie. Le produit testé est un candidat vaccin vivant atténué qui a déjà démontré une certaine efficacité sur des animaux SPF. Il s’agit maintenant de démontrer son efficacité - seul ou couplé - sur des animaux conventionnels c’est à dire en présence d’anticorps maternels. L’étude visant à évaluer l’efficacité du vaccin face aux anticorps maternels présents, le recours à l’espèce cible est à l’heure actuelle indispensable, car il n’existe pas de modèle pouvant reproduire les interactions existantes entre les anticorps maternels, le vaccin administré et la réponse immunitaire en découlant.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans la procédure 1 de screening est calculé de manière à obtenir un nombre suffisant de chiots avec un taux d’anticorps maternels anti-CPV permettant l’inclusion dans la procédure 2, en se basant sur des données obtenues historiquement (cf détail §3.4.10). En cas de vaccination avant sevrage des animaux (l’âge de vaccination dépendant d’un taux de MAB cible), les animaux seront inclus dans les procédures 2 et 3 par portées; le nombre de chiots dans ces procédures sera donc fonction du nombre de chiots par portée. Dans tous les cas, le nombre minimum de chiots/groupe sera de 8 dans les lots vaccinés et de 5 dans le lot contrôle, nombre minimal pour garantir la validité des résultats obtenus et limiter l’impact de la variabilité des anticorps maternels au niveau du groupe. Ce nombre a été calculé en se basant sur les exigences de la Pharmacopée Européenne et sur l’historique des études précédentes.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’au moins 4 jours est prévue. Si les chiots sont déjà hébergés avec leur mère avant le début des procédures, la période d’acclimatation ne sera pas nécessaire. Les conditions d’hébergement seront adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe ou par portée. Des enrichissements adaptés au milieu seront mis en place : litière, jouet, panier ou tunnel/plateforme. La contention et les actes techniques seront réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils pourront avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour la phase vaccinale, les animaux seront hébergés dans un milieu protégé pour éviter toutes contamination des animaux non vaccinés par un virus sauvage ou une souche vaccinale provenant d’animaux vaccinés sur le même site. Dans tous les cas, les animaux sont suivis quotidiennement voire biquotidiennement en période de phase critique. Des points limites spécifiques de la parvovirose sont appliqués.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible d’un vaccin contre la parvovirose canine, et le jeune chien est le modèle optimal pour évaluer l’efficacité d’un vaccin vis-à-vis des anticorps maternels. Des chiots à partir de 2 semaines seront prélevés afin d’évaluer et de suivre les taux d’anticorps maternels anti-CPV. Des chiots à partir de 4 semaines d’âge et possédant un taux d’anticorps maternels contre CPV élevés seront inclus dans la procédure 2 (vaccination pouvant être réalisée jusqu’à 8-9 semaines d’âge). Pour pouvoir évaluer l’efficacité de candidat vaccin vis-à-vis des anticorps maternels, il est nécessaire d’utiliser des chiots ayant encore un taux élevé d’anticorps maternels. La cible est fixée pour une vaccination des animaux à des titres forts rencontrés lors des schémas de vaccination classique contre la parvovirose. Ces titres peuvent être obtenus à partir de 4 semaines d’âge, il est donc nécessaire de commencer à suivre les titres d’anticorps de manière précoce (2 semaines d’âge).
Cibler les signaux synaptiques « Mangez-moi » pour prévenir l’engloutissement synaptique excessif par la microglie et réduire la perte synaptique dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
505 souris porteuses de mutations Alzheimer vont être utilisées, chacune recevant une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, passant trois demi-journées de tests comportementaux, puis subissant une chirurgie terminale. 300 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 205 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Environ 15 % développent une paralysie des membres postérieurs, d'autres de l'épilepsie, une hydrocéphalie ou une malocclusion. Le porteur annonce trois tests destinés à explorer mémoire et anxiété sans préciser lesquels, et avance qu'un traitement retardant la maladie de cinq ans diviserait par deux le nombre de cas, projection qui reste à démontrer.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle aucun remède n’existe à ce jour. Dans la MA, la perte des synapses (connexion entre les neurones) est le principal moteur du déclin cognitif. Des données récentes mettent en évidence le rôle central des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans cette perte synaptique, via un excès de phagocytose (destruction) des synapses par les microglies. Cela pourrait ouvrir la voie à des applications thérapeutiques ciblant le signal aberrant de type « mange-moi » émis par les synapses à destination des microglies, ce qui constitue l’objectif principal de ce projet. L’objectif global est de réduire la perte synaptique dans la maladie d'Alzheimer et de ralentir le déclin cognitif. Ce projet a pour but de tester deux molécules développées par l’équipe, conçues pour convertir le signal aberrant « mange-moi » des synapses en un signal « ne me mange pas », empêchant ainsi une phagocytose synaptique excessive par les microglies. Sur la base de résultats préliminaires prometteurs obtenus in vitro, nous souhaitons désormais évaluer l’impact de ces molécules sur la perte synaptique et neuronale dans un modèle murin de MA, ainsi que leurs effets sur la fonction cognitive, l’activité et la structure synaptique et les modifications protéiques, notament dans les synapses affectées par la MA.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la perte des synapses (connexions entre les neurones) dans la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la transformation du signal aberrant « mange-moi » des synapses en un signal « ne me mange pas », empêchant ainsi la destruction excessive des synapses par les microglies qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
Tous les animaux subiront une anesthésie gazeuse (5 minutes maximum) afin de recevoir une injection intraveineuse unique dans le sinus rétroorbitaire. Tous les animaux subiront 3 tests comportementaux pendant 3 demi-journées et une chirurgie terminale sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital peut générer une douleur, un saignement ou une inflammation. Tous les animaux subiront 3 tests comportementaux pouvant entrainer un stress, destinés à explorer leurs capacités de mémorisation et leur niveau d'anxiété.Notre modèle de la maladie d'Alzheimer peut développer une paralysie des membres postérieurs qui pourra à la longue les empêcher d'accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Ces souris peuvent aussi faire de l'épilepsie, de l’hydrocéphalie et de la malocclusion (mauvais alignement des dents) qui pourront générer de la souffrance, du stress et une perte de poids. En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives mais peuvent être stressantes pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique ainsi que les pathologies alzheimer sont très/assez difficiles à obtenir in vitro. Les souris modèles de la maladie d'Alzheimer du projet représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin. De plus, les modèles de test comportementaux n'étant pas possible in vitro, l’utilisation d’un animal qui développe des altérations mnésiques similaires à celles observées dans la MA est donc nécessaire, avec des capacités mnésiques mesurables.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Nous utiliserons mâles et les femelles témoins et les souris modèles de MA.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Au cours de l'injection rétro-orbitaire, chaque souris sera préalablement anesthésiée au sévoflurane et recevra une goutte d'anesthésique local en collyre dans l’oeil. Suite aux injections rétro-orbitaires, une attention particulière sera accordée aux yeux lors de l'observation quotidienne afin d'identifier de possibles effets indésirables (oeil fermé, saignement, inflammation…). Les souris MA développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Environ 15% des souris MA développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois. Les premiers signes sont la rétraction des membres postérieurs quand la souris est soulevée par la queue. Au début, les souris sont entièrement ambulatoires et peuvent accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Cela peut évoluer vers une faiblesse des membres postérieurs et éventuellement une paralysie. A ce stade de la nourriture humidifiée et/ou du gel hydratant seront disposés à l’intérieur de la cage. Les souris sont observées quotidiennement pour leur capacité à atteindre la nourriture et l'eau. Ce processus, lorsqu'il se produit, progresse au cours des semaines à plus d'un mois. Critères d’euthanasie : signes de douleur persistante (animal prostré, dos courbé, etc.) ou incapacité à se déplacer pour boire ou manger. Notre objectif est de les amener à 10 mois maximum. Les souris MA sont sensibles au bruit et à la manipulation. Si une crise épileptique se produit, nous laisserons la souris récupérer et observerons 5 minutes. Si elle est incapable de se remettre d'une crise, elle sera euthanasiée. Habituellement, les souris récupèrent et se comportent normalement. Si la souris développe une hydrocéphalie, elle sera euthanasiée. Si une malocclusion est identifiée, la souris sera évaluée. Une malocclusion dentaire empêche l’usure normale des dents qui poussent en continu, entraînant des douleurs, des blessures et une incapacité à s’alimenter. Les dents seront taillées chaque semaine par le personnel animalier et le poids sera surveillé.
Choix des espèces
Les souris modèles Alzheimer constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, les pathologies cérébrales, ainsi que la neurodégénérescence progressive responsable des troubles cognitifs dans la maladie Alzheimer sont très difficilement modélisables in vitro et nécessites des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. - Une cohorte sera utilisée de 4/5 mois à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la maladie sans neurodégénérescence mais avec pathologies Alzheimer. - Une cohorte sera utilisée de 4/5 mois à 10 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la maladie avec neurodégénérescence résultant des pathologies Alzheimer. Les cohortes seront composées de mâles et de femelles.
Induction et suivi des modèles de colite chez le rat ou la souris pour évaluer le rôle des protéases et leurs récepteurs dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 1800
L'état général des animaux est observé au minimum une fois par semaine, et tout individu atteignant un point limite est tué. 5 760 souris et rats vont être utilisés dans des modèles de colite, dont 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever le colon et l'iléon. La colite provoque perte de poids, diarrhée, sang dans les fèces et hypersensibilité viscérale. Les animaux subissent jusqu'à sept endoscopies sous anesthésie, un gavage pouvant aller jusqu'à deux fois par jour pendant deux mois, et des administrations intracoliques pratiquées sur rat vigile en contention, avec un risque de perforation de l'intestin. L'objet est de tester des molécules candidates contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, et le porteur précise qu'aucun logiciel ni test statistique n'a servi à fixer l'effectif, son expérience des modèles lui suffisant.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) se caractérisent par une inflammation du tractus gastrointestinal. Il existe deux pathologies : la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces pathologies touchent entre cinq et six personnes sur 100 000. Elles débutent généralement chez le jeune adulte et touchent indifféremment les deux sexes. Les traitements disponibles aujourd’hui sont soit des traitements symptomatiques, soit reposant sur des actes chirurgicaux. Les causes des MICI sont encore mal connues. Les modèles animaux ont grandement enrichi notre compréhension de nombreuses pathologies intestinales. En plus d'améliorer la compréhension de la maladie, les modèles animaux sont également utilisés de manière importante pour tester les nouveaux médicaments ainsi que pour les interventions diagnostiques ou thérapeutiques précliniques. Des techniques d'imagerie sophistiquées ont été développées afin de surveiller l'activité de la maladie chez la souris. Ces techniques endoscopiques permettent une visualisation directe de l'inflammation intestinale ou la cicatrisation des plaies. Ce processus donne un état objectif en temps réel permettant des études chez le même animal à des moments répétés. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques pour les MICI chez le rat et la souris. Le modèle utilisé sera adapté aux cibles thérapeutiques à évaluer.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes de l'inflammation dans les modèles de colite est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre projet vise a évaluer le rôle de récepteurs activés par les protéases et des protéases elles mêmes dans les modèles de colite.
Procédures
- endoscopie sur animal anesthésié (au minimum 2 fois maximum 7 fois) durée : 15 minutes par endoscopie - gavage minimum 1 fois sur la durée de l'expérimentation (2 mois maximum), maximum 2 fois par jour quotidiennement durée: 1 minute par geste - prélèvement de sang sur animal anesthésié 1 fois sur la durée de l'expérimentation (2 mois maximum), maximum 1 fois par semaine durée: 5 minutes par geste - administration intracolique de produit sur souris anesthésiée minimum 1 fois maximum 4 fois durée 2 minutes par geste - administration intracolique sur rat vigile en contention minimum 1 fois maximum 4 fois durée 3 minutes par geste - administration intrapéritonéale sur animal vigile 2 fois (1 fois par jour, 2 jours consécutifs) durée 1 minute par geste -administration cutanée sur animal vigile (1 fois par jour, 2 jours consécutifs) durée 1 minute par geste)
Impact sur les animaux
L'induction de la colite est caractérisée par la perte de poids des animaux, l'apparition de diarrhée et de sang dans les féces ainsi qu'une douleur et hypersensibilité viscérale. L'administration intracolique chez le rat vigile et le gavage peuvent induire du stress. L'endoscopie et les biospsies sont réalisées sous anesthésie mais il y a un risque de perforation de l'intestin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus (colon, ileon).
Remplacement
La colite est une réaction integrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’experimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'inflammation intestinale. Dans le cadre de ce projet, l’expérimentation animale est indispensable.
Réduction
La technique d'endoscopie utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux). De plus, les résultats obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: avant traitement versus après traitement). Les tests statistiques utilisés peuvent comparer les mesures sur le même individu ou entre individus. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Aucun logiciel ou test statistique n'ont été utilisé mais notre expérience de ces modèles nous permet de connaitre le nombre d'animaux minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. Les souris sont anesthésiées lors des administrations intracoliques et du prélèvement de sang.
Choix des espèces
Chaque espèce présente une sensibilité différente pour les différents modèles. Dans le but d’une plus grande homogénéité des réponses et donc pour limiter le nombre d’animaux nécessaire, nous utiliserons des espèces «sensibles » (plus reproductibles). Ainsi, en fonction du modèle : des rats (espèce pour laquelle le modèle est plus reproductible) et/ou des souris (le choix rat ou souris dépendra du mécanisme et/ou cible de la molécule à tester). De plus nous avons des souris transgéniques pour des protéases d'interet. 3 modèles seront réalisés car ils miment chacun des pathologies différentes. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. Leur métabolisme, leur système immunitaire et leur physiologie étant stabilisés nous auront ainsi moins de variation que sur des jeunes animaux.
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Evaluation de l’efficacité de candidats vaccins contre la parvovirose canine par suivi de la réponse immunitaire et possible épreuve chez le chien 2/2
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Un écouvillon rectal par jour pendant quatorze jours, et des prises de sang jusqu'à deux fois par semaine pendant vingt-quatre semaines : 80 chiens vont être utilisés dans un essai de candidats vaccins contre la parvovirose canine. 72 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 8 un niveau sévère, 59 étant gardés vivants pour être réutilisés ou adoptés quand les autres sont tués pour raisons de biosécurité. L'épreuve consiste à inoculer le parvovirus par voie oro-nasale après vaccination, et les chiots du groupe témoin, non vaccinés, peuvent développer diarrhées et vomissements sévères. Le porteur indique que le recours à l'espèce cible est "indispensable" et que des chiots doivent être prélevés dès l'âge de deux semaines pour suivre leur taux d'anticorps maternels.
Objectifs
Le projet sera réalisé sur 2 sites. Un site d'élevage où se déroulera partie efficacité sérologique (EU1) et un autre site (EU2) pour la partie efficacité par épreuve. Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité immédiate vis-à-vis des anticorps maternels de candidats vaccins contre la parvovirose canine chez le jeune chien. Chez le jeune animal, la réaction immunitaire après une vaccination peut être freinée par la présence des anticorps maternels transmis par la mère (elle-même vaccinée), ce qui entraine une mauvaise immunisation des chiots contre la maladie. Ce projet vise à évaluer la capacité de candidats vaccin à entrainer une production d’anticorps efficace et suffisante contre la maladie chez des jeunes chiens conventionnels (dont les mères ont été vaccinées contre la maladie). Cette efficacité sera évaluée par suivi de la réponse immunitaire et si besoin, par une phase d’épreuve après administration du vaccin. L’épreuve consiste en l’administration de l’agent pathogène contre lequel sont dirigés les candidats vaccins. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation.
Bénéfices attendus
La finalité de cette étude est de permettre le développement d’un vaccin efficace précocement contre la parvovirose canine, qui reste une pathologie majeure/sévère sur des chiots de jeunes âges.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 fois sur tous les animaux vigiles des groupes vaccinés en vigile par voie sous cutanée, acte inférieur à 1 minute. (EU1) - Administration de l’agent pathogène : en oro-nasale sous anesthésie, 1 sur tous les animaux de la procédure 2, acte inférieur à 5 minutes (EU2) - Prélèvements sanguins : acte inférieur à 1 minute, sur animaux vigiles (EU1 et EU2) o Pendant la procédure 1 : 1 à 2 (cas exceptionnel) par semaine pendant maximum 10 semaines (jusqu’à obtention des intervalles d’anticorps maternels souhaités) (EU1) o Pendant la procédure 2 : 1 à 2 fois par semaine, pendant maximum 24 semaines (jusqu’à ce que le groupe contrôle soit sensible à l’épreuve) (EU1) o Pendant la procédure 3 : 1 à 4 fois par semaine pendant 3 semaines (1 semaine baseline + 14 jours épreuve) (EU2) - Ecouvillons rectaux : 1 par jour pendant 14 jours sur tous les animaux de la procédure 3, sur animauxen vigiles, acte inférieur à 1 minute. (EU2)
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement une douleur légère et transitoire au point d’introduction de l’aiguille. - Stress lié au transport. - L’administration oro-nasale peut provoquer des éternuments et/ou une gêne respiratoire momentanée. - Les écouvillons rectaux peuvent provoquer une gêne pour l’animal. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (diarrhées, vomissements) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Les animaux non sélectionnés, du fait d'un taux antiparvovirose trop bas, seront gardés en vie et pourront être réutilisés et/ou adoptés. Dans le cas où certains animaux doivent être utilisés pour la phase d'efficacité par épreuve, ceux-ci devront être euthanasiés pour des raisons de biosécurité après administration d’un agent pathogène ARG2.
Remplacement
La première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats, ce qui permet une première sélection, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie. Le produit testé est un candidat vaccin vivant atténué qui a déjà démontré une certaine efficacité sur des animaux SPF. Il s’agit maintenant de démontrer son efficacité - seul ou couplé - sur des animaux conventionnels c’est à dire en présence d’anticorps maternels. L’étude visant à évaluer l’efficacité du vaccin face aux anticorps maternels présents, le recours à l’espèce cible est à l’heure actuelle indispensable, car il n’existe pas de modèle pouvant reproduire les interactions existantes entre les anticorps maternels, le vaccin administré et la réponse immunitaire en découlant.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans la procédure 1 de screening est calculé de manière à obtenir un nombre suffisant de chiots avec un taux d’anticorps maternels anti-CPV permettant l’inclusion dans la procédure 2, en se basant sur des données obtenues historiquement (cf détail §3.4.10). En cas de vaccination avant sevrage des animaux (l’âge de vaccination dépendant d’un taux de MAB cible), les animaux seront inclus dans les procédures 2 et 3 par portées; le nombre de chiots dans ces procédures sera donc fonction du nombre de chiots par portée. Dans tous les cas, le nombre minimum de chiots/groupe sera de 8 dans les lots vaccinés et de 5 dans le lot contrôle, nombre minimal pour garantir la validité des résultats obtenus et limiter l’impact de la variabilité des anticorps maternels au niveau du groupe. Ce nombre a été calculé en se basant sur les exigences de la Pharmacopée Européenne et sur l’historique des études précédentes.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’au moins 4 jours est prévue. Si les chiots sont déjà hébergés avec leur mère avant le début des procédures, la période d’acclimatation ne sera pas nécessaire. Les conditions d’hébergement seront adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe ou par portée. Des enrichissements adaptés au milieu seront mis en place : litière, jouet, panier ou tunnel/plateforme. La contention et les actes techniques seront réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils pourront avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour la phase vaccinale, les animaux seront hébergés dans un milieu protégé pour éviter toutes contamination des animaux non vaccinés par un virus sauvage ou une souche vaccinale provenant d’animaux vaccinés sur le même site. Dans tous les cas, les animaux sont suivis quotidiennement voire biquotidiennement en période de phase critique. Des points limites spécifiques de la parvovirose sont appliqués.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible d’un vaccin contre la parvovirose canine, et le jeune chien est le modèle optimal pour évaluer l’efficacité d’un vaccin vis-à-vis des anticorps maternels. Des chiots à partir de 2 semaines seront prélevés afin d’évaluer et de suivre les taux d’anticorps maternels anti-CPV. Des chiots à partir de 4 semaines d’âge et possédant un taux d’anticorps maternels contre CPV élevés seront inclus dans la procédure 2 (vaccination pouvant être réalisée jusqu’à 8-9 semaines d’âge). Pour pouvoir évaluer l’efficacité de candidat vaccin vis-à-vis des anticorps maternels, il est nécessaire d’utiliser des chiots ayant encore un taux élevé d’anticorps maternels. La cible est fixée pour une vaccination des animaux à des titres forts rencontrés lors des schémas de vaccination classique contre la parvovirose. Ces titres peuvent être obtenus à partir de 4 semaines d’âge, il est donc nécessaire de commencer à suivre les titres d’anticorps de manière précoce (2 semaines d’âge).
Evaluation de radiotraceurs dans des modèles de mélanome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
Toutes tuées en fin d'expérience pour que leurs tumeurs et leurs organes soient prélevés, 2 160 souris vont être utilisées dans l'évaluation de radiotraceurs contre le mélanome. 1 560 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 600 d'un niveau sévère. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie, une injection de radiotraceur et jusqu'à quatre examens d'imagerie nucléaire de 45 minutes, nuisances que le porteur qualifie toutes de légères, y compris la gêne fonctionnelle liée à la tumeur. Sur le remplacement, il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant", et prévoit d'utiliser les animaux sans prise tumorale pour la formation du personnel ou pour constituer une banque d'organes.
Objectifs
Les mélanomes avancés demeurent associés à un sombre pronostic et la recherche de nouvelles thérapies plus efficaces est plus que jamais d’actualité. Notre projet a pour but de développer des radiotraceurs spécifiques des cellules tumorales pigmentées associant des ligands de la mélanine à un isotope radioactif. Ainsi, leur profil de biodistribution sur modèles murins de mélanome sera évalué. Les radiotraceurs les plus pertinents en termes de stabilité et de profil de biodistribution (fortes affinité et spécificité pour la cible tumorale, faible accumulation dans les organes sains) feront l’objet d’une étude d’efficacité antitumorale in vivo afin de démontrer la pertinence de notre approche en vue d’un transfert clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à établir une preuve de concept préclinique de l’intérêt d’un radiotraceur pour la radiothérapie interne vectorisée des mélanomes avancés. Ce traitement ciblé, qui s’adresse à la maladie disséminée, est particulièrement bien adapté à cette pathologie et pourrait apporter une réponse efficace aux patients en échec thérapeutique ou non éligibles aux traitements actuels.
Procédures
- 1 injection de cellules (durée
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : - Une douleur ou inflammation locale liée à l’inoculation des cellules tumorales sous anesthésie, réduite à une dizaine de secondes (nuisance légère). - Une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur (nuisance légère). - Le stress modéré lors de l’injection de la molécule radioactive dans un appareil de contention, réduite à une dizaine de secondes car réalisée par un expérimentateur expert (nuisance légère). - Le stress léger dû à l’induction de l’anesthésie (nuisance légère).
Devenir
Afin de caractériser l'effet de nos traitements notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tumeurs, ainsi que celles des tissus des autres organes est indispensable pour évaluer les effets anti tumoraux mais également la toxicité des traitements testés.
Remplacement
Les molécules seront sélectionnées en amont selon leur affinité à la mélanine et leur stabilité dans du sérum de souris. Le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules diagnostiques et/ou thérapeutiques requièrent la détermination de paramètres de biodistribution des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.
Réduction
Selon nos expériences antérieures, le modèle tumoral présente dans 20% des cas aucune ou peu de prise tumorale, cela a donc été intégré dans nos calculs de taille. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. L'approche statistique consistera en une analyse non paramétrique suivant le nombre de groupe à comparer. De plus, les examens d’imagerie sont des méthodes non invasives qui permettent également de réduire le nombre d’animaux grâce à la possibilité d’un suivi longitudinal où un animal est son propre contrôle au cours du temps. Les animaux non inclus dans les procédures (pas de prise tumorale…) seront utilisés pour la formation du personnel ou la création de banque d’organes pour des mises au point techniques.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux inclus dans ce projet, nous mettons à disposition un enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette dans chacune des cages. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période d’acclimatation de 5 jours est définie afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils seront habitués à la contention et à l’appareillage de contention pour les injections intraveineuses dès la fin de la période d’acclimatation. De plus, certains gestes seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Ils seront habitués à la présence de nourriture humide dans le fond de la cage pour une meilleure prise en charge non médicamenteuse des éventuelles gênes liées à l’inoculation des cellules. La surveillance quotidienne permettra de visualiser l’état général des animaux et de réagir rapidement en cas de signe d'inconfort, de stress ou de souffrance grâce à l’évaluation des points limites. Des mesures de poids et de taille tumorale seront réalisées 2 fois par semaine. Si besoin, une injection d'antalgiques sera réalisée. En cas d'atteinte d'un des points limites, l'animal sera mis à mort. Les gestes techniques sont optimisés grâce à un programme de formation et de tutorat ainsi qu’au suivi des compétences techniques du personnel ce qui permet de limiter le stress des animaux et augmenter la précision et la rapidité des gestes.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer pour lequel on peut avoir un suivi de la croissance tumorale et une évaluation de la biodistribution des radiotraceurs. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront réceptionnés dans l’animalerie, les expérimentations seront réalisées après une période d’acclimatation de 5 jours.
Développement d’une nouvelle thérapie génique ciblant la production de leptine adipeuse pour traiter le syndrome de Rett
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tester une thérapie génique visant la leptine dans le syndrome de Rett conduit à utiliser 510 souris modifiées pour développer les symptômes de la maladie. 375 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 135 un niveau sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Biopsie de la queue vers le dixième jour de vie, injection sous-cutanée au vingtième, un ou deux prélèvements sanguins, puis tests moteurs, cognitifs et sociaux, mesure de l'activité respiratoire et suivi de l'épileptogenèse entre le 45e et le 50e jour. Les souris mâles ont une espérance de vie réduite à deux mois et le porteur annonce qu'il évaluera l'effet du traitement sur cette durée de vie, les animaux étant tués quand une grille de score signale une dégradation de leur apparence ou une perte de poids.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Ce syndrome entraîne un polyhandicap qui se manifeste par une déficience intellectuelle sévère, infirmité motrice, des troubles respiratoires et présence d’activité épileptique. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif de la maladie. Diverses thérapies géniques ou pharmacologiques sont envisagées pour traiter ce syndrome. Notre objectif est de développer une nouvelle thérapie génique ciblant la leptine. La leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux, capable d’agir au niveau du cerveau et de contrôler de nombreuses fonctions physiologiques telles que la prise alimentaire, le métabolisme, les activités respiratoires et cardio-vasculaires, l’anxiété, les fonctions cognitives et la susceptibilité à l’épilepsie. Ces fonctions sont affectées chez les patients atteints du syndrome de Rett et chez les modèles murins de la pathologie, ce qui soulève la possibilité que des niveaux excessifs de leptine puissent contribuer à la progression du syndrome de Rett. En accord avec cette hypothèse, des taux élevés de leptine circulante ont été observés chez des patients atteints du syndrome de Rett et dans des modèles murins. Notre objectif est de tester le rôle de l’hormone adipocytaire, leptine, dans les troubles associés au syndrome de Rett sur un modèle murin, au niveau comportemental et neuronal.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet pre-clinique est de démontrer un rôle de la leptine dans l’etiologie du syndrome de Rett et d'ouvrir vers le développement d'une nouvelle approche thérapeutique pour traiter cette maladie qui devra être tester dans d'autres étdues cliniques.
Procédures
Dans ce projet, nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes et troubles décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Ces souris seront générées et élevées au laboratoire. Un prélèvement de poils pour le génotypage et une injection sous-cutanée seront réalisées chez les animaux mâles et femelles au sevrage (20-21ieme jour de vie postnatale). Certains animaux seront soumis à un (au 40ieme jour de vie) ou deux (au 30ieme et 40ieme jour de vie) prélèvement(s) sanguin(s). Des analyses comportementales (moteur, cognitif et social), physiologique (activité respiratoire) et pathologique (épileptogenèse) seront réalisées entre le 45ieme et 50ieme jour de vie postnatale. Nous évaluerons également les effets du traitement sur l’espérance de vie des animaux, d’une durée moyenne de 2 mois chez les animaux non-traités. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les symptômes seront rapportés sur une grille de score nous permettant de définir le point limite d'euthanasie afin de limiter leur souffrance.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour présenter les symptômes observés chez les patients souffrant du syndrome de Rett. Ces symptômes, qui apparaissent vers le 30ieme jour de vie, sont des difficultés respiratoires, des troubles locomoteurs et cognitifs, des activités épileptiques (chez les souris femelles), et une perte de poids (uniquement chez les souris mâles). Les souris mâles présentent une espérance de vie réduite de 2 à 3 mois. Une biopsie de la queue sera effectuée vers le 10iéme jour de vie pour définir le génotype des animaux ce qui entrainera une douleur légère de courte durée. Les animaux recevront une injection sous-cutanée au 20ieme jour de vie. Certains animaux seront soumis à un (au 40ieme jour de vie) ou deux (au 30ieme et 40ieme jour de vie) prélèvement(s) sanguin(s). Ces injectons et prélèvements devraient provoquer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
Dans toutes les procédures, les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être. En fonction de l’évolution de différents critères comme par exemple l’apparence de l’animal ou une perte de poids, les animaux seront euthanasiés pour réduire toute forme de souffrance. Tous les animaux utilisés pour l'analyse comportementale seront euthanasiés à la fin de l'étude.
Remplacement
Seule l'expérimentation chez l'animal permettra de remplir les objectifs de ce projet. Il n'est actuellement pas possible par des méthodes in vitro (non animales) de reproduire les processus pathologiques complexes du syndrome de Rett. L’organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux ne peuvent être reproduits dans des modèles de lignées cellulaires ou de cultures neuronales.
Réduction
Des calculs statistiques utilisant les données d'études antérieures ont été utilisés pour calculer le nombre minimum d'animaux requis tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres au niveau comportemental et neuronal, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements de l’activité nerveuse, 2 chercheurs seront mobilisés. La présence de 2 chercheurs pour ces enregistrements permettra d’augmenter le nombre de neurones enregistrés par animal, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés pour atteindre une taille de l’échantillon permettant une analyse statistique.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement via l’observation de leur aspect général (poil hirsute, position voûtée, yeux) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation). Le suivi de leur poids sera également un critère. Lorsque les points limites sont atteints (signes visibles de la maladie, perte ou prise de poids excessive) les animaux seront euthanasiés. L'équipe continuera à examiner les dernières découvertes afin d'identifier toute nouvelle possibilité d'affiner l'expérience de ces animaux, tout en atteignant les objectifs de l'étude. Nous respecterons un délai de 15 jours entre les deux prélèvements pour éviter toutes complications (choc hypovolémique, et anémie). Dans le cas peu probable où une anémie serait observée, nous cesserons immédiatement les prélèvements. Dans le cas peu probable où un choc hypovolémique serait observé, l’animal sera euthanasié. Les animaux destinés à l’analyse comportementale seront habitués à la manipulation par l’expérimentateur. Les animaux seront anesthésiés avant d’être euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, son rythme rapide de reproduction et une gestation courte par rapport à d’autres organismes-modèles. De nombreux animaux existent permettant par exemple de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans différentes pathologies. Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Il s’agit donc d’un modèle pertinent concernant les objectifs du présent projet. Pour ce projet, les analyses comportementales et neuronales seront réalisées à partir du 40ieme jour de vie, qui correspond à la période d'apparition et d'aggravation des symptômes.