Procédures sévères

Opérés à l'âge de sept jours pour réduire l'afflux de sang à leur cerveau, puis placés quatre-vingt-dix minutes dans une chambre pauvre en oxygène, des ratons subissent une lésion cérébrale durable. Une partie passe ensuite trois heures en hypothermie contrôlée, reçoit des injections quotidiennes de J7 à J9, parfois pendant deux semaines, et enchaîne les tests moteurs jusqu'à J16 : redressement, marche, géotaxie, grille, suspension à un fil. 2 760 rats vont être utilisés, dont 2 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec des déficits moteurs et cognitifs attendus et une prise de poids ralentie. Tous seront tués pour que leurs cerveaux soient prélevés et analysés.

Objectifs

Trois à cinq nourrissons sur 1 000 souffrent d'hypoxie-ischémie à la naissance. L’hypoxie correspond à un défaut d’apport d’oxygène et l’ischémie un défaut d’afflux sanguin au cerveau. Les causes courantes sont des complications pendant l’accouchement (cordon ombilical autour du cou, rupture utérine…), des problèmes chez la mère (hypertension, diabète gestationnel, infections) ou chez le nouveau-né (prématurité, infections…). Il se développe alors chez le nourrisson une lésion cérébrale. Cet événement est une cause majeure de handicap persistant, voire de mortalité périnatale. En effet, 40 à 60% des enfants ayant souffert d’hypoxie-ischémie néonatale meurent avant 2 ans de vie ou présentent des déficits neurologiques sévères. Ces déficits neurologiques à long terme sont principalement des troubles de l'apprentissage et des retards intellectuels mais également de l’épilepsie, des troubles de la vision ou de l’audition. Le seul traitement validé et utilisé en clinique est l’hypothermie thérapeutique. La température corporelle du nourrisson est réduite pour ralentir le métabolisme ce qui donne au cerveau une chance de récupérer. Malheureusement près d'un nouveau-né sur deux n'y répond pas favorablement. En plus de son efficacité partielle, l'hypothermie a une fenêtre d'action limitée puisqu’elle doit être initiée dans les 6 heures suivant la naissance et est responsable d’effets indésirables comme des troubles cardiovasculaires, respiratoires, des convulsions… Ces effets potentiels imposent une surveillance médicale étroite des nouveau-nés en hypothermie thérapeutique. Nous avons développé des candidats médicaments qui agissent sur plusieurs mécanismes neuroprotecteurs dans le cerveau. Nous avons déjà montré chez un modèle rongeur juvénile que nos composés réduisent les lésions cérébrales et les séquelles à long terme de l’hypoxie-ischémie du nouveau-né. Notre objectif est maintenant de démontrer, toujours chez le modèle rongeur juvénile, que nos candidats médicaments peuvent agir en synergie avec l'hypothermie thérapeutique afin d’augmenter la survie des nouveau-nés souffrant d’hypoxie-ischémie et diminuer les potentielles séquelles neurologiques.

Bénéfices attendus

Un traitement médicamenteux pour les lésions hypoxiques-ischémiques néonatales pourrait apporter plusieurs bénéfices significatifs : - réduction de l’incidence et de la gravité des séquelles neurologiques à long terme, telles que la paralysie cérébrale, les troubles cognitifs et les retards de développement ; - amélioration de la qualité de vie des enfants affectés et de leurs familles, en diminuant le besoin de soins spécialisés et de rééducation ; - élargissement de la fenêtre thérapeutique : Si le nouveau traitement peut être administré plus tardivement que l'hypothermie (qui doit être initiée dans les 6 heures suivant la naissance), il pourrait bénéficier à un plus grand nombre de nouveau-nés, y compris ceux qui ne peuvent pas recevoir immédiatement des soins spécialisés ; - Possible effet synergétique réduîsant la durée ou l’intensité de l’hypothermie et minimisant ainsi les effets secondaires comme les troubles cardiovasculaires ou respiratoires. - Personnalisation des soins qui pourraient être adaptés à chaque cas : le traitement médicamenteux pourrait être utilisé en complément ou comme alternative à l'hypothermie ; - Réduction des coûts pour les familles et les systèmes de santé, en diminuant la nécessité de soins intensifs prolongés et de rééducation à long terme ;. - Accessibilité dans les régions où les équipements pour l'hypothermie thérapeutique ne sont pas disponibles. En parallèle, le développement d’un tel médicament pourrait également contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de la pathologie, ouvrant la voie à d'autres innovations thérapeutiques.

Procédures

Certaines interventions concernent tous les animaux : - une procédure chirurgicale permettant de réduire l’afflux sanguin et d’oxygène au cerveau sera réalisée. L’acte chirurgical dure moins de 10 min par animal. Les animaux sont ensuite placés dans une chambre à hypoxie pour une exposition à un air faible en oxygène pendant 90 minutes. Cette procédure chirurgicale induit une lésion cérébrale localisée chez les animaux. D’autres interventions ne concernent que des groupes d’animaux : - Une hypothermie thérapeutique pratiquée pour mimer l’intervention réalisée chez les nouveau-nés : les animaux seront placés dans une chambre permettant d’abaisser leur température corporelle de façon contrôlée pendant 3 heures. - l’administration de l’un des candidats médicaments par injection. 3 schémas d’administrations seront réalisés : - Schéma 1 : une administration par jour pendant 3 jours soit à J7, J8 et J9. - Schéma 2 : une administration à J7 puis deux administrations par jour à J8 et J9 - Schéma 3 : schéma 1 ou 2 prolongé sur 2 semaines - Des tests moteurs: ces tests sont effectués de l’âge 8 jours à l’âge 16 jours. Le test de redressement est effectué quotidiennement entre J7 et J10 et prend moins d’une minute par animal. Le test de la marche est effectué quotidiennement entre J8 et J10 et prend 2 min par animal en deux sessions de 1 min. Le test de la géotaxie est effectué quotidiennement entre J8 et J16 et prend 1 min par animal en deux sessions de 1 min. Le test de la grille et de la suspension à un fil sont réalisés entre J14 et J16 et prennent une minute en deux sessions de 1 min. Une acclimatation préalable permettra de préparer les animaux afin de réduire leur stress lié à la manipulation par les expérimentateurs.

Impact sur les animaux

L’induction de l’hypoxie-ischémie cérébrale implique une procédure chirurgicale et donc un stress et de la douleur pour les animaux du fait de la procédure en elle-même, de l'isolement, de la gestion post-opératoire et des manipulations répétées, ainsi que de la gestion de la température (hypothermie ou réchauffement quand les animaux sont replacés avec la mère ou en groupe). Les animaux peuvent également souffrir de complications chirurgicales, d’infections ou douleurs post-opératoires. Les animaux souffrent de lésions cérébrales qui miment les lésions cérébrales observées chez les nouveau-nés. La durée et l’intensité des déficits dépendent de l’étendue des lésions cérébrales induites et des traitements administrés afin de réduire ces lésions. Les animaux présenteront donc des déficits moteurs et cognitifs ainsi qu’une prise de poids généralement moins rapide. Les déficits moteurs attendus sont un retard de l’ouverture de yeux, un retard d’acquisition de la marche, une perte de coordination musculaire et une difficulté à maintenir l’équilibre. Les déficits cognitifs sont des troubles de la mémoire spatiale et des troubles de l’apprentissage. En dehors de l’acte d’injection lui-même, l’administration d’un candidat-médicament n’a pas démontré d’effet indésirable dans nos études préliminaires aux doses qui seront utilisées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issus du projet afin de prélever les cerveaux qui seront utilisés pour des analyses permettant de caractériser les lésions cérébrales induites et les effets protecteurs de nos candidats médicaments

Remplacement

Différents modèles cellulaires ont permis de tester les candidats médicaments pour choisir les meilleurs candidats. Néanmoins, ils ne permettent pas de s’affranchir totalement de l’expérimentation animale car ces modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité des mécanismes moléculaires, cellulaires, physiologiques, qui se mettent en place dans le cerveau et dans l’ensemble d’un organisme vivant, suite à une hypoxie-ischémie cérébrale et l’administration d’un candidat-médicament, ou d’évaluer la biodistribution ou bien la phamacocinétique des médicaments testés

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous avons choisi de faire des groupes de 30 rats (moitié mâles, moitié femelles) ce qui est le nombre minimum et suffisant pour aboutir à une étude statistique significative en nous basant notamment sur les données de la littérature ainsi que sur nos expériences antérieures utilisant ce modèle d’étude. Chez l’homme comme dans les modèles pré-cliniques, les mâles sont reconnus comme plus vulnérables face à l’hypoxie-ischémie cérébrale néonatale que les femelles. Cette différence de réponse nous impose d’évaluer le bénéfice thérapeutique dans les deux sexes séparément.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement, un suivi quotidien des animaux par les animaliers ainsi que par les expérimentateurs sera opéré afin de détecter tout problème. . Un protocole d’anesthésie/analgésie est mis en place afin de réduire et prévenir la douleur chez les animaux, notamment lors de la procédure chirurgicale d’induction de l’hypoxie-ischémie cérébrale mais également dans les quelques jours après l’intervention. Des études sur la formulation de nos composés ont permis d’obtenir une solubilité dans du sérum physiologique, ce qui optimise leur tolérance. Des études de toxicologie ont été réalisées in vitro et in vivo et ont permis de démontrer l’absence d’effet toxique après 7 jours d’administration des candidats médicaments à la concentration à laquelle ils seront utilisés. Des points limites ont été fixés, c’est-à-dire que des signes cliniques ont été définis comme des indicateurs d’un état de stress ou de souffrance incompatibles avec la poursuite du protocole pour un animal. Des actions correctives ont été définies et seront mises en place dans l’éventualité de l’atteinte d’un point limite pour un animal (en premier lieu, retrait du protocole et observation renforcée de son état de santé).

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée en recherche translationnelle. L’étude préclinique de l’hypoxie-ischémie néonatale est largement documentée dans la littérature scientifique. Le modèle classiquement utilisé et que nous utiliserons dans ce projet est l’induction de l’hypoxie-ischémie chez le rat de 7 jours. Le rat de 7 jours est un choix particulièrement adapté car à cet âge, son cerveau est au stade de développement proche de celui d’un nouveau-né humain à terme. Cela permet de mieux reproduire les réactions biologiques et les mécanismes cellulaires qui se produisent lors d’une hypoxie-ischémie chez les nouveau-nés. Ce modèle bien établi chez le rat offre une approche scientifique rigoureuse et fiable, permettant de mieux comprendre la maladie et d’avancer dans la recherche de traitements efficaces pour protéger le cerveau des nouveau-nés victimes d’hypoxie-ischémie.

Opérés sous anesthésie générale pendant trente minutes à trois heures pour recevoir un dispositif orthopédique à tester, puis parfois réopérés pour le retirer, 2 100 animaux non-humains vont être utilisés et tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Il s'agit de 660 moutons, 330 chèvres, 240 chiens, 540 lapins, 210 rats et 120 cochons d'Inde, exposés selon le porteur à un risque infectieux, à des hématomes ou des œdèmes pouvant entraîner un déficit sensitif ou moteur des membres postérieurs, dans des études qui peuvent durer plusieurs années. Les essais fournissent les données de tolérance et de performance exigées pour la mise sur le marché de produits de santé orthopédiques, et les tissus prélevés après la mise à mort sont analysés au microscope. L'effectif, indique le porteur, dépend "directement du nombre d'études signées avec les différents donneurs d'ordre".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en orthopédie . Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en orthopédie. Ainsi, il est possible d’étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.

Procédures

Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 0h30 et 3h00). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie . Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 00h30 et 3h00). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude (plusieurs années possibles), 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie (nuisance modérée). - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours (nuisance légère)- risque infectieux lié à la chirurgie (nuisance modérée à sévère)- hématome ou oedème au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur (exemple : déficit sensitif et/ou moteur des membres postérieurs) (Nuisance légère à modérée).

Devenir

Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des vertèbres pour évaluer la fusion dans le cadre de la procédure de stabilisation de la colonne vertébrale ). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en orthopédie.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes", sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir du nombre de sites requis en analyse. Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. De cette façon, le nombre d’animaux précisé ci-dessus constitue une estimation basée sur l’historique des essais conduits durant ces dernières années. De plus les normes requierent un nombre minimal d'animaux par produit analysé et par délai d'analyse, et le type de dispositif implanté ne permet pas toujours la réalisation d'un grand nombre de sites par animal. Le nombre d’études sur 5 ans est donc estimé à 36 (3 x 12 procédures expérimentales ; pour 660 ovins ; 330 caprins ; 240 chiens ; 540 lapins ; 210 Rats ; 120 cobayes).

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : Avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…). - La douleur des animaux : En phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et completée par des scores de suivi de la douleur. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme : - Caractéristiques anatomiques (structure des os, épaisseur du cartilage...), poids, propriétés mécaniques et régénération osseuse des ovins/caprins et des chiens - Caractéristiques anatomiques et mécaniques des lapins, des cobayes et des rats. Ces espèces sont souvent utilisées également pour des raisons économiques et éthiques (exemple : réalisation d’études de faisabilités via la réutilisation d’animaux d’études précédentes ) - Colonne vertébrale uniforme et régulière simplifiant les procédures chirurgicales, structure et biomécanique de la colonne lombaire et thoracique similaires.

15 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart tuées à l'issue. Immunodéficientes, immunocompétentes ou dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisé, elles reçoivent selon les études des greffes de tumeurs humaines ou murines, des injections répétées de candidats médicaments, des injections de plasmides qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires, et pour certaines une castration, des prélèvements vaginaux quotidiens ou des séances d'imagerie. Parmi les risques de la chirurgie, le porteur cite le cas où "la souris se réveille en cours de procédure". 1 200 souris sont déclarées réutilisées, et le porteur prévoit que des souris n'ayant subi qu'une partie de la procédure puissent passer dans un projet de formation interne aux gestes techniques. Il indique enfin qu'aucune approche statistique n'a fixé l'effectif, prévu pour 309 études de 50 souris et estimé d'après les années antérieures, avec une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Différentes stratégies d’implantation des tumeurs pourront être mises en œuvre en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser sa toxicité et l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la fonctionnalité de candidats médicaments dans des modèles se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'humain.

Procédures

[MODIFICATION] Identification par puce électronique : 2 fois maximum si puce non fonctionnelle ou perdue. Durée de quelques secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les administrations de traitements ou de cellules seront réalisées par injections qui pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour la castration, l’implantation de fragments de tumeurs et/ou de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera environ 8 minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. Concernant la castration, celle-ci durera moins de 10 minutes. Le suivi de la croissance tumorale pourra se à l’aide d’un pied à coulisse pour une durée de quelques secondes et/ou par imagerie pour une durée comprise entre 10 et 45 minutes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

[MODIFICATION] -Identification par puce électronique classique ou thermopuce (prise de température) : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements ou de cellules cancéreuses : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : anémie, hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions, au développement des tumeurs et des éventuelles métastases. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux en fin d'étude, ayant atteints les points limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 15480 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser 309 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction de la variabilité de croissance historique sur un modèle déterminé.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. [MODIFICATION] Les souris pourront recevoir des puces électroniques permettant de mesure la température corporelle afin d’éviter une prise rectale plus impactante. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un relais dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie sans réveil, suivi d’une euthanasie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites sont définis selon l’état général (score clinique), perte de poids ou volume tumoral.

Choix des espèces

90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. De plus, le métabolisme des souris présente des similarités avec celui des humains, ce qui permet de prédire la distribution, biotransformation et élimination d’un médicament. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. Les animaux humanisés avec des cellules modifiées seront inclus à partir de 5 semaines, âge auquel la greffe de cellules dans le sang est la plus efficace.

1 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules de lymphome dans la veine de la queue, sur animal vigile, puis jusqu'à quatre injections intrapéritonéales. Le porteur indique que les cellules tumorales se disséminent dans tout l'organisme et peuvent se développer dans le foie ou le cerveau, ou provoquer une paralysie par atteinte de la moelle osseuse. Aucun médicament contre la douleur ne leur sera administré, ces substances modifiant le système immunitaire étudié et risquant de "fausser les résultats".

Objectifs

Le cancer est une maladie grave qui touche des millions de personnes chaque année dans le monde, et reste l’une des principales causes de décès. Ces dernières années, de nouveaux traitements appelés immunothérapies, qui utilisent les défenses naturelles de notre corps, ont permis de mieux soigner certains cancers et d’augmenter la durée de vie des patients. Ces progrès sont possibles grâce à une meilleure compréhension du système immunitaire, en particulier grâce à des études chez la souris dont le fonctionnement est proche de celui de l’humain. Parmi les cellules du système immunitaire, les cellules Natural Killer (ou cellules NK) sont très importantes : elles sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Malheureusement, dans beaucoup de cas, ces cellules deviennent moins efficaces au fil du temps, comme si elles s’épuisaient. Notre projet cherche à comprendre pourquoi les cellules NK perdent leur efficacité face au cancer. Dans un modèle de lymphome chez la souris que nous avons développé, les cellules NK réagissent d’abord bien aux tumeurs, mais finissent par devenir inactives. Nous pensons que certaines cellules du système immunitaire appelées cellules dendritiques (ou DCs), ainsi que d’autres cellules proches, produisent des substances (les cytokines) qui aident à maintenir l’activité des cellules NK. Mais, quand la tumeur grandit, elle perturbe ce soutien, ce qui rend ces dernières moins efficaces. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour étudier de plus près les échanges entre cellules NK et cellules dendritiques au cours du processus tumoral. Grâce à ces recherches, nous espérons mieux comprendre comment les cellules NK s’épuisent face à un cancer, quel rôle les cellules dendritiques jouent dans ce processus, et surtout, comment agir pour renforcer les cellules NK. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour améliorer les traitements contre le cancer.

Bénéfices attendus

Les immunothérapies, qui stimulent le système immunitaire pour qu’il combatte le cancer, ont profondément changé la manière de traiter certains cancers. Malheureusement, ces traitements ne fonctionnent pas chez tous les patients, et beaucoup meurent encore prématurément de la maladie. Il est donc essentiel de mieux comprendre pourquoi ces traitements échouent parfois, pour les améliorer et sauver plus de vies. Notre projet s’inscrit dans cet objectif. Nous cherchons à comprendre pourquoi certaines cellules du système immunitaire, appelées cellules NK, s’épuisent et deviennent moins actives face aux tumeurs. Nous étudions le rôle dans ce processus de leur dialogue avec un autre type de cellules immunitaires, les cellules dendritiques (ou DC). Les connaissances que nous allons acquérir dans ce projet pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour rendre les immunothérapies plus efficaces, et ainsi augmenter les chances de guérison des patients atteints de cancer.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique des cellules tumorales dans la veine de la queue d’une durée de quelques secondes. La manipulation des souris pour les pesées ou la contention représentera un stress de courte durée pour les souris. Les animaux inclus dans les différentes procédures subiront au maximum 4 injections intrapéritonéales de courte durée.

Impact sur les animaux

Un inconfort temporaire sera induit par l’injection de cellules tumorales dans une veine de la queue, effectuée sur des animaux éveillés, pouvant entraîner un léger stress ou une petite douleur passagère. Les manipulations nécessaires pour peser les animaux ou les maintenir immobiles provoquent un stress de courte durée. Les injections intrapéritonéales de certains produits peuvent générer un léger stress ou une petite douleur passagère. Le développement des tumeurs elles-mêmes peut entraîner des douleurs chez les animaux. En effet, l'injection par voie intraveineuse des cellules tumorales entraîne leur dissémination dans tout l'organisme, ce qui peut favoriser le développement tumoral dans des organes vitaux (foie, cerveau) ou entrainer une paralysie suite à l’atteinte de la moelle osseuse. D'autres effets indésirables peuvent être observés tels qu'une perte de poids ou une modification du comportement (prostration).

Devenir

A la fin de chaque procédure, la totalité des animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et analyse par divers protocoles. La quasi-totalité aura reçu une injection de cellules tumorales.

Remplacement

Dans ce projet, nous avons besoin de mesurer différentes réactions du système immunitaire pendant un développement de tumeur, directement dans un organisme vivant. Cela s’explique par la complexité du système immunitaire, qui repose sur de nombreuses interactions entre différents types de cellules. Ces échanges sont essentiels au bon développement des réponses immunitaires et à leur capacité de réagir face à une tumeur. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle vivant complet, comme la souris, pour pouvoir observer ces mécanismes dans leur ensemble, dans des conditions proches de la réalité. Les modèles alternatifs dans l’état actuel des connaissances ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre cellules immunitaires dans le développement tumoral du lymphome.

Réduction

Nous ferons tout pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet, tout en garantissant la qualité des résultats. Pour cela, nous travaillerons avec une souche de souris, qui a l’avantage de donner des résultats plus homogènes entre les individus. Cela nous permet de limiter le nombre de souris à 3 ou 10 par groupe, selon les expériences. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique garantissant la fiabilité des résultats obtenu. Chaque expérience sera reproduite plusieurs fois (jusqu’à 2 fois), car la croissance des tumeurs peut varier d’une souris à l’autre. Une première expérience, dite "pilote", nous servira à trouver la bonne dose de la molécule utilisée pour éliminer certaines populations de cellules immunitaires , et à vérifier son effet dans le temps. Cette étape sera faite seulement 2 fois maximum, et si elle fonctionne dès le premier essai, nous n’aurons pas besoin de la refaire, ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux utilisés. Enfin, si lors des expériences principales aucune différence n’est observée entre les groupes traités et les groupes témoins, nous pourrons réduire le nombre de répétitions pour ces derniers, ce qui contribuera encore à limiter l’utilisation d’animaux dans l’ensemble du projet.

Raffinement

Pour éviter au maximum le stress des animaux, ils seront maintenus en petits groupes stables, composés de souris compatibles entre elles. Elles auront également du matériel pour faire des nids et se cacher, ce qui contribue à leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé chaque jour, en observant leur poids, leur apparence et leur comportement. Si des signes de souffrance ou de détresse apparaissent, des seuils d’alerte précis ont été définis pour intervenir rapidement, selon une grille d’évaluation adaptée à chaque type de procédure. Certaines injections seront faites sur des animaux éveillés, mais elles seront réalisées avec soin par du personnel formé et expérimenté, pour réduire au minimum la gêne ou le stress. Pendant les séances d’imagerie, les animaux respireront un gaz anesthésiant pour les endormir légèrement. Cela permet qu’ils ne bougent pas et qu’ils ne ressentent pas de stress pendant l’examen. Enfin, dans ce projet, nous ne pourrons pas utiliser de médicaments contre la douleur, car ces substances modifient le fonctionnement du système immunitaire et risqueraient de fausser les résultats. Nous veillerons donc à limiter l’inconfort et la souffrance au maximum par des mesures correctives adéquates.

Choix des espèces

La souris est l’animal le plus adapté pour ce type d’étude, car elle se reproduit rapidement, sa taille est pratique pour la recherche, et son patrimoine génétique est bien connu. Cela nous permet de réaliser des manipulations précises, y compris avec des souris génétiquement modifiées, indispensables pour nos expériences. Le fonctionnement de l’organisme de la souris est assez proche de celui de l’humain, en particulier pour ce qui concerne le système immunitaire. Étudier la souris nous aide donc à mieux comprendre les mécanismes immunitaires chez l’homme. Nous utiliserons des souris des 2 sexes âgées de 7 à 30 semaines, car, à cet âge, leur système immunitaire est arrivé à maturité. Pour éviter les différences liées à l’âge au sein d’un même groupe, nous veillerons à ce que les souris d’un même groupe aient au maximum 2 semaines d’écart, ce qui garantit une meilleure fiabilité des résultats.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, chacun passant jusqu'à cinq heures sur la table d'opération pour une chirurgie unique du crâne, puis jusqu'à deux semaines seul en cage le temps que les sutures cicatrisent. On leur injecte une sonde fluorescente et on leur implante une fibre optique, des électrodes d'enregistrement et une électrode de stimulation. Sept jours durant, ils subissent une crise convulsive provoquée par jour et jusqu'à quatre heures d'enregistrement, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, le porteur signalant que certains peuvent en mourir subitement. L'objet déclaré reste la mise au point de la mesure, ces 60 rats étant utilisés pour caler une méthode en vue d'un projet ultérieur.

Objectifs

Plusieurs complications de l’épilepsie sont associées au sommeil, telles que les troubles respiratoires du sommeil ou la mort subite et inattendue (SUDEP : Sudden Unexpected Death in Epileptic Patient), pour laquelle, il n’existe aucune stratégie de prévention spécifique. Les crises sont modulées par les états de vigilance des patients, avec une interaction entre le sommeil et l’épilepsie. La SUDEP fait généralement suite à une crise convulsive généralisée nocturne, résultant principalement d’un dysfonctionnement respiratoire central post crise. Cette altération de la commande respiratoire induit une apnée centrale fatale. Cette interaction entre dysfonctionnement respiratoire, régulation de l’éveil et l’épilepsie pourrait jouer un rôle dans la pathophysiologie de la SUDEP, en particulier à travers un effet de la répétition chronique des crises sur la voie de l’adénosine dans le tronc cérébral. L’adénosine est un neuromodulateur qui participe à la fois à la régulation du cycle veille-sommeil et à la régulation de la respiration. L’étude proposée ici porte sur la mise au point de la mesure de l'adénosine dans trois structures cérébrales impliquées dans la régulation de la vigilance et dans le contrôle respiratoire. Les résultats obtenus permettront une étude poussée portant sur le dysfonctionnement de la régulation de l’adénosine dans ces structures dans l’épilepsie pharmaco-résistante et l’impact sur le risque de SUDEP.

Bénéfices attendus

Cette étude fournira de nouvelles indications essentielles pour l’optimisation de futures études portant sur le role de l'adénosine dans l'épilepsie. En particulier, ce projet nous permettra de mettre en place une méthode fiable pour l’implémentation d’un système de quantification des fluctuations de l’adénosine dans diverses régions du tronc cérébrale chez le rat, en situation contrôle et en situation pathologique lors d’une crise aigüe.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale permettant l’injection d’une sonde fluorescente et l’implantation d’une fibre optique, d'électrodes d'enregistrements ainsi que d’une électrode de stimulation (chirurgie unique d'une durée maximale de 5h). De plus, ils seront soumis à des injections de médicaments (d'une durée maximale de quelques secondes, 5 fois pendant la chirurgie). Aussi, ils pourront être placés en hébergement individuel post chirurgie afin de permettre la cicatrisation complète des sutures (d'une durée maximale de 2 semaines). Finalement, ils pourront être soumis à des enregistrements électrophysiologiques et photométriques (d'une durée maximale de 4h une fois par jour pendant 7 jours) en conditions de crise convulsive (maximum une crise par jour).

Impact sur les animaux

Chirurgie : - Douleur modérée due à l’incision du scalp. - Déshydratation légère de courte durée. Enregistrements : - Stress léger et de courte durée dû au raccordement par câble de l’animal au dispositif d’enregistrement électrophysiologique et photométrique. Hébergement individuel pour cicatrisation: - Isolement jusqu'à 2 semaines. Induction de crise épileptique : - Stress intense de courte durée du à l’induction dû à l’induction de crises d’épilepsie. - Douleur modérée de courte durée en cas d’endommagement du connecteur par l’animal. - Dans de très rares cas, les animaux peuvent subir une mort subite (SUDEP).

Devenir

À l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et le cerveau sera récupéré pour des investigations ex-vivo.

Remplacement

Le caractère inattendu de la SUDEP chez le patient rend les expériences prévues dans ce projet non envisageables chez le sujet humain. L’étude des rythmes cérébraux et cardio-respiratoires au cours ou en dehors d’une crise épileptique nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne permet pas l’utilisation de méthodes substitutives à l’expérimentation animales telles que des modèles in vitro ou des analyses informatiques de par notamment les interactions entre différents organes (système respiratoire et système nerveux) dans la physiopathologie de la SUDEP.

Réduction

Cette demande est réalisée pour un faible nombre d’animaux afin de pouvoir déterminer différents paramètres et réduire par la suite le nombre total d’animaux pour un projet futur. Nous avons estimé un nombre suffisant d’animaux pour mettre au point notre protocole et confirmer, en comparaison des données de la littérature sur la mesure in vivo chez la souris de la fluctuation de l’adénosine, la reproductibilité de nos méthodes, intégration virale et mesure photométrique, chez le rat et dans nos 3 régions d’intérêt.

Raffinement

Ce projet a été planifié en gardant à l’esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux. L’évaluation et la prise en charge de la douleur, la souffrance et l’angoisse seront effectuées tout au long du projet. Des critères de points limites précis sont définis dans une grille de suivi. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai et l’expérience est stoppée. Le bien-être des animaux sera pris en compte à chaque étape : une pesée hebdomadaire, l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu et le recours à de l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgies. L’utilisation d’analgésiques sera systématique avant la chirurgie puis quotidiennement et durant les 3 jours qui suivent le jour de la chirurgie. Afin de réduire au maximum le stress lié au changement d’environnement entre le fournisseur et l’animalerie, les animaux seront commandés dès l’âge de 9 semaines, permettant une adaptation à l’animalerie ainsi qu’à l’expérimentateur de 4 semaines avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en groupe de deux ou trois avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et à un enrichissement (bandes de papier, des cubes de bois et une maison en plastique semi-opaque) pour assouvir leur besoin naturel de ronger. Les animaux qui auront été isolés dû à la chirurgie seront manipulés quotidiennement pendant 5 minutes.

Choix des espèces

Le projet sera réalisé sur le rat pour les raisons suivantes : 1) le modèle d’épilepsie chez le rat fait partie des modèles les plus utilisés dans le domaine de la recherche préclinique en épilepsie, dès lors que des études comportementales et électrophysiologiques doivent être couplées 2) La caractérisation de ce modèle sur le plan respiratoire est à ce jour spécifique à l’espèce « rat » permettant ainsi de réduire l’effectif des animaux que nécessiterait une nouvelle caractérisation de la fonction respiratoire chez une espèce différente de celle du rat. Nous travaillerons sur des rats pubères (âgés de 13 semaines, poids entre 180 et 200 g) car la grande majorité des cas d’épilepsie acquise (non-génétique) chez l’humain se déclarent chez l’adolescent et le jeune adulte et que les cas de SUDEP surviennent majoritairement chez l’adulte jeune.

Des souris de deux lignées génétiquement modifiées, dont les motoneurones dégénèrent, reçoivent des candidats médicaments par la bouche ou en injection jusqu'à une fois par jour pendant trois mois, par le nez chaque jour pendant six mois, ou jusqu'à trois fois dans la colonne vertébrale lors d'une chirurgie sous anesthésie générale, avec un risque de lésion de la moelle épinière dans moins de 5 % des cas. 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Les souris d'une lignée perdent peu à peu l'usage des pattes arrière jusqu'à la paralysie complète, et les souris ont subi chez le fournisseur la coupe d'un morceau de queue à dix jours, puis un transport en avion pouvant durer jusqu'à cinq jours. Pour tester ces médicaments contre la maladie de Charcot, le porteur fonde l'effectif de 15 souris par groupe sur des "tests comportementaux" et des "tests moteurs" sans en nommer aucun.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), appelée couramment maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui se caractérise par une dégénérescence progressive des neurones du cortex moteur, des motoneurones du tronc cérébral et de la moelle épinière. On distingue des formes sporadiques et des formes familiales. Quelle que soit la forme de la maladie, les signes cliniques sont identiques. Cependant, en fonction de la région initiale d’atteinte, on distingue deux variétés de SLA : (1) une forme spinale qui affecte tout d’abord les motoneurones de la moelle épinière et qui est caractérisée par une atteinte de la motricité des membres supérieurs et inférieurs; et (2) une forme bulbaire, affectant les motoneurones du tronc cérébral et provoquant des troubles de la parole et de la déglutition. Au cours des 25 dernières années, la recherche sur les patients SLA a révélé des mutations dans plus de 20 gènes, dont 2 d’entre eux sont les plus affectés et ont été associés à des cas familiaux de la SLA. Des mutations de ces 2 gènes ont été associées à la neurodégénérescence observée dans la SLA. Par conséquent, ces deux gènes font actuellement l’objet de nombreuses recherches, notamment pour le développement de stratégies thérapeutiques. Afin d’étudier la progression de la maladie et d’aider au développement de nouveaux candidats médicaments, des modèles de souris transgéniques ont été générés pour mettre en évidence les mécanismes physiopathologiques responsables de la dégénérescence moto-neuronale observée dans la SLA. Par conséquent et pour étudier deux voies fortement représentés chez les malades de la SLA, nous utiliserons dans ce projet deux modèles de souris transgéniques dont les deux gènes d'intérêt ont été modifiés et présentant des signes pathologiques qui reprennent la pathologie humaine sous sa forme spinale avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur progressif. Les souris présentent, à partir de 6 semaines, des tremblements des membres inférieurs, des signes de faiblesse musculaire ainsi que des déficits moteurs qui s’aggrave avec l’âge. Ces deux modèles fournissent des outils précieux pour identifier les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse SLA et pour étudier les stratégies thérapeutiques à mettre en place pour arrêter la maladie, et dans notre cas, d’étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte des motoneurones à la fois centraux et périphériques. Il s'agit de la plus fréquente des maladies du motoneurone de l'adulte (environ 2.5 malades pour 100000 habitants en France). Son diagnostic repose avant tout sur des éléments cliniques et l'exclusion d'autres pathologies. Ainsi, le délai entre l'apparition des symptômes et la pose du diagnostic est souvent long (9 à 13 mois), alors même que l'évolution de la maladie est rapide, avec un décès survenant généralement dans les 3 à 5 ans (le plus souvent par détresse respiratoire). Il s'agit d'une pathologie complexe et hétérogène dont les processus physiopathologiques sont encore mal compris. Les seuls traitements actuellement utilisés chez les patients atteints de SLA ne permettent, tout au plus, qu'une amélioration mineure de la survie, avec des résultats controversés. Ainsi, ce projet est utile pour avancer dans le traitement de cette maladie et donc le développement de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

Dans ce projet, 2 lignées d’animaux génétiquement modifiés à phénotype dommageable sont étudiée. Les deux lignées sont des modèles de la sclérose latérale amyotrophique (ou maladie de charcot) mais ne développent pas la maladie de la même façon puisque les voies altérées dans les deux lignées sont différentes. Pour la lignée SOD1, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent tout au long de la vie de l’animal pour atteindre une paralysie des membres postérieurs et une diminution significative du poids (points limites définis dans le projet). Pour la lignée TDP-43, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent assez rapidement et se limite au bout de quelques semaines à une atteinte des membres postérieurs induisant une démarche laborieuse. Contrairement à la lignée SOD1, aucune paralysie des membres postérieurs n’est observée, les animaux ne montrent pas de perte de poids significative et il n’y a pas de mort prématurée observable sur la durée de notre projet. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration hormis pour les administrations intrathécales). Les fréquences d'administration dépendront des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments. La fréquence et la durée maximales d'administration sont définies selon le type d'administration utilisée de la façon suivante : -Administration orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée : 1 administration par jour pendant 3 mois -Administration intraveineuse : 2 administrations par semaine pendant 3 mois -Intranasale : 1 administration par jour pendant 6 mois -Intrathécales 3 administrations maximum réalisées sous anesthésie générale à une fréquence d’une par mois (temps minimal entre chaque administration). La durée de l’administration sera de 15-20 min environ. Des prélèvements de sang à la veine mandibulaire seront réalisés tous les mois (durée environ 2 min).

Impact sur les animaux

Ces modèles de souris transgéniques présentent des phénotypes dommageables qui reprennent la pathologie humaine avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur. Pour une des lignées, les animaux développent des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs sans induire de paralysie complète de ces membres, de perte de poids significative ou de mort prématurée avant la fin de l’étude. Les animaux issus de l'autre lignée utilisée dans ce projet développent également des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs allant jusqu’à la paralysie complète. Chez le fournisseur, les animaux à l'âge de 10 jours sont soumis au prélèvement d'un petit morceau de queue utilisé comme matériel biologique pour le génotypage. Lors du transport des animaux par avion d'une durée maximale de 5 jours (entre le moment où les animaux sortent de l’animalerie du fournisseur et celui où ils arrivent dans nos locaux), les animaux jeunes (3-4 semaines au minimum soit après sevrage) peuvent présenter un déficit moteur précoce léger dans le cas de la première lignée. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Dans notre projet, des études in vivo ont déjà été réalisées au préalable avec les candidats médicaments et ne montrent aucune toxicité particulière de ceux-ci. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents mode d’administration. Une administration (intra-veineuse, per os, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress particulier. L’administration dans la colonne vertébrale sous l'arachnoïde au niveau lombaire (intrathécale) si elle a lieu, induit un acte de chirurgie et sera réalisée sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Cet acte de chirurgie peut entrainer une perte de poids des animaux ainsi qu'une légère déshydratation durant les 24 à 48h qui suivent. Un risque de lésion de la moelle épinière est possible dans moins de 5% des cas. Un stress peut également être présent lors de la manipulation des animaux pour leur passage dans les différents tests moteurs. Des prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés avec un intervalle minimal d’un mois sur animaux anesthésiés.

Devenir

En fin d’étude, pour des analyses sérologiques, histologiques, moléculaires et immunohistochimiques, les animaux seront soumis à différents types de prélèvements (organes) post mortem. L’ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l’étude comportementale sera mis à mort.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte d’un grand nombre de ces phénomènes, et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer les symptômes moteurs de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc incontournable pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.

Réduction

Les études internes précédemment réalisée dans notre EU sur les tests moteurs utilisés dans ce projet avec d’autres lignées ont montré qu’un nombre d’animaux égal à 15 par groupe est nécessaire pour observer des effets significatifs des candidats médicaments dans les tests comportementaux utilisés dans cette étude. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés. Les données seront présentées en moyenne et erreurs standard à la moyenne (SEM). Les différences entre les groupes seront évaluées à l’aide de tests paramétriques. Les tests paramétriques seront utilisés car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Des tests non paramétriques pourront être utilisés en deuxième intentions . Le choix des tests paramétriques ou non paramétriques sera fait en fonction des résultats obtenus dans un test de normalité. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, en plus des analyses comportementales, des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés sur les animaux pour des études complémentaires.

Raffinement

Une période d’habituation sans expérimentation est laissée aux animaux d’au minimum une semaine après leur arrivée. Durant cette période d'habituation, les animaux sont soumis à une évaluation journalière suivant la grille scoring mise ne place dans ce projet mais aucune pesée de sera réalisée pour éviter de rajouter un stress lié à la préhension de l'animal en surplus du stress récent induit par le transport et le changement d'environnement. Les souris seront ensuite pesées une fois par semaine. Lorsqu’une perte de poids sera observée, la fréquence des pesée pourra être augmentée en fonction de la perte de poids et de l‘apparition des déficits moteurs. Par ailleurs, leur état général sera évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un des points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Des procédures particulières seront mises en place suivant l’atteinte moteur des animaux (alimentation hydratée et hydrogel placé dans le fond de la cage). Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux. Pour la procédure chirurgicale (administration dans l'espace sous arachnoïdien de la colonne vertébrale au niveau lombaire appelée administration intrathécale), les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Après la chirurgie et afin de faciliter leur convalescence, de l’hydrogel sera placé dans le fond de la cage pour les premières 24h et plus si besoin. Le poids des animaux sera suivi quotidiennement pendant une période minimale de 72h et jusqu’à reprise du poids initial. Des procédures particulières pourront être mise en place en cas d’altération de l’état physique des animaux après la chirurgie (mise en place d’une analgésie, alimentation hydratée et hydrogel dans le fond de la cage en concertation avec le vétérinaire). Une période d’au moins 10 jours de récupération sera respectée, après la chirurgie liée à l’administration dans l'espace sous arachnoïdien de la colonne vertébrale au niveau lombaire avant que les animaux ne soient soumis à un autre test de comportement.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments, et les données obtenues nous permettent maintenant de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette pathologie dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont essentiels pour modéliser les mécanismes physiopathologiques de la SLA. Ils sont donc nécessaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Au minimum 5 semaines pour la lignée TDP-43 et 12-13 semaines pour la lignée SOD1 au début de l’analyse comportementale. Dans ce projet, l’expérience et l’administration de traitements sont initiés à un moment où les animaux sont jeunes, avant le début des premiers symptômes pour pouvoir commencer à administrer le candidat médicament au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent. Le génotypage est effectué chez le fournisseur à l'âge de 10 jours. Ils partiront de chez lui, après sevrage, à l'âge de 3-4 semaines pour la lignée TDP-43 (au minimum) et plus tardivement pour les souris SOD1 (au minimum 10 semaines).