Procédures sévères

Des cellules tumorales humaines sont injectées dans l'œil de souris immunodéficientes, dont une partie est ensuite énucléée, d'autres greffées à la rate ou au foie par une incision abdominale. 7 002 souris vont être utilisées, 5 586 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 416 un niveau sévère. Le porteur signale une exophtalmie possible, c'est-à-dire la sortie du globe oculaire hors de son orbite sous la poussée de la tumeur, puis ajoute que chez l'être humain l'énucléation est peu douloureuse. Toutes sont tuées en fin de procédure pour analyse post-mortem, après des traitements administrés jusqu'à trois fois par jour et des pertes de poids pouvant dépasser 20 % à l'apparition des métastases.

Objectifs

Le mélanome de l’uvée est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Même si actuellement existe des traitements pour éliminer la tumeur primaire (chirurgie ou radiothérapie), pour la maladie métastatique qui présente 50% des patients atteints de mélanome uvéal (MU), les traitements utilisés sont peu ou pas efficaces. De nouvelles thérapies sont proposées aujourd’hui. Un modèle métastatique a été obtenu par injection des cellules tumorales humaines aux souris immunodéficientes. Ce modèle nous a permis d’observer le développement de métastases principalement au niveau hépatique (comme souvent rapporté chez les patients) mais également au niveau péritonéal. Ce modèle est utilisé pour évaluer l’efficacité des traitements disponibles. Malheureusement, l’obtention des métastases s’avère longue et par ailleurs il ne présente qu’un des sous-groupes de cette maladie . L’objectif est d’évaluer l’efficacité antitumorale de nouvelles molécules anticancéreuses, seules ou en combinaison (chimiothérapie) ou bien associées à la thérapie photo-activée. En outre, l’absence de toxicité de ces molécules sera aussi évaluée chez la souris. Nous allons mettre au point des modèles murins du cancer de l’œil et des métastases hépatiques associées au MU. Un modèle métastatique a été obtenu par injection des cellules tumorales humaines aux souris immunodéficientes. Ce modèle nous a permis d’observer le développement de métastases principalement au niveau hépatique (comme souvent rapporté chez les patients) mais également au niveau péritonéal. Ce modèle est utilisé pour évaluer l’efficacité des traitements disponibles. Malheureusement, l’obtention des métastases pour ce modèle s’avère longue et par ailleurs il ne présente qu’un des sous-groupes de cette maladie. Grâce à ces études précliniques basées sur des modèles murins, nous allons sélectionner les molécules et /ou les méthodes thérapeutiques les plus efficaces pour chaque sous type du MU. Par ailleurs, les études moléculaires liées aux mécanismes d’action et la résistance des métastases contre certaines thérapeutiques nous permettent d’optimiser le choix des traitements qui seront ensuite utilisés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. Le MU représente 5% de tous les mélanomes et se distingue du mélanome cutané au niveau biologique et génétique. La prise en charge des patients commence dès la confirmation du diagnostic par des thérapies anticancéreuses allant de la radiothérapie à la chirurgie (énucléation) pour éliminer la tumeur primaire. Cependant, presque 50% des patients développent des métastases (même plusieurs années plus tard) principalement au niveau hépatique. Malheureusement, à ce niveau-là, l’espérance de vie est d’environ un an. Actuellement, il n’existe pas de traitement de référence contre la phase métastatique du MU avec ses différents sous-types. Ce projet permet d’établir dans un premier temps des modèles de métastases du MU représentatifs de la maladie chez l’homme. Ces modèles murins devraient servir pour tester en préclinique l’efficacité de différentes thérapies antitumorales (existantes ou nouvelles) destinées au traitement du MU. Les résultats finaux de ce projet permettront de proposer des molécules/ approches thérapeutiques contre le MU et d’augmenter ainsi l’espérance de vie des patients qui sont au stade métastatique de la maladie. L’approche thérapeutique que nous souhaitons tester au cours de ce projet est basée sur des molécules anticancéreuses, seules ou combinées entre elles, oula chimiothérapie photo activée (PACT). Cette dernière approche est une technique innovante, non invasive et prometteuse. Enfin, les analyses post-mortem des tumeurs permettront de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du MU (croissance de la tumeur primaire ainsi que des métastases) ainsi que les mécanismes d’action des molécules sélectionnées pour le traitement du MU.

Procédures

Lot 1 : les animaux anesthésiés seront injectés avec des cellules tumorales au niveau de l’œil (

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau, l’exérèse de la tumeur et la suture de la paroi interne et de la peau, provocant de la douleur et/ou surinfection bactérienne de la plaie (très rare) durant les premières 48 heures. Un effet dû à l’anesthésie (30 min) est la sécheresse des yeux et la baisse de la température corporelle. Les injections de cellules tumorales ne provoquent pas de douleur chez les animaux au-delà de l’injection elle-même (15 sec). . Par ailleurs, la croissance des tumeurs greffées au niveau des différents sites, pourraient provoquer une perte de poids ou une gêne pour se déplacer. L’apparition des métastases peut déclencher des pertes de poids rapides (>20%) ou apathie chez l’animal. L’injection des cellules tumorales sera faite au niveau de l’œil une zone peu innervée. Les gênes causées par le développement des tumeurs au niveau de l’œil peuvent être une exophtalmie unilatérale (protrusion anormale du globe oculaire hors de son orbite suite au développement de la tumeur) avec +/- de la douleur. Dans ce cas de figure, on prévoit de réaliser une énucléation (retirer chirurgicalement l’œil, 15 min). A noter que, chez l’homme, l’énucléation est peu douloureuse. Enfin, parmi les effets secondaires attendues, bien que modérée, une inflammation oculaire peut survenir après le traitement par le laser(

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin des procédures pour analyse post mortem

Remplacement

L’efficacité antitumorale des molécules que nous allons utiliser est vérifiée in vitro sur des cultures cellulaires tumorales 2D et plus récemment des modèles en 3D, dit organoïde, dérivés des tumeurs humaines et plus représentatifs de ces dernières. Uniquement, les molécules jugées efficaces seront testées chez l’animal. Malheureusement, il n’y a pas d’autres modèles « ex vivo » qui permet de remplacer le modèle animal et d’obtenir des résultats extrapolables à l’homme. En effet, l'utilisation des animaux se justifie par le fait qu’un modèle vivant intégré est indispensable non seulement pour étudier les interactions entre la tumeur et ses métastases mais aussi pour investiguer les interactions avec l’organisme dans sa totalité. Par ailleurs, l’évaluation de la toxicité des molécules et l’atteinte de leur cible dans un organisme entier est indispensable et ne peut être évalué que sur les animaux vivants. Cette évaluation conduit à optimiser les modalités thérapeutiques, prédire les effets indésirables du médicament seul ou bien en association et identifier des marqueurs de réponse ou de résistance aux traitements. Les effets des thérapies testées sur la dissémination métastatique et sur les cellules initiatrices de tumeurs sont également étudiés.

Réduction

Pour l’apprentissage des nouveaux gestes expérimentaux, le personnel sera formé d’abord sur les animaux euthanasiés et une fois le geste maîtrisé, leur formation est complétée sur les souris vivantes. Pour cette étape, afin de réduire le nombre d’animaux et après l’avis favorable du vétérinaire, nous utiliserons les animaux injectés en intradermique et dont la tumeur n’a pas pris. Pour la mise au point des nouvelles techniques d’établissement de métastases hépatiques et définir les délais d’apparition des métastases pour les 3 sous-groupes principaux du MU que nous souhaitons étudier dans ce projet, nous allons inclure 5 souris par modèle. Nous allons choisir maximum 2 techniques, parmi les 4, qui donnent d’une part les meilleures prises tumorales et d’autre part, dans les délais les plus courts afin de réduire le nombre de souris. Pour les expériences de tolérance/toxicité, nous allons utiliser 3 souris par molécule ou combinaison de molécules testées. Pour les expériences d’efficacité antitumorale, le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence de réponse de 20% (= biologiquement significative via les tests statistiques entre les groupes traités et contrôles. Ce nombre tient compte du taux de prise tumorale et l’hétérogénéité des réponses des animaux.

Raffinement

- Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : - Utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques lors des chirurgies (réalisées par du personnel formé maitrisant pleinement le geste) et établissement des modèles orthotopiques. - Réduction de l’hypothermie pendant l’anesthésie générale : tapis ou lampe chauffante - Prevention du dessèchement des yeux par application du gel ophtalmique (gels à base de paraffine). - Addition d’alimentation hydraté en post-opératoire, et hydratation supplémentaire de l’animal si perte de poids. - Des conditions appropriées d’hébergement et manipulation permettront de réduire le risque de développement d’infection - Les animaux seront surveillés, dans les premières 24 heures suivant l’intervention chirurgicale (greffes orthotopiques). Si besoin, cette surveillance sera prolongée jusqu’à 7 jours. - Si l’animal montre des signes de souffrance (posture anormale persistante, surinfection bactérienne), il sera mis à mort. - Pour faciliter le suivi des métastases, nous allons utiliser de l’imagerie (technique non-invasive) sous anesthésie générale - Les traitements par différentes voies sont peu invasifs et se font sur animaux vigiles ; néanmoins si des signes de douleurs sont notés lors de l’administration d’une molécule, la procédure sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Le traitement des souris par le laser sera fait sous analgésie générale. - Une inflammation intraoculaire est possible lors de traitement par le laser : en cas de signe de gravité un traitement par des corticoïdes sera administré (jusqu’à 5jours si besoin). Un traitement hydratant (larme artificielle ou gel larme est systématiquement appliqué . - Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limite. Les animaux seront mis à mort en cas d’atteinte d’un point-limite.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère dont sa physiologie est proche de celle de l'Homme. - Les souris immunodéprimées permettent de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non soi. - L’existence de souches immunodéficientes chez la souris permet la greffe de cellules humaines, plus difficiles dans d’autres espèces (le poisson zèbre est moins permissif) - La réglementation exige à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux d’espèces différentes avant de faire des essais cliniques chez l’humain. - - La souris est le modèle le plus utilisé en préclinique. Il permet d’acquérir un grand nombre d’information pour un investissement contrôlé. Jeune adulte : l’injection des cellules tumorales aura lieu à partir de 5 semaines d’âge. Les souris ont ainsi fini leur croissance.De plus le temps de croissance des cellules tumorales MU est long ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à partir de cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements

Perte de poids, signes respiratoires marqués, baisse d'activité ou de prise alimentaire : le dépassement de ces seuils déclenche la mise à mort. 2 640 souris vont être utilisées, 1 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 240 un niveau sévère, toutes tuées pour prélèvement des poumons, de la rate et des ganglions. Elles reçoivent des injections immunosuppressives tous les deux à trois jours, des instillations d'agents infectieux sous anesthésie pendant une à quatre semaines et des prélèvements sanguins une à deux fois par semaine, l'infection fongique pouvant devenir systémique et mortelle chez les souris immunodéprimées. Les retombées annoncées, des thérapies contre les infections fongiques graves et une réduction des coûts de santé, restent au conditionnel, tandis que le porteur qualifie l'expérimentation animale d'"indispensable" pour ce projet.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment notre organisme réagit face à certaines infections respiratoires causées par des champignons, qui peuvent être graves chez les personnes dont les défenses immunitaires sont affaiblies ou particulièrement sensibles. L’étude se concentre sur les réactions du système immunitaire au niveau des poumons, en particulier dans des situations où la réponse inflammatoire devient excessive et aggrave l’état de santé. Pour cela, des expériences seront menées sur un modèle murin (souris) afin de reproduire ces infections dans des conditions proches de celles observées chez l’humain. Ce modèle permettra d’identifier les mécanismes responsables de l’inflammation, et d’évaluer l’effet de nouvelles approches thérapeutiques, comme l’utilisation de traitements qui bloquent certains signaux dans l’organisme. À terme, ces recherches pourraient contribuer à améliorer les soins pour des maladies respiratoires encore difficiles à traiter aujourd’hui.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à : Identifier de nouvelles voies de signalisation cellulaire impliquées dans la reconnaissance fongique, l’activation immunitaire et l’inflammation pulmonaire, pour mieux comprendre les mécanismes de réponse de l'hôte face aux infections. Décrypter les interactions hôte-pathogène lors de l’aspergillose invasive, des co-infections virales et de l’aspergillose bronchopulmonaire allergique (ABPA), afin d’améliorer la compréhension des pathologies respiratoires complexes. Explorer des approches thérapeutiques ciblant ce récepteur, comme des anticorps bloquants, pour moduler les réponses inflammatoires et optimiser les traitements existants. Réduire la mortalité et la morbidité associées aux infections pulmonaires sévères et aux syndromes inflammatoires chroniques comme l’ABPA. Bénéfices pour la santé humaine : Ce projet pourrait aboutir à des thérapies innovantes pour les infections fongiques graves, un défi clinique majeur dû aux résistances aux antifongiques. Une meilleure gestion des réponses inflammatoires pourrait être bénéfique dans d’autres maladies respiratoires, comme l’asthme ou la fibrose pulmonaire. Ces avancées faciliteront un diagnostic précoce et des traitements mieux adaptés, réduisant les complications et les hospitalisations. Bénéfices pour la recherche : Les connaissances générées enrichiront l’immunologie et la microbiologie, ouvrant des perspectives pour d’autres pathologies. Les modèles développés seront utiles pour évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques. Impact sociétal : Réduction des coûts de santé grâce à des traitements plus efficaces. Amélioration de la qualité de vie des patients, limitant hospitalisations et complications. Balance coût bénéfice : Les bénéfices dépassent largement le coût. Ce projet offre des solutions innovantes pour des infections pulmonaires complexes, répondant à un besoin médical urgent.

Procédures

Dans ce projet, les souris seront soumises à différents types d’interventions encadrées, visant à étudier les réponses immunitaires et physiopathologiques associées aux infections fongiques et virales. Toutes les procédures sont réalisées dans le respect des normes éthiques, en limitant la douleur, le stress et la souffrance. 1) Injections immunosuppressives : administrées sur animaux vigiles, tous les 2 à 3 jours selon les protocoles. Chaque injection dure environ 30 secondes à 1 minute. 2) Instillations : réalisées sous anesthésie générale légère, pour administrer des agents infectieux. Ces interventions sont espacées de quelques jours, sur une période allant de 1 à 4 semaines selon les modèles. Chaque session dure environ 10 à 15 minutes, incluant l’induction anesthésique, la procédure, et le réveil. 3) Injections de solutions expérimentales : administrées à des animaux vigiles tous les 2 à 3 jours pendant une durée pouvant aller jusqu’à 4 semaines. Chaque injection dure environ 1 à 2 minutes. 4) Prélèvements sanguins : réalisés sous anesthésie légère, 1 à 2 fois par semaine. Chaque prélèvement dure environ 5 à 10 minutes par animal, incluant l’induction anesthésique et le soin post-procédure. 5) Euthanasie : Les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires en fonction des prélèvements et analyses à effectuer ou si un point limite est atteint. Cette étape dure environ 5 minutes et permet la collecte des organes et échantillons nécessaires aux analyses. Toutes les procédures sont menées par du personnel formé, avec une attention constante portée au raffinement, à la réduction du stress, et à la limitation du nombre d’animaux utilisés.

Impact sur les animaux

Les animaux impliqués dans ce projet pourraient être exposés à différentes nuisances liées aux procédures expérimentales. L’anesthésie utilisée pour certaines manipulations peut entraîner une baisse de la température corporelle, voire, dans de rares cas, des troubles respiratoires. Des douleurs légères sont possibles lors des injections ainsi que lors des prélèvements sanguins. Les injections peuvent aussi induire une douleur légère et transitoire au point d’injection. Dans de rares cas, l'instillation peut entraîner une mortalité précoce ou des lésions pulmonaires non immédiatement visibles. Les infections fongiques ou les sensibilisations répétées à des antigènes fongiques peuvent provoquer une inflammation modérée des voies respiratoires. Dans le modèle reproduisant l’aspergillose bronchopulmonaire allergique, une hyperréactivité des bronches et une inflammation plus marquée sont attendues, mimant ce qui est observé dans certaines pathologies humaines chroniques. Lorsqu’une infection virale est associée à une infection fongique, les réactions inflammatoires peuvent être plus sévères, affectant l’ensemble de l’organisme et aggravant la détresse respiratoire. Enfin, chez les souris immunodéprimées (immuno-supression induite expérimentalement) utilisées dans le modèle d’aspergillose invasive, une infection systémique sévère peut survenir, pouvant parfois conduire à la mort de l’animal.

Devenir

La totalité des animaux seront euthanasiés pour permettre la collecte d’organes (poumons, rate, ganglions lymphatiques) et d’échantillons nécessaires à des analyses approfondies (histologiques, transcriptomiques, immunologiques). Ces analyses sont indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques du projet, notamment pour étudier les mécanismes immunitaires et inflammatoires associés aux infections.

Remplacement

L’expérimentation animale reste indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, car certains phénomènes complexes, comme les réactions du système immunitaire ou les interactions entre un microbe et l’organisme, ne peuvent pas être entièrement reproduits en laboratoire sans animaux. Cependant, avant de recourir aux animaux, nous utilisons plusieurs méthodes alternatives : - Cultures de cellules humaines : Nous étudions les premières étapes de l’infection en laboratoire en utilisant des cellules des poumons (bronches et alvéoles) cultivées dans des conditions proches du corps humain. - Modèles mathématiques : Des équations informatiques nous permettent de simuler l’évolution de l’infection et l’effet des traitements. Cela nous aide à faire des prévisions et à réduire le nombre d’expériences sur les animaux. Ces méthodes nous permettent de limiter autant que possible le recours aux animaux, tout en assurant des résultats fiables pour mieux comprendre la maladie et développer de nouveaux traitements.

Réduction

Des mesures ont été mises en œuvre pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Un total de 2640 souris sera impliqué dans les différentes expériences, réparties entre les groupes traités et les groupes témoins. Ces expériences concernent plusieurs modèles, dont l’aspergillose invasive, l’ABPA (aspergillose bronchopulmonaire allergique) et les co-infections. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé avec soin, à l’aide d’une méthode de calcul qui permet de s’assurer qu’il est juste suffisant pour obtenir des résultats fiables, sans en utiliser plus que nécessaire. Les données obtenues seront analysées à l’aide de méthodes statistiques appropriées, afin de garantir une interprétation rigoureuse et objective des résultats. Par ailleurs, les organes et échantillons non utilisés immédiatement seront conservés pour de futures analyses ou partagés avec d’autres projets compatibles, afin d’éviter des expérimentations répétées et de maximiser l’utilisation des animaux déjà inclus dans l’étude. Bien que l’expérimentation animale reste indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet, tout est mis en œuvre pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et optimiser leur contribution à la recherche.

Raffinement

Des mesures spécifiques ont été mises en place pour garantir le bien-être des animaux tout au long du projet. Les conditions d’hébergement respectent la réglementation en vigueur, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, dans des cages ventilées enrichies (matériaux à ronger, abris ou tunnels). Lors de chaque intervention invasive, une anesthésie appropriée est systématiquement utilisée. Une surveillance rapprochée est mise en place pour détecter toute complication post-injection. Une surveillance rigoureuse des animaux est assurée une à deux fois par jour en fonction de la procédure, afin de détecter au plus tôt les signes de souffrance ou de détresse après infection. Les protocoles ont été conçus pour limiter les nuisances liées à l’infection ou à l’inflammation, en évitant les effets prolongés ou excessifs. Des points limites précoces ont été définis pour permettre une prise en charge rapide : perte de poids, signes respiratoires marqués, réduction de l’activité ou de la prise alimentaire. En cas de dépassement des seuils, les animaux seront immédiatement retirés de l’étude et euthanasiés selon les procédures éthiques établies. Ces mesures permettent d’assurer à la fois la qualité scientifique des résultats et le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale choisie pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique et éthique : Arguments scientifiques : Les souris offrent un modèle immunologique robuste, bien documenté et transposable aux infections humaines. Elles permettent d’étudier les réponses immunitaires spécifiques. Arguments techniques : Les lignées utilisées permettent d'étudier précisément les voies de signalisation impliquant le récepteur fongique étudié. Les outils génétiques et les réactifs disponibles pour cette espèce facilitent les analyses approfondies. Arguments éthiques : L’utilisation des souris est justifiée par l’absence de modèles alternatifs permettant de reproduire la complexité des interactions hôte-pathogène observées dans ces infections. Les procédures ont été conçues pour minimiser la souffrance et maximiser la transposabilité des résultats. Les souris adultes jeunes (6-12 semaines) sont idéales pour étudier les réponses immunitaires pulmonaires, car leur système respiratoire est pleinement développé et reflète fidèlement les réponses observées chez des patients adultes.

1 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur tissu nerveux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes subissent une chirurgie stéréotaxique de trois heures au plus, 480 reçoivent une lésion de la substance noire qui provoque un syndrome parkinsonien, 960 passent des tests moteurs répétés trois fois (marche en champ ouvert, sur tapis roulant et en couloir, nage en couloir) et 200 subissent un enregistrement électrophysiologique de deux heures. Pendant les quatre semaines d'un test de léchage, l'eau de boisson est remplacée par une eau à l'acide citrique de pH 2,07, "afin d'induire une légère déshydratation". Le porteur formule les retombées pour les patients comme un espoir, celui de résultats "pré-cliniques importants pour la compréhension et le traitement des maladies humaines".

Objectifs

Le contrôle de nos mouvements repose sur des réseaux complexes de neurones dont le fonctionnement reste en grande partie mystérieux. Cela s'explique par le fait que chaque niveau du système nerveux central, du cortex cérébral à la moelle épinière, joue un rôle dans nos mouvements. Des études récentes montrent que certaines zones du cerveau, situées dans les régions bulbo-pontiques, sont organisées en modules spécialisés. Ces modules contrôlent différents types de mouvements comme la marche, la préhension, la mastication, et la succion. Ils envoient ensuite des signaux aux neurones moteurs situés dans le tronc cérébral et la moelle épinière pour exécuter ces mouvements. Cependant, nous ne savons pas encore précisément comment le cortex cérébral et les ganglions de la base choisissent et activent ces modules en fonction de nos besoins comportementaux. Notre projet de recherche vise donc à comprendre comment ces structures intermédiaires, situées entre le cortex et les ganglions de la base, contribuent à la sélection des modules de commande du tronc cérébral. Pour ce faire, nous allons étudier l'organisation en réseau des structures motrices du cerveau et déterminer le rôle de chaque composant dans la réalisation et la modulation des mouvements. En parallèle, nous allons examiner comment ces circuits sont affectés par la maladie de Parkinson. Notre objectif est de développer et tester des stratégies pour restaurer des mouvements adaptés en intervenant sur le fonctionnement des réseaux moteurs du cerveau. Nous espérons que ce projet, en plus de son intérêt scientifique, apportera des résultats pré-cliniques importants pour la compréhension et le traitement des maladies humaines, notamment dans le cadre des soins pour les patients.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de comprendre comment certaines structures du cerveau, qui sont connectées entre elles et forment des réseaux moteurs, contribuent à différents types de mouvements. Ces mouvements incluent atteindre un objet, le saisir, le manipuler, ainsi que marcher. Nous nous concentrons particulièrement sur des structures cérébrales qui pourraient être contrôlées par le cortex et les ganglions de la base, car ces derniers jouent un rôle crucial dans le choix des comportements moteurs.

Procédures

-Nous réaliserons sur 1340 animaux une chirurgie stéréotaxique de (maximum) 180 minutes durant laquelle ils recevront une injection i.p. (0,15 ml), 2 injections s.c. une sur la tête (0,05 ml) et une sur le corps (0,15 ml). Puis des soins post-opératoires durant lesquels ils recevront une injection s.c. (0,5 ml). -Nous réaliserons sur 480 animaux une lésion de la substance noire compacte durant laquelle ils recevront deux injections quotidiennes s.c. (0,2 ml, une le matin et une le soir) durant 14 jours. -960 animaux réaliseront des tests moteurs d’environ 5-10 minutes de types : marche en champs ouvert, marche sur tapis roulant, marche en couloir de marche, et de la nage en couloir de nage répartis sur 4 jours. Ces tests seront réalisés 3 fois avec 14 jours entre chaque répétition. -Des enregistrements électrophysiologiques d'une durée de 2h seront réalisés sur 200 animaux. Les animaux recevront une injection i.p. (0,15 ml). L’ensemble des injections dureront moins de 1 minute. -Durant les 4 semaines du test de licking, l'eau des animaux sera remplacée par de l'eau citrisée (pH = 2,07) afin d'induire une légère déshydratation des animaux.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie les animaux pourront présenter une douleur transitoire. En outre les animaux pourraient présenter une légère déshydration. Suite à l’induction d’un syndrome parkinsonien les animaux seront affectés sur le plan moteur avec pour conséquence une diminution de l’activité et des comportements de rotation sans pour autant altérer leur capacité à se nourrir. En outre les animaux pourront présenter une perte de poids limitée dans le temps pouvant induire un stress transitoire chez les animaux. Enfin, les animaux seront manipulés ce qui pourra générer un léger stress chez ces derniers.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever le tissu nerveux pour des analyses histologiques.

Remplacement

Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, les approches in vitro ou in silico ne pouvant pas reproduire ou modéliser la complexité d’un organisme entier.

Réduction

Dans ce projet, des animaux mâles et femelles seront utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet n'excèdera pas 12 à 20 animaux par groupe, c'est à dire le nombre d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine.

Raffinement

Le laboratoire est doté de l'ensemble des infrastructures (animalerie, salles d'expérimentation etc.) nécessaires à la réalisation du projet et dispose de l'ensemble des agréments requis et délivrés par les services compétents. Les conditions d'hébergements et d'enrichissement respectent les normes dictées par les directives européennes. Nous sommes particulièrement vigilants en ce qui a trait au bien-être animal et la prise en charge de la douleur. Des points limites précoces et spécifiques de notre étude ont été fixés et des procédures adaptées ont été établies, les mesures analgésiques incluses dans protocoles permettant de garantir à la fois la pertinence des résultats et le bien-être des animaux. Les chercheurs participant au projet ont une solide expérience dans la manipulation de rongeurs et l'ensemble des compétences requises à sa réalisation (notamment chirurgicales). À ce titre, il convient de préciser d'une part que le chercheur par ailleurs référant en matière de bien-être animal au laboratoire prend part au présent projet et d'autre part que le projet est bâti en accord avec les recommandations et conseils de la vétérinaire de l’établissement. Cette dernière sera sollicitée chaque fois que nécessaire par le coordinateur du projet qui lui permettra en outre de suivre, bien que de façon externe, le déroulement du projet et de proposer des procédures de raffinement bénéfiques à tous les égards. Les procédures mises en place suivent également les normes en matière de raffinement des pratiques expérimentales. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésies générale (isoflurane) et locale (lidocaïne) et sont associées à des traitements analgésiques (buprénorphine/meloxicam) qui seront maintenus tant que nécessaire en fonction de l'état des animaux par ailleurs suivis quotidiennement. La mise en place des points limites et des mesures analgésiques notamment chez l'animal repose sur une méthode de scoring comprenant 4 niveaux : normal, modérée, sévère, mise à mort. Cette méthode prend en considération la douleur et l'état général de l'animal (poids, hydratation, soin au pelage etc.). Un animal classé modéré ou sévère recevra un traitement adapté aux symptômes exprimés. L'ajustement des traitements sera évalué sur une base quotidienne.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser des souris pour étudier les circuits moteurs et leurs altérations dans le cadre de la maladie de Parkinson. La maladie peut être reproduite expérimentalement chez la souris grâce à une neurotoxine. De plus, les souris transgéniques, combinées à l'injection de vecteurs viraux pour cibler des populations neuronales spécifiques, permettent d'explorer de manière précise l'organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux. Ces méthodes ne peuvent pas être appliquées chez l'homme. Les souris adultes seront utilisées pour ce projet, car elles correspondent aux objectifs scientifiques et méthodologiques, notamment pour les tests moteurs, les procédures chirurgicales et l'induction de la maladie de Parkinson.

Tués à l'issue pour l'analyse pathologique de leurs organes, sauf une centaine réutilisés ou confiés à des associations, 2 800 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 200 d'entre eux et sévère pour 600. Ils reçoivent de façon répétée des candidats médicaments ou des pesticides, subissent des prélèvements sanguins en état vigile, des prélèvements d'urine par sondage échoguidé sous sédation, des ponctions de liquide céphalorachidien et de liquide synovial ainsi que des biopsies d'organes sous anesthésie profonde. Les effets toxiques attendus vont des atteintes neurologiques aux atteintes métaboliques, et restent difficiles à estimer à l'avance. L'établissement mène ces études pour le compte des laboratoires qui développent ces produits, et présente le recours au chien comme "nécessaire" au regard des exigences réglementaires.

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie indispensables à l’évaluation clinique de xénobiotiques pour le compte de laboratoires les développant. Ce projet vise à d’évaluer la sécurité et la toxicité de xénobiotiques avant leurs utilisations, selon les recommandations des autorités règlementaires, chez le chien domestique Canis familiaris. Ces xénobiotiques sont des médicaments en cours de développement ou des composés chimiques comme les pesticides. Leur évaluation est effectuée conformément aux exigences des autorités réglementaires. Elle constitue la phase « pré-clinique » de leur développement, qui est un pré-requis aux essais cliniques de phase I, II et III et nécessaire pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché. Pour chaque xénobiotique, afin de caractériser ses potentiels effets toxiques, d’identifier ses organes cibles et de définir ses marges de sécurité, plusieurs études complémentaires et séquentielles sont nécessaires : - Des études préliminaires de détermination range de doses (DRF, dose range finding) ou de la dose maximale tolérée (MTD, maximal tolerable dose) qui constituent la première étape des évaluations toxicologiques et pharmacocinétiques. Elles permettent d’identifier la dose appropriée pour les études réglementaires ultérieures, notamment la toxicité à dose unique et à doses répétées. Elles aident également à déterminer les effets pharmacologiques et toxiques afin de confirmer les études règlementaires et de garantir le succès du dépôt d'une demande d'autorisation de mise sur le marché. - Des études de toxicologie réglementaires et de pharmacocinétique qui ont pour objectif de déterminer le niveau exempt d'effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique de candidats médicament avant administration chez l’humain ou chez l’animal. Le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R. Les procédures sont optimisées pour limiter le nombre d’animaux requis, agir en étapes progressive pour raffiner le choix des doses et réduire la douleur et la contrainte, notamment par l’utilisation de techniques moins invasives et la validation d’approches alternatives.

Bénéfices attendus

Les études de toxicologie ont pour objectif de déterminer le niveau exempt d'effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, de collecter des données sur la sécurité, l’efficacité et/ou la toxicité, de xénobiotiques (ex : candidats médicaments). Ces données sont des préquis avant le passage aux essais cliniques ainsi que pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché. Le projet favorisera l’application des principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), en optimisant les protocoles d’étude et en limitant l’impact sur le bien-être animal, ce qui renforcera la qualité scientifique des résultats et la conformité aux normes éthiques et réglementaires.

Procédures

Les animaux sont soumis dans ce projet : - des prélèvements de sang réguliers réalisés dans le cadre de recommandations vétérinaires, vigiles (sauf en cas d'anesthésie prévus pour d'autres prélèvements, cf ci-dessous). Chaque prélèvement dure quelques minutes, le nombre total est établi en fonction des caractéristiques du produit testé et limité en suivant les recommandations vétérinaires internationales. -des prélèvements d'urine, de manière passif (isolement jusqu’à diurèse ou bien de 4h maximum), ou échoguidé sous sédations (quelques minutes). Généralement, un prélèvement au début et un prélèvement en fin d’étude sont suffisants. - prélèvement d’autres fluides biologiques (liquide céphalorachidien, liquide synovial) : jusqu’à une fois par semaine, sous anesthésie profonde d’une quinzaine de minutes environs - des biopsies d’organes par ponction échoguidée (mini invasive), sous anesthésie profonde (10 minutes environ) - des contention manuelle, notamment dans le cadre d'examen clinique pour détecter des effets toxiques, d’environ 10 minutes. Afin d’éviter la répétition d’actes anesthésiques, les prélèvements peuvent être réalisés au cours d’une même anesthésie, permettant, en 10 à 15 minutes, de recueillir plusieurs échantillons de tissus et liquides biologiques. A chaque étude, tous ces prélèvements ne sont pas effectués, à l’exception des prélèvements de sang et d’urine qui sont systématiques. Ils sont choisis selon la nature du produit testé et les données préliminaires déjà connues (in vivo ou in vitro).

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de tissus biologiques (principalement de sang) et l’administration répétée du xénobiotique peut provoquer des lésions et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus, les animaux sont placés en cage individuelle pendant la phase d’évaluation de la diurèse (prélèvement d’urine, durée limitée à 4 heures maximum). - Liées à une toxicité du xénobiotique testé : les études de toxicologie visent à évaluer la toxicité d’une molécule. Ce type de nuisances est difficilement estimable, mais selon le mécanisme d’action du xénobiotique (anticorps, anticancéreux, neurologique, etc), la voie d’administration, ou encore sa biodistribution, des effets toxiques sont possibles (neurologique, immunologiques, inflammation, métabolique, etc).

Devenir

Les études de toxicologie nécessitent généralement une analyse pathologie et donc la mise à mort des animaux d'après les recommandations des instances pharmaceutiques et médicales internationales. Néanmoins, pour chaque étude, 2 animaux peuvent être inclus dans la phase de préparation uniquement sans recevoir le produit testé et donc maintenus en vie en fin d'étude et inclus après validation vétérinaire dans d'autres études dans le cadre d'une même procédure (utilisation continue). Sans produits administrés, ou bien dans le cas où une mise à mort n'est pas utile d'un point de vu scientifique, ils peuvent être réutilisés dans d'autres procédures, ou bien placés. L'établissement travaille avec des associations pour les faire adopter.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ces études. Suivant les recommandations des autorités règlementaires, il est nécessaire de recourir à des modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues d’après les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques.. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Afin de le réduire, des animaux peuvent faire plusieurs études préliminaires après une période de repos (wash-out) dans le cadre d’une utilisation continue. Des études pilotes sont menées sur un nombre restreint d’animaux, lorsque cela est pertinent, afin d’optimiser les conditions expérimentales et d’affiner les protocoles, ce qui permet de réduire le besoin en animaux pour les études principales. De plus, les tissus et échantillons biologiques collectés au cours des études sont réutilisés pour des analyses complémentaires (histopathologie, biomarqueurs, etc.), ce qui évite de recourir à des animaux supplémentaires pour des tests additionnels. L’ensemble de ces mesures s’inscrit dans une démarche proactive de réduction du nombre d’animaux, en accord avec les principes des 3R et les exigences des bonnes pratiques de laboratoire. Enfin, la réutilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ est possible tant que ces animaux n’ont pas reçu de xénobiotique en cours de test. Cela permet de réduire le nombre global d’animaux utilisé au sein de l’établissement et d’utilisés des animaux bien habitués aux manipulations liées aux études. Cette réutilisation est validée par un vétérinaire et la structure en charge du bien-être animal

Raffinement

Une période d’acclimatation 15 à 21 jours pour les chiens est respectée à réception des animaux. Pendant cette période d’acclimatation, les animaux bénéficient d’un programme d’habituation et de training adapté aux procédures qu’ils devront subir, afin de réduire leur stress et de favoriser leur coopération. Ce programme inclut des manipulations progressives et régulières, permettant aux animaux de s’habituer au contact humain et aux équipements utilisés. Pour les chiens, après la période d’acclimatation, des séances de jeu sont intégrées dans leur routine, favorisant leur stimulation cognitive et physique. Un programme d’enrichissements est appliqué quotidiennement. Il inclue un roulement régulier pour éviter l’habituation, est mis en place et validé par la Structure de Bien-Être Animal. Ce programme garantit des conditions de vie optimales et contribue à minimiser les impacts des expérimentations sur les animaux. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi par la structure en charge du bien-être animal. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase d’administration du principe actif. L’examen clinique complet est effectué par un personnel formé pour évaluer les fonctions motrices, nerveuses, cardiaques, respiratoires, la température et l’état général des animaux. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. L’établissement développe des techniques les moins invasives possibles (ex: des gilets de télémétrie, permettant d’analyser les fonctions cardiaques, respiratoires et l’activité sans contrainte physique ou pose d’implant). Les volumes prélevés/administrés respectent les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Ces animaux sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de xénobiotiques destinés à devenir des médicaments humain. Les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques requièrent généralement deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Le chien est la principale espèce non rongeur utilisée. Selon ces lignes directrices, il convient d’utiliser de jeunes animaux sains : les chiens seront utilisés à partir de 6 mois.

Une tumeur greffée sous la peau du flanc, puis mesurée tous les deux jours pendant treize jours, 1 428 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyses post-mortem, 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 188 un niveau modéré. Selon les groupes, elles reçoivent jusqu'à trois injections d'un agent qui détruit leurs macrophages, ou cinq injections d'immunothérapie, et le porteur signale diarrhées, déshydratation et perte de poids pendant six jours dans un des modèles, ainsi qu'une nécrose possible de la tumeur en fin d'expérience. Le projet cherche à comprendre comment les macrophages modifient la matrice qui entoure la tumeur et gêne l'entrée des cellules immunitaires. Les souris employées sont génétiquement modifiées et les tumeurs greffées choisies pour leur résistance variable aux immunothérapies, le porteur jugeant la similitude des systèmes immunitaires humain et murin suffisante pour parler de modèle "idéal".

Objectifs

Au cours de la tumorigénèse, la matrice extracellulaire, qui constitue l’architecture de tout tissu, est profondément modifiée, contribuant à la progression tumorale en limitant l’accès des cellules immunitaires à l’intérieur de la tumeur, et en favorisant les métastases. Les macrophages sont des cellules immunitaires qui peuvent avoir des effets pro- ou anti-tumoraux, et sont capables de modifier la matrice extracellulaire. Notre projet étudie dans un premier temps le rôle des macrophages dans la modification de la matrice tumorale, pour évaluer, à terme, leurs effets sur la réponse immunitaire naturelle et sous immunothérapie. En particulier, notre projet vise à comprendre comment les propriétés physiques de la matrice influencent l’infiltration des cellules immunitaires, et le rôle que jouent les macrophages dans ce processus.

Bénéfices attendus

Ce projet va contribuer à une meilleure compréhension du dialogue entre cellules tumorales, cellules immunitaires et matrice extracellulaire, 3 acteurs centraux de la tumorigénèse. Les modèles expérimentaux choisis permettront d’obtenir des connaissances fondamentales sur les tumeurs solides et la réponse immunitaire contre celles-ci. Ce projet pourrait permettre à terme d’améliorer les stratégies d’immunothérapies par anticorps ou cellules CAR-T.

Procédures

1-Greffe de cellules tumorales: 1 seule fois par animal, sur animal vigile, puis suivi de la croissance tumorale pendant 13 jours maximum (J3-5-7-9-11-13), sur maximum 1108 animaux 2- Injections d’un agent non douloureux délétant les macrophages : sous anesthésie générale, 3 injections à J3-5-7 ou 9-11-13, sur maximum 458 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes) 3- Traitement par un autre agent non douloureux délétant les macrophages : sous anesthésie générale, une injection à J3 ou à J9, sur maximum 96 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes) 4-Traitement d’immunothérapie (ou contrôle), non douloureux : une injection à J10-13-16-19-22 sur 160 animaux. 5-Traitement (ou contrôle), non douloureux, sous anesthésie générale : une injection à J10-11-12-13 sur 192 animaux (durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes).

Impact sur les animaux

Nous injectons au niveau du flanc des souris des tumeurs sous-cutanées plus ou moins résistantes aux immunothérapies, puis déplétons ou non les macrophages. L’expérience dure entre 9 et 15 jours. Nos observations se font à des temps précoces de la tumorigénèse, la taille de la tumeur reste modérée et ne gêne pas les déplacements de l’animal. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Le traitement pour la déplétion des macrophages peut provoquer des diarrhées et une déshydratation, pouvant entrainer une perte de poids pendant la durée de la déplétion dans un des modèles (6 jours)

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Des études in vitro ont montré l’importance de la matrice extracellulaire dans la tumorigénèse. Afin d’évaluer l’effet des macrophages et de la matrice extracellulaire sur la réponse immunitaire, nous avons besoin impérativement de réaliser des expériences in vivo pour avoir une tumeur, un stroma et un système immunitaire complets.

Réduction

Chaque tumeur sera coupée en 2 échantillons afin de réaliser plusieurs analyses sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cela permet également de corréler les résultats des différentes analyses pour chaque tumeur et de pouvoir mieux analyser les raisons potentielles d’hétérogénéité inter-souris. Par ailleurs, certaines expériences ne seront réalisées que si les expériences précédentes donnent des résultats intéressants (différences de matrice extracellulaire et / ou d’infiltrat immunitaire).

Raffinement

En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis attentivement (mesure de la tumeur, poids, aspect et comportement) afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être, et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les animaux seront sacrifiés en cas d’atteinte des points limites. Du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent être causés par les traitements pour la déplétion des macrophages. En cas de déshydratation, une réhydratation parentérale sera réalisée. En cas d’inflammation cutanée ou de nécrose superficielle des tumeurs, de la crème hydratante et cicatrisante sera appliquée.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie et recherche en thérapeutique anti-cancéreuse. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en font un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire adulte.

1 310 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement des tissus, dont 810 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les lots, elles subissent une chirurgie du cou pour boucher des veines, une ou deux injections dans une zone précise du cerveau, et jusqu'à trois heures d'anesthésie par intervention, avec des risques de lésions de la cornée et de chute de température. Le porteur compte dans cet effectif les souris consacrées à l'entraînement des opérateurs. Il affirme que les organoïdes ne reproduisent ni la régulation du flux veino-lymphatique ni les réponses physiologiques globales, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

Des vaisseaux lymphatiques ont récemment été identifiés dans l’enveloppe la plus externe du cerveau, appelée dure-mère. Ils sont aujourd’hui considérés comme jouant un rôle important dans certaines maladies neurologiques. Situés en dehors du tissu cérébral, ces vaisseaux suivent le trajet de certains vaisseaux sanguins dans cette enveloppe. Des études ont montré que la circulation sanguine dans le cerveau peut influencer leur bon fonctionnement ainsi que l’élimination des liquides présents autour du cerveau. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces vaisseaux lymphatiques et de la circulation sanguine dans l’élimination de certaines substances produites par le cerveau, dont l’accumulation est impliquée dans plusieurs maladies dégénératives. Pour cela, deux approches seront mises en œuvre chez la souris : -Une première approche consistera à modifier l’activité des vaisseaux lymphatiques en injectant une substance dans le liquide entourant le cerveau. -La seconde approche visera à réduire le flux sanguin du cerveau en occluant certains vaisseaux veineux du cou. Ces modèles permettront d’étudier l’élimination des déchets cérébraux en utilisant des traceurs injectés soit dans le liquide qui entoure le cerveau soit directement dans le cerveau. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ce système d’élimination et leur lien possible avec les maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Le drainage des fluides cérébraux joue un rôle essentiel dans le bon fonctionnement du cerveau, en permettant l’élimination de substances qui, si elles s’accumulent, peuvent devenir nocives. Ce processus contribue notamment à limiter l’apparition de certaines maladies liées au vieillissement. Des structures situées autour du cerveau, comme certains vaisseaux sanguins et lymphatiques, participent activement à ce mécanisme de nettoyage. Bien que leur implication ait déjà été mise en évidence, les interactions précises entre ces systèmes restent encore mal comprises. En étudiant plus en détail leur rôle, ce projet vise à mieux comprendre les processus d’élimination cérébrale et à explorer de nouvelles pistes pour améliorer ce mécanisme. À terme, cela pourrait ouvrir la voie à des approches innovantes pour retarder ou limiter le développement de certaines pathologies neurologiques.

Procédures

Un premier lot d’animaux aura une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum) puis recevront ensuite une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau (une fois, 3h d’anesthésie maximum). Un deuxième lot aura une injection au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum). Un troisième lot aura deux injections avec un intervalle de 4 semaines, au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 ou 3 heures d’anesthésie maximum par intervention). Un quatrième lot aura deux injections avec un intervalle de 16 jours au niveau d’une zone spécifique du cerveau sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1h30 d’anesthésie maximum, réalisée 2 fois), et dans l’intervalle une chirurgie au niveau du cou sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée (une fois, 1h d’anesthésie maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une ou plusieurs interventions chirurgicales au niveau du cou ou du cerveau qui peuvent entraîner un inconfort ou des douleurs temporaires chez les animaux, notamment dans les deux jours suivant l’opération. Des signes comportementaux inhabituels tels que l’agitation, la prostration ou une mobilité réduite peuvent être observés à court terme. Il est également possible d’observer des effets secondaires oculaires : gêne oculaire, lésions de la cornée. Enfin, il existe des risques liés à l’anesthésie générale tels que la baisse de température corporelle, sécheresse oculaire ou rares réactions cardio-respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus d’intérêt pour nos analyses pour répondre à notre objectif scientifique.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucune méthode alternative aux modèles animaux permettant d'atteindre les objectifs de ce projet. L’étude des mécanismes physiopathologiques, en particulier les interactions biologiques entre le système neurovasculaire et le drainage des fluides cérébraux, nécessite un modèle vivant pour reproduire de manière réaliste ces processus complexes. La circulation active des fluides cérébraux, ainsi que les dynamiques fonctionnelles du système neurovasculaire, sont des éléments essentiels qui ne peuvent être correctement modélisés par des organoïdes ou des systèmes in vitro. Les organoïdes, bien qu’utiles dans certains contextes, ne permettent ni la reproduction des mécanismes de régulation dynamique du flux veino-lymphatique, ni l’étude des réponses physiologiques globales à une altération fonctionnelle. Par conséquent, le recours à des modèles animaux est indispensable pour analyser les réactions physiologiques complexes, comprendre les mécanismes sous-jacents à l’atteinte de certaines fonctions, et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Réduction

Pour répondre aux exigences du plan expérimental, un total de 1310 souris sera nécessaire. Ce nombre prend en compte plusieurs facteurs, notamment les différentes procédures à réaliser, les analyses post-mortem, les risques de perte liés aux chirurgies, ainsi que les souris requises pour l'entraînement et la formation des opérateurs afin de garantir des interventions standardisées et maîtrisées. Un calcul de puissance statistique rigoureux a été effectué pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires par groupe, en tenant compte des variations expérimentales attendues et des hypothèses formulées. Ce calcul vise à minimiser autant que possible le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse et la fiabilité des résultats obtenus. Ainsi a été défini qu’un nombre minimal de 10 à 15 souris par groupe serait nécessaire pour chaque condition ou type d’analyse. Par ailleurs, ce nombre pourra être ajusté en fonction des résultats intermédiaires obtenus au cours de l’étude. Ces analyses intermédiaires permettront d’évaluer la nécessité de poursuivre certains volets expérimentaux ou, au contraire, de réduire le nombre d’animaux requis, en optimisant les procédures en fonction des données déjà collectées. Pour l’analyse des données, nous utiliserons des tests diagnostiques adaptés aux caractéristiques des échantillons et à leur distribution statistique, afin d’assurer une interprétation précise et rigoureuse des résultats. Cette approche garantit une utilisation raisonnée et éthique des modèles animaux tout en maximisant la qualité scientifique des conclusions.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine. Ils seront hébergés dans une animalerie agréée, en groupe et avec un accès à un enrichissement de leur environnement (matériaux de nidification et bâtonnets de bois à ronger). Les paramètres environnementaux, tels que la lumière, la température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Ils auront un accès permanent à de la nourriture et à de l’eau à volonté. Ils seront observés quotidiennement et toute anomalie sera consignée et transmise à l’équipe de recherche, au vétérinaire et à la structure chargée du bien-être animal pour la mise en place d’une prise en charge adaptée. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Nous maintiendrons la température des animaux tout au long de leur anesthésie et appliquerons un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. Une injection de sérum physiologique sera également réalisée pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Nous assurerons une surveillance renforcée dans la période post-opératoire ou après les prélèvements sanguins afin de nous assurer de la bonne récupération des animaux. En post-opératoire nous utiliserons un cahier opératoire qui sera rempli le jour de l’intervention, consignant les observations per-opératoires et post-opératoires immédiates, ainsi que les suivis à un, deux et huit jours après la chirurgie. Nous utiliserons également une grille de surveillance pour évaluer la douleur et détecter toute atteinte de points limites. Ce suivi permettra de détecter tout signe de stress ou de douleur

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les systèmes veineux et lymphatiques participent au nettoyage naturel du cerveau, en éliminant certains composés qui peuvent s’y accumuler. Pour cela, un modèle animal est nécessaire. Des souris seront utilisées, car ce modèle est bien adapté à ce type de recherche : les techniques chirurgicales permettant de manipuler le système vasculaire cérébral y sont maîtrisées. L’utilisation combinée de modèles chirurgicaux permettra d’analyser de manière complémentaire le rôle de ces systèmes dans le fonctionnement cérébral. Les procédures expérimentales seront menées sur des souris adultes âgées de 2 mois à 1 an, une période durant laquelle la croissance de la boîte crânienne est achevée, permettant une précision optimale lors des interventions, et où la taille corporelle favorise de bonnes conditions opératoires. Cet âge garantit également que certaines structures impliquées dans la circulation des fluides cérébraux sont encore pleinement fonctionnelles. Tous les animaux seront identifiés par tatouage (au niveau des phalanges) dès leur arrivée au laboratoire, à un âge minimal de 6 semaines.