Procédures sévères
Evaluation préclinique de produits de santé pour la cicatrisation
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 300
Cochons d'Inde : 150
Cochons : 360
Jusqu'à trois heures de chirurgie pour créer les plaies et y poser le produit à tester, 360 porcs, 300 rats, 200 souris et 150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sévère pour 60 des porcs. Les plaies sont ensuite observées et les pansements changés régulièrement, avec ou sans anesthésie selon les espèces, et des biopsies peuvent être prélevées. Le porteur compte parmi les effets attendus la mauvaise cicatrisation et l'infection des plaies lorsque l'article testé ne fonctionne pas comme prévu, et rappelle que la réglementation exige ces preuves avant une autorisation de mise sur le marché. Le choix des espèces suit des critères techniques, peau et cicatrisation proches de celles de l'être humain chez les porcs, plaies qui se referment par contraction chez les rongeurs, lignées diabétiques plus faciles à obtenir chez le rat et la souris.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en cicatrisation (exemple : pansements, crèmes, sutures...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en cicatrisation. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin de créer les plaies et y appliquer le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 30 minutes et 3h). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et/ou gazeuse) et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Des observations des plaies et des changes de pansements auront régulièrement lieu, avec ou sans anesthésie selon les espèces. Plus rarement, des biopsies pourront également avoir lieu sous anesthésie générale si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie, contrôlés par la prise d’analgésique (morphinique) et par la réalisation d’une anesthésie générale. Un suivi a minima quotidien des animaux permet de détecter les signes de douleur et d’adapter le traitement analgésique en conséquence pour diminuer autant que possible ces nuisances. - mauvaise cicatrisation / infection des plaies liée à un article test ne fonctionnant pas comme prévu. - présence d’un pansement secondaire pour protéger les plaies et les articles appliqués ainsi que les risques d’infection. L’intégrité de ce pansement secondaire est vérifiée quotidiennement et peut éventuellement gêner l’animal. - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours, contrôlée par le suivi quotidien du transit et/ou de l’alimentation et la mise en place de mesures de soutien, jusqu’à la reprise d’un comportement alimentaire normal et spontané. Les mesures mises en place peuvent être par exemple : mise à disposition d’aliments plus appétant (friandises), distribution d’un aliment de convalescence (prise spontanée ou assistée) ...
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en cicatrisation.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test". Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, éléments de nidification…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, ces suivis sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance et éventuellement réfection additionnelle des pansements (en plus de ceux prévus les jours de lecture), nettoyage des plaies à chaque réfection de pansement, prolongation du traitement analgésique post-opératoire). La douleur liée aux prises de sang éventuelle peut être maitrisée par la réalisation de la prise de sang sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou locale, ou encore sous sédation légère.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie en fonction des attentes du test et les similarités avec l’homme : - Structure de la peau et processus de cicatrisation similaires chez les porcins. - Plus d’exsudation des plaies chez les porcins que chez les rongeurs. - Processus normal de cicatrisation des rongeurs par contraction, comme certains types de plaies chez l’Homme (par exemple, plaies de brulures) - Lorsqu’un phénotype/génotype diabétique est nécessaire pour une étude, les espèces de petite taille, telles que les rats et les souris, sont privilégiées car ces lignées sont plus facilement générées et maintenues. - Les petits animaux (rat, souris, cobayes) sont souvent utilisés pour des raisons de facilité d’utilisation (actes techniques plus facilement réalisables car animaux moins lourds, hébergement de plus petite taille). Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Rôle des cellules endotheliales cuboidales de veinules post-capillaires (High Endothelial Venule ou HEV) dans la recirculation des lymphocytes T dans un contexte de lymphome B chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Porteuses d'un lymphome qui gonfle leurs ganglions et réduit leur mobilité, 2 191 souris reçoivent une à trois injections, dont une chimiothérapie, et une partie subit une chirurgie puis une à deux heures d'imagerie sans jamais être réveillée. Toutes sont tuées à l'issue, les ganglions étant prélevés pour analyse, et 1 658 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère. L'objectif reste descriptif, comprendre comment le traitement donné aux patients modifie les vaisseaux du ganglion envahi. Le porteur ramène pourtant les atteintes au stress de la pesée et de la contention, alors qu'il indique par ailleurs que le lymphome provoque douleur, sensibilité des ganglions et perte de mobilité.
Objectifs
Les veinules cuboidales ou HEV sont des vaisseaux sanguins particuliers qui constituent les portes d’entrées majeures des lymphocytes dans la plupart des organes lymphoides secondaires comme les ganglions lymphatiques et sont indispensables pour le bon fonctionnement du système immunitaire. Lorsque les cellules d'un lymphome (cellules cancéreuses) envahissent un ganglion, l’organisation du ganglion est détruite, ces vaisseaux disparaissent et le système immunitaire du patient est donc affecté. Le traitement utilisé chez les patients atteints de lymphome est une chimiothérapie associée à un anticorps thérapeutique. Ce traitement permet de réduire le lymphome et de détruire les cellules cancéreuses. Cependant, certains patients rechutent et l’objet de ce projet est donc d’étudier en utilisant le modèle souris comment le traitement utilisé chez les patients module la vascularisation du ganglion infiltré par le lymphome, et de déterminer si ces changements peuvent être utiles pour améliorer la prise en charge des patients notamment lors des rechutes.
Bénéfices attendus
Comprendre à l'aide d'un modèle chez la souris les effets de la chimiothérapie sur les vaisseaux des ganglions infiltrés par une tumeur de type lymphome afin de mieux choisir les traitements à administrer aux patients qui répondent moins bien ou qui rechutent.
Procédures
Les animaux seront soumis à: 1, 2 ou 3 injections (La durée de chaque injection allant de 10 secondes à quelques minutes mais toujours < 5min chacune). Certains animaux auront trois injections puis seront anesthésiés pour la réalisation d'une procédure de chirurgie dont la durée est de moins d'une heure et d'imagerie par microscopie dont la durée est de 1 à 2h cette chirurgie et imagerie se faisant sans réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé développe des cancers au niveau des ganglions appelés lymphome. Ce lymphome peut provoquer de la douleur à l’animal, sensibilité au niveau des ganglions et une perte de mobilité liée notamment au gonflement des ganglions au niveaux de l'aine ou du creux axillaire. Les souris qui subiront des injections subiront du stress lié à la pesée et à la contention nécessaire à l'injection. Les souris qui reçoivent la chimiothérapie ou qui sont anesthésiées pour une chirurgie sans réveil peuvent aussi subir un stress au moment de l'injection.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car les analyses nécessitent le prélèvement des ganglions.
Remplacement
A l’heure actuelle, les procédures réalisées sur l'animal dans le cadre de ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, les veinules cuboïdales des ganglions ou HEV sont dépendantes de l'environnement du ganglion lymphatique. De ce fait, toute étude in vitro est actuellement non envisageable. De plus, ces cellules sont associées à une fonction particulière qui permet la recirculation des lymphocytes qui sont des cellules majeures dans la surveillance immunitaire, et cela ne peut également être évalué qu’in vivo. Par conséquent, l’ensemble des études sur ces veinules se font exclusivement chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque groupe a été déterminé par nos études antérieures et celles de la littérature. Il est de 15 animaux dans chaque groupe étudié, un nombre d’individus suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Enfin, le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure est possible uniquement si les résultats de la précédente procédure le justifient.
Raffinement
La stratégie de raffinement est premièrement fondée sur l’utilisation de points limites précoces, prédictifs et adaptés. Le suivi des animaux est réalisé par les expérimentateurs ou l’équipe de zootechnie quotidiennement (aspect externe, comportement, palpation des ganglions périphériques). Les procédures d'injections ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Les injections se font sous anesthésie locale et les chirurgies sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique. Les conditions d’hébergement et les méthodes expérimentales utilisées sont les plus appropriées pour réduire au maximum toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est lié au fait que les ganglions lymphatiques ne sont véritablement apparus au cours de l'évolution qu'à partir des mammifères. La souris est donc le plus petit mammifère adapté à l'étude des veinules cuboïdales dans le cadre des lymphomes. Seuls des adultes âgés d'un minimum de 6 semaines sont utilisés car le développement de ces ganglions et du système immunitaire mature est tardif.
Evaluation de l’efficacité d’une thérapie ciblée dans un modèle endogène de tumeur du pancréas
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées portent deux mutations qui leur font développer un cancer du pancréas, la maladie apparaissant dès l'âge de six semaines. 130 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, avec douleur, perte de poids, mobilité réduite et comportements anormaux liés à la croissance de la tumeur. Elles sont biopsiées à l'oreille pour le génotypage, injectées trois à cinq fois par semaine dans le péritoine, et passées deux fois par semaine sous échographie et élastographie sous anesthésie gazeuse. Une partie est tuée à huit semaines pour récupérer des tumeurs de haut grade, l'autre est menée jusqu'au point limite pour mesurer combien de temps le traitement retarde la maladie.
Objectifs
On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en forte croissance dans les pays développés, et encore plus en France en passant de 8.000 cas en 2020 à 16.000 cas en 2021. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. L'objectif premier de notre projet consiste à évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie ciblée (nommée NP137) contre la Nétrine-1 (une protéine secrétée avec un rôle connu dans l'embryogenese et surexprimée dans certains cancers) seule ou en association avec le traitement de référence (nommé Folfirinox) dans un modèle murin de tumeurs du pancréas. Ainsi, nous pourrons évaluer si cette nouvelle thérapie anti-Netrine-1 (nommée NP137) serait une nouvelle option thérapeutique, seule ou en combinaison avec le traitement actuel de référence (nommé Folfirinox). L’objectif secondaire sera, si une efficacité est constatée dans le premier objectif, d’étudier les mécanismes d’action de notre candidat médicament afin de pouvoir ultérieurement en améliorer son efficacité. Cette étude pilote permettra de valider la maitrise du modèle et de mesurer la variabilité des paramètres observés en réponse au différents traitements. Une analyse rétrospective sera réalisée.
Bénéfices attendus
Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux (Thérapie ciblée, immunothérapie, chimiothérapie). Notre hypothèse est que notre cible thérapeutique joue un rôle dans le développement des tumeurs du pancréas. Nous nous basons pour cela sur des éléments d'évaluation de son expression dans une cohorte de patients atteints de ces tumeurs. Dans le cadre de notre structure, l'objectif principal sera d'évaluer l’effet anti-tumoral d’une thérapie ciblée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie. Notre objectif secondaire sera de mieux comprendre le fonctionnement du candidat médicament et son fonctionnement en association avec des chimiothérapie.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux dans les deux procédures inclues dans cette demande sont identiques. Les animaux vigiles seront en amont biopsiés aux oreilles afin d'identifier leur génotype et de les affecter dans le bon groupe d'étude. En fonction de leur groupe d'affectation les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales (Entre 3x et 5x/semaine selon les groupes, 30 secondes de manipulation) lors des administrations thérapeutiques. Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées, et le suivi de la croissance tumorale . Ainsi, jusqu’à la fin des procédures, un suivi de la taille et de la dureté de la tumeur sera effectué par échographie et élastographie sous anesthésie gazeuse (5 minutes, sous anesthésie) deux fois par semaine. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie juste avant l'euthanasie pour prélèvement d'organes d'intérêt (donc 1 seul prélèvement par souris, qui dure 30 secondes au maximum).
Impact sur les animaux
Les effets subis par les animaux sont, pour les procédures 1 et 2, les nuisances induites par le développement des tumeurs pancréatiques dans ces modèles de tumeurs pancréatiques endogènes : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux. Ces nuisances sont, grâce à notre expertise du modèle et à un suivi journalier des animaux, rapidement détectées. Par ailleurs, les manipulations des animaux peuvent entrainer du stress durant le temps des contentions.
Devenir
L'ensemble des animaux des procédures 1 et 2 seront euthanasiés. La procédure 1 relève d'une procédure dite "de survie" pour évaluer l'efficacité du traitement à limiter le développement des tumeurs pancréatiques. Les animaux développeront tous des tumeurs mais de manière retardée par le traitement s'il est efficace. Les animaux devront donc quand même être euthanasiés quand ils atteindront un point limite. Pour la procédure 2, les animaux seront tous euthanasiés à un même temps donné afin de récupérer leur tumeur. Cette étape est cruciale pour récupérer du matériel biologique afin d'analyser l'effet biologique anti-tumoral du traitement.
Remplacement
En raison de la nature complexe de nos recherches, qui visent à comprendre les interactions cellulaires au sein du pancréas et de différents organes affectés par sa dysfonction, nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à évaluer le rôle de potentiel médicament anti-cancéreux d'un traitement, en combinaison ou non avec le traitement de référence actuel chez les patients. Ce projet fait suite à plusieurs validations in vitro et ex vivo de la pertinence de l'efficacité du traitement.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un effet anti-cancéreux significatif de chaque traitement par rapport aux animaux des groupes contrôles a été défini à l'aide d'un outil informatique, en utilisant des données bibliographiques et des résultats antérieurs de l’équipe. Ainsi, pour chaque procédure, le nombre d’animaux nécessaire est de 10/groupe.
Raffinement
Une voire 2 personnes compétentes (formations en expérimentation animale + chirurgie) réaliseront la surveillance et la manipulation quotidienne des souris. Des critères objectifs seront quantifiés (poids, mobilité, divers points d'aspect de la souris) et un score cumulé sera établi signifiant le bien-être animal. Une prise en charge spécifique de la douleur ou l'euthanasie de l'animal pourra être réalisée en fonction de cette évaluation. Un enrichissement matériel de l’environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu’ils expriment des comportements normaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, modèle d'étude de référence dans le domaine du cancer pancréatique et dont les caractéristiques morphologiques et génétiques des tumeurs récapitulent fidèlement la maladie chez l’homme. De plus, cette espèce se caractérise par de nombreux avantages, notamment leur développement rapide, une descendance nombreuse et une facilité d’entretien et d’élevage. Ces souris nommées "KIC" (un acronyme de la combinaison des deux mutations génétiques les plus fréquentes chez les patients atteints de cancer pancréatiques) développent des tumeurs pancréatiques et seront traitées, ou non pour les groupes contrôles, dès l’âge de 6 semaines pour une durée de 2 semaines pour la procédure 2 ou jusqu’à l’atteinte d’un point limite pour la procédure 1. Elles seront euthanasiées au stade de jeune adulte (à 8 semaines pour la procédure 2 stade à partir duquel les tumeurs prélevées sont dites de haut grade, comme la majorité des tumeurs pancréatiques diagnostiquée chez les patients) ou à l’atteinte d’un point limite pour la procédure 1. Ce dernier argument est requis pour notre étude qui vise à améliorer à terme l’efficacité des traitements des cancers du pancréas.
Effets de l’acide valproïque sur la reproduction chez l’animal épileptique – Etude pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectées à répétition d'un agent épileptogène jusqu'à un état convulsif d'au moins 30 minutes, des souris femelles CD-1 sont rendues épileptiques à vie, avec une mortalité attendue de 30 à 50 % par arrêt cardio-respiratoire. 448 souris vont être utilisées, 96 femelles et environ 352 souriceaux nés de la reproduction d'une partie d'entre elles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Les femelles épileptiques boivent pendant deux à huit semaines un traitement antiépileptique dilué dans leur eau, l'objectif étant une concentration d'acide valproïque proche de celle des patients qui n'empêche ni la reproduction ni la viabilité des portées. Le porteur écrit que la méconnaissance des mécanismes de l'épilepsie "ne permet pas de calculer un nombre précis d'animaux", et l'étude n'est qu'un pilote, préalable à un projet sur au moins trois générations de descendants.
Objectifs
Les médicaments antiépileptiques représentent un enjeu majeur dans la recherche pour la santé publique. L’épilepsie affecte plus de 60 millions de personnes dans le monde. De nombreuses études ont montré le risque de provoquer des malformations chez l’embryon au cours de son développement de certains traitements antiépileptiques. Cependant beaucoup de femmes atteintes d’épilepsie continuent d’être traitées au cours de leur grossesse et allaitement. En plus du risque de malformations au cours du développement, l’acide valproïque, un traitement antiépileptique largement prescrit ces cinquante dernières années, a montré des effets secondaires persistant sur plusieurs générations chez des rongeurs. Ces études ont utilisé des animaux non atteints d’épilepsie, de plus le traitement antiépileptique n’a été administré que sur de courtes périodes. Pour rendre compte de la réalité clinique, il est nécessaire de tester chez des animaux atteints d’épilepsie les effets secondaires sur plusieurs générations de l’acide valproïque et autres traitements sur une longue période, et ainsi montrer que l’exposition aux antiépileptiques peut être un facteur de risque chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but, dans un premier temps, de tester la possibilité d’induire une épilepsie chez une souche de souris non consanguine (souris générées par des croisements d’animaux non apparentés) ainsi que de s’assurer de la capacité de ces animaux à se reproduire. Utiliser une souche de souris non consanguine permet de se rapprocher au mieux de la réalité chez l’homme (forte variabilité génétique contrairement aux souches de souris consanguines) afin d’évaluer de potentiels facteurs de risque. Dans un second temps, l’objectif de cette étude pilote est de déterminer une concentration optimale d’acide valproïque qui permette de se rapprocher au mieux de la concentration thérapeutique utilisée chez les patients et qui n’empêche ni la reproduction des animaux épileptiques traités, ni la viabilité des portées engendrées par ces animaux. Valider les étapes expérimentales de cette étude pilote supporterait la mise en œuvre d’un projet dont l’objectif est de déterminer dans quelle mesure les médicaments antiépileptiques affectent les descendances (au moins sur trois générations) de souris femelles épileptiques exposées à ces traitements. Ces objectifs de recherche dans le traitement de l’épilepsie se placent dans un cadre de santé publique.
Bénéfices attendus
En validant la possibilité d’induire un modèle d’épilepsie chez des souris femelles et de reproduire ces animaux traités à l’acide valproïque, cette étude pilote permettra à plus long terme de mieux comprendre les effets observés sur plusieurs générations des médicaments antiépileptiques. Démontrer le facteur de risque pour l’Homme que représentent les antiépileptiques aidera à améliorer les traitements de l’épilepsie ainsi que de limiter les effets secondaires sur les futures générations.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement à un agent épileptogène qui permet le développement d'une épilepsie qui perdure à vie. Ce traitement est injecté à plusieurs reprises si nécessaire. Une première dose est injectée 30 minutes après l’administration d’un médicament protégeant des effets secondaires de ce traitement. Si au cours des 20 minutes suivant cette injection l’animal ne présente pas d’état convulsif, alors une seconde dose, plus faible, est injectée. Si aucun état convulsif n’est observé chez l’animal 10 minutes après cette seconde dose, alors une dose encore plus faible est administrée de façon répétée (toutes les 10 minutes) jusqu'à apparition d'un état convulsif. L’état convulsif doit durer au minimum 30 minutes pour qu’une souris soit considérée en épilepsie chronique. Passé ce délai, un anticonvulsivant est administré à l’animal. Ces animaux ingéreront un traitement antiépileptique directement dilué dans leur eau pour une durée minimum de deux semaines pouvant aller jusqu’à 8 semaines.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus durant l’induction de l’épilepsie. Pour induire cette épilepsie il est nécessaire de déclencher un état convulsif chez les souris naïves. Pour obtenir cet état convulsif, les animaux subissent des injections répétées d’un agent épileptogène qui peuvent induire un stress au cours de la contention de l’animal. L’état convulsif dure au minimum 30 minutes au cours desquelles les animaux peuvent ressentir des douleurs dues aux contractions musculaires involontaires. Une perte de poids peut subvenir mais elle se rattrape dès le deuxième/troisième jour suivant l’induction de l’épilepsie. Au cours de cette procédure une mortalité de 30 à 50% est attendue due aux effets secondaires de l’agent épileptogène injecté (arrêts cardio-respiratoires). L'ajout du traitement antiépileptique dans l'eau des boissons des animaux pourrait avoir des effets indésirables sur les animaux tels qu'une diminution dans la prise d'eau et perte de poids. Ces effets seront surveillés afin de ne pas dépasser de points limites. Les effets de l’épilepsie et du traitement à l’acide valproïque étant inconnus sur le comportement de reproduction des femelles, des nuisances pourraient être occasionnées par celles-ci sur leurs portées telles qu’un manque de soin (peu ou pas d’allaitement) ou des blessures physiques. Également, durant les périodes de gestation, des complications pourraient survenir engendrant un état de stress et de douleur (contractions prolongées, terme de mise-bas dépassé). A la fin de l’étude ou dans le cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront transférés dans une cuve d'induction afin de les anesthésier avant euthanasie. Cette manipulation peut engendrer un stress chez l'animal avant d'être complètement anesthésié.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Au cours de cette étude pilote, il sera développé et utilisé un modèle d’épilepsie chez la souris reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’Homme (affects cognitifs et comportementaux). L’épilepsie est une pathologie dont l’origine est localisée dans le cerveau, qui est un organe contrôlant l’ensemble des fonctions de l’organisme. De ce fait, les effets recherchés du traitement antiépileptique nécessitent l’accès à l’organisme entier (étude du comportement de reproduction, atteintes anatomiques sur les portées générées), ce qui n’est pas compatible avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale telles que la modélisation informatique ou bien les expériences in vitro. De plus, il est compliqué d’étudier les conséquences d’un traitement sur plusieurs générations chez un modèle humain. C’est pourquoi le modèle animal se retrouve nécessaire pour mener ce projet de recherche dont le but est de mieux comprendre les effets secondaires transgénérationnels, potentiellement dangereux pour la santé, des antiépileptiques.
Réduction
Le caractère méconnu des mécanismes cérébraux de l’épilepsie ne permet pas de calculer un nombre précis d’animaux pour les différentes procédures de cette étude pilote. L’induction de l’épilepsie peut engendrer une mortalité de 30 à 50% chez les animaux. Compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle, du comportement de reproduction inconnu chez les souris épileptique et de ce taux de mortalité, le nombre d’animaux a été optimisé à 448 souris CD-1 (96 femelles et une estimation de 352 souris générées par reproduction d’une partie de ces souris) pour permettre d’obtenir les observations nécessaires à cette étude, tout en réduisant au minimum le nombre d’animaux. L’organisation des animaux en différents lots permettra dans le cas d’un taux de mortalité plus faible que prévu de ne pas avoir recours au nombre total d’animaux estimé pour cette étude. Les souris femelles seront utilisées pour l’ensemble des procédures.
Raffinement
Au cours de cette étude pilote, des points limites suffisamment précoces et adaptés pour chaque procédure (induction épilepsie et traitement antiepileptique) seront mis en place pour réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse chez les animaux durant les manipulations ainsi qu’en dehors de ces périodes. Les animaux seront suivis quotidiennement jusqu’à leur mort. Leur poids ainsi que différentes variables, regroupées sur des fiches de suivi, seront surveillés afin de pallier quelconques signes de douleur ou de souffrance. Selon les observations, un protocole prévoit une action curative pouvant impliquer l’utilisation de médications pour soulager rapidement la douleur. L’induction de l’épilepsie chez les souris nécessite l’injection répétée de substance épileptogène. Le comportement de chaque souris sera surveillé entre chaque injection et permettra de prendre la décision de réinjecter ou non chaque animal individuellement. Ce protocole individualisé permet de réduire le temps de souffrance que les souris peuvent subir jusqu’à l’apparition d’une épilepsie chronique et accélère leur rétablissement. La semaine suivant l’induction de l’épilepsie, les animaux seront observés deux fois par jour pour s’assurer de leur bonne récupération, surtout dans la perte de poids qui peut survenir les 2 premiers jours. Des croquettes ramollies dans de l’eau avec du sucre seront placées dans les cages afin de réduire la perte de poids et faciliter la convalescence. Au cours du début du traitement antiépileptique, une attention particulière sera portée sur l’abreuvement des animaux. Si le traitement présente un caractère trop aversif et provoque des déshydrations trop importantes, celui-ci sera interrompu. Après accouplement, les femelles seront surveillées 2 fois par jour au cours de la dernière semaine de gestation afin de s’assurer que la mise-bas se déroule correctement. Les portées générées seront également surveillées et pesées quotidiennement afin de s’assurer de leur bonne croissance jusqu’au sevrage. Une attention particulière sera portée sur le comportement des mères envers leurs portées pour s’assurer que les souriceaux sont bien allaités et ne subissent pas de violences physiques. Le bien-être des animaux est également privilégié au niveau de leurs conditions d’hébergement. Ils seront regroupés par 2 jusqu’à 4 selon la taille des cages. Des études montrent que les animaux épileptiques présentent des crises moins sévères lorsqu’ils sont hébergés en groupe.
Choix des espèces
De nombreuses études ont montré la similarité des régions cérébrales impliquées dans l’épilepsie entre l’Homme et les rongeurs (rats et souris). Cette similarité permettra de mieux extrapoler les résultats de notre étude aux mécanismes pathologiques chez l’Homme. Des souris d’au minimum 6 semaines seront utilisées, cet âge correspondant à la maturité sexuelle nécessaire pour la reproduction. Les portées générées seront conservées jusqu’au sevrage (21jours après la parturition) pour étudier leur croissance.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles solutions thérapeutiques sur des modèles de lupus chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Prélevées jusqu'à dix fois à la veine de la queue, une fois par œil en rétro-orbitaire, et traitées jusqu'à deux fois par jour pendant un mois par voie orale, 3 000 souris sont utilisées dans des essais de médicaments contre le lupus. 600 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère et toutes sont tuées pour prélever leurs organes. Le lupus provoque chez elles une insuffisance rénale progressive et fatale, avec perte de poids, activité réduite, lésions cutanées douloureuses, polyarthrite et inflammation des glandes salivaires, sur trois à quatre mois. Le porteur annonce une grille de cotation quotidienne fondée sur la perte de poids, l'aspect général et le comportement, pour tuer les souris avant que les signes cliniques ne deviennent trop sévères, sans indiquer les seuils retenus.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans des modèles de lupus chez la souris. Le lupus systémique (LS) est une maladie auto-immune chronique caractérisée par la production d’autoanticorps dirigés contre les propres organes du patient. La maladie affecte de nombreux organes comme la peau, les articulations, le cœur, les reins et les systèmes nerveux et hématologiques. La prévalence au niveau mondiale est de 44 pour 100000, 9 sur 10 étant des femmes. Le traitement du lupus adaptée au risque évolutif individuel et à l’activité de la maladie et fait l’objet d’ajustements en cas d’inflammation persistante. En général ces traitements ciblés contrôlent bien la progression de la maladie chez la majorité des patients. Mais ils peuvent induire des effets secondaires assez problématiques à gérer, parfois toxiques. Il y a environ un tiers de patients pour qui ces traitements sont largement inefficaces ou ont perdu en efficacité ou bien ont conduit à des complications sérieuses comme des infections fongiques. Le LS est une maladie extrêmement hétérogène dans ses manifestations et mécanismes sous-jacents. La recherche pharmaceutique est donc orientée vers le développement de traitements mieux tolérés ou ciblant spécifiquement les catégories de patients sans solution thérapeutique avec pour objectif une rémission durable.
Bénéfices attendus
Les études de ce projet permettront d’évaluer le potentiel thérapeutique de médicament expérimentaux dans le lupus systémique. A court terme elles permettront de faire évoluer le projet de recherche : Un effet thérapeutique en deçà des objectifs conduirait soit à conduire une campagne d’optimisation du principe actif, soit à un arrêt définitif du projet de recherche. Un effet thérapeutique en ligne avec les attentes permettrait d’initier les phases de développement suivantes, c’est-à-dire les études pharmacocinétiques et toxicologiques réglementaires. A plus long terme, ces études permettront d’aider à déterminer les doses qui seront administrées chez les patients et enfin à procurer un traitement efficace et mieux toléré aux personnes souffrant du lupus.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. -Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu'à 1 fois pour jour de 1 à 3 mois. -Mesure de la température corporelle : Durée 15 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale per injection ou gaweusse, via une sonde rectale pour rongeur, pourrait être effectuée pour confirmer une hypothermie. 3 fois par animal. -Prélèvement de sang par voie retro-orbitale au cours de la procédure : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par oeil et par animal. -Prélèvement de sang via la veine caudale : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Jusqu'à 10 fois par animal. -Prélèvement de sang terminaux par ponction cardiaque : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par animal. Les volumes et lq fréquence des prélèvements seront selon les criètres de la consigne SBEQ en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µl. Le volume total prélevé n'exèdera pas 7,5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place, pouvant aller jusqu'à 1 semaine. Administrations des composés à potentiel thérapeutiques. Plusieurs choix possibles : -Par voie orale : Durée 10 secondes sur animal vigile, jusqu'à 2 fois par jour pendant 1 mois. -Par voie intrapéritonéale : Durée 10 secondes sur animal vigile 1 fois par semaine pendant 3 mois. -Par voie sous-cutanée : Durée 10 secondes sur animal vigile, 1 fois par jour pendant 3 mois en alternant les sites d'injections. -Par voie intraveineuse retro-orbitale : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par oeil et par animal, par étude. -Par voie intraveineuse par la veine caudale : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 2 fois par mois pendant 3 mois. -Par voie in
Impact sur les animaux
Le lupus induit chez la souris une dégradation rapide de son état de santé. Cette dégradation est due principalement au développement d’une insuffisance rénale progressive, à terme fatale pour les animaux.Les souris seront sujettes à une perte de poids progressive, à un état de fatigue se traduisant par une activité réduite, à des douleurs liées aux lésions cutanées, au développement d’une polyarthrite rhumatoïde, à une inflammation des glandes salivaires et des vaisseaux sanguins. L’intensité de ces effets se développera de manière progressive sur une durée maximale de 3 4 mois. Dans le cadre des études de ce projet les souris seront mises à mort avant que les signes cliniques ne deviennent trop sévères. Une grille d’évaluation du lupus et de l’état général des souris sera utilisée pour le suivit des souris au quotidien. Les critères principaux comprendront la perte de poids, l’aspect général, le comportement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts qui feront l'objet d'analyses comme le dosage de biomarqueurs et les concentrations des composés à potentiel thérapeutiques.
Remplacement
Une revue de la littérature montre qu’il n’existe pas à ce jour de systèmes in silico ou in vitro qui permettraient de modéliser l’extrême complexité de la physiopathologie du lupus et d’étudier l’effet de nouveaux traitements. Les systèmes in vitro les plus sophistiqués du moment sont des cultures d’organoïdes qui représentent des versions simplifiées d’organes. Or l’écosystème dont la pharmacodynamie, la pharmacocinétique et le lupus dépendent, intègre de nombreux tissus et organes (vaisseaux, reins, foie, système immunitaire, sang etc.). A ce jour, seule l’utilisation d’un animal peut permettre d’étudier les interactions complexes entre les traitements expérimentaux et ces différents systèmes biologiques. Cependant, les études de ce projet s’appuieront très largement sur les résultats d’études réalisées sur des cellules en culture et autres systèmes in vitro (biochimiques, physiques). Ces phases d’évaluation in vitro évitent d’utiliser l’animal directement et donc réduisent son usage. L’utilisation d’animaux dans ce projet permettra de démontrer le potentiel thérapeutique de nouveaux traitements ce qui est une étape indispensable avant l’évaluation sur des volontaires sains, puis sur des patients.
Réduction
Les composés seront préalablement évalués sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire certaines caractéristiques médicamenteuses des composés). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés seront donc éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles animaux de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des analyses de détermination de la taille des groupes expérimentaux. L’effet des composés expérimentaux sera évalué à l’aide de tests statistiques et la procédure d’analyse sera validé par des statisticiens comme il est d’usage dans la recherche pharmaceutique.
Raffinement
Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire et donc sur la sévérité du lupus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. La gravité du lupus sera évaluée grâce à un système de cotation pour permettre d’anticiper les dommages irréversibles de la maladie et mettre à mort les individus impactés et ainsi prévenir des souffrances inutiles.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique a été décrite chez le rat et la souris. De nombreuses données sur les modèles de lupus chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l'avancement des projets (exemple : effets de molècules de réfèrences). Adulte : Les données de la littérature indiquent que le lupus peut être induit chez la souris adulte et se manifeste chez des souris mutantes ou transgéniques de 5 à 24 semaines d'âge.
Mise en place et caractérisation d’un biomarqueur d’imagerie d’ischémie-reperfusion cérébrale et IDENTIFICATION DES CIRCUITS CÉRÉBRAUX DE LA NOCICEPTION POST-AVC chez le Primate Non-Humain (PNH) EU (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacun subit une occlusion de l'artère cérébrale moyenne qui provoque un AVC et une perte des capacités motrices et cognitives, suivie de plusieurs jours de confinement, puis des séances d'imagerie TEP, IRM et EEG, des prélèvements de sang répétés et des stimulations thermiques allant jusqu'à 49 °C. L'apprentissage d'une tâche alimentaire s'étale sur quatre mois et demi sous contrôle de la quantité d'eau donnée, la ration étant ajustée aux performances de l'animal. Le porteur reprend d'une étude antérieure un taux de mortalité de 18 % lié à l'occlusion, prévoit deux à quatre animaux supplémentaires pour l'absorber, et affirme que le recours au primate est "essentiel" pour valider une inclinaison de la tête à 15° avant l'essai chez l'humain.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est un déficit neurologique soudain causé par un caillot ou une hémorragie cérébrale. Le traitement le plus récent de l'AVC ischémique est la thrombectomie, visant à retirer l’occlusion par une intervention endovasculaire pour restaurer l'apport sanguin cérébral. L’étendue de la pénombre ischémique, la zone cérébrale affectée par l’infarctus, est un facteur déterminant de l'issue de l'AVC. Sauver la pénombre est crucial pour limiter les séquelles graves. Notre projet a pour objectif de valider la sécurité de la procédure HDT15°, qui consiste à incliner de 15° le corps et la tête du sujet pendant l’occlusion, pour augmenter l’apport sanguin vers la pénombre par les vaisseaux collatéraux. Cette approche, déjà validée chez le rongeur, doit être testée chez le primate avant un essai clinique. HDT15° pourrait réduire les risques de décès ou de handicaps graves. La mesure du métabolisme de l'oxygène cérébral (CMRO2) reflète l’état de la pénombre ischémique et peut servir de biomarqueur pour évaluer l'atteinte cérébrale et prédire la récupération post-AVC. Ce projet vise à valider l’utilisation de CMRO2 mesuré par IRM dans la phase aiguë de l'AVC, et à évaluer sa valeur prédictive pour la récupération. Des analyses corrélatives seront menées entre les déficits moteurs observés chez l'animal (par exemple, une tâche de prise alimentaire nécessitant dextérité) et les marqueurs d’activité cérébrale dans les zones corticales et sous-corticales afin de corréler l’intensité des déficits et la vitesse de récupération. CE MODÈLE ANIMAL UNIQUE A DÉJÀ ÉTÉ VALIDÉ POUR ÉTUDIER L’IMPACT DE L’AVC SUR LA RÉCUPÉRATION FONCTIONNELLE, QUI S’ACCOMPAGNE SOUVENT DE DOULEUR CHRONIQUE (20 % DES CAS CHEZ L’HOMME). C'EST POURQUOI NOUS DEMANDONS UN AMENDEMENT À NOTRE PROTOCOLE POUR AJOUTER UNE PROCÉDURE SUPPLÉMENTAIRE POUR ÉVALUER CE RISQUE. EN OUTRE, LA DÉCOUVERTE DE LIENS ENTRE L’ACTIVITÉ CÉRÉBRALE OBSERVÉE À LA SURFACE DU CORTEX VIA EEG ET LES MODIFICATIONS DE L’ACTIVITÉ SOUS-CORTICALE LIÉES À LA NOCICEPTION (MESURÉES PAR IRM FONCTIONNELLE ET IMAGERIE TEP) OFFRE DES INFORMATIONS PRÉCIEUSES SUR L’EFFET DES AGENTS PHARMACOLOGIQUES, COMME LE FENTANYL, QUI PEUVENT INDUIRE DES EFFETS ANALGÉSIQUES MAIS AUSSI INDÉSIRABLES. CETTE APPROCHE EXPÉRIMENTALE PERMETTRA D'ÉTUDIER DES MOLÉCULES DE REMPLACEMENT POTENTIELLES POUR TRAITER LA DOULEUR CHRONIQUE POST-AVC. CE PROJET SE DÉROULE DANS DEUX EU DIFFÉRENTS, L'UE1 POUR LE COMPORTEMENT ET L’UE2 POUR L’IMAGERIE.
Bénéfices attendus
Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la reperfusion dans la compensation et la récupération post-AVC. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant la procédure de l’HDT15°, un traitement non pharmacologique de première intention pour améliorer la récupération de nombreux patients atteints d’AVC. Une meilleure compréhension des mécanismes de compensation grâce à une imagerie par CMRO2 (consommation de l’oxygène) ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différents types d’imagerie, nous allons avoir l’opportunité de caractériser les marqueurs d’inflammation et de comprendre comment ces zones lésées peuvent compenser à travers l’utilisation d’autres circuits cérébraux. Cette compensation ayant lieu dans d’autres pathologies comme le coma, nos résultats seront donc également d’intérêt plus général. Afin d'être largement disponible pour une utilisation clinique dans les maladies cérébro-vasculaires, LES BIOMARQUEURS D’IMAGERIE CÉRÉBRALE QUI PERMETTENT DE PRÉDIRE LA RÉCUPERATION FONCTIONNELLE POST-AVC SERONT INTÉGRÉS DANS LES LOGICIELS PRODUITS PAR OLEA SPHÈRE ET AINSI OPTIMISERAIT L’AIDE AU DIAGNOSTIC EN SOINS INTENSIFS. L’AJOUT DE LA DEUXIÈME PROCÉDURE AVEC L’UTILISATION DE L’EEG POUR DÉTERMINER A LA SURFACE DU CRANE DES MODIFICATIONS DES CIRCUITS DE LA NOCICEPTION QUI PEUVENT ENTRAINER DES DOULEURS CHRONIQUES EST UN BÉNÉFICE MAJEUR APPORTÉ PAR L’AMENDEMENT QUE NOUS AVONS FAIT A CE PROJET. EN EFFET, LA DÉCOUVERTE DE LIENS CORRÉLATIFS ENTRE LES SIGNAUX EEG ET DES ANOMALIES D’ACTIVITÉS DES CIRCUITS DE LA NOCICEPTION PERMETTRA DE MIEUX ÉVALUER ET TRAITER CE SYMPTOME DES DOULEURS CHRONIQUES SURVENANT A DISTANCE DE L’AVC ET QUI CAUSE DES PROBLÈMES IMPORTANTS DE PRISES EN CHARGES DES PATIENTS AUSSI BIEN EN CLINIQUE HUMAINE QUE VÉTÉRINAIRE. NOUS POURRONS AINSI DÉTERMINER L’IMPACT D’AGENTS PHARMACOLOGIQUES POUVANT INDUIRE DES EFFETS ANALGÉSIQUES, COMME LE FENTANYL OU D’AUTRES MOLÉCULES EN DÉVELOPPEMENT.
Procédures
Une légère anesthésie sera réalisée pour poser le collier des animaux (sur le site EU1 : 1 heure). L’apprentissage et la réalisation de la tache alimentaire se fera sous un contrôle hydrique (SITE EU1: 4 mois et 15 jours). En fonction des performances de l'animal et de son apport hydrique venant des aliments obtenus dans la tâche, la quantité d'eau dans la bouteille sera ajustée pour donner un apport hydrique constant. Un apport nutritionnel complémentaire, composée de croquettes primates et légumes, sera dispensé dans la cage après chaque séance et sera pris en compte dans l’apport hydrique quotidien. Les jours de repos (week-end), les animaux auront un accès libre jusqu’au dimanche, ou l’apport hydrique de référence pour chaque animal sera repris. De plus, les animaux seront exposés à des stimuli nociceptifs (stimulation thermique) et somesthésiques (air puff). Les imageries multimodales TEP-IRMf-EEG seront réalisées (SITE EU2: 1/2 journée). Des imageries seront réalisées pour évaluer les lésions cérébrales et évaluer la valeur prédictive du CMRO2 ou de l’intensité du phénomène d’inflammation mesuré par IRM de diffusion ou imagerie TEP (SITE EU2: 1/2 journée par imagerie). Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux, lors des étapes d’imagerie sous anesthésie. Ces prélèvements de sang seront plus nombreux lors de l’étape d’occlusion-reperfusion (SITE EU2). Finalement un dernier prélèvement sanguin sera effectué avant l'euthanasie scientifique de l’animal (SITE EU1). A la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés par injection intraveineuse létale d’un agent euthanasiant vétérinaire suite à une sédation a la kétamine (SITE EU1).
Impact sur les animaux
La partie habituation/entraînement du projet peut induire un léger stress à l’animal au tout début de cette étape mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. La partie du projet impliquant une intervention d’occlusion/reperfusion (étape 4) constitue une source potentielle de nuisances importantes. En effet l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, va provoquer des lésions cérébrales dans une zone localisée du cerveau. Ces lésions impliquent une perte des capacités motrices et cognitives de l’animal en post-opératoire, qui implique un isolement et un confinement de l’animal durant quelques jours, jusqu’à la récupération quasi-totale de sa motricité. CETTE CHIRURGIE SERA EFFECTUÉE LE MATIN AFIN DE POUVOIR SUIVRE L’ÉTAT DE REVEIL DE L’ANIMAL. SON ETAT SERA SURVEILLE TOUS LES JOURS AINSI QUE LES WEEK-ENDS ET EVALUE VIA DES GRILLES DE SCORE PAR L’EXPÉRIMENTATEUR. Une étude précédente utilisant ce même modèle d’AVC chez le macaque (Debatisse et al. 2021) a montré que la phase aigüe de l’AVC est la plus critique en termes d’effets indésirables sur les animaux (18% de risque de mortalité estimé). Une surveillance accrue des animaux sera donc réalisée lors de cette phase. Cette approche peut aussi induire des micro-accidents vasculaires par augmentation de la pression sanguine et de la rupture des vaisseaux cérébraux. C’est pour mesurer les risques de produire des effets indésirables, découlant de ces potentiels accidents vasculaires induit par l’approche thérapeutique testée qu’il est essentiel de valider cette approche thérapeutique de reperfusion. C’EST AUSSI POUR CELA QUE NOUS AVONS FAIT UN AMENDEMENT À CE PROTOCOLE POUR ÉVALUER PAR IMAGERIE TEP-IRM-EEG, L’EXISTENCE D’UNE POTENTIELLE DOULEUR CHRONIQUE DÉCOULANT DE L’AVC Les parties de l’étude intégrant la phase d’entraînement et les examens d’imagerie sont considérés légères et modérés tandis que l’intervention d’occlusion/reperfusion qui présente des risques de déficits lésionnels étant classée en procédure plutôt sévère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure sévère pour tous les animaux. AUSSI, LES ANIMAUX PEUVENT DÉVELOPPER DES DOULEURS SUITE A L’INTERVENTION CHIRURGICALE VISANT A INDUIRE UN AVC. EN REVANCHE, LES STIMULI NOCICEPTIFS (STIMULATION THERMIQUE) INDUITS AUX ANIMAUX NE PEUVENT PAS INDUIRE DE FORTE DOULEUR NI DE BRULURE CAR LES TEMPERATURES NE DÉPASSERONT PAS 49°C.
Devenir
LES 6 PREMIERS ANIMAUX SERONT EUTHANASIES A J+45 POST-OCCLUSION TANDIS QUE LES 4 A 6 AUTRES ANIMAUX SERONT EUTHANASIES APRES AVOIR SUIVIS LES IMAGERIES TEP-IRM-EEG. L'EUTHANASIE DE TOUS LES ANIMAUX EN FIN DE PROTOCOLE EST ESSENTIELLE POUR VALIDER, AU NIVEAU CELLULAIRE, LES MÉCANISMES DES OUTILS D'IMAGERIE DÉVELOPPÉS DANS CE PROJET. Seulement des approches histologiques au niveau cellulaire, sur du tissu cérébral post-mortem, peuvent nous permettre de valider ces outils IRM de la CMRO2 ainsi que des processus inflammatoires et dégénératifs observés et mesurés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour valider l’efficacité et l’innocuité d’un nouveau traitement de l’AVC ischémique. En effet, les alternatives non animales (in silico, in vitro ou ex vivo) ne permettent pas d’étudier la sécurité de l'angulation de la tête et du corps à 15° lors de l'occlusion, les interactions entre les déficits moteurs observés et les marqueurs cérébraux associés à l’intensité des déficits ou de la vitesse de récupération. Avant de tester cette procédure chez l’Homme, il est donc nécessaire de l’évaluer avec un modèle animal pertinent. Il est donc judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’Homme dans le cadre de l’AVC ischémique. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec des analyses comportementales. Ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Ainsi, les informations obtenues sur le PNH seront plus facilement transposables et applicable à l’humain qui subit une perte de fonction similaire découlant d’un AVC. Enfin, le macaque cynomolgus est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations mesurées grâce à un calcul de puissance est de 8 animaux. Au total, nous prévoyons 12 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux pour réaliser des corrélations (n=8) chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2 à 4). En effet, en nous basant sur la précédente étude ayant utilisée ce modèle PNH d’AVC par occlusion de l’artère cérébrale moyenne, nous estimons à 18% le taux possible de mortalité suite à la procédure d’AVC. Si le nombre d’animaux atteignant un point limite s’avérait inférieur à notre prévision, dû probablement à l’effet bénéfique de l'angulation de la tête et du corps de 15° sur la reperfusion cérébrale, nous limiterons le nombre total d’animaux au nombre nous donnant une puissance statistique suffisante. Si nous réussissons à mener nos 8 premiers animaux à pouvoir faire toutes les étapes du protocole et que nous obtenons une puissance statistique suffisante, nous nous gardons la possibilité de réduire le nombre prévu de 12 à 8 animaux.
Raffinement
Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’ischémie-reperfusion cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères, chaque sujet étant son propre contrôle. De plus, le fait que nos deux principales mesures d’imageries, l’IRM de la CMRO2 et la TEP, seront réalisées simultanément grâce à la caméra hybride, nous pourrons limiter le nombre d’examens par animaux dans cette étude. Dès leur arrivée et tout au long de l’étude, en dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (4 ou 2), lorsque possible. Pour maximiser les effets bénéfiques de l’environnement, même durant les périodes post-AVC, les animaux seront toujours maintenus en hébergement par paire, pour limiter les effets délétères de l’isolement. Les animaux disposeront d’une quantité d’eau de boisson contrôlée et d’une quantité quotidienne d’aliment adaptée à leur poids.
Choix des espèces
L’organisation du système nerveux central est très différente selon les espèces, aussi bien au niveau macroscopique (taille des différentes structures) qu’au niveau moléculaire. Ce projet sera donc réalisé chez le macaque cynomolgus, du fait de sa proximité phylogénétique avec l’Homme et en particulier en raison des similitudes du cerveau et des comportements entre ces deux espèces. Les animaux utilisés seront adolescents car ce sont des animaux qui n’ont jamais été utilisés dans d’autres études.
Etude de l’effet anti-hyperalgésique d’une molécule dans un modèle de neuropathie chimio-induites par injections répétées de Paclitaxel chez le rat suivi en Pression de patte
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Injectés de paclitaxel de façon répétée jusqu'à développer une neuropathie, 1 950 rats sont ensuite soumis à un test de pression de patte, jusqu'à six mesures par jour, trois jours par semaine sur trois semaines. Ils reçoivent en parallèle les composés à évaluer, parfois plusieurs fois dans la journée, et jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang en théorie. 1 625 d'entre eux relèvent d'un niveau de souffrance sévère, avec une allodynie tactile, une constipation, une alopécie et une déshydratation possibles, et tous sont tués à la fin, le porteur écrivant qu'un anticancéreux administré de façon systémique rend impossible d'évaluer l'impact réel sur l'animal. Le test s'arrête à une valeur de cut-off, la pression maximale que le laboratoire s'autorise à exercer sur la patte.
Objectifs
Les patients atteints de tumeur solide (sein, ovaire, poumon...) sont souvent traités avec une chimiothérapie à base de paclitaxel. Le paclitaxel (Taxol) est un agent anti-néoplasique issus de l'écorce d'un arbre (Taxus brevifolia), qui entraine le développement d’une neuropathie périphérique chez 50-90% des patients dès une injection de paclitaxel à forte dose ou après plusieurs injections à plus faibles doses. La laboratoire a mis au point un modèle de neuropathie chimioinduite par injections répétées de paclitaxel. L’allodynie mécanique induite par ce modèle a été mesurée en Pression de patte et la réversion par des antalgiques de référence a été réalisée. Ce modèle doit permettre l’évaluation des propriétés analgésiques de candidats médicaments. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs neuropathiques et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causées par l’administration de paclitaxel. Actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ces molécules ne sont pas efficaces à long terme et présentent de nombreux effets secondaires. Le but de ce projet est donc de permettre une meilleure prise en charge des neuropathies due à l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Induction du modèle : injection afin d’induire le modèle. Tests : stimulation mécanique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours, pour un maximum de 3 tests par semaine sur 3 semaines différentes. Les animaux recevront des traitements de composés par injection. Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les limites de volume et de fréquence imposées par les recommandations en vigueur (maximum théorique :25 prélèvements).
Impact sur les animaux
Ce modèle entraine le développement d’une allodynie tactile (nuisance modérée) mais peut également entrainer une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie, de la piloérection et de la déshydratation (nuisances modérées à sévères). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal. Pour la pression de patte,les tests sont pratiqués avec les animaux en contention pour des durées d’environ une minute par rat par point de cinétique (nuisance légère). Le test peut être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. (nuisance légère). De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé (nuisances légères).
Devenir
Les animaux sont induits de manière systémique par administration d’un agent anticancéreux. Il peut donc avoir un impact sur l’ensemble des mécanismes biologiques de l’animal. Il est donc impossible de déterminer l’impact réel. Pour cette raison, il n’est pas concevable de les replacer. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP(International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles et les données de la mise au point du modèle. un test statistique sera réalisé en fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale),suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation afin de limiter leur stress. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie) est réalisé tous les jours jusque J10 après la première induction puis une fois par semaine. Des croquettes sont déposés dans le fond de la cage pour stimuler la prise alimentaire des animaux. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injectionde NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumés en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the Study of Pain) est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Des rats pesants entre 200-250g pour les males et 150-200g pour les femelles, le jour de l’induction vont être utilisés. Cette gamme de poids correspond à un âge de cinq à six semaines. Ceci a été choisi en accord avec les données bibliographiques sur lesquels nous nous sommes basées pour choisir nos critères d’induction.
Etude de l’efficacité de traitements innovants pour traiter le syndrome hématologique radio-induit chez le primate non humain (PNH)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour tester une molécule censée limiter les dommages de la moelle osseuse après une irradiation de guerre ou d'accident nucléaire, 67 macaques à longue queue sont utilisés, dont 59 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chacun subit une irradiation corporelle totale sous anesthésie générale, trente jours d'administration quotidienne, jusqu'à seize ponctions de sang veineux et six ponctions de moelle osseuse en trois mois, chacune sous anesthésie. Le porteur indique qu'environ la moitié des animaux témoins, ceux qui ne reçoivent pas le traitement, devraient atteindre un point limite après des pétéchies, une anémie, des saignements digestifs et une anorexie. Les 59 macaques irradiés seront tués pour constituer une tissuthèque, les 8 autres, qui n'auront reçu que la molécule, pouvant être réutilisés dans d'autres protocoles après avis vétérinaire.
Objectifs
Dans un contexte de guerre nucléaire ou d’accident nucléaire majeur, l’exposition à une forte dose de rayonnement ionisant conduit notamment à des dommages de la moelle osseuse, qui produit les cellules sanguines. Ces atteintes sont parmi les premières causes de mortalité des victimes civiles comme militaires. En dépit des avancées des dernières décennies, le besoin d’une molécule capable de réduire ces effets et de mise en œuvre facilitée dans le contexte d’un afflux de nombreuses victimes demeure. Le but du présent projet est d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule pour 1) réduire la gravité des dommages de la moëlle osseuse et 2) accroitre le taux de survie des victimes. Cette évaluation sera réalisée chez le primate non humain (PNH). En effet, le présent projet est mené en parallèle du développement clinique de cette molécule et il apportera les données d’efficacité qu’il n’est pas possible d’obtenir chez l’humain. Les résultats obtenus seront inclus dans le dossier d’enregistrement. Une étude de pharmacologique préliminaire a déjà été réalisée chez le PNH et ses résultats seront utilisés dans raffiner notre étude. Conformément aux recommandations européennes, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique sera réalisée chez des modèles animaux mâles et femelles. Des molécules dérivées de la nouvelle molécule pourront éventuellement être testées en complément, dans le cadre d’études pilotes. Cette étude comportera 2 phases : • une phase d’efficacité pilote, réalisée étape par étape, sur de petits nombres d’animaux, • si la la phase pilote est concluante, une étude d’efficacité incluant suffisamment d’animaux pour permettre une analyse statistique robuste.
Bénéfices attendus
Valider un nouveau traitement des lésions de la moelle osseuse après une exposition à des radiations, en particulier dans les situations d'urgence où il y a un grand nombre de victimes. L'objectif est de trouver une méthode efficace pour traiter ces lésions le plus rapidement possible et améliorer les chances de guérison des personnes touchées.
Procédures
Irradiation corporelle totale unique sous anesthésie générale Administration quotidienne pendant 30 jours de traitements médicamenteux (médicamenteux (voie orale, sous-cutanée ou intraveineuse ; durée de chaque traitement : 10 minutes maximum). Une éventuelle implantation d’une chambre d’administration du traitement sous anesthésie générale. Durée de l’intervention 30 minutes. Suites possibles : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 joursPonctions de sang veineux (16 ponctions maximum sur une durée de 3 mois) et de moelle osseuse (6 maximum sur une durée de 3 mois) sous anesthésie générale durant 30 à 45 minutes chacune.
Impact sur les animaux
Après l’irradiation, les animaux qui ne peuvent reconstituer leur hématopoïèse sont victimes de petits saignements visibles sur la peau sous la forme de pétéchies, conséquence du manque de plaquettes. La perte de sang correspondante provoque une anémie et une fatigue jusqu’à des difficultés de respiration, entre 10 et 20 jours après irradiation. Des troubles gastro-intestinaux tels que nausées, vomissements, diarrhées et saignements digestifs peuvent se produire. Une anorexie résultant en une faible perte de poids est possible, entre 10 et 40 jours après irradiation. Une atteinte des points limite est attendue chez environ la moitié des animaux témoins. L’administration des molécules peut causer un stress.. L’éventuelle chirurgie pour implanter une chambre d’administration du traitement peut induire une réaction locale au site d’incision -gonflement, suintement de la plaie), rarement : une hémorragie et/ou une infection. Les anesthésies peuvent induire une légère perte d’appétit dans les premières heures qui suivent, pouvant causer une déshydratation chez les animaux qui sera surveillée et compensée au besoin.
Devenir
Animaux irradiés : mise à mort pour analyse anatomopathogique et constitution d’une tissuthèque Animaux non irradiés : les animaux ayant reçu uniquement le traitement pourront être réutilisés dans d’autres protocoles après un avis vétérinaire favorable.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de modèles animaux pour réaliser ce projet. L’évaluation de l’efficacité d’une molécule pharmacologique capable de réduire la durée et la profondeur l’atteinte de la moelle osseuse radio-induite sévère chez l’humain nécessite une étude de la réponse intégrée à l’échelle de l’organisme entier. D’autant plus qu’en cas d’irradiation corporelle totale où d’autres tissus que le tissu hématopoïétique, notamment le système digestif, sont impliqués. Il est donc nécessaire d’utiliser un organisme entier présentant les caractéristiques physiologiques et immunologiques les plus proches de l’humain que possible. Le modèle expérimental primate non humain (macaque) répond à ces requis entrant pleinement dans le cadre de l’évaluation d’un traitement d’une « maladie » létale . Il reproduit de plus le caractère intrinsèquement hétérogène des dommages radio-induits observés après irradiations accidentelles, lié notamment à l’atténuation du rayonnement par l’épaisseur corporelle. Ce paramètre est fondamental pour tester la capacité d’une molécule à stimuler l’hématopoïèse résiduelle issue des zones relativement sous exposées.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire. L’étude préliminaire inclura les animaux de façon échelonnée, pour tirer parti des résultats des cohortes précédentes afin de minimiser le nombre d’animaux inclus. Dans la même optique de réduction, nous réaliserons une phase de preuve de concept avec un nombre réduit d’animaux par groupe (n=4 ou 5), avec des cohortes échelonnées. Cette phase sera considérée un jalon décisif pour la poursuite de l'étude. L’étude permettant une analyse statistique robuste, qui inclut un nombre plus important d’animaux par groupe (n=8), nécessaire pour démontrer l’efficacité de la molécule candidate, utilisée seule ou en combinaison, selon les recommandations des agences réglementaires, ne sera réalisée que si la preuve de concept est concluante. Le nombre d’animaux par groupe a été calculé pour permettre de mettre en évidence l’efficacité du traitement selon les méthodes statistiques en vigueur.
Raffinement
Les interventions et l’irradiation seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et des mesures seront réalisées à chaque anesthésie. Une grille de suivi clinique et biologique, basé sur notre expérience et sur la bibliographie, a été établi. Ce score pourra être adapté si besoin afin de suivre de plus près l’évolution clinique des animaux pour limiter au mieux la souffrance. Les traitements seront réalisés en première intention sur les animaux vigiles après un entrainement comportemental par conditionnement opérant de type click-training, faisant appel à la collaboration des animaux. Après l’éventuelle chirurgie pour implanter une chambre d’administration des traitements,une surveillance accrue sera réalisée pendant 15 jours avec une échographie de contrôle à J15 post implantation. En cas de douleurs, une analgésie sera mise en place. Suivi quotidien : • Suivi de l’état général des animaux vigiles (1x/j minimum, week-end compris). En cas de modification de comportement de l’animal ou de signe de souffrance, un signalement vétérinaire sera effectué. • Les animaux seront scorés chaque jour avec la grille précédemment établie avec les vétérinaires de l’installation. Cette grille a une valeur prédictive quant à la possible dégradation de l’animal. Si un PNH venait à atteindre un score limite, un vétérinaire et le directeur d’étude seront consultés immédiatement pour prendre une décision rapide quant au devenir de l’animal. • Si des atteintes inattendues surviennent ou si l’animal démontre une souffrance non anticipée, une analgésie sera mise en place si pertinente et un vétérinaire et le directeur d’étude seront également consultés immédiatement pour prendre une décision rapide quant au devenir de l’animal. Suivi lors des prélèvements : En plus du suivi clinique (poids, température), un suivi biologique complémentaire sera réalisé. Ce suivi sera réalisé à une fréquence plus rapprochée au début de l’étude puis progressivement espacée lorsque la période critique sera passée. Transport : les animaux seront transportés vigiles, par paire au minimum. Des jouets, de l’eau et de la nourriture seront à leur disposition. Hébergement : les animaux seront hébergés en accord avec la réglementation et bénéficieront d’un l’enrichissement multimodal : sensoriel, alimentaire, social et ludique (jouets fixes et mobiles).
Choix des espèces
Le macaque cynomolgus jeune adulte (2 à 8 ans), qui est notre modèle animal historique, a été retenu pour ce projet car : - Il présente des caractéristiques physiologiques, hématologiques et immunologiques proches de l’humain adulte. - Il permet de plus de par sa taille, son âge (hématopoïese mature non sénescente) et son épaisseur corporelle de reproduire le caractère hétérogène des irradiations accidentelles (gradient de dose et donc de dommage antéro-postérieur significatif) fondamental pour tester la capacité d’une molécule à stimuler l’hématopoïèse résiduelle post accidentelle.
Evaluation des effets antinociceptifs de plusieurs molécules injectées par voie intrathécale à l’aide d’un cathéter dans chez le rat
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
945 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un cathéter leur est implanté par une chirurgie du dos, puis une injection de formol sous la peau de la patte provoque une inflammation que le porteur décrit comme une douleur locale intense, avec des gonflements et jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang possibles par animal. Les retombées annoncées pour les patients, des antalgiques efficaces sans les effets secondaires des opiacés, sont renvoyées au long terme, l'attente à court terme se limitant à des posters et des articles. Sur le remplacement, le porteur affirme que les modèles in silico et in vitro n'atteignent pas la douleur comme "expérience sensorielle et émotionnelle" et conclut au recours au rat.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. La douleur inflammatoire est associée à des phénomènes d’inflammation qui perdurent anormalement. Dans des conditions normales, l’inflammation aiguë est essentielle pour protéger l’organisme contre les agents pathogènes ainsi que pour favoriser la réparation des tissus. À l’inverse, une inflammation chronique, qui dure 6 semaines ou plus, entraîne des lésions tissulaires et des douleurs indésirables. Les modèles in vivo, aident à comprendre les mécanismes physiopathologiques responsables de la génération de douleurs inflammatoires chroniques et permettent l’identification de nombreux candidats médicaments analgésiques. L’implantation de cathéter permettra l’évaluation de l'efficacité de composés administrés en perfusion directement au niveau central. elle sera évaluée par le test du formol, qui est couramment décrit dans la littérature et est réalisé dans le laboratoire depuis plusieurs années. L’objectif de ce projet est donc de proposer une méthode pertinente qui permettra l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisées en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
L’implantation du cathéter nécessaire pour le traitement se fait via une chirurgie au niveau dorsale qui dure 10-15min sous anesthésie avec un traitement local de la douleur. La stimulation chimique induisant une douleur locale intense. Les animaux seront également isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés par injection. Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux pendant 3 semaines maximum) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur (nombre maximum théorique: 25 prélèvements)
Impact sur les animaux
Le modèle du formol est un modèle de douleur inflammatoire. Des nuisance liées à l’inflammation sont donc attendues notamment des gonflements ( nuisances modérées à sévères selon l’inflammation). Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’une injection unique d’un agent inflammatoire (stimulation chimique) en sous-cutanée plantaire (nuisance légère < 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 1h maximum) De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle : nuisance légère < 1 min, administration répétée : nuisance modérée). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (posture anormale, sédation). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère < 3 min). Les nuisances liées à la pose du cathéter et du système de perfusion sont : le risque d’infection, l’apparition de tissu cicatriciel et l’anesthésie.
Devenir
La douleur induite par ce test ne permet pas un retour à l’état physiologique de base. Les animaux ne peuvent donc pas être gardés. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité du laboratoire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus, mais pas sur la douleur dans sa globalité. Selon sa définition par l’IASP (International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi la douleur n'est pas étudiée dans toute sa complexité.
Réduction
Ce test est couramment mis en place au sein de la structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (enceinte) afin de limiter leur stress. Un système de surveillance de l’état général des animaux associé à des points limites est mis en place au laboratoire. Lors de ce test un temps maximal d’observation est en place afin de limiter la douleur. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, pose de cathéter. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite à la pose de cathéter : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injection de solutions hydratantes en cas de déshydratation.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles (4-7semaines). Ce stade a été choisi car il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats.
Exploration des modèles de neuropathologies par des tests comportementaux dans le but de caractériser le phénotype des lignées murines
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
9 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, au sein d'un service d'animalerie qui met des batteries de tests comportementaux à la disposition des équipes de neurosciences. Les souriceaux subissent une biopsie de la queue entre trois et six jours de vie, les adultes une restriction alimentaire de quinze jours destinée à les motiver, puis jusqu'à huit tests de locomotion, huit tests d'anxiété et de sociabilité et sept tests cognitifs étalés sur onze semaines. Certaines lignées présentent des convulsions, des troubles moteurs qui compliquent l'accès à l'eau et à la nourriture, ou un retard de croissance, et le porteur présente ce phénotypage comme un moyen de fixer des points limites plus précoces et d'"assurer le bien-être animal". 3 264 animaux passent ensuite en utilisation continue vers d'autres projets autorisés, une partie rejoint les élevages, les autres sont tuées.
Objectifs
L’objectif du projet est de proposer par un service d’animalerie dédié un ensemble de tests (et protocoles) comportementaux mis à la disposition des équipes de recherche qui étudient les neurosciences. Le but est d’explorer des modèles de souris ayant des neuropathologiques qui miment un ensemble de maladies ou de troubles affectant le système nerveux, notamment le cerveau, la moelle épinière et les nerfs périphériques et de caractériser une altération de la santé de l’animal (phénotype dommageable). La meilleure connaissance de ces nouveaux modèles permettra dans le cas d’un phénotype dommageable de déterminer des points limites précoces afin d’améliorer le bien-être animal. L’ensemble des tests couvrent tous les âges (présevrage, juvénile, adulte et sénior) selon des protocoles classiques et modulables et selon les modèles pour s’adapter aux observations préliminaires qui ont conduit à la demande d’exploration comportementale par le chercheur.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance du phénotype des animaux permet de déterminer des points limites plus précoces, permet d’assurer le bien-être animal, de faire progresser les connaissances neuropathologiques des modèles générés par les chercheurs afin d'établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
Dans le cadre du projet, différentes interventions sont réalisées : Interventions sur des animaux vigiles (conscients) : 1. Biopsie de queue : Réalisée sur des souriceaux âgés de 3 à 6 jours, cette intervention rapide (moins d’une minute) permet d’analyser leur patrimoine génétique afin de confirmer leur génotype. 2. Restriction alimentaire : Chez les souris adultes, une restriction modérée peut être appliquée pendant 15 jours afin de stimuler leur motivation lors de certains tests comportementaux. 3. Tests comportementaux : Divers tests sont menés pour évaluer l’activité motrice, la sociabilité, l’anxiété ou les capacités d’apprentissage. 4. Tests de locomotion : Très brefs (moins de 5 minutes), ils peuvent être réalisés deux fois par jour pendant 4 jours consécutifs, soit jusqu’à 8 tests sur 2 semaines. 5. Tests d’anxiété et d’interaction sociale : Ils durent entre 10 et 40 minutes, avec un jour de repos entre chaque session, pour un maximum de 8 tests répartis sur 3 semaines. 6. Tests cognitifs : Ils comportent entre 1 et 8 essais par jour, pendant 1 à 15 jours, dans une limite de 7 tests répartis sur 11 semaines. 7. Phénotypes dommageables : Certaines souris, en raison de modifications génétiques, peuvent présenter des troubles moteurs, des convulsions ou un retard de croissance. 8. Prélèvements sanguins : Deux prélèvements sont réalisés sur des animaux adultes vigiles, espacés de deux semaines, chacun durant moins d’une minute, afin d’analyser certains paramètres biologiques. 9. Évaluation globale : Des observations régulières de l’état physique et du comportement sont effectuées pour détecter précocement tout signe de malaise ou de maladie. 10. Interventions sous anesthésie – Chirurgie terminale : Une intervention courte (environ 5 minutes) est pratiquée sous anesthésie générale avec analgésie, sans réveil de l’animal (chez des juvéniles ou adultes).
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible. Lors des tests comportementaux un léger stress peut être induit par la découverte d’un nouvel environnement. La séparation maternelle, peut également induire un stress chez les nouveau-nés et un abandon de la progéniture par la mère. La restriction alimentaire provoquera une sensation de faim et une perte de poids de l’animal. Le test de comportement interaction sociale peut induire des comportements anxieux et de l’agressivité chez les animaux. L’anesthésie peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire. Les modèles de neuropathologies sont susceptibles de ressentir des douleurs allant de légères à sévères. En cas de crises d’épilepsie à un stade élevé, une fatigue, une atonie et une perte de poids peuvent également se manifester. Les troubles moteurs entraînent des difficultés de mouvement, rendant l'accès à l'eau et à la nourriture plus compliqué. Le retard de croissance affecte le développement des animaux, ce qui se traduit par un sevrage plus tardif. L’hébergement individuel peut induire un stress social
Devenir
L’ensemble des animaux qui ne sont pas euthanasiés à l’issus de ce projet rentreront en utilisation continue (N 3264) pour d’autres projets autorisés. Les souris dédiées aux tests de comportement seront euthanasiées pour réaliser des analyses histologiques. Les souris non utilisées pour des objectifs scientifiques seront pour une partie utilisée pour le maintien des élevages et pour une seconde partie euthanasiée.
Remplacement
Nos projets en neurosciences reposent sur des approches in vitro pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires dans un environnement contrôlé. Cependant, les modèles animaux sont indispensables pour analyser les interactions neuronales complexes, explorer les dynamiques cérébrales et valider les résultats in vitro dans un organisme vivant. Les alternatives aux modèles animaux, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes cérébraux et les simulations informatiques, ont progressé ces dernières années. Ces méthodes permettent d'approfondir la compréhension des mécanismes neuronaux tout en évitant les contraintes éthiques. Les cultures en 2D et les organoïdes en 3D reproduisent certains aspects du développement neuronal, mais ne peuvent reproduire la complexité fonctionnelle et structurelle du cerveau. Malgré leurs avancées, ces alternatives présentent des limites. Les organoïdes manquent de vascularisation et d’interactions avec les systèmes immunitaire et circulatoire, tandis que les simulations informatiques, bien qu'efficaces, ne remplacent pas les connaissances acquises par l’expérimentation biologique. Ainsi, bien que les approches in vitro et informatiques réduisent l'utilisation des animaux, elles ne peuvent totalement s’y substituer.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 9000
Raffinement
Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. L'acclimatation des animaux à l'expérimentateur sera effectuée à raison de 10 minutes par jour sur une période de 5 jours Pour limiter le stress des femelles allaitantes et un éventuel rejet de leurs progénitures après manipulations, les mains gantées des expérimentateurs sont imprégnées de l’odeur de la sciure de la cage avant de manipuler les petits. Les animaux subissant une restriction alimentaire, seront sortis du protocole en cas d’une perte de poids supérieure à 15 pour cent de leur poids initial et remis dans une cage d’hébergement avec à disposition un aliment enrichi . L’état des animaux est alors surveillé plusieurs fois par jour. Le raffinement des phénotypes dommageables repose sur une surveillance précoce des nuisances et l’adoption d’un hébergement adapté, avec enrichissements et manipulations douces pour certaines lignées. L’évaluation du bien-être est non invasive, basée sur des paramètres zootechniques et physiologiques. En cas de détection d’un phénotype dommageable, une prise en charge immédiate est effectuée. Les enrichissements sont ajustés au type d’animaux et les points limites définis tôt. La chirurgie est réalisée conformément aux bonnes pratiques vétérinaires, en utilisant des agents anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et réglementaires dans une pièce isolée du reste des autres souris.
Choix des espèces
Les équipes de recherche utilisent le modèle souris, essentiel pour les études en neurosciences en raison de sa similarité génétique avec l'homme. Les chercheurs demandant des phénotypages se concentrent sur ce modèle, qui permet d'étudier les mécanismes génétiques sous-jacents à des maladies, notamment neurodégénératives et psychiatriques. Selon les premières observations faites, les animaux pourront être utilisé dès la naissance, ou à partir du sevrage, ou à l’âge adulte.
Evaluation de la toxicité d’un candidat médicament après administration unique ou répétée chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
Le protocole suit la voie d'administration retenue par la société qui développe le candidat médicament, orale par gavage, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale, jusqu'à deux fois par jour pendant un mois. 3 600 souris et 1 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue. La mise à mort suit un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde et permet de peser et d'examiner le cerveau, le cœur, le foie et les reins. Les effets attendus du produit vont de la prostration aux troubles digestifs et nerveux, et le porteur justifie ces essais par la nécessité de mesurer la toxicité sur un "organisme entier".
Objectifs
La société développe des médicaments pour l'homme avec différentes voies d'administration possibles et visant divers récepteurs, enzymes ou d'autres cibles. Il est important de connaître la toxicité et la distribution du candidat médicament dans le corps. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer la toxicité et l'exposition dans le temps d'un candidat médicament dans le sang et les organes dans différentes espèces animales rongeurs (rat ou souris), après un traitement unique ou répété (si répété :1 mois maximum, 2 administrations maximum par jour) par voie orale, ou par voie intramusculaire, sous-cutanée, ou intrapéritonéale. 1) L'observation clinique journalière des animaux permettra de détecter d'éventuels signes de toxicité. 2) Des analyses sanguines sur prélèvement sanguin terminal permettront de compléter le recueil d'informations. 3) L'autopsie terminale des animaux permettra un examen des organes (poids, aspects macroscopiques), leur recueil éventuel pour analyses histologiques. 4) Les mesures de taux de candidat médicament dans le sang et les organes nous donneront ainsi une bonne indication quant à l'exposition du candidat médicament dans le temps, nous aideront à relier les expositions aux effets toxicologiques. Ce projet d'utilisation des animaux s'intègre dans un projet de Recherche exploratoire plus global de ce candidat médicament au profit de la santé humaine et sera fait en complément des études in vitro.
Bénéfices attendus
L'implication des animaux dans ce projet va nous permettre d'avoir une meilleure connaissance du devenir du candidat médicament dans un organisme physiologiquement proche de l'homme sur une espèce (rat ou souris) qui sera utilisée dans toutes les études de toxicité réglementaires obligatoires avant le passage en clinique chez l'homme. Cette étude permettra 1) d'avoir une première approche de la gamme de doses sans effet toxique, de la comparer à la gamme de doses thérapeutiques efficaces et le cas échéant d'éviter d'engager un candidat médicament dans les études réglementaires de toxicité obligatoires qui sont lourdes et consommatrices d'animaux, 2) de déterminer d'éventuel(s) organe(s) cible(s) en termes de toxicité et 3) d'obtenir les expositions du candidat médicament dans le sang et les organes en fonction du temps. Ces expositions pourront être reliées aux effets pharmacologiques et toxicologiques du produit. Ce projet chez le rongeur aura un grand bénéfice dans le développement du candidat médicament car cette étude ne peut pas être substituée par des études cellulaires in vitro qui ne miment pas assez finement la complexité et la dynamique d'un modèle entier vivant et sa physiologie.
Procédures
Contention et administration du produit par voie orale (gavage) ou par injection intramusculaire, sous-cutanée, ou intrapéritonéale, l'ensemble durant moins de 30 secondes à chaque administration et ce pour l'administration aigue et pour l'administration répétée pendant 1 mois maximum (au maximum deux fois par jour). Anesthésie générale profonde pour prélèvement terminal sanguin suivi de la mise à mort de l'animal avant de réaliser des prélèvements d'organes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles liées à la contention de l'animal, l'administration du produit à tester (gavage, injection), à l’anesthésie avant les prélèvements sanguins terminaux pouvant conduire à un stress de l’animal ainsi que les effets indésirables éventuels du produit. Les effets indésirables liés au produit pourront être de l'ordre : prostration, hyperlocomotion, ou hypolocomotion, des comportements anormaux induits, des troubles digestifs ), des troubles du système nerveux central, des perturbations du métabolisme.
Devenir
Chaque animal sera anesthésié pour prélèvement terminal sanguin pour analyses, avant une mise à mort suivie de prélèvements terminaux d'organes (cerveaux, coeur, foie, reins...) pour analyses.
Remplacement
L'utilisation d'animaux pour des évaluations de toxicité et de toxicocinétique d'un candidat médicament est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de la molécule à tester sur un organisme entier, reflétant physiologiquement l'humain. La complexité et la dynamique de l'organisme et des interactions organes-médicament ne nous permettent pas de se limiter aux seuls modèles in vitro ou ex-vivo car ils ne représentent pas assez finement l'ensemble des mécanismes physiologiques. Toutefois, les candidats médicaments qui seront testés auront déjà passé une série de tests en phases précliniques précoces (in vitro) et qui permettent d'identifier les molécules les plus sélectives pour nos récepteurs d'intérêt et sans effets sur des cibles non désirées (cardiaque par exemple).
Réduction
Pour les prélèvements destinés aux analyses toxicocinétiques, le nombre d'animaux par temps selon nos données historiques est au maximum de 5 individus afin d'avoir une fiabilité de résultat en tenant compte de la variabilité inter-individus. Pour les prélèvements destinés aux analyses de biochimie et de numération-formule sanguine, le nombre d'animaux par temps selon nos données historiques est au maximum de 10 individus afin d'avoir une fiabilité de résultat en tenant compte de la variabilité inter-individus et permettre une analyse statistique. Chaque animal sera analysé sur l'ensemble des paramètres à son temps de sacrifice avec mesures des taux du candidat médicament dans le sang et dans d’autres organes (par exemple cerveau, coeur, foie, rein...), détermination de la numération-formule sanguine, mesures des paramètres de biochimie sanguine, observation macroscopique et pesée d'organes clefs en termes de toxicologie comme le coeur, le foie, les reins... et leur conservation le cas échéant pour analyse histologique.
Raffinement
Afin de réduire le stress, les animaux seront hébergés en animalerie et acclimatés au minimum 5 jours avant toute expérimentation pour s'habituer au nouvel environnement (contrôlé en continue). Pour le bien-être de l'animal et lui éviter un stress, chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour la nidation et d'un enrichissement (igloo ou tunnel), et ce, dès leur arrivée au laboratoire. Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin (exemple : désinfection d'une plaie). Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal anxieux soit durant le temps d'acclimatation, soit le jour même de l'expérimentation au moment de sa manipulation. Les groupes sociaux resteront ceux formés depuis l'arrivage jusqu'à la fin de l'étude. Les animaux disposeront de nourriture et eau de boisson à volonté sous surveillance quotidienne. Les traitements (oraux, injections...) se feront par du personnel formé avec du matériel adéquat pour chaque espèce rongeur. La méthode de mise à mort avec initialement un grand prélèvement terminal sanguin sera préalablement précédée d'une anesthésie gazeuse de l'animal. Le contrôle de l'anesthésie se fera par un contrôle du réflexe de retrait de la patte et en s'assurant d'une respiration abdominale. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue pendant l'expérimentation. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l'animal sera euthanasié de façon anticipée afin de lui éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces relativement proches de l'homme, les données obtenues seront pertinentes afin d'extrapoler les résultats. Ces espèces sont utilisées dans les études de toxicité/toxicocinétique réglementaires obligatoires avant de passer un candidat médicament en phase clinique chez l’homme. Ces espèces sont 2 espèces de petite taille pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs assurant une robustesse dans les résultats et limitant les quantités nécessaires en produit administré. Le choix de l'espèce entre la souris et le rat va s'orienter selon : 1/le type de candidat médicament, 2/ les organes d'intérêt (exemple : le rat ne présente pas de vésicule biliaire par rapport à la souris) et 3/ du profil métabolique de l'espèce rongeur comparé au profil métabolique humain déterminé au préalable par des tests comparatifs in vitro. Les animaux seront utilisés au stade adulte : cela permettra de refléter un organisme mature et métaboliquement développé (en particulier au niveau du foie).
Role de la serotonine dans la mort subite et inexpliquee en epilepsie
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
Rendues épileptiques par l'inhalation quotidienne d'un gaz pendant deux séries de cinq jours, puis par un épisode d'hyperthermie, 336 souris subissent des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent aussi une biopsie de la queue, une chirurgie d'implantation d'électrodes pouvant durer une heure trente, jusqu'à trois périodes de trois jours d'enregistrement continu avec limitation des mouvements, et dix injections sous la peau. Le porteur attend une mortalité par mort subite d'un peu plus de 31 %, effet recherché pour pouvoir l'étudier, tout en écrivant que les crises ne provoquent aucune douleur et que la mort survient sans gêne perceptible. Les survivantes sont tuées à la fin de la procédure, les cerveaux de celles qui n'ont pas été implantées étant récupérés pour analyse.
Objectifs
Le syndrome de Dravet est une maladie développementale et épileptique sévère, due aux mutations d’un gène codant pour un canal laissant passer le sodium, caractérisée par une apparition précoce (
Bénéfices attendus
La mort subite est la cause principale de décès chez les patients épileptiques et représente une énorme source d’angoisse pour la majorité des patients épileptiques et leurs familles à cause de son caractère imprévisible, sans aucun signe précédent la mort, et de ses conséquences dramatiques. Ce projet permettra une meilleure connaissance des effets de 2 médicaments, utilisés en routine pour traiter les patients épileptiques, sur les morts subites et les anomalies cardiaques et ventilatoires et viendra compléter l'étude en cours sur le rôle de la sérotonine dans le mécanisme de la mort subite.
Procédures
Tous les animaux subissent une biopsie de queue puis une partie est utilisée dans une des procédures. Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie (maximum 1h30) qui permet d’implanter des électrodes pour mesurer les paramètres physiologiques d’intérêt (activité électrique du cerveau et du cœur, ventilation). Les périodes d’enregistrement en continu seront sur 3 x 3 jours maximum avec une limitation des mouvements. Un modèle animal est spontanément épileptique sans aucune intervention. Les animaux du second modèle sont rendus épileptiques par l'utilisation d’un gaz qui déclenche une crise au bout de 20 minutes environ. Ce protocole d’induction est répété quotidiennement pendant 2x5 jours, puis après une pause de plusieurs semaines, certains animaux subiront une seconde et dernière série de 2x5 jours avec des enregistrements en même temps (2h). Nous utiliserons également une fois l'hyperthermie pour déclencher une seule crise par animal. Les animaux subissent 10 fois une injection quotidienne sur 10 jours en sous-cutané (5 sec).
Impact sur les animaux
Chez l’humain, les crises d’épilepsie avec perte de connaissance ne provoquent pas de douleur, et il est très probable qu’il en soit de même chez la souris. Les crises observées sur nos animaux modèles Dravet ont une durée inférieure à 1 minute. La mort subite survient sans signe annonciateur, et n’est donc précédée d’aucune douleur ni gêne perceptible. Pendant les inductions de crises les animaux sont dans un petit compartiment et les inductions par hyperthermie induisent un certains stress, dans les 2 cas cela est limitée dans le temps (15 à 30 min avant apparition de la crise). Les anomalies cardiaques mesurées sur des animaux adultes favorisent probablement la mort subite mais ne se traduisent pas par un phénotype visible, les animaux ont une activité physique normale. Les défauts cognitifs observés chez les adultes traduisent des pertes de mémorisation mais non associées à une douleur pour les animaux. Les anomalies cardiaques et cognitives sont des conséquences à moyen terme, observées après plusieurs jours et non pas immédiatement après le début des premières crises. En résumé, les animaux ont un comportement normal pendant leur élevage mais meurent soudainement. Les inductions artificielles de crises pendant les procédures vont augmenter la fréquence des morts subites pendant ses procédures jusqu’à la mise à mort, c'est l'effet attendu pour pouvoir les étudier. On attend une mortalité d’un peu plus de 31% pour les 2 modèles animaux. Les nuisances principales induites par les procédures seront les chirurgies d’implantations (électrodes, thermistor) et les enregistrements chroniques avec une limitation des mouvements. Les animaux implantés avec des électrodes sont étudiés pour une durée maximale de 20 jours avant mise à mort. Tous les animaux implantés sont en hébergement individuel par 2 avec un séparateur pendant les procédures, une dérogation d'hébergement est demandée pour cela.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, ceux non implantés d'électrodes seront ensuite utilisés afin de récupérer le cerveau pour des analyses.
Remplacement
L’épilepsie est un syndrome complexe avec des mécanismes de mise en place peu connus qui impliquent le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le système cardiaque et vasculaire et probablement le système immunitaire. Il est donc impossible d’étudier ces mécanismes dans des systèmes in-vitro et l’utilisation d’animaux vivants est absolument nécessaire.
Réduction
Nous utilisons indifféremment les mâles et les femelles qui seront répartis dans les groupes d’étude, soit une perte minimale. Le nombre minimum d’animaux nécessaires dans chaque groupe de chaque procédure a été calculé avec des outils statistiques afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en répondant à la question scientifique.
Raffinement
Les compartiments utilisés pour les inductions sont systématiquement nettoyés avant chaque animal, après chaque crise les animaux sont placés sous un ventilateur pendant 30s afin de les refroidir ou éliminer toute trace du gaz utilisé puis mis au calme dans une cage de récupération. Les animaux seront hébergés (au minimum 2 et maximum 5 par cage) avec un abri, de la ouate et une buchette pour leur permettre des activités variées. Les conditions de réalisation des chirurgies ont été optimisées afin de réduire au maximum la souffrance des animaux ; tapis chauffant avec sonde rectale pour maintien précis de la température, application d’anesthésique local, cage de réveil chauffée, traitements antalgiques et anti-inflammatoire (pendant et après la chirurgie). Nous utilisons une liste de points limites avec des actions précises. Nous utilisons des électrodes implantées en routine depuis plusieurs années dans des cages adaptées (connectique souple et rotative) et en alternant les périodes d’enregistrement avec des périodes de repos sans enregistrement pour diminuer la contrainte. Nous utilisons des parois en plastique transparent rouge afin que les animaux ne voient pas les expérimentateurs. Les animaux sont manipulés par la technique de la cup pour améliorer leur bien être. Les animaux en enregistrement ne présentent aucun signe de souffrance (enregistrements déjà réalisés sur plusieurs mois). Ils sont enregistrés en hébergement individuel avec un séparateur muni de nombreux trous permettant les contacts visuels, auditifs, olfactifs et physiques (contacts nez-nez), et des échanges de ouate.
Choix des espèces
Deux types de souris modèles du syndrome de Dravet sont utilisés, ils reproduisent très bien les symptômes observés chez les patients humains. Nous avons basé ce projet sur un modèle que nous utilisons couramment et connaissons bien, nous n’avons pas besoin de générer une autre lignée et nous pouvons sélectivement augmenter le taux de mort subites à plusieurs âges (après induction). Les crises peuvent être induite sans limite de 19 jours jusqu’à l’âge adulte. Nous utiliserons les animaux dès le sevrage (21 jours) pour avoir des animaux assez robustes.