Procédures sévères

Environ 70 études précliniques réparties sur quatre ans fixent le volume de ce projet, pour lequel 3 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 200 d'entre elles seront réutilisées dans un projet de formation aux gestes techniques, les autres tuées parce que le porteur indique qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé. Chaque souris reçoit une greffe de tumeur dans l'organe où le cancer se développe, fémur, foie, poumon, vessie ou cerveau, avec pour effets annoncés paralysie, douleurs articulaires chroniques, perforation de la vessie ou décès par lésion cérébrale. L'effectif n'a fait l'objet d'aucune approche statistique, il est estimé d'après les études des années précédentes et "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines implantés sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Différentes stratégies d’implantation des tumeurs pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. En développant un modèle permettant aux tumeurs de se développer dans leur micro-environnement et en nous appuyant sur ce dernier pour modéliser et tester des potentiels traitements in vivo, nous permettons des études précliniques plus spécifiques et dont les résultats peuvent être transférés à l'humain dans le cadre des essais cliniques avec davantage de sécurité. Des modèles sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la fonctionnalité de candidats médicaments dans des modèles se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l’humain.

Procédures

Injection : 2 fois maximum. Chaque injection dure moins de 5 minutes. Chirurgies (fémur, foie, poumon, …) : les souris ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie, et que la durée de cette intervention peut varier de 5 à 30 minutes selon l’organe cible du modèle. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par différentes voies pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Chaque injection dure moins de 5 minutes. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie d’une durée comprise entre 10 et 45 minutes. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel,…) ou bien par palpation. Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées et dureront moins d’une minute. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon une limite fixée. La répartition dépendra du protocole d’étude. Elle sera contrôlée par le vétérinaire et figurera dans le protocole d’étude.

Impact sur les animaux

-Injection d'ADN: hématome, troubles cardio-respiratoires et altération marquée de l’état général pendant les minutes suivants l’injection. -Injection échoguidée: stress, effets potentiels des anesthésies prolongées (hypothermie,déshydratation, récupération ralentie), saignement, inflammation locale, dégradation de l’état général. -Prélèvements vaginaux: irritation locale, inflammation ou stress temporaire. -Administration de traitements ou de cellules cancéreuses (chirurgie) : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées), complications en lien avec la chirurgie. - Imagerie: stress, effets potentiels des anesthésies prolongées ou répétées (hypothermie,déshydratation, récupération ralentie), effets secondaires liés à la luciférine, bien qu’ils soient très rares à doses standards, une perturbation possible du cycle veille/sommeil si les imageries sont réalisées à des moments non physiologiques. -Chirurgie: douleur, hémorragie, défaut du système d’anesthésie / analgésie (réveil en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (hypothermie), mauvaise cicatrisation. - Prélèvements sanguins: hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire: microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie: risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire. -Prélèvement d’urine et de fèces: stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. - Modèles orthotopiques (= la tumeur est greffée au niveau de l'organe dans lequel elle se développe naturellement) vessie: douleur, perforation de la vessie ou de l’urètre. Effets de la poly-L-lysine (PLL) : irritation locale transitoire de l’urothélium, inflammation modérée. L’insertion du cathéter peut également entraîner une gêne temporaire ou un léger traumatisme urétral, notamment si des répétitions sont prévues. - Modèles orthotopiques fémur: paralysie, douleurs articulaires chroniques, lésions ligamentaires, luxations de la rotule. -Modèles orthotopiques cerveau: décès par lésion cérébrale, paralysie, douleurs, manifestations neurologiques diverses.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés car ils auront été implantés avec des cellules tumorales ou auront reçu des candidats médicaments pour lesquels un impact négatif sur la santé des souris ne peut être exclu. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de ce projet pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable et à condition qu'elles n'aient pas subit de geste plus sévère qu'une injection d'ADN (pas d’injection orthotopique de cellules tumorales). Ceci permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 3 500 souris seront utilisées, couvrant une période de 4 ans et permettant de réaliser environ 70 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures en modèles classiques et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction de la variabilité de croissance historique sur un modèle déterminé.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un relais dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sans réveil sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Des points limites sont définis.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement dans du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique ou à partir de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. Cela dépendra des besoins de l’étude.

Pour tester si un inhibiteur de microARN injecté dans la veine renforce les os dans une forme de maladie des os de verre, 40 souris oim, porteuses d'une mutation du collagène, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces souris se fracturent sur de faibles traumatismes, en moyenne 10 fractures à 18 semaines selon le porteur, et toutes sont tuées sous anesthésie à l'issue pour l'analyse de leurs os et de leurs organes, dont un test de rupture des fémurs. Pendant huit semaines, elles sont anesthésiées chaque semaine pour une injection intraveineuse et une radiographie, des mesures que le porteur dit "non-invasives". Il prévoit des anti-douleurs dans l'eau de boisson et la mise à mort de toute souris qui atteint "un état de stress important ou un point limite de bien-être".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement potentiel pour une maladie rare appelée l'ostéogenèse imparfaite (OI), communément connue sous le nom de "maladie des os de verre". Cette maladie héréditaire rend les os très fragiles et sujets à des fractures, même avec des traumatismes mineurs, et cause des déformations du squelette. Elle est due à une mutation génétique qui affecte la production de collagène de type 1, une protéine essentielle à la solidité des os. Il n’existe actuellement aucun traitement ayant fait solidement preuve de son efficacité sur la réduction du risque de fracture. Le traitement que nous testons utilise un inhibiteur de microARN, appelé AntagomiR, qui est administré par injection dans la veine. Les microARNs sont de petites molécules qui régulent l'activité des gènes, et dans le cas de l'OI, ils sont dérégulés, contribuant à l'aggravation des symptômes de la maladie. Au laboratoire, nous avons observé que cet inhibiteur stimule la production de collagène et d'autres composants importants pour la formation des os par les cellules osseuses. Cette étude se déroule sur des souris oim qui présentent les mêmes mutations génétiques que celles trouvées chez les personnes atteintes de la maladie des os de verre et présentent des fractures sur faible traumatisme tout comme les patients atteints. L'objectif est de voir si ce traitement peut renforcer les os et réduire les déformations squelettiques et fractures. Nous espérons développer de nouvelles thérapies pour les patients atteints de cette maladie, ou améliorer les traitements existants, qui sont actuellement très limités, surtout chez les enfants.

Bénéfices attendus

Bénéfices Scientifiques : Compréhension des mécanismes de la maladie : Cette étude vise à approfondir notre compréhension du rôle d'un microARN, qui influence la formation et le remodelage des os. En étudiant comment ce microARN agit, nous pourrions découvrir des mécanismes fondamentaux liés à la fragilité des os chez les personnes atteintes de la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite). Cela pourrait aussi nous aider à mieux comprendre les interactions complexes au sein des cellules qui conduisent à cette maladie. Identification de nouvelles cibles pour les traitements : Si cette recherche démontre que le traitement à base d'un AntagomiR est efficace, cela pourrait confirmer que le microARN est une cible valable pour de futurs médicaments. Le mécanisme étudié pourrait être applicable pour un futur traitement pharmaceutique. Non seulement cela pourrait mener à de nouveaux traitements pour la maladie des os de verre, mais cela pourrait aussi avoir des implications pour d'autres maladies où les os sont anormalement fragiles. Progrès technologiques : En menant cette étude, nous allons également perfectionner des techniques avancées pour administrer des traitements basés sur les microARNs, comme cet AntagomiR, directement dans les organismes vivants. Les méthodes que nous développons pourraient être utiles dans d'autres domaines de la recherche médicale, notamment pour améliorer les approches en thérapie génique. Bénéfices Cliniques : Amélioration des traitements disponibles : Si le traitement avec cet AntagomiR s’avère efficace, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie des os de verre, une maladie pour laquelle les traitements actuels sont limités. Un tel traitement pourrait non seulement renforcer les os et réduire les fractures, mais aussi améliorer de manière significative la qualité de vie des patients en diminuant les risques liés aux dommages osseux et des autres tissus comprenant du collagène. Réduction des effets secondaires : Comparé aux traitements existants, comme les bisphosphonates, qui peuvent entraîner des effets secondaires parfois difficiles à gérer, surtout chez les enfants, cet AntagomiR pourrait offrir une alternative mieux tolérée.

Procédures

Les injections seront hebdomadaires pendant 8 semaines dans chaque procédure et réaliser au cours de l'anesthéise gazeuse des radiographies. Pour connaitre l’efficacité du traitement, les souris sont anesthésiées pour une durée de 15 minutes pour avoir une injection intraveineuse du traitement suivie d’une radiographie par scanner afin d’évaluer la qualité osseuse et le nombre de fractures. Ces mesures sont non-invasives, ce qui signifie qu'elles ne causeront pas de douleur ou de dommage aux animaux. Cette intervention permet: > la surveillance de l'apparence et de la santé générale : Chaque semaine, nous examinerons les souris pour voir comment elles grandissent, si leur poids change et si elles subissent des fractures. > radiographies hebdomadaires et recherche de fracture. > Une analyse détaillée des os par imagerie : permet de voir l’aspect 3D des os et de mesurer plusieurs éléments importants, comme la densité des os, le volume osseux par rapport au volume total, l'épaisseur des petites structures osseuses (trabécules), leur nombre, et l'espace entre elles. Cette internvetion sera dont répétée 8 fois par souris pour une durée estimée de 15 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Au cours de cette étude, les souris pourraient éprouver certains inconforts en raison des manipulations fréquentes et des injections répétées du traitement ou des fractures. Les effets possibles incluent une perte de poids, une diminution de l'appétit, et des difficultés à se déplacer. En raison de leur mutation génétique spécifique, les souris sont également plus susceptibles de subir des fractures osseuses spontanées, ce qui peut causer de la douleur. Les souris oim présentent des fractures spontanées sur de faible traumatisme, en moyenne 10 fractures à 18 semaines, sans mortalité associée. Les signes de douleur ou de stress que nous pourrions observer chez les souris incluent un frottement ou un léchage excessif, une agressivité inhabituelle, ou une posture anormale. Elles pourraient également montrer un malaise général, une réduction de leur activité, et un pelage qui semble mal entretenu. Conformément à la littérature scientifique, il n’existe pas d’effet attendu du traitement sur le plan de la tolérance viscérale ou comportementale au-delà de l’effet thérapeutique recherché

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale afin de réaliser les analyses post-mortem qui permettront : - La mesure des marqueurs osseux et des niveaux circulants de miR-93-3p dans les sérums des animaux. - L’analyse des vertèbres et des fémurs pour évaluer la structure et la qualité des os par histomorphométrie - L’évaluation de la résistance mécanique par test de rupture en 3 points, réalisé sur les fémurs. - L’autopsie par examen des principaux organes (cœur, poumons, foie, reins) pour évaluer la tolérance systémique du traitement et analyse des niveaux d’expression de miR-93-3p dans les tissus

Remplacement

Pour trouver de nouvelles solutions de traitement pour la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite, OI), il est crucial de mener des études sur des souris. Ces études sont nécessaires car elles permettent de recréer un environnement qui se rapproche le plus possible de celui des patients atteints d’OI. Les souris utilisées dans ces expériences présentent des altérations génétiques et physiques similaires à celles des personnes atteintes par la maladie, c’est-à-dire une mutation du collagène qui se traduit par une fragilité osseuse et des fractures. Ceci rend les résultats plus pertinents pour le développement de nouveaux traitements. Ces projets sont basés sur les résultats obtenus par nos études cliniques chez l’homme qui montrent que de petites séquences d’ARN (miRNAs) excrétés des tissus, notamment du tissu osseux sont dérégulés chez les patients. Avant de passer à ces études in vivo, nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules osseuses de souris, montrant que l'inhibiteur de l’un de ces miRNAs, appelé AntagomiR, a des effets bénéfiques sur la fragilité osseuse. Ces tests nous ont permis d'affiner notre approche et de nous préparer pour les essais plus complexes sur des souris. Bien que nous ayons déjà effectué des tests en laboratoire sur des cellules osseuses, ces modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire toutes les interactions complexes présentes chez la souris notamment en termes de tolérance et efficacité phénotypique. Par conséquent, les études in vivo sur des souris restent indispensables pour obtenir des données cliniquement pertinentes. Les souris OIM constituent le modèle le moins sensible reproduisant le plus fidèlement sur le plan physiopathologique et sur le plan clinique l’atteinte humaine.

Réduction

Les protocoles d'injection seront optimisés au cours d’une première étape pilote sur 10 animaux avec 5 régimes d’injection différents, garantissant que le rythme d'injection le mieux toléré et le plus efficace sera utilisé dans les étapes suivantes. L’innocuité et la durée du traitement seront précisés par absence d’effets secondaires et le rythme d’injection le mieux toléré par les souris, sera déterminé en observant la réaction des animaux à l’issue de la première administration et les signes pertinents de mal être. L’efficacité du traitement sera également prise en compte par le jugement du critère principal d’amélioration fonctionnelle, c’est-à-dire une diminution de la fragilité osseuse et du nombre de fractures, en fin de procédure. Cela permettra de minimiser les variations et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires par la suite, avec l’injection chez 10 souris de l’antagomiR et 10 souris de l’antagomiR-contrôle. Enfin dans une dernière phase, en cas d’échec de la phase 2, l’utilisation de 10 souris avec cette fois l’injection unique d’un antagoniste du microARN sous forme de particules lentivirales qui conduirait à une antagonisation stable et continue du microARN. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats statistiquement significatifs, nous avons défini des critères précis de réduction basés sur l'incidence des fractures. Nous anticipons une diminution de 30% des fractures par rapport au groupe contrôle. Cette estimation nous conduit à un échantillon de 10 souris par groupe expérimental. L'utilisation de cette approche statistique rigoureuse permet de minimiser le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus. La collecte de données longitudinales sur les mêmes animaux à différents points de temps maximisera les informations recueillies et réduira le besoin d'augmenter la taille des groupes pour les analyses de fin d'étude.

Raffinement

Nous mettons en place plusieurs mesures pour garantir le bien-être des souris. Une anesthésie gazeuse sera utilisée pour permettre l’injection de traitements et l’immobilisation simultanée des animaux pour les examens d’imagerie, minimisant ainsi les manipulations. Des techniques d’injection moins invasives seront également adoptées. Les souris seront surveillées quotidiennement pour détecter rapidement tout signe d’inconfort, de douleur ou de détresse, permettant une intervention immédiate. Pour leur confort, les souris bénéficieront d’un environnement enrichi avec des matériaux de nidification et des structures souples pour limiter le stress et les traumatismes, particulièrement chez les souris à fragilité osseuse accrue. Les manipulations seront effectuées à l’aide de tunnels pour éviter les traumatismes et réduire le stress, toute manipulation autre que par main en coupe étant proscrite. Le personnel recevra une formation continue sur les meilleures pratiques de soins et de manipulation. Les conditions d’hébergement seront adaptées : les souris seront logées en groupes réduits pour minimiser les risques d’agressivité et bénéficier d’un suivi qualitatif renforcé. Les cages seront équipées de matériaux non abrasifs et d’une litière épaisse, avec de la nourriture et de l’eau gélifiée disposées au fond pour faciliter l’accès, même en cas de douleur ou de boiterie. Une évaluation du bien-être et de la douleur de manière standardisée permettra une intervention rapide. Des anti-douleurs seront mis dans l’eau de boisson pour la gestion autonome des douleurs, et en cas de douleur ou de fracture, de l'anti-inflammatoire ou un anti-douleur plus puissant sera administré. Si un animal atteint un état de stress important ou un point limite de bien-être, il sera euthanasié après une sédation gazeuse pour une fin de vie sans douleur. Les souris seront identifiées par tatouage d’oreille effectué par le fournisseur avant leur arrivée, deux semaines avant l’expérimentation, afin de s’acclimater à leur nouvel environnement. Tous les équipements ou fournitures entrant en contact avec les souris seront stérilisés pour éviter toute contamination. Les expérimentations auront lieu dans un environnement confiné et sécurisé. En cas de plaies mineures, une crème apaisante sera appliquée pour faciliter la cicatrisation.

Choix des espèces

L'utilisation de souris dans cette étude est justifiée par leur capacité à mimer la maladie humaine, en particulier les souris oim+/+, qui présentent un phénotype très proche de celui observé chez les patients atteints d’ostéogenèse imparfaite (OI). Âge des Souris : 6 Semaines à J0 : Développement Osseux Critique : À 6 semaines, les souris sont en pleine croissance rapide, ce qui est essentiel pour étudier l'effet des traitements sur le développement osseux et la fragilité liée à l'OI. Les manifestations de l'OI, telles que les fractures et les dommages osseux, sont déjà présentes à cet âge, permettant une évaluation claire des effets thérapeutiques. Homogénéité et Comparabilité : Utiliser des souris du même âge assure une cohérence dans les données, réduisant les variations dues à des différences de développement entre individus. Cette approche soigneusement planifiée permet d'assurer que les résultats obtenus seront significatifs et utiles pour envisager des interventions thérapeutiques chez les patients humains souffrant d'OI.

Pesées, scorées et surveillées tous les jours week-ends compris à partir du septième, les souris reçoivent eau et nourriture en gel quand leurs troubles moteurs les empêchent de s'alimenter. 3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La maladie, proche de la sclérose en plaques, est déclenchée par un rasage et deux injections sous anesthésie, suivies d'une troisième deux jours plus tard, avec une paralysie partielle des membres postérieurs et une perte de poids attendues entre le huitième et le dix-huitième jour. Tout cela pour caractériser le rôle, "totalement inconnu" selon le porteur, d'une enzyme dans deux régions du cerveau, l'identification de cibles thérapeutiques restant une perspective lointaine.

Objectifs

Les phospholipases A2 sécrétées sont des enzymes clés dans le métabolisme lipidique. Chaque enzyme présente des localisations tissulaires et cellulaires uniques ainsi que des propriétés enzymatiques spécifiques, ce qui suggère des rôles biologiques distincts et complexes. Récemment, nous avons découvert qu'une de ces phospholipases sécrétées était exprimée dans 2 régions particulières du cerveau de souris: les plexus choroïdes, qui forment l'interface entre le sang et le liquide cérébrospinal et l'éminence médiane, un organe situé à la base de l'hypothalamus servant de barrière par une communication étroite entre les boucles de capillaires fenêtrés et une population de cellules gliales spécialisées, les tanycytes. Nous souhaitons donc mener des études afin d’étudier le rôle de cette phospholipase dans les processus neuro-inflammatoires et plus spécifiquement dans un modèle murin de sclérose plaques. Si son implication est avérée, nous étudierons alors le potentiel d'un inhibiteur pharmacologique sur ces phénomènes.

Bénéfices attendus

Il est important de mener des recherches approfondies pour comprendre le rôle encore totalement inconnu de cette phospholipase dans le cerveau et en particulier dans les processus neuroinflammatoires. La neuroinflammation est un phénomène pathophysiologique commun à un grand nombre de pathologies du système nerveux, telles que la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson et l'accident vasculaire cérébral. Cette phospholipase est une enzyme déjà impliquée dans la régulation de l'inflammation en périphérie, mais son rôle dans le cerveau reste largement méconnu. De par son expression très localisée dans ces 2 régions du cerveau chez la souris, comprendre comment cette phospholipase contribue aux processus neuroinflammatoires dans un modèle murin de sclérose en plaques aiderait à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.

Procédures

Induction de la pathologie avec 1 rasage et 2 injections sous anesthésie (1 fois pendant x 15min) puis 2 jours après : 1 injection sur animal vigile (1 fois pendant x 30 secondes). Génotypage des souris : un prélèvement de queue sera réalisé sur animal vigile (1 fois pendant 10 secondes).

Impact sur les animaux

Biopsie pour génotypage : stress inhérent à la préhension et contention et douleur légère de courte durée lors du prélèvement. Induction de la pathologie : douleur légère de courte durée suite aux injections. Pathologie : entre 8 à 12 jours suivant la phase d’induction, apparition de déficits moteurs des membres inférieurs (paralysie partielle induisant une mobilité réduite et une perte de poids progressive jusqu'à 18 jours post-induction) puis amélioration avec régression des signes durant 1 semaine suivie d’une phase de léger rebond.

Devenir

Après leur production, tous les animaux en expérimentation seront euthanasiés afin de collecter les organes d’intérêt pour réaliser nos dosages et observations histologiques.

Remplacement

Notre projet se base sur des données de transcriptomique spatiale disponibles publiquement qui montrent l'expression ciblée et spécifique d'une phospholipase dans certaines zones cérébrales. Si certaines de ses fonctions sont connues en périphérie (coeur, poumons...), rien n'est encore connu à ce jour sur ses fonctions dans le cerveau, et en particulier sur son rôle dans les processus neuroinflammatoires. La neuroinflammation est un processus complexe qui fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires d'origine cérébrale (microglie, astrocytes...) et périphérique (cellules immunes sanguines) ainsi que les structures d'interface entre le sang et le cerveau (barrière hématoencéphalique et barrière sang-liquide cérébrospinal). Il s'agit d'un phénomène complexe et multisystémique qui ne peut être modélisé in vitro, in silico ou ex vivo. Ces questions ne peuvent trouver de réponse qu’en étudiant la physiologie d'un organisme vivant entier et la souris est un modèle de choix.

Réduction

Nous utiliserons des mâles et des femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre. Nous avons également pu réaliser une étude pilote qui a permis de mettre en évidence un léger retard dans l’induction de la phase inflammatoire, une absence de la phase de rebond et une plus forte perte de poids dans les phases de rémission partielle et rebond chez les souris KO. L’analyse statistique de cette étude nous a donc permis d’évaluer la puissance de cet effet et nous indique de travailler avec des groupes expérimentaux de 10 souris par groupe.

Raffinement

Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (cachette, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 5 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Les souris auront libre accès à l'eau et à la nourriture. Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Les injections seront réalisées par des opérateurs expérimentés. Les animaux seront suivis sur plusieurs critères, comme le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement. Les points limites établis seront scrupuleusement respectés en cas de nécessité. Après immunisation, les souris sont surveillées tous les jours, week-end compris à partir de J7 post immunisation. Elles sont pesées, scorées et de la nourriture et de l’eau gélifiée sont ajoutées dans la cage pour leur permettre de s’hydrater et s’alimenter facilement malgré leurs problèmes de motricité. Enfin, il est à noter que les animaux seront anesthésiés lors de l’immunisation et avant leur mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour caractériser les fonctions des phospholipases A2 sécrétées. Pour l’une de ces phospholipases, des données récentes sur le cerveau de souris ont montré que son expression est localisée dans des régions très spécifiques, comme chez l'Humain. Les souris déficientes pour ce gène nous permettront donc de tester notre hypothèse de l'implication de cette enzyme dans les processus neuro-inflammatoires, en modulant notamment la composition du liquide cérébrospinal et le recrutement de cellules immunes périphériques. Des études sur l'expression génique de cette phospholipase nous indique qu'elle ne varie pas significativement chez la souris en fonction de l'âge. De ce fait, nous utiliserons préférentiellement des souris jeunes adultes de 8 à 20 semaines pour l’induction de la pathologie. Enfin, le génotypage des animaux sera réalisé sur des souriceaux de 21 jours.

Une craniotomie, une greffe de tumeur cérébrale, puis l'excision chirurgicale de cette tumeur et l'administration de traitements dans la cavité laissée ouverte : 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent de la radiothérapie, des administrations orales, des anesthésies répétées et des hémorragies locales possibles, la tumeur provoquant à terme perte d'appétit, malnutrition et perte de poids. Le porteur écrit qu'aucun médicament testé ces quinze dernières années n'a donné de résultats cliniques cohérents, en partie parce que les modèles de recherche actuels ne reflètent pas la complexité du glioblastome humain, et conclut plus loin qu'"aucune autre méthode" ne pourrait se substituer à l'expérimentation animale. Les souris de l'étude de survie sont tuées quand un point d'arrêt est atteint, ou au plus tard 150 jours après la greffe.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale très agressive, avec une survie médiane de seulement 15 mois malgré des traitements combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Deux principaux obstacles limitent l’efficacité de ces traitements : la barrière cérébrale, qui empêche aux médicaments d’atteindre la tumeur, et les cellules tumorales résistantes aux traitements. Après l’opération, la majorité des récidives surviennent près des bords chirurgicaux, où le microenvironnement favorise la croissance des cellules cancéreuses. Deux approches thérapeutiques locales montrent un grand potentiel : l’implantation de matériaux bioactifs dans le cerveau pour délivrer directement des médicaments anticancéreux et l’utilisation de thérapies basées sur des acides nucléiques pour bloquer les gènes responsables des récidives. Ces méthodes permettent de contourner la barrière cérébrale et d’administrer les traitements de manière ciblée et prolongée. Cependant, bien que les résultats précliniques soient prometteurs, aucun médicament testé ces 15 dernières années n’a donné de résultats cliniques cohérents, en partie à cause des modèles de recherche actuels qui ne reflètent pas suffisamment la complexité du glioblastome humain. Il est donc essentiel de développer des modèles expérimentaux qui reproduisent mieux le microenvironnement post-chirurgical du glioblastome et de tester de nouveaux traitements locaux pour prévenir les récidives. Ce projet proposera deux nouveaux modèles expérimentaux de résection tumorale et évaluera la sécurité et l’efficacité de quatre traitements locaux.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mettre en place des modèles de GBM pertinents et de vérifier la tolerabilité et l’efficacité anticancéreuse de quatre nouveaux traitements locaux pour une application post-chirurgicale dans le glioblastome. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement du tumeur cérébrale haut grade qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.

Procédures

Les animaux seront soumis à: 1) acte chirurgical permettant l’intégration de matériel génétique; 2) greffe tumorale ; 3) excision chirurgicale de la tumeur et administration de traitements dans la cavité post-chirurgicale; 4) imagérie nucléaire ou par bioluminescence. Une administration de médicament par voie orale et de la radiothérapie ainsi que des anesthésies répétées sont aussi prévus pour certains animaux. La durée approximative des chirurgies ou tout acte nécessitant une anesthésie ne dépassera pas les 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe, la pousse tumorale, l'excision chirurgicale de la tumeur, l'administration de traitements et la douleur liée aux actes chirurgicaux. La manipulation, contention des animaux, les injections répétées d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La résection peut induire des hémorragies locales et avec la craniotomie elles peuvent générer des douleurs post-opératoires minorées par l'administration d'antalgiques. Les souris nude et SCID seront hébérgées en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Les animaux de l’étude de survie seront mis à mort lorsque l'un des points d'arrêts est atteint. Si les animaux n'ont pas atteint ces points au jour 150 post-greffe tumorale ou 120 post-traitement, ils seront mis à mort. Les animaux de l'étude de tolerabilité et de biodistribution dans le cerveau seront mis à mort à des temps prédéfinis pour effectuer des analyses post-mortem.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse des traitements locaux véhiculant des agents chimio thérapeutiques dans de matériaux bioactifs ou des acides nucléiques pour le glioblastome. Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes conceptuelles et expérimentales sur la base des résultats obtenus préalablement in vitro . L'étape de validation de l'efficacité du traitement in vivo est indispensable avant toute évaluation clinique chez le patient. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif. Animaux des deux sexes seront utilisés dans les procédures expérimentales.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupes de 5 par cage, avec des mesures d'enrichissement de leur environnement pour assurer leur bien-être. Cela inclut l'utilisation de litière à base de cellulose, de petits dômes stérilisables, et des morceaux de bois à ronger dans chaque cage. Les souriceaux seront gardés en portée avec leur mère. Les animaux seront observés quotidiennement. Une échelle d'évaluation de la souffrance sera utilisée pour mesurer leur niveau de douleur ou de détresse, en tenant compte de critères comme la perte de poids, les changements physiques ou comportementaux, la réaction aux stimuli, et l'apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score obtenu, des mesures seront prises pour soulager la détresse (comme fournir de l'eau gélifiée, de la nourriture dans la cage ou des enrichissements supplémentaires) et pour gérer la douleur, notamment avec des analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle souris représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Les modèles de tumeur que nous étudions vont nous permettre de mimer des mécanismes cellulaires et moléculaires des tumeurs humaines. Un acte chirurgical permettant l’intégration de matériel génétique sera effectué au stade nouveau-né pour induire des tumeurs chez l’animal adulte. Les tumeurs seront greffées ou induites à 7-8 semaines, sur la base de résultats publiés auparavant. Le poids des souriceaux à P1 sera d’environ 2-3 g ; le poids des adultes au moment de l’induction sera d’environ 20-22 g.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui leur interdit de rejeter les cellules humaines qu'on leur injecte. 270 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Chacune reçoit dans le flanc des mélanocytes humains prélevés dans l'œil de patients puis modifiés génétiquement, passe en imagerie sous anesthésie d'abord toutes les deux semaines puis chaque semaine, subit l'exérèse chirurgicale de la tumeur, puis six mois de suivi pendant lesquels des métastases peuvent apparaître et provoquer une perte de poids rapide ou de l'apathie. Une souris est mise à mort si elle garde une posture anormale, ou si une ulcération ou une surinfection persiste plus de 72 heures malgré les soins.

Objectifs

Le mélanome uvéal (MU) est un cancer rare de l’adulte avec une incidence de 500 à 600 nouveaux cas par an en France. La tumeur primaire est généralement traitée par chirurgie ou radiothérapie, cependant 30 à 50% des patients développent des métastases pour lesquelles il n’existe à ce jour que très peu d’option thérapeutique. Ce cancer se développe à partir des mélanocytes, qui tapissent la couche profonde de l’œil et l’iris. Le modèle actuel de la transformation de ces mélanocytes en mélanome uvéal malin propose l’action de deux altérations successives du patrimoine génétique (ADN). Une première altération favorise la prolifération et la survie des cellules, aboutissant à une tumeur bénigne appelée naevus (grain de beauté) sur le fond de l’œil. Une deuxième altération de l’ADN peut malheureusement survenir, aboutissant au mélanome uvéal. Cette deuxième altération de l’ADN touche différents gènes, impliqués dans des processus biologiques distincts, et impliqués dans des tumeurs de pronostics très différents. Cependant, les mécanismes biologiques précis impliqués dans le développement de ce cancer et notamment dans le développement des métastases restent à élucider. Afin de vérifier le modèle actuel de transformation maligne du mélanome uvéal, et de mieux comprendre les processus biologiques sous-jacents, nous avons établi des lignées de mélanocytes normaux à partir de tissu d’yeux obtenus suite à l’énucléation de patients traités pour leur MU. Dans ces mélanocytes normaux, nous introduisons les différentes altérations de l’ADN identifiées chez les patients afin de reproduire in vitro la transformation de mélanocytes sains en cellules tumorales. Pour valider la malignité et le potentiel métastatique de ces mélanocytes modifiés in vitro, nous allons injecter ces cellules dans des souris immunodéficientes et évaluer d’une part, leur capacité à développer des tumeurs et d’autre part, leur pouvoir à développer des métastases. Les objectifs de ce projet sont de vérifier le modèle actuel de la transformation maligne et d’établir des modèles précliniques qui permettront de tester de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Le mélanome uvéal (MU) provient de la transformation maligne des mélanocytes qui tapissent une couche interne de l’œil. La chirurgie et la radiothérapie sont très efficaces pour contrôler la tumeur primaire oculaire. Cependant, plus de 30% des patients développent des métastases principalement au niveau hépatique. Malheureusement le pronostic est mauvais au stade métastatique, avec à ce jour un seul traitement ayant démontré un bénéfice, et uniquement pour une fraction des patients. Les retombées attendues des expériences in vivo proposées ici sont (i) de comprendre par l’établissement de modèles cellulaires les mécanismes biologiques en cause dans le développement de mélanome uvéal chez la souris immunodéficiente ; (ii) d’établir des modèles précliniques qui permettront de tester de nouvelles approches thérapeutiques et (iii) de comprendre certains facteurs de prédisposition à ce cancer.

Procédures

Injection sur animal vigile de cellules dans le derme de la souris au niveau du flanc droit, 1 fois en début d’expérience : 10 secondes / 270 souris. Imagerie sur souris anesthésiées en gazeuse après injection de sonde colorimétrique, 1 fois toutes les 2 semaines, puis une fois par semaine tout au long de la procédure / 270 souris. Durée de l’anesthésie : 30 minutes maximum. Prélèvements sanguins sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro-orbital / 1 fois en début d’expérience et 1 fois en fin d’expérience avant mise à mort / 270 souris - 20 secondes sur animal vigile, 3 minutes avec anesthésie.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales, d’anesthésiques ou de la molécule permettant de visualiser les métastases, seront celles liées à la piqûre elle-même (douleur légère pendant la durée d’injection :15 secondes). La croissance des tumeurs greffées sur le flanc peut provoquer une perte de poids ou une gêne pour se déplacer, et ce jusqu’à l’excision de la tumeur. Les nuisances attendues lors des procédures chirurgicales seront celles liées à l’incision de la peau (nuisance modérée) et l’exérèse de la tumeur primaire provocant de la douleur et/ou surinfection bactérienne de la plaie (très rare) durant les premières 48 heures. Par ailleurs, l’anesthésie pendant la chirurgie et l’imagerie provoque la sècheresse des yeux et une baisse de la température corporelle de l’animal (40 minutes) L'apparition des métastases peut provoquer la perte de poids rapide ou apathie chez l’animal (durée : 7 jours maximum)

Devenir

Les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem.

Remplacement

L’efficacité de la transformation des cellules normales en cellules tumorales par les différentes combinaisons de mutations sera étudiée au préalable in vitro. Des tests classiques de migration, d’invasion et de prolifération seront conduits sur ces cellules. Ces analyses in vitro permettront de sélectionner les lignées ayant les caractéristiques recherchées pour les analyses in vivo et donc de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Cependant, il est indispensable de valider et comparer la capacité de former des tumeurs primaires et des métastases pour ces modèles cellulaires portant différentes modifications. En effet, la souris, en tant qu’organisme vivant intégré et autonome, permet de se rapprocher au plus près du contexte dans lequel se développent les tumeurs des patients. Les modèles murins permettent de reproduire les interactions des cellules tumorales au sein d’un tissu, la croissance tridimensionnelle, ainsi qu’un environnement hypoxique avec un accès limité aux nutriments. De plus, les cellules de mélanome uvéal poussant difficilement in vitro, l’injection chez l’animal est indispensable pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour les expériences envisagées.

Réduction

Dans un premier temps, nous évaluerons le taux de prise tumorale de nos modèles ayant subi toutes les étapes de la transformation maligne. Si le taux de prise tumorale est satisfaisant (greffe d’au moins 2 souris sur 5), nous estimons l’utilisation de 5 souris par groupe comme étant le minimum suffisant pour comparer la croissance tumorale et la dissémination métastatique. Sinon, la greffe sera faite sur 5 souris supplémentaires par groupe (10 au total), en considérant comme positive la greffe d’au moins 2 souris sur les 10). Si ce taux n’est pas atteint, l’expérience sera considérée comme négative et arrêtée. Dans le cas où ces cellules modifiées ne donnent pas de tumeur in vivo, les cellules normales ou partiellement modifiées (par la seule mutation GNAQ) ne seront pas injectées. Les animaux ayant une prise tumorale sur le flanc au niveau de l’injection seront suivis à long terme, pendant 6 mois après exérèse de la tumeur primaire, par l'utilisation d'imagerie longitudinale pour rechercher une diffusion métastatique. Ceci sera mis en œuvre afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Aucun test statistique n’est mis en œuvre. La réponse recherchée est la prise ou non de la greffe, en fonction des modèles. La taille des cohortes a été déterminée sur le taux d’échec expérimental lors de projets similaires, pour minimiser le taux de faux négatifs tout en minimisant le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les différentes procédures seront mises en œuvre de façon à engendrer le minimum de contraintes et de douleur aux animaux : Utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques lors des chirurgies. Prévention du dessèchement des yeux lors de l’anesthésie par application du gel ophtalmique. Réduction de l’hypothermie lors de la chirurgie : utilisation de tapis ou lampe chauffants. Addition d’alimentation hydratée en post-opératoire si besoin, hydratation supplémentaire par injection des solutés de réhydratation tel que Ringer lactate à l’animal si perte de poids ou difficulté à se déplacer après chirurgie. Si l’animal montre des signes de douleur, des antalgiques lui seront administrés. Les animaux seront surveillés pendant 24h en post-chirurgie et, si besoin, la surveillance peut être prolongée pendant 7 jours, au moins une fois par jour. Si l’animal montre des signes de souffrance (posture anormale persistante, surinfection bactérienne), il sera mis à mort. Par la suite, les animaux sont surveillés au minimum 1 fois par semaine par le personnel. Pour faciliter le suivi des métastases, nous allons utiliser l’imagerie technique non-invasive sous anesthésie générale. Si l’animal montre des signes de souffrance (posture anormale persistante, surinfection bactérienne ou ulcération qui durent >72h malgré les soins), il sera mis à mort. Une grille de score permettra d’évaluer de manière objective l’état des animaux et de définir les points-limites au-delà desquels les animaux seront mis à mort

Choix des espèces

Le choix de l’espèce a été fait pour plusieurs raisons : - La souris est un mammifère comme l’Homme et sa physiologie est proche de celle de l'Homme. - La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en cancérogenèse - L’existence de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules humaines sans risque de rejet. Le taux de succès des greffes de ce type de cellules humaines dans d’autres espèces comme le poisson-zèbre est trop faible pour envisager leur utilisation dans ce projet. Utilisation de jeunes adultes entre 5 à 8 semaines. Les souris ont ainsi fini leur croissance, mais sont suffisamment jeunes pour que la tumeur greffée puisse prendre sur les animaux. De plus le temps de croissance des cellules tumorales de mélanome uvéal est long, ainsi que l’apparition des métastases. Les animaux à cet âge supportent également mieux le transport à partir de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.

Tués en fin d'essai pour l'autopsie de leur estomac ou de leur peau, ou pour le prélèvement de leurs fémurs dont on extrait la moelle osseuse, 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une administration unique du produit à tester, par gavage, par application cutanée sous pansement pendant 24 heures ou par injection, les animaux traités par voie orale étant mis à jeun jusqu'à 19 heures avant le test et ceux traités par voie cutanée isolés pendant 24 heures. Les signes attendus vont des convulsions et des tremblements à l'érythème évoluant vers l'escarre et la destruction du derme, la toxicité pouvant aller jusqu'à la mort, et le porteur indique qu'il est impossible d'estimer la durée de ces atteintes puisqu'elles dépendent du produit testé. Ces essais servent à documenter des dossiers de mise sur le marché, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro de toxicité systémique aiguë n'est aujourd'hui reconnu par les normes.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques dans un contexte réglementaire ou de recherche et développement afin de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Parmi les paramètres permettant d’évaluer la toxicité d’un produit chimique, nous évaluons sa toxicité systémique aigüe, son potentiel mutagène. Pour répondre aux exigences des instances réglementaires européennes ou de recherche avant mise sur le marché de produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests de toxicité systémique aigue ou de mutagénicité (TAO : toxicité systémique aigue par voie orale, TAD : toxicité systémique par voie cutanée, MIC : test micronoyau de mutagénicité). Pour cela, le produit à tester est administrée par la voie qui convient chez le rat afin de déterminer la toxicité du produit, par les différents signes cliniques observés et effets délétères observés.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer la dangerosité potentielle sur la santé humaine liée à une substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique. Ces études de toxicité et de mutagénicité permettront de définir les conditions de sécurité nécessaires pour leur manipulation lors de leur fabrication, leur stockage, leur transport et leur utilisation. Sur un plan plus large, ces évaluations, basées sur des normes très strictes, permettent d’évaluer la non dangerosité des médicaments ou des denrées alimentaires destinées à l'homme ou aux animaux.

Procédures

- Toxicité aiguë par voie oral: traitement unique par gavage (temps de contention + gavage maximum 1min). Pesée à J0, J2, J7 et J14 (1min). Observations cliniques répétées dans les premières heures puis quotidiennes (si l’animal ne présente aucun signe il est observé dans sa cage, sinon il est tenu par l’expérimentateur sans contention pendant un temps pouvant varier en fonction des signes (max 5min)). Procédure pour la mise à mort (30sec x2). - Toxicité aiguë par voie cutanée: rasage (1min), traitement unique local par patchage (30 sec) / dépatchage (30 sec) (mise d’un pansement pendant 24h puis retrait). Pesée à J0, J2, J7 et J14 (1min). Observations cliniques répétées dans les premières heures puis quotidiennes (si l’animal ne présente aucun signe il est observé dans sa cage, sinon il est tenu par l’expérimentateur sans contention pendant un temps pouvant varier en fonction des signes (max 5min)). Procédure pour la mise à mort (30 sec x2). - Test de mutagénicité: traitement unique qui se fait par la voie la plus propice (gavage, patchage, injection) (selon la voie 30 sec à 1min), pesée quotidienne (1 min), observations cliniques répétées dans les premières heures puis quotidiennes (si l’animal ne présente aucun signe il est observé dans sa cage, sinon il est tenu par l’expérimentateur sans contention pendant un temps pouvant varier en fonction des signes (max 5min)), procédure pour la mise à mort (30 sec x2).

Impact sur les animaux

Les réactions attendues sont des signes cliniques généraux relevant d’une toxicité aiguë : augmentation/diminution de l’activité spontanée des animaux ; diminution du mouvement involontaires des pavillons des oreilles déclenché par un son ; augmentation/diminution de la respiration, de la température corporelle, et du tonus musclaire ; limitation du réflexe de retournement ; aspect anormale de la ptose palpébrale, de l’aspect de la pupille, de l’aspect du poil ; observation de convulsions, tremblements, salivation, et larmoiement. La toxicité systémique peut également aboutir à la mort de l’animal. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. Concernant le test de toxicité aiguë dermique, en plus des effets systémiques, des réactions locales limitées à la zone de traitement peuvent être observées (sécheresse cutanée, perte de souplesse de la peau, érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escharre et/ou de croûte, desctruction de l’épidermes et du derme, œdème). Il est impossible d’estimer ou de prédire la durée de ces nuisances car elles seront dépendantes du produit testé. Cependant, une grille d'évaluation est mise en place en parallèle pour suivre le bien-être de l’animal, s’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. De plus les animaux traités par voie orale seront avant le test mis à jeûn pendant plusieurs heures (max 19h) et les animaux traités par voie dermique seront isolés pendant la durée de l’application (24 heures).

Devenir

- Toxicité aiguë par voie oral et cutanée: le but étant d’évaluer la toxicité systémique de la substance d’essai, une autopsie générale ainsi que celle du site de traitement (estomac ou peau) est réalisée en fin d’essai. Pour cela les animaux sont mis à mort en fin d’essai. - Test de mutagénicité : l’essai évalue la formation de micronoyaux dans les cellules sanguines prélevées dans la moelle osseuse des animaux. Pour ce faire, il est nécessaire de mettre à mort les animaux en fin d’essai afin de prélever leurs fémurs, os dans lesquels sera prélevé la moelle osseuse pour effectuer l'analyse.

Remplacement

L’ensemble de ces tests n’est mené qu’après analyse de la fiche de données sécurité par le directeur d’étude. Ces fiches rassemblent l’ensemble des données permettant de caractériser le produit : identité et structure chimique, propriétés physico-chimiques, résultats obtenus dans tous les autres essais de toxicité in vitro et in vivo, données toxicologiques de substances semblables et/ou ayant un usage similaire. L’analyse de ces fiches permettra de déterminer la dose de produit au démarrage de l’étude, et des études d’irritation et de corrosion in vitro (sur tissus de peau reconstitués) peuvent également être exigées si un doute persiste sur le produit avant le début de l’étude in vivo. Néanmoins à ce jour aucun modèle in vitro, permettant d’évaluer la toxicité systémique aiguë des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques, n’est décrit dans les normes communément accepté pour autoriser la mise sur le marché.

Réduction

L’ensemble de ces tests n’est réalisé que sur un seul sexe (généralement des femelles) afin de limiter le nombre d’animaux. De plus les témoins dit négatif, traités avec des substances connus pour ne causer aucune toxicité mais permettant de diluer le produit si nécessaire, ne sont réalisés que deux fois par an et non à chaque essai, excepté pour le test de mutagénicité où le test négatif sera inclu dans chaque essai. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étape est fixé par les normes spécifiques aux procédures. Et ne peut donc pas être réduit. Le nombre de test annuel est basé sur une estimation au vu du nombre de tests effectués les années précédentes. Aucun test statistique ne sera effectué dans ces projets.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par groupe de 2, 3 ou 5 animaux, par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont transparentes et contiennent de la litière constituée de copeaux de bois résineux déshydratée puis tamisée, ainsi que des frisottis, un tunnel en carton et des briquettes en bois comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. Une liste de point limite et une grille pour évaluer l'importance de ces points limites a été établi. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal sera mis à mort pour raison éthique avant la fin de l’étude. Les points limites sont définis pour ces tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le rat, reste le modèle de choix utilisé pour les tests de toxicité. Il est décrit dans les lignes directrices de l’OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques) 402, 420, 423, 425 et 474 dont les versions originales ont été mises à jour en 2001 (OCDE 420 et 423), 2016 (OCDE 474), 2017 (OCDE 402) et 2022 (OCDE 425). L’espèce et le stade de développement des animaux à utiliser est imposé par les normes OCDE correspondantes. Nous utilisons des jeunes adultes de 8 à 12 semaines. Si des femelles sont utilisées, elles doivent être nullipares et non gravides.