Procédures sévères

L'épithélium de leurs bronches est éraflé par brossage mécanique ou par une solution chimique, au cours d'une endoscopie d'une heure trente sous anesthésie générale, suivie de deux autres endoscopies de quarante-cinq minutes à un jour et à sept jours pour des biopsies. 12 cochons juvéniles de 30 à 40 kg vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tués au septième jour pour le prélèvement des poumons. Il s'agit de choisir la méthode d'érosion qui permettra ensuite de greffer des cellules bronchiques chez des patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive. Le porteur écrit qu'aucune sensation désagréable n'est attendue, les bronches et les poumons ne contenant pas de nerfs sensibles à la douleur, et annonce dans la même rubrique deux anesthésies générales en vingt-quatre heures et un risque de détresse respiratoire après l'érosion.

Objectifs

Le projet vise à développer une thérapie cellulaire et génique pour soigner la dyskinésie ciliaire primitive, une maladie génétique qui empêche les cils des cellules des voies respiratoires d’éliminer le mucus. Des recherches sur des tissus pulmonaires créés à partir de cellules souches ont montré que des cellules immatures (progéniteurs bronchiques) peuvent s’implanter, se multiplier et se transformer en cellules ciliées fonctionnelles, rétablissant ainsi le battement des cils. Cependant, pour que ces cellules s’intègrent bien, il est nécessaire de préparer les bronches en retirant une partie de la couche cellulaire existante. Des tests préalables en laboratoire ont évalué différentes méthodes (mécaniques, enzymatiques et chimiques), et les plus prometteuses sont le brossage mécanique et une solution chimique. L’étape suivante consiste donc à tester ces méthodes sur des modèles vivants pour identifier la meilleure technique permettant une bonne intégration des cellules greffées.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de transposition de la greffe de progéniteurs bronchiques vers un essai clinique chez l’homme, et concerne une étape indispensable sur l'animal pour la translation de cette thérapie au niveau clinique chez l’homme. Les patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive (incidence de 1/15000 naissances) restent aujourd’hui encore sans aucun traitement curatif. Le développement de cette thérapie au niveau clinique représente donc un espoir pour ces patients, mais ouvre aussi la voie au développement de thérapies pour d’autre pathologies pulmonaires tel que certaines formes de la mucoviscidose.

Procédures

Trois endoscopies bronchiques seront réalisées sous anesthésie générale, à J0 pour le geste d'érosion tissulaire (1h30 h), à J1 pour réaliser les biopsies (45 min), à J7 pour réaliser des biopsies (45 min) juste avant mise à mort. Au cours de l'anesthésie, deux prélèvements sanguins (quelques secondes) de 7 ml à chaque fois seront réalisés à J1 et J7.

Impact sur les animaux

À part le stress et la piqûre ressentie lors de l’injection pour l’anesthésie, aucune sensation désagréable n’est attendue car les bronches et les poumons ne contiennent pas de nerfs sensibles à la douleur. Cependant, les animaux subiront deux anesthésies générales en 24 heures. Même si elles seront courtes, elles pourraient ralentir leur récupération et réduire leur activité pendant deux jours. De plus, des difficultés respiratoires pourraient survenir après l’application du traitement érosif.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en prévision du prélèvement des poumons pour analyse.

Remplacement

Pour que la greffe de cellules réussisse et répare correctement les bronches, il est nécessaire d'effectuer une préparation au préalable. En effet, la barrière naturelle de l’épithélium bronchique empêche l’intégration des cellules greffées, ce qui limiterait l'efficacité du traitement. Des tests préliminaires en laboratoire ont permis de trouver des méthodes efficaces pour éroder cette barrière. Cependant, à ce stade, il est essentiel de tester ces méthodes sur des modèles plus complexes, proches de la réalité du vivant, afin de vérifier qu’elles ne sont pas toxiques et qu’elles fonctionnent dans des conditions normales. Il est donc nécessaire de passer à un modèle animal, car il n’existe pas d’autres alternatives pour tester ces solutions dans des conditions aussi proches que possible de la clinique.

Réduction

L'objectif est de comparer la quantité de cellules de base dans les biopsies des bronches, entre les zones traitées (ou érodées) et non traitées (contrôles), et de calculer le pourcentage de cellules éliminées en fonction du traitement appliqué. Suite à une évaluation statistique et pour tenir compte des variations entre les animaux, le nombre d'animaux a été estimé à 12 animaux (4 traitements testés donc 4 groupes de 3 animaux), avec 10 prélèvements par bronche. Chaque animal donnera donc 60 prélèvements (3 bronches par animal, sur 2 lobes). Ce nombre inclut aussi le risque 15% des prélèvements qui ne soient pas exploitables, ce qui est cohérent avec ce qui est généralement observé dans la littérature scientifique.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiennes par les soigneurs, hébergement en groupe, environnement adapté et enrichi. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale avec l’utilisation de médicaments analgésiques et anesthésiques adaptés. Une attention particulière sera portée au suivi post-opératoire des animaux entre J1 et J7. En effet, le risque de développement d’une détresse respiratoire nécessitera une surveillance accrue de l’état clinique des animaux au niveau de la fonction respiratoire. Certains paramètres seront des alertes pour la mise en place de points limites associés à des actions et des traitements.

Choix des espèces

Le porc apparaît comme le meilleur modèle pour étudier la thérapie cellulaire bronchique humaine pour deux raisons principales : son poumon a une anatomie proche de celle du poumon humain, notamment au niveau de la structure pulmonaire, et en particulier du nombre de ramifications des voies respiratoires et du diamètre des bronches ; ces similitudes permettent de s’approcher des conditions cliniques humaines. De plus, seul un grand modèle comme le porc peut fournir une situation clinique similaire à celle trouvée chez l'homme, notamment en ce qui concerne l'accès à la bronchoscopie lobaire par fibre optique avec un endoscope humain. Les animaux utilisés seront des juvéniles dont la taille (30-40 kg) et les caractéristiques anatomiques permettront la réalisation de la procédure dans des conditions proches de celles rencontrées chez l’humain.

Une souris sur cinq meurt de l'opération elle-même, chiffre que le porteur situe "dans la fourchette basse" de ce que rapporte la littérature. 191 souris subissent une ouverture du thorax et l'occlusion d'une artère cardiaque pour provoquer un infarctus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées pour des analyses post-mortem. Après la chirurgie, réalisée dans un autre établissement puis suivie d'un transport entre deux étages, l'infarctus est confirmé par échographie, puis chaque animal reçoit un agent d'imagerie et passe jusqu'à une heure sous anesthésie volatile, entre deux et vingt et un jours après l'induction. La souris a été retenue parce que le fragment d'anticorps testé reconnaît la protéine murine et la protéine humaine, mais pas celle du rat.

Objectifs

Les maladies du cœur et des vaisseaux restent en France, une des premières causes de décès. Parmi elles, l’infarctus du myocarde, mieux connue sous le nom de crise cardiaque, est la destruction d'une zone plus ou moins étendue du muscle cardiaque, induisant une réponse inflammatoire qui est nécessaire à la cicatrisation. Cette inflammation peut cependant parfois avoir un effet néfaste. Des thérapies visant à moduler la réponse inflammatoire, soit en la stimulant soit en l’inhibant selon le contexte et la fenêtre temporelle, sont donc à l’étude. Un agent d’imagerie permettant de visualiser de manière non invasive la réponse inflammatoire permettrait de mieux appréhender sa cinétique, et d’évaluer des thérapies ciblant celle-ci. L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué dans ce contexte est en cours d’évaluation clinique dans une autre indication. Les objectifs ici sont donc de déterminer s’il est suffisamment spécifique et sensible pour permettre la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque après la survenue de l’infarctus, ainsi que d’évaluer avec précision sa distribution et notamment les types cellulaires qui sont impliqués dans le signal observé par imagerie. S’il est validé comme étant pertinent pour monitorer l’inflammation, il pourra être utilisé dans le cadre de la recherche ou de la pratique clinique pour évaluer cette inflammation et pour tester de nouvelles thérapies. Cela ouvrira également la voie à l’exploration d’autres maladies caractérisées par de l’inflammation du muscle cardiaque telles que le rejet de greffe. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs distincts, néanmoins situés au sein du même bâtiment, à des étages différents.

Bénéfices attendus

L’agent d’imagerie étudié a déjà fait ses preuves pour l’imagerie de lésions des artères et il fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour cette application. La cible de cet agent d’imagerie est exprimée dans d’autres maladies caractérisées par des phénomènes inflammatoires. Evaluer le potentiel de cet agent d’imagerie après la survenue de l'infarctus du myocarde permettra donc potentiellement d’étendre son champ d’applications diagnostiques. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.

Procédures

Les animaux subiront une unique procédure incluant l’ouverture du thorax afin d’occlure une artère cardiaque (

Impact sur les animaux

Cette procédure a été classée en sévère car l’ouverture du thorax et l’induction d’une occlusion d’une artère cardiaque est une chirurgie avec réveil qui peut être une source de stress et de douleurs pour l’animal. Toutefois, le modèle est bien maitrisé par le laboratoire en charge de sa réalisation et la médication adaptée. Ainsi, la taille de l’infarctus est bien contrôlée, et le vide pleural correctement réalisé. De ce fait la mortalité associée à la procédure chirurgicale se trouve dans la fourchette basse de ce qui est classiquement reporté dans la littérature (20%).

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.

Remplacement

La réponse inflammatoire suite à un infarctus ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine produite par modification génétique et sur cellules. Sa spécificité et sa sensibilité pour lier sa cible ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.

Réduction

Une étude pilote a été réalisée au préalable pour d’assurer de la faisabilité. Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux, et la consolidation du modèle chirurgical sera, au maximum, réalisée à partir d’animaux de réforme ou d’élevage. Ainsi, dans un premier temps un suivi longitudinal sera réalisé sur un petit nombre d’animaux afin de restreindre l’étude aux seuls temps pertinents.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée par des personnes compétentes et expertes du domaine. La médication sera adaptée à la sévérité de la chirurgie, avec une analgésie en pré- et en post-opératoire. Des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile. Lors du transport entre les deux établissements utilisateurs (

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence, avec le rat, pour l’étude des événements se produisant suite à un infarctus chez le petit animal. L’agent d’imagerie évalué est un fragment d’anticorps reconnaissant la protéine de souris et la protéine humaine, mais pas la protéine de rat. De ce fait l’espèce retenue est la souris. Des souris adultes seront utilisées afin de se rapprocher du contexte clinique.

Un guide vissé sur le crâne, saillant sous la peau, sert à injecter des cellules de glioblastome humain dans le cerveau de 152 rats athymiques, opération de deux heures sous anesthésie, tandis que 38 rats au système immunitaire intact reçoivent la même greffe. Les 190 animaux sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tous tués à l'issue, la tumeur provoquant des troubles neurologiques dont la perte d'équilibre. Le porteur écrit que ce guide se trouve à un endroit que les pattes du rat ne peuvent pas atteindre, qu'aucune modification du comportement n'a été observée, et que "rien n'indique" que les séances d'imagerie hebdomadaires soient source d'inconfort. La mise à mort est fixée à trois semaines après le traitement, au motif qu'au-delà la tumeur serait trop grosse et que les animaux finiraient par en souffrir.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et la plus agressive avec une médiane de survie de 15 mois malgré les traitements de première ligne. Certaines tumeurs sont inopérables, diminuant d’autant les perspectives thérapeutiques. La thérapie photodynamique interstitielle (iPDT) est une procédure qui permettrait de cibler et traiter ces tumeurs profondes inopérables. Le principe de cette thérapie repose sur l’activation par la lumière d’une molécule qui s’accumule préférentiellement dans les cellules cancéreuses ce qui induit leur destruction. Les études antérieures du laboratoire nous ont permis de valider la faisabilité du projet, et de mettre en évidence des limites associés à la résistance à ce traitement : la variabilité des modèles cellulaires et l’export des molécules photosensibles. Outre un effet antitumoral direct, l’iPDT peut générer une réponse immunitaire spécifique et nous souhaitons en mesurer les paramètres. Ainsi, ce projet permettra (i) de réaliser une preuve de concept préclinique de l’efficacité de l’iPDT dans le GBM, indispensable à la mise en place de futurs essais cliniques chez l’Homme ; (ii) de proposer une revue des modèles cellulaires applicables en expérimentation animale du GBM humain (non disponible à ce jour dans la littérature), (iii) ouvrir des pistes pour améliorer l’efficacité thérapeutique en combinaison aux inhibiteurs d’ABCG2, et (iv) analyser le développement de la réponse immunitaire. Ce projet sera donc bénéfique à moyen/long terme pour les patients atteints de glioblastome (santé humaine) et pour la communauté scientifique travaillant sur le sujet (recherche fondamentale).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cette étude sont multiples. Nous pourrons évaluer de l’effet de la thérapie photodynamique (PDT) sur les modifications de structure, de forme et de fonction des tumeurs, en corrélation avec la survie des animaux. Cet aspect permettra de mieux justifier l’utilisation de la PDT interstitielle dans le traitement du glioblastome, pour la mise en place d’un premier essai clinique en France. Elle nous permettra également de mesurer l’effet combinatoire du blocage chimique/médicamenteux du transport de la molécule photosensible sur le plan de la tolérance au traitement et de la survie globale des animaux. Cet aspect permettra, en cas de résultats favorables, de mettre en place dans un deuxième temps un essai clinique utilisant ce médicament. Nous pourrons évaluer l’effet de la PDT interstitielle sur les modifications du système immunitaire. Cet aspect permettra à la communauté scientifique de mieux comprendre l’implication du système immunitaire dans le processus de guérison, et d’éventuellement associer la PDT à des thérapies favorisant une réponse du système immunitaire pour révolutionner la prise en charge de cette maladie. Cette étude nous permettra de mieux documenter l'effet de la PDT interstitielle en fonction de la composition cellulaire des glioblastomes. A l'heure actuelle, seule la lignée cellulaire humaine de glioblastome est véritablement documentée, ainsi de plus amples expérimentations permettront d'étoffer la bibliographie sur le sujet et d’aider d’autres projets sans pour autant recourir à l’expérimentation animale inutilement.

Procédures

Pendant 10 jours, les 190 animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer au contact humain et réduire leur stress. Le projet se déroulera en deux phases. Dans la première, des cellules tumorales seront greffées dans le cerveau de 152 rats sans système immunitaire et de 38 rats avec système immunitaire. Cette opération, qui dure environ 2 heures, sera réalisée sous anesthésie et comprendra l'insertion d'un guide sur leur crâne pour permettre l'injection précise des cellules. Deux jours après l'implantation, une imagerie sous anesthésie générale d'une durée d'une heure sera effectuée pour vérifier la localisation et la taille de la tumeur. La seconde phase consistera à appliquer un traitement. 50 rats ne recevront pas de traitement, tandis que 140 recevront une molécule photosensible qui ira s'accumuler dans les cellules tumorales. Parmi eux, 70 auront également un médicament qui bloque la sortie de cette molécule des cellules tumorales. Cette phase de traitement dure environ deux heures. Elle est effectuée sous anesthésie générale. Une fibre optique sera placée pour activer la molécule à l’aide d’un faisceau lumineux, ce qui provoquera la mort des cellules tumorales. Les animaux seront suivis par imagerie (toujours sous anesthésie générale) chaque semaine, et du sang sera prélevé sur les rats avec système immunitaire pour suivre leur réponse au traitement. À la fin du protocole, les rats seront euthanasiés et leur cerveau sera analysé.

Impact sur les animaux

Le protocole de greffe est une opération chirurgicale risquant d'entraîner une douleur aiguë, en particulier cutanée. Celle-ci fera l’objet d’une analgésie. La procédure de greffe passe par l'implantation d’un guide fixé au crâne pour guider l'aiguille et la fibre. Ce guide dépasse de la peau du crâne mais à un endroit que les pattes du rat ne peuvent pas atteindre, l'empêchant de se blesser, et il n'a pas été observé de modifications du comportement précédemment. Rien n'indique que le passage en imagerie soit vecteur d'inconfort ou de douleur chez le rat. La procédure est, de plus, non-invasive, et les animaux sont anesthésiés. Concernant les effets de la tumeur induite : le grossissement de la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques, le plus visible et fréquent étant la perte d'équilibre. La désorientation manifeste ou un trouble moteur sera considéré comme le début d’un processus n’ayant pas vocation à s’améliorer après analgésie et conduira à la mise à mort de l’animal. De même, la perte de poids de plus de 15% sur une période de trois jours sera également considérée comme un point limite, ainsi que tout trouble de l’alimentation ou prostration prolongés au-delà de 24h ; et conduiront à la mise à mort de l’animal.

Devenir

Le glioblastome étant une maladie cancéreuse incurable du cerveau, tous les animaux seront euthanasiés. Cette euthanasie sera effectuée : soit 3 semaines après le traitement (au-delà, la tumeur serait trop grosse et les animaux finiraient tôt ou tard à en souffrir) soit avant, si nous apercevons des signes de souffrance qui ne peuvent pas être résolus avec des soins simples. Cette euthanasie sera effectuée sous anesthésie générale, sans douleur ni inconfort.

Remplacement

Les méthodes de laboratoire ont déjà été employées pour restreindre les hypothèses de travail. De nombreuses expérimentations de thérapie photodynamique (PDT) ont été faites sur les cellules cancéreuses qui seront employées dans ce projet, mais la validation expérimentale du concept de PDT interstitielle (iPDT) stéréotaxique et de son évaluation à l’imagerie implique de travailler sur le vivant. Il est en effet nécessaire de se rapprocher au maximum des conditions dans lesquelles les patients humains sont diagnostiqués et seront traités. Il est important de prendre en compte à la fois les modalités de croissance de la tumeur et son lien avec l'environnement qui la voit croître ; il n'est, à l'heure actuelle, pas possible de mimer efficacement la croissance des vaisseaux sanguins, la mort spontanée des tissus tumoraux parfois observée, l'effet sur les tissus sains environnants des différents messagers chimiques libérés par les cellules, de l'effet d'un système immunitaire sur la croissance tumorale et sa réponse à la PDT. Les différents travaux déjà menés sur modèle murin sont intéressants et confirment l’efficacité de ce traitement et la possibilité d’obtenir des informations pertinentes à l’imagerie pour évaluer la réponse. Cependant, ces données sont encore imparfaites et l’approche multimodale, avec une confrontation des informations d’imagerie est ce qu’il y a de plus performant. La PDT antitumorale est en cours d’essai sur le glioblastome chez l’homme avec des résultats prometteurs mais tout changement ou ajout au traitement doit être validé par une étude préclinique, ce qui n'est possible efficacement que sur l'animal. De plus, les études précliniques permettent d’obtenir des informations histologiques et de corréler celles-ci à ce que l’on observe en imagerie.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser est évalué au plus juste à 190 animaux. Nous avons pu définir que selon la procédure et les attentes en termes de résultats des groupes de 8 animaux seraient suffisants pour obtenir une puissance statistique élevé. Bien qu'insuffisante, l'expérimentation en laboratoire nous a permis de réduire les hypothèses de travail et, par conséquent, le nombre de groupes d'animaux à utiliser dans ce projet, réduit à 3. Les groupes ne seront pas formés dès le départ, mais les animaux seront commandés au fur et à mesure de l'avancement du projet. Ainsi, nous éviterons de générer de nouveaux modèles animaux qui ne seraient pas nécessaires ; la marge demandée concernant le nombre d'animaux par groupe doit rester une précaution, et les personnes affectées à ce projet mettront tout en œuvre pour qu'il soit inutile de les mettre à contribution. D'autre part, s'agissant de l'emploi de cellules tumorales peu répandues dans la littérature, la réduction ne se fera pas que sur notre projet : les résultats obtenus, une fois publiés, permettront à d'autres équipes travaillant sur des sujets similaires ou dans le même domaine de mieux s'orienter sans devoir utiliser autant d'animaux qu'il aurait été nécessaire en partant de rien. Une attention particulière sera portée à la réduction du risque de mortalité pendant les procédures, notamment dans la gestion de l'anesthésie. Si, au cours des procédures expérimentales, la méthode d'anesthésie s'avère poser problème, nous nous concerterons avec le personnel impliqué pour définir la meilleure option de remplacement. Nous ajoutons que l’utilisation, à la fois de rat avec ou sans système immunitaire permet en une procédure de répondre à la fois aux questions sur l’effet des molécules bloquant le transport du médicament, mais aussi d’analyser le système immunitaire, en éliminant un maximum de biais méthodologiques.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés 10 jours dans leur salle d’hébergement. Ils seront inspectés quotidiennement pour déceler tout mal-être, blessure ou dommage comportemental, dès leur arrivée à l'animalerie par les personnes participant directement aux procédures (pour habituer et sociabiliser les rats). Un enrichissement est prévu dans les cages (tubes de cartons, carrés de cellulose). Durant les procédures, les animaux seront en anesthésie gazeuse profonde et sous analgésique ; en fonction de la durée des procédures, une seconde injection d'analgésique sera effectuée avant le réveil. En cas de mauvaise tolérance du traitement ou de l’évolution tumorale, un traitement symptomatique par anti-inflammatoires permettra de diminuer efficacement la souffrance de l’animal. S'il y a lieu, les personnes devant effectuer les gestes chirurgicaux ou de prélèvements seront formés ou remis à niveau en utilisant des rats de taille similaire mais fraîchement décédés ou bien sortant d'une procédure tierce dont ils ne doivent pas se réveiller. En cas de blessure physique, des soins seront apportés par le personnel. La sensibilisation du personnel au contact des animaux reste une de nos priorités, et tout sera mis en œuvre pour que les rats soient traités avec grand soin. Des points limites ont été définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie à distance des autres animaux. Les points limites de notre étude concernent les conséquences de la chirurgie et celle de l’évolution du volume de la tumeur dans la boite crânienne du rat. Ainsi, l’activité motrice des animaux sera suivie en pré- et post-opératoire quotidiennement en cage ; s'agissant de tumeurs cérébrales, toute perte d'équilibre ou désorientation manifestes sera considérée comme le signe d'un dommage cérébral impossible à soigner efficacement et entraînera la mise à mort de l'animal. La mesure du poids de l’animal sera réalisée quotidiennement : une perte de poids de plus de 15% par rapport au poids avant greffe s’étalant sur plus de trois jours consécutifs, entrainera la mise à mort de l’animal. L’aspect général de l’animal (aspect du poil, couleur de l’œil) ainsi que son comportement : activité d’exploration, prostration, cris… seront observés, et corrélés entre eux pourront mener à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le choix s'est porté sur le rat pour des questions de gabarit de l'animal : le cerveau des souris est trop petit pour être pertinent, et de plus gros animaux poseraient un problème de logistique inutile. D'aute part, le rat est bien documenté pour ce type de protocoles, en termes de bibliographie expérimentale mais aussi anatomique. Nous avons choisi des animaux athymiques, unique espèce utilisée dans le cas de xénogreffes de cellules tumorales humaines, qui sont des rats nude mâles, âgés de 8 semaines au moment des greffes. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniene correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie employé.

Poils hérissés, dos courbé, posture prostrée : ces signes, attendus plus tôt chez les souris rendues insuffisantes rénales, déclenchent la mise à mort. 192 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour histologie. Chacune subit trois interventions chirurgicales de vingt minutes, deux pour provoquer une maladie rénale chronique et une pour créer une fistule entre une artère et une veine, une partie d'entre elles recevant en plus vingt-quatre gavages sur sept semaines. L'objet est de comprendre pourquoi les fistules de dialyse se bouchent, complication qui cause 30 % des hospitalisations de patients dialysés, et le bénéfice annoncé se limite pour l'instant à "proposer des cibles thérapeutiques".

Objectifs

Au stade terminal de maladie rénale chronique (MRC) les patients bénéficient d’un traitement par dialyse qui consiste à épurer le sang en remplacement des reins qui ne fonctionnent plus. La fistule artério-veineuse (FAV) qui consiste à relier chirurgicalement une veine superficielle du bras à une artère, est indispensable pour épurer le sang par dialyse. Cependant, il arrive fréquemment que la FAV rétrécisse ou se bouche amenant à son dysfonctionnement. C’est une complication majeure qui est responsable de 30% des hospitalisations des patients en dialyse et les mécanismes liés à cette dysfonction ne sont pas décrits à ce jour. Notre hypothèse est que des toxines, dont la concentration est élevée dans la circulation sanguine de ces patients, provoquent ce dysfonctionnement amenant à l’échec de fistule artério-veineuse. Notre objectif est d'étudier in vivo, dans un modèle animal de maladie rénale chronique et de FAV, le rôle des toxines et de leur récepteur dans l’échec de création de fistule artério-veineuse (FAV). Nous testerons : 1) Si la maladie rénale chronique augmente le taux d’échec de FAV, et 2) si l’inhibition du récepteur aux toxines permet d’augmenter le taux de réussite de création de FAV.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes liés à l'échec de création de fistule artério-veineuse (FAV) et de proposer des cibles thérapeutiques afin d'améliorer la qualité des séances de dialyse et par conséquent la qualité de vie des patients atteints de maladie rénale chronique.

Procédures

Dans la première procédure, les animaux seront soumis à des 2 interventions chirurgicales pour reproduire une maladie rénale chronique, sous anesthésie générale, espacées d'une semaine et chaque interventionchirurgicale durera 20 minutes. Deux semaines après, ces mêmes animaux seront soumis à une 3ème intervention chirurgicale pour la création de la fistule artério-veineuse (FAV) qui durera 20 minutes également. Les animaux de la procédure n°2 seront soumis aux mêmes interventions chirurgicales que ceux de la première procédure à savoir 3 chirurgies de 20 min (à 8, 9 et 11 semaines de vie). Ces mêmes animaux seront également soumis à un gavage oral toutes les 48h pendant 7 semaines et chaque gavage durera quelques secondes, soit 24 gavages sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées aux différentes procédures chirugicales (douleur et/ou risque infectueux), aux gavages par voie orale (stress), ainsi qu'à la détérioration de la fonction rénale des souris qui aurons une maladie rénale chronique (MRC). Chez ces souris MRC, nous nous attendons à observer une perte de poids et une apparition plus précoce des points limites par rapport à l’apparence physique (poils hérissés, dos courbé ou posture anormale), aux signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire par exemple) et aux comportements non provoqués (attitude prostrée par exemple).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prèlèvements de tissus à des fins d'histologie. Ceci permettra de comprendre les mécanismes liés aux échecs de fonctionnement des fistules artério-veineuses.

Remplacement

Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur les mécanismes de dysfonctionnement des fistules artério-veineuses (FAV) qui sont fréquentes chez les patients traités par dialyse. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux sauvages et génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.

Réduction

Dans ce projet, nous utiliserons tous les animaux, à savoir 192 souris. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées afin d’utiliser le moins d’animaux possibles : rédaction d'un protocole expérimental avant toute expérimentation, utilisation des statistiques lors de la conception du protocole expérimental pour une estimation préalable du nombre d'animaux nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d'animaux, le partage d'organes ou de tissus d'animaux mis à mort sera également effectué, avec d’autres d’équipes du centre de recherche et d'autres équipes s'intéressant à la maladie rénale chronique.

Raffinement

Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, et angoisse que pourraient ressentir les animaux. Les animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. La douleur ou la détresse de l’animal sera évaluée sur les paramètres suivants : poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Des scores seront établis en fonction de ces observations et grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Des mesures seront prises en fonction de ces scores pour éviter tout inconfort de l’animal. Nous serons particulièrement attentifs à la perte de poids qui est un symptôme lié à la détérioration de la fonction rénale et aux suivis postopératoires. Le contrôle quotidien des animaux sera réalisé par un technicien animalier et la mesure du poids sera réalisée au moyen d'une petite balance de paillasse deux fois par semaine. Les animaux seront hébergés par groupes de 5 individus au maximum par cage et un enrichissement sera mis en place par l’ajout de dômes ou de matériaux de nidification de type « Nestlets ». Les quantités de nourriture et d'eau de boisson seront aussi vérifiées quotidiennement. Concernant la chirurgie, l’utilisation de l’anesthésie gazeuse est établie comme permettant une induction rapide des animaux, un ajustement facile de l’anesthésie pendant les chirurgies en fonction de la fréquence respiratoire, et permettant un réveil plus rapide et plus facile pour les animaux. La température des animaux sera maintenue grâce à un tapis chauffant pendant et après chirurgie et une analgésie avant et après les chirurgies sera mis en place pour permettre un rétablissement rapide. L’augmentation du nombre de visites après la chirurgie est prévue. Pour l'administration d'un composé par gavage, des canules en plastique seront utilisées afin de réduire le risque de blessure et cette procédure d'administration sera réalisée par une personne expérimentée à cette technique.

Choix des espèces

Les modèles animaux de maladie rénale chronique (MRC) sont essentiels pour l’étude des évènements physiopathologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant une MRC. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le mieux maitrisé pour générer des animaux génétiquement altérés. Les animaux utilisés pour notre projet seront utilisés à partir de 8 semaines car nous souhaitons que la période de la puberté soit révolue (vers 4-6 semaines chez les mâles, 6-7 semaines chez la femelle). Toutes les expérimentations seront réalisées avec des souris au stade adulte. En effet, la maladie rénale chronique est une pathologie qui touche principalement les sujets humains adultes. Il faut donc utiliser un modèle murin adulte pour ce projet. Par ailleurs, il est beaucoup plus aisé de réaliser les procédures chirurgicales sur des souris de taille adulte et ainsi d’effectuer les bons gestes, ce qui justifie également d'utiliser les souris au stade adulte.

Pour tester si une levure probiotique protège d'une colite provoquée par Salmonella, 240 souris dépourvues d'immunoglobuline A vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles sont gavées pendant sept ou vingt et un jours selon les groupes, subissent quatre prélèvements sanguins à la joue, puis une ponction cardiaque. L'infection peut provoquer une inflammation digestive avec diarrhées, et une bactériémie accompagnée de fièvre et de déshydratation. Le porteur se borne à indiquer que les points limites ont été définis en classe sévère, sans dire quels seuils déclenchent la mise à mort.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier l'effet du probiotique Saccharomyces boulardii sur la composition du microbiote intestinal de souris déficientes en immunoglobuline A et d’évaluer son effet protecteur dans un contexte de colite inflammatoire.

Bénéfices attendus

La possibilité de limiter la mise en place d'un déséquilibre de la flore intestinale par transfert passif du probiotique Saccharomyces boulardii a un intérêt clinique majeur. Si cette solution se révèle efficace, elle pourra en effet être testée chez des patients déficients en immunoglobuline A ou sous immunosuppresseurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à des gavages par voie orale pendant 7 ou 21 jours selon les groupes. La manipulation par animal dure entre 20 secondes et 1 minute. 4 prélèvements sanguin seront réalisés par prélèvement mandibulaire (environ 15 secondes par prélèvement) et un prélèvement sanguin sera réalisé par ponction cardiaque.

Impact sur les animaux

L'induction d'une forte charge bactérienne peut provoquer une inflammation du système digestif avec une apparition de diarrhées. La survenue d'une bactériémie peut provoquer un état infectieux général incluant de la fièvre et de la déshydratation. Les points limites ont été définis, classe sévère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement de sang et de tissus. Ces prélèvements permettront de mesurer différents marqueurs inflammatoires et de déterminer la composition du microbiote intestinal.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier finement les interactions entre un hôte et son microbiote intestinal puisque ces interactions dépendent d’un très grand nombre de facteurs (alimentation de l'hôte, la réponse immunitaire…) qui ne peuvent pas être contrôlés in vitro. Il n'y aucune possibilité de réaliser ce projet sans l'utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum pour conserver une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les animaux seront manipulés une fois par jour pour être habitués à la présence et à l'odeur de l'expérimentateur. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien être optimal tout au long de l’étude. Leur douleur est rigoureusement contrôlée et gérée grâce aux moyens pharmacologiques. Les animaux sont hébergés en groupes harmonieux et dans un environnement enrichi. L'eau et la nourriture sont mis à disposition "ad libitum". Enfin, le suivi quotidien des points limites établis spécifiquement pour ce projet permettra de sortir les animaux de la procédure et limiter ainsi les souffrances potentielles.

Choix des espèces

La souris présente plusieurs avantages pour ce projet. Premièrement, elles produisent des immunoglobulines A à la structure proche de celles retrouvées chez l’humain. De plus, la grande majorité des travaux effectué sur ces immunoglobulines est effectué sur le modèle murin, ce qui nous permettra d’analyser nos travaux en regard de cette vaste littérature. Enfin, les modèles de souris déficients en immunoglobulines A sont déjà présents dans notre animalerie. Souris entre 5 semaines et 6 mois car avant 5 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complet et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée.

546 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès les premiers jours de vie, elles reçoivent des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant vingt et un jours pour dérégler leur microbiote, avec des diarrhées à la clé, puis on leur injecte soit des cellules cancéreuses qui prolifèrent dans les poumons, soit des allergènes qui déclenchent une inflammation pulmonaire allergique. Le porteur espère identifier de nouveaux marqueurs pour prédire, diagnostiquer et traiter l'asthme et le cancer du poumon chez l'humain, quand le projet lui-même s'arrête à la caractérisation de cellules immunitaires. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire pertinent n'existe pour étudier l'éducation du système immunitaire pendant la période néonatale, ce qui rendrait "indispensable" un système biologique intégré.

Objectifs

Les objectifs du projet sont : - Mettre en évidence l’éducation des cellules immunitaires par le microbiote pendant la période néonatale grâce à un traitement antibiotique. - Caractériser la fonction des cellules immunitaires éduquées par le microbiote et implantées dans les tissus muqueux pendant la période néonatale dans des modèles expérimentaux murins de cancer du poumon et d’asthme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet expérimental sont doubles : caractériser des nouvelles cellules immunitaires participant à l’inflammation des muqueuses notamment respiratoire ou à la tumorigenèse pulmonaire, et identifier de nouveaux marqueurs cellulaires pour prédire, diagnostiquer et traiter l’asthme et le cancer du poumon chez l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à l’administration d’antibiotiques dans l’eau de boisson pendant 21 jours suivie de différents types d’injections d’une durée inférieure à 10 secondes et sous anesthésie de courte durée : 4 injections d’anticorps et 1 injection de cellules cancéreuses ou 2 injections d’anticorps et 3 injections d’allergènes suivant la procédure.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux seront présentes lors des traitements antibiotiques (1), du modèle expérimental de cancer du poumon par injection de cellules tumorales (2), ainsi que du modèle expérimental d’asthme par injection d’allergènes (3). 3 nuisances : (1) Les traitements antibiotiques par administration passive peuvent engendrer des diarrhées modérées. Durée : 21 jours. (2) L’administration des cellules tumorales se fait par injection sous anesthésie et entraine la prolifération de cellules cancéreuses pulmonaires. Durée : 14 jours. (3) L’administration d’allergènes respiratoires se fait par injection sous anesthésie et entraîne une inflammation pulmonaire allergique. Durée : 5 jours.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus pour analyse.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle cellulaire pertinent pour étudier l'éducation des cellules immunitaires au cours de la période néonatale, ni pour déterminer si leur persistance à l'âge adulte contribue au développement de pathologies telles que les maladies inflammatoires allergiques ou la tumorigenèse. Par conséquent, un système biologique intégré, englobant l'ensemble des acteurs cellulaires impliqués (système immunitaire, environnement tissulaire inflammatoire ou tumoral, microbiote), est indispensable. Dans ce contexte, le modèle animal le plus fréquemment utilisé en première intention est celui de la souris. Les modèles expérimentaux murins permettent, par exemple, de provoquer une réaction allergique pulmonaire imitant l'asthme humain par l'administration d'allergènes respiratoires, ou de reproduire le développement d'un cancer pulmonaire humain par l'injection de cellules cancéreuses. Les modèles proposés dans le cadre de notre projet ont déjà été étudiés et validés dans notre équipe ainsi que par d'autres groupes de recherche.

Réduction

Nous allons d’abord mener des expériences pilotes pour vérifier la pertinence de la méthode et ainsi éviter de devoir tout reprendre si elle s’avérait inadaptée, ce qui limite le nombre total d’animaux utilisés. Nous utilisons des groupes de souris homogènes pour réduire la variabilité, puis nous répartissons les animaux de façon aléatoire entre un groupe qui reçoit le traitement à tester et un groupe témoin, afin de minimiser les biais et de garantir une distribution équitable des caractéristiques. Enfin, pour comparer les traitements de manière rigoureuse, nous appliquons un test statistique qui indique si les différences observées sont réellement dues au traitement ou simplement liées au hasard.

Raffinement

Nous mettons en place plusieurs actions pour limiter la douleur et la détresse des animaux : ils font l’objet d’une surveillance attentive, renforcée après les interventions les plus sensibles. Des médicaments adaptés (analgésiques, anti-inflammatoires) sont administrés si des signes de souffrance apparaissent, et l’étude est interrompue si l’état d’un animal se détériore de manière préoccupante (perte de poids importante, troubles respiratoires…). Les procédures nécessitant une contention ou une anesthésie sont effectuées rapidement par le personnel afin de réduire au maximum l’inconfort, et tout signe de douleur ou de complication déclenche une prise en charge immédiate médicamenteuse ou une mise à mort si nécessaire. Cette approche garantit un suivi étroit de chaque individu et un respect du bien-être animal.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix pour l’étude des cellules immunitaires grâce à la solide description de son développement immunitaire, à la disponibilité de nombreux outils d’analyse, ainsi qu’à l’existence de modèles reconnus pour reproduire des maladies pulmonaires et allergiques de façon proche de la pathologie humaine. L’utilisation d’animaux dès la période de développement néonatale se justifie par le fait que cette étape est cruciale pour comprendre l’apparition de certaines maladies à l’âge adulte. Dans ce contexte, des traitements sont administrés durant les tout premiers jours de vie pour prouver que certaines cellules jouent un rôle essentiel dans les pathologies étudiées une fois l’organisme devenu mature. Parallèlement, ces mêmes traitements sont reproduits sur des souris plus âgées pour confirmer que l’“éducation” de ces cellules immunitaires dépend surtout de la phase néonatale.