Procédures sévères
Rôles de modulateurs de perméabilité dans le syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un modèle de péritonite
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 604 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère : un choc septique dont le porteur décrit l'évolution vers l'endormissement puis le coma. Le choc est déclenché par injection, puis les traitements testés arrivent par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou par mini-pompe implantée sous anesthésie, avant une échographie de vingt minutes et un prélèvement dans le cœur. Neuf heures après l'induction, une autre molécule est injectée pour contrôler la prolifération bactérienne. Les bénéfices annoncés, de nouvelles thérapeutiques contre la fuite capillaire, restent au conditionnel, quand la totalité des 2 604 souris subit un choc septique bien réel.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. L’une de ces protéines a un intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Nous avons également retrouvé plusieurs gènes dont l’expression est associée à la fuite capillaire, ceux-ci devenant des cibles thérapeutiques potentielles. Nous avons confirmé chez 42 patients que la quantité de protéine produite par un de ces gènes est corrélée à la sévérité de la fuite capillaire. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de 2 gènes permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique.
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Chaque animal recevra une injection pour induire le choc septique conduisant à la fuite capillaire. Les souris recevront toutes un traitement de nos protéines d’intérêt. En effet, un groupe d’animaux recevra une injection soit par voie intrapéritonéale (i.p.) (1 min), un second groupe recevra une injection par voie intraveineuse (i.v.) au niveau de la veine caudale (3 min) un troisième groupe recevra le traitement par des mini-pompes dont l’implantation sous anesthésie gazeuse et analgésie en sous-cutanée (1 min) dure 10 minutes. De manière à ne s’intéresser qu’à l’inflammation consécutive aux effets des toxines bactériennes sur l’induction du choc septique, une molécule d’intérêt sera injectée, par voie i.p. (1 min), 9h après l’induction du choc septique afin de contrôler la bactériémie. Ensuite, une échographie (d'une durée totale de 20 min) suivie d’un prélèvement intracardiaque (typiquement 1 à 2 min) seront réalisés sur une partie des souris. Sur une autre partie, une mesure de la pression artérielle (également d’une durée de 20 min) sera réalisée. De manière générale, une injection prophylactique d’antalgique sera réalisée systématiquement en sous-cutanée en début d'expérimentation pour tous les animaux pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une min).
Impact sur les animaux
Le principal effet indésitable est lié à l’induction du choc septique engendrant engendrant les phénomènes physiologiques suivants : une baisse de la pression artérielle, insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Les souris seront également soumises à plusieurs injections de traitements (de notre protéines d'intérêt et de la molécule d'intérêt contrôlant la bactériémie) par voies intrapéritonéale ou intraveineuse pouvant engendrer un inconfort malgré l'expérience des manipulateurs. De plus, certaines procédures nécessistant une chirurgie peuvent générer de l'inconfort chez les animaux malgré l'administration d'analgésique et l'anesthésie gazeuse.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et les cibles thérapeutiques testées régulent de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.
Raffinement
Le choc septique s’accompagne d’un effet sédatif, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques entre l’induction du choc septique et le stade de coma. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, une antalgie prophylactique par une injection sous-cutanée (SC) d’analgésique sera réalisée. De plus, durant cette phase, une surveillance plus fréquente sera mise en place. Durant l’ensemble du projet, les animaux seront suivis grâce à une grille d’observation scorée qui permettra de mettre en œuvre des réponses adaptées aux observations (points limites adaptés au type d’expérience faite).
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS induit est depuis quelques années bien établi chez la souris et il permettrait de démontrer les effets protecteurs de nos protéines d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si les gènes qui les codent peuvent être des nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris âgées de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.
Modèles murins de deux maladies inflammatoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 922 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 153 d'entre elles. Chacune subit une biopsie de l'oreille, certaines reçoivent une sonde de température sous la peau, une injection de bactéries dans le sang, deux prises de sang au niveau de l'œil et onze jours d'injections quotidiennes dans le ventre. L'objectif déclaré est de créer deux modèles de maladies auto-inflammatoires rares. Les traitements "moins toxiques et plus efficaces" annoncés sont renvoyés à un "à terme" sans échéance. Le porteur affirme que l'analyse des animaux est "indispensable" parce que les essais en tubes ne reproduisent pas la complexité des interactions entre l'animal et la bactérie.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de créer deux nouveaux modèles murins de maladie inflammatoire, pour mieux comprendre ces maladies et tester un nouveau traitement. Cesmaladies sont des maladies rares qui ne peuvent pas être étudiées directement en clinique du fait du faible nombre de patients. Le développement de nouveaux traitements dans ces maladies passe par le développement de modèles précliniques dans lesquel il faut tester les nouvelles molécules et les voies d'administration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme de mieux comprendre les maladies autoinflammatoires étudiées ainsi que l'émergence d'une de ces maladies dans la population humaine au cours de la co-évolution de l'homme avec les agents pathogènes. Finalement, à terme, il pourrait permettre de développer de nouveaux traitements moins toxiques et plus efficaces pour l'homme.
Procédures
Les souris seront soumises à une biopsie sur l'oreille pour la procédure d'élevage. Une seule intervention de ce type qui dure moins de 5 secondes sera réalisée sur chaque animal vigile (2922 animaux maximum). Certains animaux (parties 2 et 3-maximum 153 animaux) subiront une injection sous la peau de 30 secondes maximum pour la mise en place d'une sonde de température, une injection dans le sang d'une durée de 30 secondes maximum, ces deux actes sous anesthésie gazeuse. Les animaux dans la partie 4 (21 animaux maximum) seront sujets à 2 prises de sang au niveau de l'oeil de 30 secondes maximum sous anesthésie gazeuse, d'une injection dans le ventre quotidienne pendant 11 jours sur animaux vigiles, chacune de 30 secondes maximum et d'une injection dans le ventre de 30 secondes maximum sur animal vigile lors de la mise à mort. Tous les animaux (2922 animaux maximum) sont susceptibles de recevoir une à trois injections sous la peau d'analgésiques (30 secondes maximum) sur animaux vigiles. Les animaux dans la partie 5 (14 animaux maximum) auront sous anesthésie gazeuse de la crème appliquée sur des lésions de la peua chaque jour pendant 2 semaines (10 secondes maximum par application).
Impact sur les animaux
Le prélèvement d'un bout d'oreille engendrera une douleur légère de courte durée. Les injections dans le ventre, la mesure de masse, la pose de sonde de température, l'injection dans le sang des bactéries, la prise de sang au niveau de l'oeil, l'application de crème sur les lésions de la peau sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. L'inflammation pourrait conduire à une croissance retardée, à une perte localisée de poils ou à des boutons sur la peau qui pourraient évoluer vers des des plaies, une grosse rate et un gros foie et un sentiment de mal être général associant fatigue générale physique et mentale. L'infection bactérienne pourrait conduire à ressentir les effects de l'infection (inflammation systémique qui se traduit par de la fièvre apparaissant à jour 2 ou 3 post-infection et à un mal être de l'animal).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale car du fait des procédures, il n'est pas souhaitable de les réutiliser. Une partie des animaux mis à mort dans la procédure d'élevage sera utilisé post-mortem pour des prélèvements d'organes hors protocoles dans une démarche de réduction (pas de commandes de nouveaux animaux pour ces prélèvements hors protocoles). Les animaux de génotype pertinent dans la procédure d'élevage seront transférés dans les procédures expérimentales suivantes car tel est le but de cette première procédure et mis à mort à la fin des procédures expérimentales.
Remplacement
L'analyse des animaux est indispensable pour remplir les objectifs du projet et s'assurer d'une efficacité et d'une non-toxicité des nouveaux traitements. Cet protocole fait suite à des tests nombreux et répétés dans des tubes sans implication d'animaux . Ces essais en tubes ne peuvent pas mimer la complexité des interactions entre l'animal et la bactérie rencontrées lors d'une infection, ni la complexité des interactions des médicaments avec les différents liquides biologiques, cellules, organes.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet pour obtenir le maximum d'informations avec le moins d'animaux. De plus, l'effectif annoncé est maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des "essais pilotes" déterminants et des analyses statistiques en amont pour réduire au maximum le nombre d'animaux sans mettre en péril la validité des résultats. Dans la procédure 5, le contrôle de traitement sera réalisé sur le même animal sur une lésion contrôle située dans une autre zone du ventre de l'animal traité (au lieu d'un autre groupe d'animaux).
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants: 1) habituation à la contention pour minimiser l'angoisse des animaux. 2) Utilisation d'implants pour prendre la température et éviter l'introduction quotidienne de thermomètre de type rectal dans les fesses des animaux. 3) Minimisation de la fréquence de manipulation. 4) Anesthésie lors de chaque gestes potentiellement douloureux (injection sous la peau, dans le ventre, dans le sang, prise de sang au niveau de l'oeil). Les points limites sont définis spécifiquement pour le projet afin de limiter au maximum la souffrance des animaux. 5) Utilisation d'analgesique en cas de trop forte de température. Les protocoles sont calibrés après une étude rigoureuse de la littérature.
Choix des espèces
Il est nécessaire pour les objectifs scientifiques du projet d'étudier un système intégré avec un fonctionnement proche de l'homme. La souris est un modèle animal très pertinent car il est manipulable génétiquement et beaucoup d'outils sont disponibles pour suivre la physiologie de cet animal. L'inflammation dans le modèle souris est très proche de l'inflammation qui peut être observée chez l'homme. Les animaux seront suivis depuis leur naissance jusqu'à leur mort pour la recherche et/ou la surveillance d'un éventuel phénotype dommageable avec une attention particulière au stade néonatal, du sevrage et de l'adulte. Les expériences d'infections débuteront à l'âge de 6 semaines ce qui correspond à l'age adulte. Les traitements (tests de médicaments) commenceront dès 4 semaines qui est l'âge auquel les premiers symptômes sont attendus.
Etude du rôle du microbiote intestinal sur l’efficacité thérapeutique d’un composé pharmaceutique mobilisant les cellules Natural Killer
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour savoir si le microbiote intestinal modifie l'efficacité d'une immunothérapie, 6 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Leur flore intestinale est d'abord détruite par antibiotiques dans l'eau de boisson, puis des cellules tumorales leur sont greffées sous la peau ou injectées dans le sang, avant un traitement quotidien pouvant durer quatre semaines. Le porteur décrit comme effets possibles la nécrose et l'ulcération de la tumeur, une paralysie pour les greffes intraveineuses, et une perte de poids. La totalité de l'effectif est déclarée en gravité sévère, le porteur renvoyant à des points limites "précoces" évalués chaque jour, sans indiquer le seuil qui déclenche la mise à mort.
Objectifs
Chaque année, le cancer touche des millions de personnes et cause de nombreux décès dans le monde. Malgré des avancées majeures dans la compréhension du développement des cancers et l’identification de nouvelles thérapies révolutionnaires pour les patients ces dernières années, nombre d’entre eux se voient confronter à des échecs thérapeutiques. L’enjeu pour la recherche est donc d’identifier de nouveaux médicaments et d’explorer les mécanismes de résistances aux traitements. Un sujet de recherche important aujourd’hui est l’étude du lien entre le microbiote (la flore intestinale dans notre tube digestif), unique à chaque patient et considéré comme un organe, le système immunitaire et le cancer. Le microbiote joue un rôle clé dans le bon fonctionnement de nos défenses immunitaires. Les immunothérapies, traitements qui manipulent le système immunitaire pour attaquer les cancers, ont montré des résultats prometteurs. Cependant, elles ne fonctionnent pas toujours pour tous les patients et peuvent provoquer des effets secondaires graves. Des recherches récentes cherchent à mieux comprendre quels microbes du microbiote pourraient améliorer l’efficacité et la tolérance des immunothérapies. L’objectif est de rétablir un microbiote équilibré chez les patients pour optimiser les traitements. Nous testerons des molécules capables de mobiliser un certain type de cellules du système immunitaire capables d’éliminer les cellules tumorales. Ce projet vise à évaluer comment le microbiote intestinal peut influencer l’efficacité de ces immunothérapies innovantes.
Bénéfices attendus
Le cancer est l'une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. Les immunothérapies, traitements qui renforcent le système immunitaire pour attaquer les cancers, ont montré des résultats prometteurs. Ce projet permettra de comprendre l'impact du microbiote intestinal sur l'effet thérapeutique d'un composé d'immunothérapie à court terme et de proposer à long terme de rétablir un microbiote équilibré chez les patients pour optimiser les traitements.
Procédures
Traitement antibiotique dans l’eau de boisson modifiant la flore intestinale. Greffe de cellules tumorales (1 injection) sur animaux vigiles ou sous anesthésie gazeuse; Administration de composés thérapeutiques (maximum 1 fois /jour pendant 4 semaines maximum) sur animaux vigiles; Administration d’une molécule ciblant une sous population de cellules immunitaires (1 injection)
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l'injection des cellules tumorales en sous-cutanée ou en intraveineuse. Stress et douleur légère lors de l'administration du composé thérapeutique par injection intra-péritonéale (administration dans la cavité péritonéale c’est-à-dire l’espace entourant les organes abdominaux). Stress et douleur légère lors de l'administration de la molécule ciblant une sous population de cellules immunitaires en intrapéritonéal. Inconfort lors de la manipulation de l'animal vigile pour les gestes de tonte du flanc et pesée. Stress lié à la modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la répartition aléatoire des animaux en groupes expérimentaux. Possibilité d'effets indésirables sévères liés au développement tumoral : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d'effets indésirables sévères liés aux composés thérapeutiques: Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux lorsque l'une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d'organe ou de tumeur au cours de l'étude ; Atteinte d'un point limite justifiant l'euthanasie ; Fin de l'étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d'un composé thérapeutique antitumoral en fonction de la flore intestinale d’un individu visant à réactiver le système immunitaire implique d'être dans un système biologique complexe. Les modèles in vitro ou ex vivo dans l’état actuel des connaissances ne permettent pas de répondre à cette question. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal dans le cadre de ce projet. Nous avons cependant testé ces molécules en amont in vitro dans les modèles cellulaires et pu ainsi sélectionner celles qui seront utilisées dans ce projet sur l’animal comme les plus prometteuses.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules ont été préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité ont été choisies pour être évaluées chez l'animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été également déterminées dans un projet dédié et ont permis de sélectionner les conditions optimales de greffe tumorale et de calculer grâce à un outil statistique le nombre minimum d'animaux nécessaires permettant d’observer un effet statistique significatif. Seulement si nous observons une différence biologique lors d’une première expérience, nous répèterons l’expérience trois fois afin d’en assurer la fiabilité, la robustesse et la significativité.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. Toutes les souris seront maintenues en portoirs ventilés. Les injections de cellules tumorales intraveineuses seront effectuées sous anesthésie gazeuse et avec application d’un anesthésique local. Des points limites précoces relatifs à l'apparence/comportement de l'animal, à l'aspect et au volume de la tumeur ainsi qu'à la perte de poids seront suivis et évalués de manière quotidienne, tout au long de l'étude. Ils pourront justifier la mise en place de mesures correctives adaptées comme l’introduction d'enrichissements supplémentaires, une surveillance accrue, une mise à disposition de nourriture humidifiée ou gélifiée, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique sur les lésions cutanées, une administration d’analgésique ou une mise à mort précoce. Les gestes techniques réalisés sur animaux vigiles seront réalisés par du personnel compétent et expérimenté.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l'homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l'analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l'existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l'efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l'étude, âge auquel le système immunitaire de l'animal est décrit comme mature.
Production de plasma hyper immuns Vipères d’Europe
- Production de routine
- Tests réglementaires
Réformés puis proposés à l'adoption après évaluation vétérinaire, 8 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections de venin de vipère à doses croissantes, puis des prélèvements de sang réguliers et des rappels de venin entre chaque cycle de production. Le porteur décrit des granulomes et des abcès aux points d'injection, des plaies qui s'écoulent et une inflammation pouvant s'étendre au point de gêner durablement la mobilité de l'encolure, tout en concluant que "les chevaux supportent bien les protocoles". Il indique que le nombre de chevaux dépend des demandes commerciales et des titres de plasma obtenus, et qu'aucun antivenin ne se fabrique aujourd'hui sans passer par l'animal.
Objectifs
Chaque année dans le monde, de nombreuses personnes décèdent où souffrent de lésions irréversibles suite à une morsure de serpent venimeux. C’est également le cas en Europe où les vipères d’Europe enveniment à des degrés divers environ 1000 personnes. Dans le cadre de la production de spécialités antivenimeuses, ciblant les envenimation de Vipères d’Europe, l’obtention d’anticorps spécifiques est indispensable. Afin de produire ces anticorps, des chevaux sont immunisés de manière répétée dans le but d’obtenir une quantité élevée d’anticorps dans leur sang. L’immunisation est réalisée par des injections d’antigènes constitués de venins et d’adjuvants. A l’issue de la phase d’immunisation, des prélèvements sanguins sont réalisés sur les chevaux.
Bénéfices attendus
Le bénéfice escompté est de s’assurer de la fourniture de Viperfav qui est la seule spécialité antivenimeuse avec autorisation de mise sur le marché (AMM) en France. Ce produit est plus largement utilisé en Europe, en fonction des besoins. Il n’existe aucune spécialité antivenimeuse ne faisant pas appel à l’animal pour la production d’immunoglobulines, les anticorps polyclonaux sont très efficaces pour la lutte contre les envenimations.
Procédures
8 chevaux reçoivent des injections de venin à dose croissante afin de solliciter leur réponse immunitaire. Ils sont ensuite prélevés régulièrement (production de plasma). Leur immunité est conservée par injections de solution de venin, entre chaque cycle de prélèvement.
Impact sur les animaux
Possible formation de granulomes inflammatoires (aux points d’injections). Également des abcès d’importance variable, plus fréquents lors de la phase d’hyper-immunisation. L’évolution peut entrainer des plaies avec écoulement. Des soins locaux sont alors dispensés, la guérison est rapide. Généralement le protocole entraine une souffrance modérée. Pour autant, certains cas étant sévères, le niveau de souffrance sévère est retenu. L’inflammation devient étendue et provoque une gêne de la mobilité de l’encolure prolongée de l’animal. Dans de rares cas, le vétérinaire peut exiger l’arrêt provisoire ou définitif du protocole. Les effets sur l’état général sont rares, les chevaux supportent bien les protocoles. L’observation quotidienne de tous les animaux permet de déceler une éventuelle pathologie. Tout animal présentant des signes cliniques fait l’objet d’un suivi vétérinaire et du traitement nécessaire.
Devenir
A l’issue de la production, les chevaux réformés sont proposés à l’adoption. Une évaluation vétérinaire est toujours associée à cette décision.
Remplacement
L’état actuel de la science ne permet pas de fabriquer des antivenimeux autrement qu’en ayant recours à l’animal. L’effet polyclonal est largement plébiscité car il agit avec un très large spectre face aux nombreuses protéines nocives des venins, et la production in vitro d’anticorps polyclonaux pour ce type de produit n’est pas encore possible.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict minimum. Les demandes commerciales et les titres des plasmas déterminent le niveau de production et par conséquent le nombre de chevaux producteurs.
Raffinement
Réduction de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse : les chevaux sont hébergés en groupe, ce qui réduit l’angoisse. Les manipulations (injection ou prélèvement de sang) sont réalisées en présence de chevaux du même groupe, dans des installations spécifiques adaptées. Des soins sont prodigués aux animaux présentant des granulomes inflammatoires au niveau des points d’injection. Ses soins peuvent aller d’un simple nettoyage d’une plaie, avec désinfection, jusqu’à l’arrêt du protocole sur décision vétérinaire. Tout animal blessé ou malade fait l’objet d’un suivi vétérinaire individuel. La possibilité de poursuivre ou non le protocole est évalué au cas par cas par le vétérinaire désigné. Enfin des mesures sont prises pour réduire l’impact des prélèvements sanguins avec des traitements contre la baisse de la volémie et de la concentration de différents composants du sang
Choix des espèces
Les équidés représentent l’espèce de choix car leur gabarit leur confère un volume sanguin circulant élevé. Les volumes prélevés sont importants, proportionnellement à ce volume sanguin, et leur capacité rapide à reconstituer ce stock en fait l’espèce de choix. C’est une espèce qui s’adapte bien à l’humain et pour laquelle il n’existe que peu de zoonoses sur le territoire français. Les animaux sont âgés d’au moins 3 ans. Il est nécessaire qu’ils aient achevé leur croissance et que leur système immunitaire soit mature.
Etude de l’hétérogénéité de la réponse musculaire au sepsis entre les muscles de la face et les muscles des membres en fonction du sexe
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Le caecum de chaque souris est ligaturé et perforé pour déclencher une péritonite, après implantation d'une sonde de température. 300 souris vont être utilisées, dont 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 120 un niveau modéré. Le porteur écrit que les nuisances attendues tiennent "principalement" au stress de la contention, avant de décrire un quart des animaux mourant du modèle dans les quatre premiers jours, avec perte de poids, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale et agressivité. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les muscles de la face et des membres, l'étude cherchant à comprendre pourquoi les muscles faciaux des patients septiques semblent épargnés.
Objectifs
Le sepsis est défini comme une défaillance multi-organe causée par une réponse excessive et incontrôlée de l'hôte à l'infection. Le sepsis est l'une des principales causes de mortalité dans les unités de réanimation en soins intensifs avec un taux de mortalité très élevé de 30 %, pouvant atteindre 40 à 50 % en cas de complications. En outre, des séquelles persistent longtemps après leur guérison et les patients survivants développent un handicap physique chronique qui affecte au quotidien leur qualité de vie. La majorité des patients survivants du sepsis présentent une atrophie et une faiblesse musculaires qui surviennent rapidement dès les 10 premiers jours de leur séjour en soins intensifs et qui s’accompagnent d’une fonte musculaire progressive. Chez les patients septiques, l’atteinte musculaire touche principalement les muscles des épaules, des bras et du bassin, tandis que les muscles des membres inférieurs sont moins touchés. L’origine et les mécanismes impliqués dans la faiblesse musculaire associée au sepsis semblent complexes et multifactoriels, et impliquent une inflammation incontrôlée, une augmentation de la dégradation des fibres musculaires ainsi qu’une altération des capacités cicatricielles des cellules souches du muscle. De façon surprenante, chez les patients septiques, les muscles faciaux et extra-oculaires semblent totalement épargnés sans que l’on ne sache pourquoi. Notre hypothèse est que les muscles de la face et les muscles extra-oculaires mettent en place des mécanismes compensatoires intrinsèques leur permettant de résister au choc septique. Dans ce contexte, l’objectif principal de notre projet vise à étudier l’hétérogénéité des réponses biologiques des muscles squelettiques et des cellules souches en réponse au sepsis en fonction de leur localisation anatomique (muscles des membres vs muscles de la face). Nous étudierons également s’il existe une différence entre les mâles et les femelles dans cette réponse hétérogène musculaire au sepsis.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra une meilleure compréhension de l’hétérogénéité de la réponse des muscles squelettiques au sepsis en fonction de leur localisation anatomique. Ce travail permettra d'identifier les mécanismes moléculaire et cellulaires responsables de la résistance de certains muscles au sepsis qui pourront être ciblés dans le futur à visée thérapeutique.
Procédures
Les procédures invasives sur animal anesthésié sont au nombre de cinq : 1. Implantation d’une sonde de température sur animal anesthésié (1 fois, durée : 5 min) 2. Modèle de sepsis (1 fois, durée : 10 min) 3. Mesure de la force musculaire sur animal anesthésié (1 fois, durée : 30min) 4. Prélèvement de sang de façon réitérée (5 fois max, durée : 2 min) 5. Prélèvement de sang sur animal anesthésié au terme de l'étude (1 fois, durée : 2 min). La seule procédure non ou peu invasive sur animal anesthésié ou vigile est le test de force musculaire sur animal vigile (2 fois, durée : 5 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement liées au stress lors de la contention et de la manipulations sur animal vigile. Les effets indésirables sont ceux liés au modèle murin de sepsis peut être associé à une perte de poids (corrélée avec la gravité de la maladie), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale), un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité) avec une surmortalité accrue pour les animaux les plus atteints (25% environ).
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester l’impact différentiel direct de la réponse inflammatoire incontrôlée associée au sepsis sur le devenir des cellules souche musculaires isolées de muscles de la face ou des muscles périphériques, des expériences de culture cellulaire seront menées indépendamment en incubant les cellules avec un cocktail de cytokines pro-inflammatoires ou du sérum de sujets (souris ou homme) en choc septique. Néanmoins, pour répondre à notre question biologique, le remplacement total par de la culture cellulaire n’est pas possible. En effet, les modèles in vitro ne rendent pas compte de l’immense complexité des interactions qui existent entre les populations cellulaires au sein d’un muscle entier, notamment dans un contexte de réponse inflammatoire aigüe. L'utilisation de modèles animaux mimant le sepsis reste essentielle pour étudier l’hétérogénéité de la réponse musculaire au sepsis, notamment entre les muscles de la face et des muscles périphériques. Dans cette étude, notre choix s’est porté sur le modèle de sepsis par ligation et poncture du caecum afin de nous rapprocher au plus près d’une des causes principales de sepsis chez l’Homme, à savoir la péritonite. Par ailleurs, la souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés. Nos expériences au laboratoire ainsi que les données préliminaires de nos collaborateurs sur le modèle de sepsis chez la souris ont démontré que des groupes de n=15 animaux sont nécessaires pour les analyses histologique et moléculaire et les analyses fonctionnelles à long terme, compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle de la réponse musculaire au sepsis et de la mortalité importante du modèle dans les 4 premiers jours suivant la chirurgie (25%).
Raffinement
Les animaux importés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. Pour raffiner, la souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Les animaux seront examinés de façon biquotidienne pendant les 7 premières jours afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie du muscle squelettique est proche de celle de l’Homme. Par ailleurs, la souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées. Les souris mutantes expriment une protéine fluorescente verte dans les cellules satellites, ce qui facilitera leur analyse spatiale en histologie et leur tri en cytométrie en flux pour l’analyse ultérieure de leur potentiel de réparation en culture ou de leur expression génique différentielle. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes de 8 semaines. A ce stade, les muscles sont parfaitement formés et les cellules satellites résident en périphérie de la fibre musculaire à l’état de repos. Par ailleurs, les données de la littérature montrent que l’incidence de la péritonite est beaucoup importante chez l’adulte que chez l’enfant.
Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie de vecteurs viraux administrés en topique ou par injection intra-neurale, chez le rongeur.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 685
Jusqu'à dix acquisitions d'imagerie par jour le premier jour, puis trois par jour pendant trois jours, puis une par jour jusqu'au dixième : 1 370 rongeurs, 685 souris et 685 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 450 d'entre eux, modéré pour 900 et léger pour 20. Les animaux subissent des abrasions ou scarifications de la voûte plantaire, de la lèvre ou de la cornée et des injections dans le nerf sciatique sous anesthésie pouvant durer une heure, avec douleurs, inflammation, gêne pour s'alimenter, difficultés locomotrices et troubles visuels annoncés. Le projet sert à établir le profil pharmacologique de vecteurs de thérapie génique, données destinées à un dossier européen de médicament expérimental puis à une éventuelle demande d'essai clinique. Dix animaux seront réutilisés et les témoins pourront être gardés en vie pour la formation continue du personnel ou servir de contrôles dans d'autres études, tous les autres étant tués pour prélèvement des ganglions.
Objectifs
Les aires thérapeutiques majeures (oncologie, neurologie, cardiologie, urologie…) demeurent sans solution thérapeutique satisfaisante. Elles constituent les principales causes de mortalité et de handicap dans le monde, et provoquent de véritables drames humains, sociaux et économiques. Mais au cours des deux dernières décennies, la thérapie génique est devenue un outil thérapeutique clé qui constitue un véritable espoir pour les patients. Actuellement, les vecteurs viraux sont devenus le principal système d'administration de gènes pour la médecine génétique. L’objectif est d’introduire des gènes dans des cellules pour soigner une maladie. Au départ, cette approche a été conçue pour suppléer un gène défectueux en cas de dysfonction. Mais au cours des deux dernières décennies, l’évolution rapide des connaissances et des technologies a permis de démultiplier les stratégies possibles et d’élargir leur utilisation à de très nombreuses indications. L’objectif de ces vecteurs est de traiter les maladies neurologiques grâce à la thérapie génique. En fonction de la voie d’administration, les vecteurs vont coloniser différents ganglions puis exprimer le transgène d’intérêt pour la maladie cible. Dans ce projet, différentes voies vont être testés afin de déterminer la voie la plus pertinente et la plus efficace dans la colonisation des neurones sensoriels cibles. Les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique chez l’animal sont nécessaires pour caractériser le potentiel thérapeutique d’une molécule. Dans ce contexte les administrations topiques (cutanées et cornéennes) et intra-nerveuse avec suivi de la molécule par imagerie, permettront d’étudier l’absorption et la distribution de ces vecteurs. L’objectif sera d’aider à la détermination de la voie d’administration optimale et du régime posologique le plus adapté. Ce projet a pour objectif de caractériser l’absorption, la distribution et l’excrétion de vecteurs viraux chez le rongeur. Il se décompose en 2 phases : l’administration de composés en topique et intra-neurales et l’évaluation de la bio-distribution.
Bénéfices attendus
A court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil pharmacologique d’un composé. A plus long terme, les données obtenues au travers ces études précliniques feront partie intégrante du dossier Européen IMPD (Investigational Medicinal Product Dossier), lequel permettra de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera peut-être sur la mise sur le marché d’un nouveau médicament.
Procédures
Les abrasions/scarifications et la chirurgie du nerf sciatique seront faites sous anesthésie générale. L’anesthésie pourra durer jusqu’à 1h du fait du temps de pénétration/séchage des produits administrées (sur les zones scarifiées/abrasées) ou de la chirurgie du nerf sciatique. Des examens scanner ou d’imagerie optique pourront également être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de : - maximum 10 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Pour les examens de bioluminescence, la durée est d’en moyenne 5 minutes, les fréquences seront de : - maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis, - maximum 3 acquisitions par semaine jusqu’au 30e jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Le stress est inhérent à toute manipulation d’animaux. Les méthodes d’administration topiques par abrasion et scarification, et les administrations intra-neurales peuvent induire des douleurs et une inflammation. La scarification de la lèvre peut entrainer une douleur entrainant une gêne pour s’alimenter. Des difficultés locomotrices pourront être observées chez les animaux ayant eu une scarification/abrasion de la voute plantaire ou une injection intra-neurales. La scarification peut entrainer une douleur et des troubles visuels.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Tout organe pertinent pourra être prélevé après mise à mort de l’animal afin de réaliser une quantification des produits par imagerie ex-vivo (micro-scanner ou imagerie optique) ou par d’autres techniques in-vitro. Les ganglions de la racine dorsale ou les ganglions trijumeaux seront prélevés pour des analyses histologiques. Les animaux contrôles pourront être gardés en vie et utilisés pour de la formation continue du personnel ou, dans la mesure du possible et en fonction des projets, ils pourront être réutilisés pour des études comme animaux contrôle.
Remplacement
La pharmacologie étudie les interactions entre un xénobiotique et une ou plusieurs cibles endogènes. Ces interactions recouvrent les effets du xénobiotique, ou ses produits de dégradation, sur la ou les cibles, mais aussi l’action de la ou les cibles sur l’agent toxique. Une bonne compréhension des mécanismes est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à un effet pharmacologique ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela qu’il est impératif d’évaluer les effets potentiels d’un composé thérapeutique sur des modèles animaux avant tout essais chez l’homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • en cas de doute, des études pilotes pourront être réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement les composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution du produit testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes pourront être réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué in-vivo par exemple.
Raffinement
Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse: une période d’acclimatation de minimum 5 ou 7 jours (si les animaux sont transportés par avion) sera respectée. Ils seront également hébergés collectivement durant toute la durée de l'étude pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, réchauffement, injection d’analgésie, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. • des évaluations cliniques quotidiennes (état général des animaux, détection d’état moribond) et régulières (pesée et scoring des signes cliniques au moins 1 fois par semaine, fréquence augmentée en fonction de l’état clinique des animaux et de la sévérité des actes réalisés), • des soins vétérinaires adaptés aux voies d’administrations des vecteus viraux et en fonction de l’état clinique des animaux, • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation des signes cliniques généraux et spécifiques à la voie d’administration sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour les études de pharmacocinétique et pharmacodynamique du fait de leur prédictivité. Étant fond génétique international, ces souches permettent de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (6 à 8 semaines) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal. Cet âge est également en accord avec les lignes directrices pour garantir une homogénéité entre les phases précliniques.
Etude de la pathogénicité et de la transmission de virus de l’influenza aviaire chez les volailles
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Dindes : 41
Autres oiseaux : 574
Infectés par instillation oculaire de virus de l'influenza aviaire, les oiseaux subissent jusqu'à 20 écouvillons oro-pharyngés, 20 écouvillons cloacaux, 20 prélèvements de plumes immatures et 5 prises de sang de 2 mL, sur animal vigile, sur 22 jours. 820 oiseaux vont être utilisés, 205 poules, 41 dindes et 574 rangés sous la mention autres oiseaux dont des canards, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués, témoins compris, pour éviter toute dissémination du virus. Les souches hautement pathogènes peuvent provoquer des signes respiratoires, digestifs, nerveux et cutanés allant jusqu'à l'anorexie totale. Sur le remplacement, une seule phrase indique que la pathogénicité ne peut pas être évaluée in vitro, et le résumé ne précise ni les espèces retenues, qui dépendront du virus détecté sur le terrain, ni les points limites appliqués.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes responsables de la variabilité des symptômes et des dommages observés lors de l’infection des volailles par différents virus de l'influenza aviaire (VIA) et de décrire la transmission directe et indirecte du virus entre individus. Les procédures expérimentales utilisées permettront de caractériser : i) le profil de multiplication du virus au cours de l’infection, ii) les réponses de l’animal à cette infection et iii) la transmission du virus entre animaux infectés et réceptifs. Pour chaque VIA étudié, les animaux sont infectés puis hébergés en animalerie confinée, le confinement des animaux devenant nécessaire pour des raisons de sûreté de manipulation des animaux infectés et de maintien de comparabilité entre les procédures pour chaque virus étudié. Des observations cliniques quotidiennes, des prélèvements par écouvillonnage et des prélèvements de sang seront effectués sur les animaux pour déterminer les caractéristiques de l'infection.
Bénéfices attendus
La description des caractéristiques de l’infection par des VIA émergents fournit des informations utiles à la gestion des foyers d’infection par les VIA et à la prévention de la diffusion du virus chez les volailles, en cas de détection sur le terrain. Ce projet permet également de créer ou d’améliorer des modèles permettant de décrire l'infection et la transmission des virus étudiés, afin de limiter le recours ultérieur à l'utilisation d'animaux.
Procédures
Les animaux sont soumis aux prélèvements suivants, sur animaux vigiles. Au maximum, 20 écouvillons oro-pharyngés, 20 écouvillons cloacaux, 20 prélèvements de plumes immatures et 5 prises de sang (2mL) seront réalisés par animal. L'infection des animaux est effectuée en début de procédure par instillation oculaire. Les prélèvements s’étalent sur une durée de 22 jours au maximum. Au cours de chaque intervention, les prélèvements sont réalisés séquentiellement sur l’animal, la durée de chacun des actes ne dépassant pas une minute pour une durée totale d’immobilisation et de contention d’environ 3 à 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Suite à l'inoculation de virus de l'influenza aviaire hautement pathogène, les signes cliniques suivants pourront être observés, isolés ou associés entre eux : symptômes respiratoires, digestifs, nerveux, cutanés et symptômes généraux pouvant aller jusqu'à l'anorexie totale. Suite à l'inoculation de virus de l'influenza aviaire faiblement pathogène, les signes cliniques précédents pourront être observés dans les cas les plus graves mais restent le plus souvent limités à des signes de gêne respiratoire modérée. Chez les palmipèdes, l'infection est fréquemment inapparente. Aucun effet indésirable n'est attendu sur la santé des animaux témoins.
Devenir
Pour des raisons de sécurité et pour prévenir tout risque de dissémination des virus inoculés, l'ensemble des animaux des groupes infectés seront mis à mort. Pour la procédure de caractérisation du pouvoir pathogène des virus de l'influenza aviaire, les animaux du groupe témoin non inoculé avec le virus sont également mis à mort séquentiellement au cours de la procédure pour permettre une comparaison sur prélèvements avec les sujets du groupe inoculé par le virus étudié.
Remplacement
L’étude de la pathogénicité et de la transmission virale ne peut pas être évaluée in vitro d’où la nécessité d'utiliser des oiseaux de l’espèce la plus adaptée.
Réduction
La stratégie employée pour réduire le nombre d'animaux utilisé consiste à réduire le nombre de sujets par lot et à utiliser en conséquence des tests statistiques adaptés aux faibles effectifs. Pour la procédure de transmission, les animaux sont contrôlés avant infection ce qui sert de point de mesure témoin et permet de diminuer le nombre d’animaux en n'utilisant pas de lot témoin.
Raffinement
Les animaux sont logés dans les animaleries dans des parcs délimités, en respectant les normes d’élevage et avec à disposition des enrichissements appropriés. Dans l’éventualité de signes cliniques provoqués par le virus occasionnant un mal-être chez l’animal, des points limites sont définis pour que les animaux soient mis à mort avant que la souffrance ait un atteint un seuil non acceptable. L'approche pour réduire la souffrance des animaux réside également dans l’instauration d’observations cliniques deux fois par jour à partir de l'inoculation.
Choix des espèces
Les espèces choisies sont des espèces de volaille domestique : le choix dépendra de l’espèce chez laquelle le virus à caractériser aura été détecté. Les animaux seront âgés de 6 à 7 semaines pour les poulets, canards et dindes. Des canards de 11 à 12 semaines d'âge pourront également être utilisés pour être pertinent avec les pratiques d'élevage de la filière d'élevage du canard. Dans les deux catégories d'âge retenu, les oiseaux sont utilisés avant leur maturité sexuelle et sont réceptifs à l’infection par les VIA.
Évaluation d’une prodrogue thérapeutique activable par la béta-glucuronidase dans des modèles de glioblastomes
- Recherche appliquée
- Cancers
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 75 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 75 un niveau modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau ou dans le cerveau par une chirurgie de vingt minutes, développent un glioblastome, puis passent deux IRM par semaine pendant dix semaines au maximum, sous anesthésie de moins d'une heure. Le porteur prévoit des troubles neurologiques possibles, mouvements circulaires, stupeur, troubles de la conscience, et la mise à mort de l'animal lorsqu'il n'est plus possible de le maintenir en vie. Il présente sa prodrogue comme activée seulement dans la tumeur, donc "sans effets secondaires" sur les tissus sains, et annonce une "efficacité redoutable" transposable rapidement à l'humain, alors que la moitié des souris est déclarée en souffrance sévère.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer une prodrogue thérapeutique plus efficace que la chimiothérapie de référence. Pour cela notre stratégie repose sur l’utilisation d’une nouvelle molécule, délivrant de manière ciblé un agent chimiothérapeutique au sein même des glioblastomes. Cette prodrogue activable transporte trois molécules de chimiothérapie sous leur forme inactive, et n’est activée (par clivage enzymatique) uniquement au sein de la tumeur, présentant donc une efficacité maximale, sans effets secondaires, sur les tissus sains où elle reste sous sa forme inactive. Notre approche s’inscrit dans un contexte de médecine de précision. Une fois validée chez le petit animal, cette stratégie pourrait être appliquée chez l’homme très rapidement.
Bénéfices attendus
L'administration contrôlée d'agents anticancéreux améliorera l'efficacité des systèmes moléculaires proposés sur le glioblastome, et augmentera ainsi les bénéfices en termes de survie et de qualité de vie des patients. Si cette approche se révèle efficace sur ces modèles de glioblastomes, elle pourrait être mise à profit pour beaucoup d’autres types de tumeurs. Cette stratégie de prise en charge pourrait potentiellement devenir universelle, quel que soit le type de tumeurs solides.
Procédures
Les animaux recevront une unique injection de cellules tumorales sous la peau (durée 2 minutes) ou dans le cerveau par chirurgie (durée 20 minutes). L’évolution des tumeurs cérébrales se fera par imagerie IRM, deux fois par semaines, durant 10 semaines maximum (durée de l’acte
Impact sur les animaux
Le protocole d’implantation tumorale orthotopique entraineront un léger stress post-chirurgical. On ne s'attend pas à ce que l'injection intracrânienne entraîne une mortalité aiguë. De même, une infection autour du site d’injection est peu probable. Pour le modèle orthotopique, les animaux développeront des tumeurs primaires dans le cerveau. Après l'implantation, il pourrait y avoir une réduction initiale du poids corporel, puis une reprise ultérieure du poids corporel. Il existe un risque théorique pour les animaux de développer des troubles neurologiques (observation visuelle d’une réaction altérée à la manipulation, de troubles de la conscience, de mouvements circulaires ou de stupeur) ou encore d’infections, auquel cas l'animal sera mis à mort s’il n’est éthiquement pas possible de le soigner et de le maintenir en vie. Pour le protocole d’implantation tumorale sous-cutané, l’implantation tumorale sur le flan des souris entrainera un léger stress à l’implantation. Les protocoles d’imagerie n’entraineront pas de douleur, souffrance ou angoisse supplémentaire. Les administrations de molécules thérapeutiques n’entraineront pas de douleur, souffrance ou angoisse supplémentaire en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intraveineuse des molécules à des animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur les tumeurs afin de valider l’efficacité de la thérapie au niveau cellulaire.
Remplacement
Aucun modèle alternatif n’est disponible actuellement pour s’affranchir de ce type d’étude. Seuls les tests in vivo pourront nous permettre de valider la supériorité en termes d’efficacité de la prodrogue pour la thérapie du glioblastome. Cependant, les études préliminaires réalisées in vivo avec d’autres constructions moléculaires ont permis d’avoir des arguments en faveur d’une efficacité redoutable sur les tumeurs.
Réduction
Nous limiterons notre étude au strict minimum requis dans le nombre de souris et les différents modèles murins à utiliser afin de sélectionner et de caractériser cette prodrogue pour la prise en charge du glioblastome. Dans ce projet, ce nombre est fixé à 150 animaux. Si aucune efficacité ni supériorité d’efficacité n’est démontrée par la prodrogue dans les modèles sous-cutanés, ce nombre sera réduit à 75 animaux, puisque les évaluations thérapeutiques sur les modèles cérébraux ne seraient pas réalisées.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie d'une durée inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse en dehors d’un stress bref et modéré lié à l’injection intra veineuse de radiotraceur. Pour le protocole d’implantation tumorale au niveau du cerveau, l’implantation se fera chirurgicalement dans le respect de la stérilité, sous anesthésie, anesthésique local, et analgésie suivie d’un relai par anti-inflammatoire. Un onguent sera appliqué sur la cornée pour éviter toute sécheresse oculaire. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal (pour les tumeurs aussi bien sous-cutanées qu’au niveau du cerveau). En ce qui concerne le phénotype dommageable des animaux immunodéprimées, une attention particulière leur sera portée, avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectuée quotidiennement. Ces animaux seront également hébergés en environnement stérile (boite, litière, boisson et nourriture) et la manipulation des animaux se fera sous hotte. Nous utiliserons des lignées de cellules tumorales murines qui seront implantées chez des animaux ayant un phénotype non-dommageable lorsque possible.
Choix des espèces
Les études précédentes utilisant notre prodrogue thérapeutique précurseur ont toutes été effectuées chez la souris. Les modèles sélectionnés sont les seuls à pouvoir permettre une expression de l'enzyme d'intérêt au niveau tumoral et ainsi déclencher l’activation de notre molécule. Ces modèles sont très pertinents vis-à-vis de la pathologie clinique puisque ce sont des modèles qui présentent des caractéristiques similaires aux tumeurs humaines. Les protocoles concerneront uniquement des souris qui seront âgées entre 5 et 6 semaines au moment de leur arrivée dans le laboratoire, pour permettre une implantation et un développement tumoral optimal.
Choc septique et déficit énergétique : une étude biochimique pour ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
L'intestin de chaque rat est incisé sous anesthésie pour libérer de la matière fécale dans son abdomen et déclencher un choc septique sévère dans les 24 heures. 45 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la moitié mourant du choc, les survivants présentant fatigue intense, frissons, écoulements oculaires et nasaux, hypothermie et chute de la pression artérielle. Le porteur écrit que les mesures prises garantissent le bien-être des animaux non-humains, et indique par ailleurs qu'aucune analyse statistique ne sera réalisée sur les données, l'objectif se limitant à valider le modèle. Tous les rats sont tués pour prélever le sang, le foie et le cœur.
Objectifs
L’état de choc septique, qui est une réponse du corps humain à une agression par un microbe infectieux, conduit à des situations critiques de stress important. Il se caractérise par une incapacité à assurer une circulation sanguine suffisante pour fournir l’oxygène nécessaire aux organes, perturbant fortement la production d’énergie par les organes, altérant leur fonctionnement et leur survie. En état de choc septique, on observe une inflammation importante. L’objectif de cette étude est de mettre en évidence le déséquilibre du métabolisme énergétique chez le rat ayant subi un choc septique provoqué. Ce travail préliminaire permettra la mise en place et la validation de ce modèle expérimental, crucial pour explorer les pistes thérapeutiques envisagées.
Bénéfices attendus
L’étude du déséquilibre énergétique chez des rats en état de choc septique nous permettra de mieux comprendre l’origine des troubles biologiques observés chez les patients pris en charge dans les services d’urgence des hôpitaux. La validation de ce modèle d’étude nous permettra de tester de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale durant 15 minutes environ par animal. Cette procédure consiste à réaliser une incision de l’intestin afin de libérer de la matière fécale dans l’organisme de l’animal, induisant ainsi un choc septique sévère dans les 24 heures suivantes. Des prélèvements sanguins de très faible volume seront effectués avant et après l’opération. Le lendemain de la chirurgie, le rythme cardiaque et la pression artérielle seront mesurés à l’aide d’instruments spécialisés nécessitant des perfusions, sous anesthésie, pendant environ 20 minutes. L’ensemble du protocole durera 24 heures au total.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux après l'induction du choc septique provoquent la mort dans la moitié des cas et dans les 24h qui suivent l’opération. Les animaux qui survivent montrent souvent des signes de grave infection, comme une grande fatigue, des frissons, des écoulements au niveau des yeux et du nez, et des selles collées près de l’anus. Ils peuvent aussi avoir une température plus basse pendant les 24 premières heures après l’opération. Leur cœur bat plus lentement et leur pression artérielle diminue, ce qui montre qu’il y a une grave infection bactérienne dans leur sang.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever et analyser l'ensemble des organes impliqués dans la maladie (sang, foie, coeur).
Remplacement
On ne peut pas bien étudier le choc septique avec d'autres méthodes car cela nécessite d'examiner plusieurs fonctions du corps et comment elles interagissent, comme le cœur, les vaisseaux sanguins et le fonctionnement du foie. Ce modèle a pour but d'étudier les relations entre plusieurs organes tels que l'intestin, le foie, le coeur et le sang dans un état de choc septique.
Réduction
Pour limiter l’utilisation des animaux, nous avons prévu 20 rats par groupe (10 mâles et 10 femelles). Cependant, nous avons fixé un objectif de 10 réussites par groupe (5 mâles et 5 femelles) pour les analyses. Cela permettra d’atteindre les objectifs du projet sans utiliser tous les animaux disponibles. Nous faisons ce choix car nous nous attendons à observer des effets marqués, rendant inutile l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux. De plus, aucune analyse statistique ne sera réalisée sur ces données, l’objectif étant de mettre en évidence des problèmes énergétiques. Un surplus est prévu pour pallier d’éventuels échecs lors des procédures, ce qui permet d’éviter de nouvelles expérimentations.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées (2 maximum par cage) avec un environnement comprenant des abris, tunnels ou bâtons à ronger, et auront un accès libre à l’eau et à la nourriture. La durée d’étude après le choc septique est réduite à 24 heures après la chirurgie, avec une surveillance renforcée après l’opération. Des points limites ont été définis. Pour l'ensemble des procédures, telles que la chirurgie, l’échocardiographie et la mesure de la pression artérielle, les animaux seront placés sous antalgique et sous anesthésie afin de limiter leur souffrance. Pour atténuer la douleur, un analgésique sera administré une heure avant la chirurgie, puis toutes les 6 heures après l’intervention, soit à 18h, minuit et 6h du matin, et ajouté à l’eau de boisson pour un apport continu. Les chirurgies seront réalisées par du personnel formé pour garantir une intervention rapide et maîtrisée. Ces mesures garantissent le bien-être des animaux tout en respectant les objectifs scientifiques de l’étude.
Choix des espèces
Les rats âgés de 10 à 12 semaines ont été choisis car ils sont plus faciles à manipuler, ce qui réduit le stress pendant les interventions. Leur taille permet des prélèvements sanguins plus simples et précis. Contrairement aux souris, les rats présentent moins de variations dans certains paramètres importants dans ce protocole. Cela en fait un modèle adapté pour notre étude.
Étude d’une voie de la douleur par modification génétique vectorisée
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chercher une alternative aux opioïdes conduit ici à provoquer des douleurs et des démangeaisons chez 204 souris, 144 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 60 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie reçoit une injection dans le cerveau ou la moelle épinière sous anesthésie de 45 minutes, avec une douleur post-opératoire modérée pouvant durer plusieurs jours jusqu'à cicatrisation, avant des tests de douleur ou de prurit de 30 minutes. D'autres subissent une inflammation de la patte qui provoque une hypersensibilité douloureuse modérée pendant six heures, jusqu'à leur mise à mort, ou des injections dans la cavité abdominale répétées cinq jours de suite. Un animal qui présente une prostration, un grattage excessif, une plaie de plus de deux millimètres ou une perte de plus de 20 % de son poids en une semaine est mis à mort.
Objectifs
Les opioïdes constituent une classe de médicaments antalgiques efficaces mais dont les effets indésirables sont un obstacle au soulagement des patients et à l’origine d’une crise sanitaire grave. La recherche d’alternatives thérapeutiques est aujourd’hui basée sur une évolution des modalités d’activation du récepteur mu aux opioïdes et ne résout que partiellement ce problème. Nous avons montré qu'une protéine était impliquée dans l’effet antalgique de la morphine mais pas dans ses effets indésirables, et que son activation directe était antalgique et bien tolérée. En s’appuyant sur le récent développement de nouveaux activateurs de cette protéine, ce projet vise à (1) déterminer dans quels contextes physiopathologiques cette stratégie antalgique est la plus efficace, (2) définir si cet effet antalgique fait intervenir la protéine au niveau du système nerveux central et/ou périphérique pour guider le développement de futurs composés, et (3) évaluer les potentiels effets indésirables liés à l’activation de cette protéine, notamment au niveau central. Ce travail permettrait une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la douleur, du potentiel antalgique des activateurs de cette protéine ainsi que de la sécurité de cette stratégie. Les activateurs de cette protéine pourraient en effet offrir une alternative aux opioïdes et constituer une nouvelle classe de médicaments antalgiques efficaces et mieux tolérés.
Bénéfices attendus
A l'issue de ce projet, nous aurons une vision claire du bénéfice thérapeutique potentiel des activateurs de la protéine étudiée, de leurs effets indésirables ainsi que des indications les plus pertinentes pour ces produits. L'étude de la contribution de cette protéine au niveau de système nerveux central et périphérique à l'effet antalgique des composés permettra d'orienter le développement de nouveaux activateurs. En effet, si l'effet antalgique est principalement périphérique, il pourra être intéressant de synthétiser des composés ne passant pas dans le système nerveux central pour limiter son exposition et donc les effets indésirables potentiels.
Procédures
- 2x72 animaux : injection dans le cerveau ou la moelle épinière sous anesthésie (45 min) - 2x72 2x72 animaux : tests de douleur ou de prurit (30 min) - 2x12 animaux : tests de sensibilité thermique et mécanique avant et après induction d'une inflammation de la patte (10 min) - 4x12 animaux : induction de prurit (10 secondes pour une injection sous-cutanée) - 60 animaux injection au niveau de la cavité abdominale ou de la patte (10 secondes) - 60 animaux injection au niveau de la cavité abdominale (1 fois par jour pendant 5 jours, 10 secondes par injection)
Impact sur les animaux
Les injections dans le cerveau ou la moelle épinière sont un geste chirurgical qui peut entrainer une douleur post-opératoire modérée chez les animaux (inconfort qui ne devrait pas être visible au delà de la récupération de l'anesthésie, mais qui peut durer plusieurs jours jusqu'à cicatrisation de l'incision cutanée). Il est également possible qu'une des modifications génétiques réalisées, au niveau local, entraine une hypersensibilité à certains stimuli thermiques ou mécaniques (au maximum équivalente à celle précédemment observée chez les animaux ayant subi cette même modification au niveau global), qui sera évaluée chez les animaux. Les animaux recevront également des injections provoquant une douleur légère de courte durée. Enfin, certains tests visant à étudier la douleur ou le prurit constituerons par essence un désagrément pour les animaux. Les tests utilisés induisent une douleur légère (seuil de détection) et très ponctuelle. L'induction d'une inflammation au niveau de la patte induit une hypersensibilité douloureuse modérée chez les animaux pendant 6h jusqu'à leur mise à mort. Les modèles de prurits utilisés entrainent une démangeaison (inconfort modéré) qui disparait en 30 min.
Devenir
Les contraintes imposées aux animaux pour l'enregistrement de l'activité neuronale sont telles que les animaux ne seront pas réveillés de l'anesthésie et seront mis à mort en fin d’expérimentation afin d’éviter toute souffrance inutile. Il en est de même pour les animaux modèles de douleur ou de prurit qui seront mis à mort après évaluation comportementale.
Remplacement
De nombreux travaux préliminaires concernant le rôle de la protéine étudiée dans la sensibilité sensorielle ont été réalisés in vitro. Il est cependant nécessaire de confirmer ce rôle in vivo, dans un contexte où les fibres nerveuses communiquent avec le tissu (en l'occurence la peau). La perception de la douleur et du prurit ne peux pas être modélisée in vitro à l'heure actuelle.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée grace à un outil statistique dédié. Les procédures sont adaptées pour obtenir plus d'information à partir des mêmes animaux, lorsque les tests réalisés chez les mêmes animaux n'interagissent pas ensemble et que la multiplication des tests n'engendre pas de nuisance supplémentaire. Les stimulations nécessitant d'être étudiées in vivo pourront également être réalisées de manière successive chez les mêmes animaux, permettant de limiter leur nombre.
Raffinement
Afin de prévenir une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie, et mis à mort si un point limite est franchi. En effet, si un animal présente un comportement anormal (prostration, grattage excessif), une posture ou une démarche anormale (faiblesse, déséquilibre), une plaie (> 2mm) ou une réduction de poids >20% en une semaine, celui-ci sera mis à mort. Les animaux seront au maximum 6 par cage (animaux issus de la même portée, mâles et femelles séparés au sevrage pour ne pas inclure de femelles gestantes ou allaitantes dans les procédures) en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront un enrichissement de type maisonnette ainsi que du coton pour la constitution d'un nid. Les procédures incluant le recours à la chirurgie seront réalisées sous anesthésie générale et un antalgique sera utilisé en péropératoire pour favoriser la récupération et limiter la souffrance.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur le modèle souris car c'est sur ce modèle que l'essentiel de la littérature scientifique existe et sur lequel notre niveau de connaissance est le plus élevé. Nous avons réalisé une cartographie de l'expression de notre protéine d'intérêt dans le cerveau et la moelle épinière de la souris qui sera essentielle à la génération de souris modifiées génétiquement de manière locale. La souris est de plus le seul modèle permettant la réalisation de ces modifications. C'est également chez la souris qu'ont été mis au point au laboratoire toutes les techniques d'investigation comportementale ainsi que les différents modèles de douleur utilisés. Les contraintes d'encombrement du microscope utilisé in vivo nous imposent également l'utilisation d'animaux de petite taille. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes en début de procédure (8-12 semaines), et certains seront des nouveaux nés. Tous les animaux utilisés subieront une anesthésie générale qui serait plus risquée chez des animaux âgés. Travailler sur des animaux plus âgés augmenterait également le risque de développement de pathologies liées à l'âge qui pourraient biaiser les résultats. Enfin, les tests et modèles utilisés, comme les données disponibles dans la littérature, concernent sauf cas très spécifiques des animaux jeunes. La sensibilité à la douleur est modifiée avec l'âge, ce qui ne nous permettrait pas de comparer nos observations avec nos travaux précédents ou avec la littérature.
Evaluation de différentes formes galéniques implantables au niveau la zone portale chez le porc miniature comme thérapeutique du diabète de type 2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Opérés par cœlioscopie pour recevoir, contre la veine porte, un implant qui libère une molécule destinée à traiter le diabète de type 2, des porcs miniatures adultes risquent une brèche vasculaire ou une compression de la veine que seule l'imagerie peut révéler, et, obèses lors de la seconde expérience, des fractures au moment des pesées hebdomadaires. 20 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, suivis un mois ou six mois avec des anesthésies répétées pour des scanners et des prises de sang, en partie pour caler des tests in vitro de libération de la molécule. Le porteur affirme que le projet sera réalisé en s'assurant qu'"aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie" et décrit les effets liés au risque septique comme "parfaitement maitrisés". Tous sont tués sous une dernière anesthésie de deux heures consacrée à une tomographie, car un réveil après une si longue anesthésie serait, selon lui, "potentiellement douloureux".
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie endémique qui touche plus de 25 millions de personnes dans le monde. De nouveaux traitements existent mais leur efficacité est entachée par de nombreux effets indésirables. Une solution vise à rétablir la sensibilité des récepteurs au Glucagon-like-peptide 1 (GLP-1 r) situés dans un très court segment de la veine porte. Cela peut être produit par la libération locale et prolongée d’un composé capable de restaurer la densité des récepteurs GLP-1. Ce dernier est libéré par un implant idéalement biodégradable sur plusieurs mois. Le projet vise à évaluer la conversion d’un dispositif antérieur reposant sur un implant non biodégradable cylindrique en dispositif utilisable chez le patient humain et répondant aux bonnes pratiques de fabrication en accord avec les autorités de régulation des dispositifs biomédicaux implantables (GMP - good manufacturing practices). Le but de l’expérience est d’évaluer plusieurs dispositifs implantables biodégradables susceptibles de libérer in situ, sur plusieurs mois, une dose idoine de la molécule capable de réguler la densité des récepteurs GLP1. Cette évaluation comprend également une mesure directe et indirecte de la libération de la molécule active afin de calibrer différents tests in vitro de validation des implants dans le cadre de l’utilisation clinique chez l’homme de l’implant une fois celui-ci sélectionné.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont ceux associé à la possibilité de lancer la phase humaine du programme. Les bénéfices à long terme sont directement associés à la mise en place d'une thérapeutique alternative au traitement du diabète de type 2. Dans tous les cas, nous visons la production d’un dispositif médical susceptible d’être produit en condition GMP et dont la mise en place soit faiblement risqué pour le patient tout en allongeant de façon significative la durée de libération de la molécule active. L’idéal étant de disposer d’un dispositif médical qui puisse fonctionner plusieurs années i.e. qui libère la molécule active durant cette période. Cela nécessite de façon connexe de disposer d’un modèle de libération in vitro. L’expérience proposée vise entre autres à caliber in vivo ce modèle in vitro
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure comprenant diverses étapes durant la durée du projet. Au cours de la première expérience, trois types de dispositifs libérant une molécule active seront placés par voie chirurgicale coelioscopique (durée max de la chirurgie proprement dite - 15 minutes)chez trois groupes d’animaux. Chacun de ces groupes sera suivi durant 1 mois avec une anesthésie au cours de la semaine 2 et 4 post implantation. Au cours de cette anesthésie, un scanner et une prise de sang (2,5 mL) seront réalisés (durée max 30 minutes). La dernière anesthésie est terminale et permettra avant l’administration de l’agent déclenchant l’euthanasie une tomographie d’émission positronique destinée à la mesure de la densité des récepteurs GLP-1 (durée anesthésie 2 heures). Au cours de la seconde expérience, un implant choisi à la suite des résultats de la première expérience sera également implanté par voie chirurgicale coelioscopique sur un groupe unique d’animaux. les animaux seront suivi durant 6 mois avec 4 prises de sang sous anesthésie légère toutes les deux semaines puis tous les mois. Come pour les animaux de l’expérience précédente, une dernière anesthésie terminale permettra avant l’administration de l’agent déclenchant l’euthanasie une tomographie d’émission positronique destinée à la mesure de la densité des récepteurs GLP-1.
Impact sur les animaux
Le projet sera réalisé en s’assurant qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. Les effets liés au risque septique bien que parfaitement maitrisés sont pris en compte dans la surveillance durant semaine post-chirurgicale (recherche d’un arrêt de l’ingestion, prostration, toux, vocalisation au couché, diminution de la diurèse, température rectale accrue). En dehors de ces effets, et dans le cas de la première expérience, les effets indésirables potentiels sont ceux directement liés à la présence physique de l’implant et correspondent soit une brèche vasculaire soit une compression portale. Ils peuvent survenir durant la totalité de la période expérimentale mais ne peuvent être objectivés que par l’imagerie abdominale (US 2D et Doppler respectivement). Ils seront suspectés par les signes cliniques classiques d’une péritonite (arrêt brutal de l’ingestion, prostration, douleur à la palpation abdominale). Outre ces signes, des effets plus complexes à mettre en évidence sont possibles mais ont un tableau clinique protéiforme. Ces effets peuvent également survenir durant la totalité du protocole expérimental. C’est pourquoi, en cas de baisse significative de l’ingestion qui reste le seul élément quantitatif précoce dont nous disposons, nous compléterons l’examen clinique par une mesure de l’ECG et de la pression artérielle. En fonction de l’impact sur le bien être de l’animal, une euthanasie préventive sera réalisée. Dans le cas de la seconde expérience, les effets néfastes directs liés à l’implant sont identifiés et résolus. Les nuisances relèvent de l’élevage en condition expérimentale (plaies de contact, fractures au moment des pesées hebdomadaires en dépit d’une conception idoine des structures d’animalerie) sur des animaux obèses. Celles=ci peuvent survenir tout au long de la durée expérimentale. Aucun autre effet indésirable n'est attendu en consequence de leur obésité.
Devenir
Un réveil à la suite d'une longue anesthésie est potentiellement douloureux et/ou induit un mal-être sans qu'il ne soit réellement possible de contrer ces effets par un susbtitut pharmacologique. Face à ce risque, nous estimons qu'il est préférable de réaliser une euthanasie à l'issu de l'expérimentation
Remplacement
Ce projet réalisera de nouvelles recherches pour lesquelles l'information n'est pas déjà disponible dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales soit un atout inestimable pour la recherche, celles-ci ne peuvent pas reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez un animal modèle, qui s’apparente étroitement à l'homme. En raison du haut niveau de complexité des systèmes étudiés, de leur intégration complexe et des conséquences multiples de leurs dérèglements, il existe trop d'inconnues pour créer des modèles fiables générés par ordinateur. Cette expérience vise d’une part à valider un modèle in vitro de libération de la substance active. Ce modèle n’existe actuellement pas du fait des particularités vasculaires de la zone d’implantation. Les questions suivantes nécessitent encore un modèle animal. Comment se comporte la libération de la molécule candidate au cours du temps et plus particulièrement une fois que l’implant est inséré dans une structure jouxtant une des plus grosses veines de l’organisme ? Encore une fois, nous avons réalisé un modèle pharmacocinétique sur la base de nos expériences antérieures et nos partenaires développent un modèle in vitro de libération à l’horizon d’un an post implantation. Néanmoins, il est impératif d’avoir des données in vivo de façon à calibrer ce modèle in vitro. Par ailleurs, l’utilisation d’un modèle animal pour le volet chirurgical reste indispensable notamment pour répondre aux questions suivantes: Quelle est la meilleure matrice biodégradable et la forme optimale de l’implant pour permettre une implantation aisée en cœlioscopie. La matrice biodégradable de l’implant peut-elle supporter la procédure d’implantation et l’outil d’implantation est-il suffisant pour réduire les contraintes physiques sur l’implant de façon à ce que ce dernier reste intact ? Ces deux questions font l’objet de modélisations physiques à l’aide de l’outil Comsol. Il reste à valider les données de stress mécanique tant sur l’implant que sur les tissus biologiques qui vont accueillir l’implant - une phase qui ne peut être réalisée que sur un modèle chirurgical.
Réduction
Ce projet a été conçu pour utiliser un nombre minimum d'animaux, tout en garantissant l'obtention de résultats scientifiquement pertinents et l'atteinte des objectifs de l'étude. Néanmoins les questions posées, le caractère exploratoire des différents modèles d’implants et le risque de survenue d’événements néfastes sont tous difficilement modélisables et par voie de conséquence un calcul de puissance statistique classique n’est pas pertinent pour le type d’expérience projeté. L'objectif de réduction se basera donc sur l'expérience acquise au cours des projets antérieurs de même nature (implantation coelioscopique d'implants non biodégradable). Par ailleurs, il est tout à fait possible que rapidement les premiers essais conduisent à identifier une incompatibilité immédiate entre la nature de l'implant et la zone à traiter. Dans ce cas, le nombre d'animaux prévu pour ce sous groupe sera immédiatement réduit.
Raffinement
Des points limites sont fixés au préalable, et un suivi des animaux est effectué de facon très régulière. Les procédures chirurgicales et d’imagerie ont été conçues et validées par un vétérinaire en incluant une valence analgésique forte. Les méthodes d’imagerie sont les plus sophistiquées possible à ce jour indépendamment de l’espèce utilisée. La méthode chirurgicale est reconnue comme celle produisant les suites post-opératoires néfastes les plus limités possibles. Les possibilités d'affiner la procédure seront continuellement explorées et mises en oeuvre dans la mesure du possible pendant la durée de vie du projet. Des revues de littérature régulières seront effectuées pendant toute la durée du projet pour s'assurer que les procédures utilisées sont aussi raffinées que possible et restent conformes aux recommandations de bonnes pratiques.
Choix des espèces
Le porc s’impose comme un modèle privilégié pour les études en nutrition et neurosciences. En contexte nutritionnel délétère, le miniporc adulte développe une obésité similaire à la pathologie humaine. De plus, le capteur GLP-1r au niveau portal est altéré par l'obèsité. Le choix du modèle porcin se justifie également par rapport à l’utilisation d’une procédure d’implantation cœlioscopique qui sera celle utilisée chez l’homme et qui ne peut être effectuée techniquement sur un animal de plus petite taille. Pour les mêmes raisons de taille, la résolution spatiale obtenue par l’utilisation du modèle porcin, du fait des limitations techniques fait qu’un modèle de grande taille est recherché. Les animaux seront des adultes bien après que leur croissance ait atteint un plateau i.e. > 3 ans. Ceci se justifie par le fait que la condition visée par notre solution thérapeutique est celle du diabète de type 2 chez l'adulte et que ce dernier se développe préférentiellemetn après 45 ans
Étudier les possibles effets toxiques d’une mutation génétique dans une maladie rare, le syndrome d’Ondine, à l’aide de modèles de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Séparés de leur mère une heure pour la mesure cardio-respiratoire, biopsiés de la queue vers quatre jours de vie, gavés ou injectés, les souriceaux de ce projet subissent des procédures dont 2 544 sont classées sévères. 6 504 souris vont être utilisées au total, 132 en souffrance légère et 3 828 en souffrance modérée, toutes tuées en fin de procédure pour des prélèvements post-mortem. Les animaux portent une mutation reproduisant le syndrome d'Ondine, maladie rare qui interrompt la respiration pendant le sommeil, et servent d'appui aux tests de molécules agissant sur le repliement des protéines. Le porteur qualifie ses méthodes de mesure de non invasives, tout en indiquant qu'une mortalité est observable dans les études de toxicité et une détresse respiratoire caractéristique de ces modèles murins.
Objectifs
Le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare diagnostiquée à la naissance : le nouveau-né diminue sa respiration jusqu’à l'arrêter pendant le sommeil. Une caractéristique majeure est l'absence d’un réflexe respiratoire qu'est l’augmentation de la respiration lorsque l’on inhale du CO2. La maladie est provoquée par une mutation d’un gène important dans le contrôle des grandes fonctions vitales comme la respiration. Actuellement, il n'existe aucun traitement pharmacologique et le recours à une ventilation mécanique à vie pendant le sommeil est nécessaire. Ce gène est à l'orgine d'une protéine qui elle-ême est une cible d’une protéine spécifique impliquée dans le contrôle qualité des protéines. Des études sur des cellules humaines montrent que la mutation provoque un mauvais repliement de la protéine pouvant former des agrégats protéiques et/ou une interaction avec la protéine non mutée et perturber ainsi son activité. Partant de l’hypothèse d’une action toxique de la protéine mutée, nous testerons chez l'animal sur les modèles murins les molécules agissant sur la réparation et/ou la dégradation des protéines malformées. Les modèles murins à disposition reproduisent à la naissance les caractéristiques du syndrome d’Ondine. Les résultats contribueraient à affiner les pistes thérapeutiques permettant d’offrir une alternative aux contraintes de la ventilation mécanique.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un traitement pharmacologique réduirait le recours à la ventilation mécanique, l’unique prise en charge actuelle pour cette pathologie, et ainsi réduirait les risques dus à un arrêt accidentel pendant le sommeil ou à une ventilation inadaptée. Par exemple, dans le cas d'apnées obstructives, l’utilisation d’un traitement pharmacologique spécifique permettrait dans de nombreux cas d’éviter une trachéotomie (technique chirurgicale qui consiste à effectuer une ouverture au niveau de la trachée et à placer une canule pour permettre l'entrée d'air dans les poumons sans pasage par le nez ou par la bouche) et de réduire les risques d'infections. La technique est utilisée chez les jeunes enfants pour lesquels la ventilation non invasive est impossible. Les retombées de ce projet sont ainsi directement utiles en termes de prévention et d’implications thérapeutiques chez le patient. Enfin, pour des médicaments à visée pédiatrique, l’agence européenne du médicament recommande des tests sur des rongeurs juvéniles pour garantir l’innocuité et l’efficacité du produit sur la population cible.
Procédures
1/ Séparation maternelle d'une heure pour la mesure cadio-respiratoire 2/ La biopsie de queue d'une durée de 3 secondes pour l'identification du statut génétique est réalisée vers quatre jours de vie (souriceau sans poils) engendre une douleur légère de courte durée. 3/ Gavage (moins de 2 minutes) et/ou injection (moins d'une minute) de produit en administration unique pouvant générer une gêne et/ou une douleur brève sur le point d'injection. Les sourieaux retrouvent une vitalité (coloration rose et mobilité) dans les 1-2 minutes de l'intervention (biopsie de queue, administration de produit), signe de récupération.
Impact sur les animaux
1/ Séparation maternelle (une heure) pour la mesure cardio-respiratoire susceptible de générer du stress 2/ une mortalité est observable dans les études de toxicité 3/ La biopsie de queue (3 secondes) pour l'identification du statut génétique est réalisée vers quatre jours de vie (souriceau sans poils) engendrant une douleur légère de courte durée.4/détresse respiratoire caractéristique des modèles murins 6/ Le gavage et/ou l'injection de produit peuvent engendrer une possible gêne et une brève douleur sur le site d'injection de l'ordre de 1-2 minutes à la réaction du souriceau.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Les observations moléculaires ou histologiques se feront sur des prélèvements postmortem en fin de protocole.
Remplacement
Les avancées obtenues par les recherches sur les cultures cellulaires permettent d'éclaircir les mécanimes et les conséquences de la mutation à l'échelle moléculaire, cellulaire. Toutefois, une validation sur des animaux en développment est nécessaire pour comprendre la maladie et les conséquences fonctionnelles sur un organisme entier. De plus, une étude préclinique sur des animaux en développement est un préalable recommandé par l’Agence européenne du médicament pour les stratégies thérapeutiques pharmacologiques notamment pédiatrique, l’utilisation de l’animal ne peut être évitée. Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et de la mortalité à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Les études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir une puissance statistique satisfaisante. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses. Par ailleurs, nos méthodes de mesures étant non invasives, nous pouvons suivre les animaux dans le temps (étude longitudinale) ce qui réduit l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Pendant les mesures, la surveillance est constante. Entre les mesures, la surveillance est biquotidienne pour le suivi de la croissance pondérale. De plus, l’équipe de l’animalerie effectue une surveillance réglementaire quotidienne des espaces d'hébergement et de toutes les cages. Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux sont décrits et comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau et le comportement de la mère envers sa portée. Pour les mesures, nous utilisons des techniques non invasives et contrôlées (sans contrainte physique, sans anesthésie, durée minimale de mesure, température constante dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. La durée maximale de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure. Les cages avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle pour l'étude du développement du cerveau humain. Plus largement, la souris transgénique contribue à la compréhension d'une maladie génétique. Dans le cas du syndrome d'Ondine, les modèles animaux existants sont murins. C’est une maladie qui se manifeste dès la naissance. Nous avons des outils adaptés pouvant prendre en charge les modèles murins dès la naissance permettant ainsi de tester et d’évaluer des stratégies thérapeutiques. De plus, le recours aux modèles animaux en développement constitue une des recommandations de l'Agence Européenne du médicament pour évaluer les médicaments à visée pédiatrique. Souriceaux étudiés de la naissance à 4 jours de vie.