Procédures sévères

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les souris porteuses de la mutation de la maladie de Niemann-Pick de type C1 perdent du poids et leur coordination et meurent en moyenne à 125 jours. Selon la procédure, elles reçoivent, comme des souris témoins, dès dix jours après la naissance des injections sous la peau, puis jusqu'à douze semaines d'injections dans le ventre ou de gavages quotidiens. Les tests comportementaux portent sur l'activité locomotrice et l'anxiété, la marche, la coordination motrice et l'inhibition de la préimpulsion, avec des prises de sang sous anesthésie, dont une dans le cœur. Le traitement des patients reste l'objectif final d'un développement clinique encore à mener. Le porteur affirme que l'étude de candidats médicaments sur des maladies neurodégénératives "ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux", tout en précisant que la molécule a été choisie "sur un modèle cellulaire".

Objectifs

Notre projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de maladie de Niemann-Pick de type C1 (NPC1), qui récapitule le tableau clinique de la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet nous permettra d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine. À plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir la preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de NPC1.

Procédures

Injections sous-cutanées (3/animal, 1 x par semaine, 1 min par injection) puis injections intrapéritonéales (1 x par semaine pendant 12 semaines, 1 min par injection), prélèvements sanguins (intracardiaque, 5 min par prélèvement sous anesthésie générale ; 3 fois à la veine temporale sous anesthésie gazeuse, 3 minutes par prélèvement). Tests comportementaux : Observations cliniques et évaluation des fonctions sensori-motrices 15 minutes chaque semaine (7 à 16 semaines d'âge), mesure de l'activité locomotrice et anxiété 5 fois 30 min, mesure des troubles de la marche (5 sessions de 3 jours, 5 minutes par jour), test de coordination motrice 4 fois 20 minutes, mesure de l'inhibition de la préimpulsion 3 fois 45 min. Amendement 1 : injections intrapéritonéales : 1 x par semaine pendant 6 semaines pour l'étude précose ou 12 semaines pour l'étude tardive, 1 min par injection. Amendement 2: injections 2 x par semaine ou gavage 1 fois par jour pendant 6 semaines pour l'étude précose ou 12 semaines pour l'étude tardive, 1 min par injection ou gavage.

Impact sur les animaux

Les souris mutés présentent un phénotype dommageable ; ce modèle animal présente une perte de poids, une diminution de la coordination motrice, une mortalité prématurée avec une durée de vie moyenne de 125 jours. Pour la première procédure, ces animaux seront mis à mort suite à une anesthésie (nuisance légère). Pour la procédure deuxième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées indusiant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines). Pour la troisième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 12 semaines induisant une nuisance modérée. Les souris subiront 3 prélèvements sanguins d’environ 3 minutes induisant une nuisance modérée. Amendement 1 : Pour l'étude précose, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées induisant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 6 semaines induisant une nuisance modérée. Amendement 2: les animaux subiront soit 2 injections intrapéritonéales par semaine soit un gavage chaque jour pendant 6 ou 12 semaines induisant une nuisance moderée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem, excepté pour l'étude pilote ou seul le sang sera prélevé.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que les maladies neurodégénératives ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexes à l'œuvre dans la mise en place d'une neurodégénérescence fatale, comme dans la maladie de Niemann-Pick de type C1. Cependant, le choix de la molécule optimale testée dans cette étude a préalablement été réalisé sur un modèle cellulaire.

Réduction

Ce projet implique des souris homozygotes présentant la mutation induisant la maladie de NPC1 et des souris non mutés qui seront considérées comme des contrôles ne présentant pas la maladie de NPC1. Dans l’étude précoce, les groupes expérimentaux seront constitués comme suit : 5 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 5 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la caractérisation préliminaire du modèle dans le laboratoire. Dix souris homozygotes mutées traitées avec le composé, 10 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 10 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la vérification des caractéristiques décrites dans le papier princeps. Le nombre de souris défini dans l’étude précoce repose sur les conditions nécessaires optimales à l’analyse des biomarqueurs. Il intègre à la fois la taille des effets attendus (diminution de 80 % de la protéine NPC1 chez les souris mutés, effet du traitement 40-45 % espéré) et la variabilité technique connue (30 %). À chaque étape, la variabilité réelle obtenue sera calculée. Dans le cas où l’étude précoce mettrait en évidence une « surestimation » par rapport à la variabilité technique théorique, une réduction du nombre d’animaux lors de l’étude d’efficacité tardive sera envisagée. Pour l’étude d’efficacité tardive afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons décidé de ne pas réaliser de groupe contrôle non muté. Le groupe muté non traité permet d’évaluer les caractéristiques liées à la pathologie. Les résultats du groupe muté traité seront préférentiellement rapportés aux souris du groupe muté (point de départ de la pathologie). En cas de « situation optimale », les souris mutés sous traitement auront des niveaux de protéine NPC1 équivalents aux souris WT. Le choix de 16 animaux par groupe a été défini en fonction de la haute variabilité des tests comportementaux.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une étude toxicologique préliminaire a été réalisée afin de déterminer la dose maximale non toxique de la molécule à administrer aux animaux. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant, pouvant entraîner l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, de boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Si un animal présente un trouble locomoteur, de la nourriture mouillée et un biberon à longue tétine seront ajoutés à la cage. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique.

Choix des espèces

La souris est l’animal de choix pour la création et l’étude de modèles avec une perte de fonction d’un gène (mutation). De plus, la souris est un modèle animal adapté à l’étude de la locomotion, phénotype d’une dégénérescence neuronale. Enfin, il n’existe pas de modèles in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier un phénotype locomoteur et/ou la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. Le traitement avec la molécule médicament débutera à 10 jours post-natal et sera donné 1 fois par semaine. Dans la littérature, l'ensemble des études ayant testé l'efficacité de notre molécule dans différentes pathologies ont commencé le traitement avant le sevrage des animaux, c'est pourquoi nous allons suivre ce même schéma expérimental.

Soumis à un rétrécissement chirurgical de l'artère pulmonaire destiné à provoquer une insuffisance cardiaque droite, 400 rats vont tous être tués pour analyse du cœur et des poumons. 320 d'entre eux subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 80 autres un niveau modéré. Chaque animal passe une échocardiographie sous anesthésie par semaine pendant quatre ou huit semaines, puis un prélèvement sanguin à la queue et un cathétérisme cardiaque. Le porteur annonce que le projet permettra "à court terme" de lancer des essais cliniques chez les patients atteints d'hypertension pulmonaire, quand l'essoufflement et la fatigue infligés aux rats sont donnés pour la conséquence attendue du protocole.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque droite est la principale cause décès de patients atteints d'hypertension pulmonaire (représentant 1 % de la population globale). Cependant, aucun traitement n'existe pour réduire l'apparition de l'insuffisance cardiaque droite. Nos résultats suggèrent qu'une protéine d'un canal calcique serait impliquée dans le développement de la dysfonction ventriculaire droite aussi bien chez l'homme que chez le rat. L'objectif de cette étude est donc de déterminer si l’inhibition de ce canal calcique par un inhibiteur spécifique, in vivo chez le rat, est bénéfique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettrait de valider l'intérêt de notre cible thérapeutique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite. Les patients atteints de cette pathologie n'ayant actuellement aucun traitement spécifique, ce projet représenterait une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades. A court, terme ce projet permettra l'initiation d'essais cliniques ciblant Orai1 chez les patients atteints d'hypertension pulmonaire.

Procédures

Le début de protocole commence par l'induction de l'insuffisance ventriculaire droite, qui sera réalisée par chirurgie sous anesthésie générale et analgésie (25 min par animal). Tous les animaux subiront des échocardiographies, une fois par semaine pendant 4 ou 8 semaines selon le protocole. Ces échocardiographies seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse(20 min par animal). A la fin des procédures, tous les animaux subiront un prélèvements sanguins à la veine caudale ainsi qu'un cathétérisme cardiaque sous anesthésie générale (25 min par animal, J28 ou J56).

Impact sur les animaux

Comme décris précédemment, la chirurgie de Banding de l'artère pulmonaire conduira au développement d'une insuffisance cardiaque droite. Les effets secondaires importants et les atteintes cardiaques (essoufflement à l'effort, fatigue) conséquences de la mise en place de l'insuffisance cardiaque droite.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux à la fin des procédures pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.

Remplacement

Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'insuffisance ventriculaire droite qui est un processus complexe.

Réduction

Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque est réalisé à la fin de l'expérimentation afin de collecter un maximum de données. Le nombre total de rats utilisés sera de 400 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de déterminer le plus précisément possible le nombre nécessaire et suffisant d'animaux, nous avons utilisé un test statistique adéquat.

Raffinement

Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. Les animaux seront au nombre de 2 par cages. De l'enrichissement, comme du coton, un morceau de bois ou encore un tunel en carton seront ajoutés dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement (évaluation de la présence de points limites) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaliers surveilleront quotidiennement l'apparition de points limites, notamment la perte de poids. L'eau ainsi que la nourriture sera en illimité pour les animaux. À la fin des expérimentations, les animaux seront sacrifiés pour prélèvement d’organes.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant les rats pour l’étude de l'hypertension pulmonaire. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler sur ce modèle. De plus, dans un but d'étude préclinique il est crucial de pouvoir tester nos molécules pharmacologiques sur l'animal entier afin de déterminer la présence d'effets secondaires non désirés. Les rats utilisés seront des jeunes adultes (8 semaines, 200g à 250g). En effet, à ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’insuffisance ventriculaire droite est plus rapide. De plus, chez l'Homme, l'hypertension pulmonaire se développe chez les jeunes adultes.

192 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 160 d'entre elles et modéré pour 32. La circulation sanguine de leurs deux reins est interrompue pendant vingt-deux minutes, ou celle du rein gauche pendant vingt-cinq minutes avec ablation du rein droit, sous anesthésie et analgésie. Le porteur décrit une insuffisance rénale aiguë qui altère l'état général et provoque une prostration liée à une importante fatigue, ainsi que des douleurs chirurgicales que l'analgésie ne supprime pas complètement. Seuls des mâles sont utilisés, le rein des femelles résistant mieux au modèle, et le porteur conclut que ces nuisances ne peuvent pas être évitées parce que l'induction d'une insuffisance rénale est "absolument indispensable" au projet.

Objectifs

Environ un patient sur trois admis dans une unité de soins intensifs va développer une insuffisance rénale aigüe définie par une diminution brutale de la fonction rénale. Il est désormais bien établi que même un épisode peu sévère d’insuffisance rénale aigüe augmente le risque de décès, indépendamment de toute autre comorbidité. En outre, il est aussi démontré que l'insuffisance rénale aigüe, y compris chez les enfants, est un facteur de risque majeur pour le développement d'une insuffisance rénale chronique en l'espace de quelques semaines ou de quelques mois. Malheureusement, il n'existe actuellement aucun traitement médical efficace. Le traitement de l’insuffisance rénale constitue donc un objectif majeur de santé publique. Nous espérons ici démontrer le rôle bénéfique joué par le récepteur d’un dérivé de la vitamine A dans la récupération rénale après une agression rénale. Dans la continuité d’un précédent projet en cours de publication, qui se proposait d'étudier les effets d'un stimulateur de la voie de la vitamine A, nous souhaitons ici étudier le rôle de l’expression du récepteur dans la récupération rénale après une agression rénale, à l'aide d'une lignée de souris transgéniques. Ces souris présenteront une délétion du gène de manière inductible dans le temps et localisée spécifiquement dans des cellules rénales d’intérêt. Notre projet a deux objectifs : 1- Etudier le phénotype rénal basal des souris transgéniques dont le gène du récepteur a été invalidé spécifiquement dans certaines cellules. 2- Etudier le phénotype rénal des souris transgéniques dans deux modèles d'insuffisance rénale induites par un clampage de l’artère rénale en conditions aigues et chroniques.

Bénéfices attendus

L'insuffisance rénale chronique est un problème majeur de santé publique, non seulement en raison du risque accru de dialyse et de transplantation, mais aussi parce que cette maladie est associée à une morbidité et une mortalité très élevées, même avant le stade de l'insuffisance rénale terminale. En effet, le déclin de la fonction rénale est associé à des augmentations majeures de la mortalité cardiovasculaire. L'insuffisance rénale aiguë constitue un véritable défi dans les unités de soins intensifs, car il s'agit d'une affection très courante, associée à une importante mortalité et pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement spécifique. Environ un patient sur trois admis dans une unité de soins intensifs va développer une insuffisance rénale aigüe définie par une diminution brutale de la fonction rénale. Il est désormais bien établi que même un épisode peu sévère d’insuffisance rénale augmente le risque de décès, indépendamment de toute comorbidité. En outre, il est aussi démontré que l'insuffisance rénale aigue, y compris chez les enfants, est un facteur de risque majeur pour le développement d'une insuffisance rénale chronique en l'espace de quelques semaines ou de quelques mois. Nous avons pu identifier une association, chez l’homme, entre l’expression d’un récepteur de la voie de la vitamine A et la récupération de la fonction rénale. Nous souhaitons ici étudier le rôle causal de l’expression de ce gène dans la récupération rénale après une agression rénale. Ce projet, en cas de résultats encourageants, pourraient déboucher sur un essai clinique chez l’homme, en particulier chez des patients sévères admis en unité de soins intensifs et souffrant d'insuffisance rénale aiguë. Il est donc d’une importance cruciale.

Procédures

(1) Tous les animaux recevront un traitement antibiotique dans l’eau de boisson pour induire la modification génétique pendant deux semaines. (2) Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 22 minutes sous analgésie et anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes. (3) Une autre partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine le rein gauche pendant 25 min (durée totale 30 min) et à exciser le rein droit (durée totale de 10 min). Cette chirurgie se fait en deux temps sous analgésie et anesthésie. (4) Toutes les souris du projet seront soumises à la mesure de leur fonction rénale par une nouvelle technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intra-veineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que 2 minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (5) Prélèvement du sang sous anesthésie (30 secondes environ), sur un plateau thermostaté ; suivi de l'euthanasie par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

L'induction d'une insuffisance rénale aigue entraine une altération de l'état général et une prostration liée à une importante fatigue. La chirurgie peut provoquer des douleurs malgré une prise en charge optimale de l'analgésie : (1) douleur provoquée par la procédure chirurgicale nécessaire pour l’ablation du rein et la pose des clamps vasculaires (injections analgésie et anesthésie, ouverture des plans cutané et musculaire, sutures); (2) complications liées à l'anesthésie chimique pour la chirurgie et gazeuse pour la mesure de la fonction rénale (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire , stress thermique) (3)altération de l'état général : perte de poids, déshydratation ; (4) stress induit par les manipulations quotidiennes pour les pesées (5) Douleurs modérées induites par les injections intraveineuses lors de la mesure de la fonction rénale. Ces nuisances ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de la mort.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs d’évaluation dans ce projet est l'amélioration de la fonction rénale.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité interindividuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 192 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées : les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée dans une animalerie exempte d'organismes spécifiques et opportunistes . La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux directement dans la cage, en plus des croquettes habituelles. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures dans une couveuse pour éviter d'endommager les petites caméras destinées à mesurer la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière pendant toute la durée du protocole. Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, une paralysie des membres postérieurs, un saignement de nez, la prostration, l'hérissement du pelage, une surinfection liée à la chirurgie. Il existe aussi un risque de saignement causé par les injections qui sera limité par l’usage d’aiguille très fine. Il peut survenir aussi des complications liées à l'anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique) mais l’usage d’un plateau chauffant pourra limiter ces complications.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Si les résultats de cette étude s’avèrent positifs, il sera intéressant de tester l’implication de cette voie de signalisation chez des femelles dans des modèles expérimentaux plus adaptés. En effet, le rein des femelles est plus résistant que le rein des mâles au modèle expérimental choisi et cela impliquerait de refaire toutes les mises au point pour avoir des lésions équivalentes. Concernant le stade de développement : Tous les animaux sont des souris mâles, âgés de 8 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu adipeux autour du pédicule vasculaire rénal, qui peut gêner l'interruption de la circulation.

Porteuses d'une mutation qui reproduit la sclérose latérale amyotrophique humaine, ces souris développent une paralysie progressive des pattes arrière qui les empêche d'accéder seules à l'eau et à la nourriture. Elles sont 693 à être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 376 d'entre elles et sévère pour 317, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit des injections quotidiennes pendant quinze ou trente jours, subit un test de nage tous les dix jours et un prélèvement de queue durant sa deuxième semaine de vie. Le point limite retenu est le moment où l'animal ne parvient plus à se retourner sur le flanc, la mise à mort intervenant alors, avec prélèvement des organes chez les souris jugées d'intérêt.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), aussi appelée maladie de Charcot, est une maladie qui détruit progressivement les cellules nerveuses responsables des mouvements. En général, elle entraîne le décès des patients en 3 à 5 ans après le diagnostic. Malgré de nombreuses recherches et des modèles expérimentaux chez la souris, la cause exacte de cette maladie reste inconnue. L’ATP, une molécule qui fournit de l’énergie aux cellules, joue aussi un rôle dans la communication entre les cellules nerveuses en interagissant avec des protéines specifiques appelées récepteurs. Nous avons découvert que ces récepteurs influencent le développement de la SLA et participent aux réactions inflammatoires dans la moelle épinière. Notre projet consiste à tester différentes molécules capables de modifier ces récepteurs spécifiques et à comparer leurs effets avec ceux de médicaments anti-inflammatoires déjà connus, en utilisant un modèle de SLA chez la souris. Nous observerons si ces traitements ralentissent l’apparition des symptômes et protègent les cellules nerveuses dans la moelle épinière.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de savoir si la manipulation des récepteurs spécifiques et de l’inflammation au cours de la SLA permet d’en ralentir l’evolution. Ce projet pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer la vie des patients atteints de SLA.

Procédures

Les animaux recevront quoitidiennement des injections de NaCl ou des molécules d’interet réalisées en quelques secondes pendant 15 ou 30 jours en fonction du groupe experimental dans lequel ils seront distribués. Les souris seront soumises à un test de nage tous les 10 jours qui durera autour de cinq/six minutes pour chaque animal. Ils subiront un prelevement de queue (1-2 mm) réalisé en quelques secondes lors de leur seconde semaine postnatale.

Impact sur les animaux

La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Les animaux vont présenter une paralysie progressive de leurs pattes arrière qui necessitera des conditions d’élevage particulieres afin de lui faciliter l’accès à l’eau et à la nourriture. Lorsqu’ils ne seront plus capables de se retourner facilement sur leur flanc, les animaux seront euthanasiés. Lors des preleveemnt de queue pour le génotypage ainsi que lors des injections, une douleur légère et de courte durée pourra être ressentie par l’animal.

Devenir

La SLA est une maladie mortelle dans 100% des cas. Il est important d'euthanasier les animaux avant toute souffrance. Un prelevement d’organes sera réalisé chez les animaux d’interet.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur l’évolution de la sclérose latérale amyotrophique dans un modèle animal suite à la modification d’un gène dans une population cellulaire donnée.

Réduction

L’ensemble de ce projet nécessite l’utilisation de 693 souris mâles et femelles. Afin de limiter le nombre d’animaux, chaque animal d’interet sera utilisé pour les études comportementales mais aussi pour les prélèvements post-mortem. Cela nous permettra de réduire au maximum le nombre de souris utilisées tout en conservant une significativité scientifique statistique (hétérogénéité interindividuelle). Ainsi, le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas 12 animaux. Nous savons sur la base de nos travaux antérieurs sur la sclérose latérale amyotrophique que des groupes de 12 animaux sont nécessaires pour une bonne puissance statistique aussi bien pour les approches comportementales qu’histologiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié). Les animaux vont présenter une paralysie progressive de leurs pattes arrière qui necessitera des conditions d’élevage particulieres afin de leur faciliter l’accès à l’eau et à la nourriture. Des points limites précis ont été définis pour les protocoles mis en oeuvre dans cette étude et seront scrupuleusement appliqués.

Choix des espèces

La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. Un modèle murin de la sclérose latérale amyotrophique a été developpé afin de mimer la pathologie humaine et de servir de modéle preclinique afin de trouver les mecanismes cellulaires à l’origine de la SLA et potentiellement un traitement pour cette pathologie aujourd’hui encore incurable. Les animaux seront utiliés à l’âge adulte au debut du processus de degenerescence des neurones et avant l’apparition des symptomes moteurs.

Comprendre pourquoi un médicament commercialisé depuis 2012 provoque des cancers de la peau : 1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 816 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Des molécules chimiques sont appliquées sur leur dos deux fois par semaine de la quatrième à la quarantième semaine pour faire pousser des tumeurs cutanées, d'autres reçoivent des cellules cancéreuses injectées dans la veine de la queue ou sous la peau. Le porteur décrit des tumeurs de volume important, ulcérées et infectées, une perte de poids, un arrêt du toilettage, ainsi que des lésions digestives liées aux gavages répétés. Il qualifie l'application des molécules cancérigènes de procédure "rapide et indolore" ne nécessitant pas d'anesthésie.

Objectifs

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies caractérisées par une production excessive de cellules du sang due à des anomalies génétiques entraînant la prolifération des cellules du sang. Depuis 2012, ces pathologies peuvent être traitées par un médicament qui bloque cette voie moléculaire. Ce traitement améliore les symptômes des patients de manière importante mais son utilisation à long terme présente un risque de cancer secondaire. En effet, il a été montré que ce médicament était responsable du développement de carcinomes cutanés épidermoïdes (CCE, type de cancer de la peau) à la fois chez les patients et aussi dans un modèle de souris. Le mécanisme de survenue de ces cancers est dû à l’activation d’une autre voie moléculaire de prolifération cutanée. De manière originale, ce traitement est à la fois capable d’induire des cancers cutanés mais aussi, à l’opposé, d’augmenter l’efficacité des traitements qui cible le système immunitaire (moyen de défense contre les infections et les cancers). Ainsi, les objectifs du projet actuel sont : 1) De mieux comprendre le mécanisme cancéreux responsable des CCE à ce traitement pour proposer des traitements préventifs et curatifs à l’ensemble des patients traités. 2) D’évaluer si les effets anti-tumoraux de ce traitement observé dans les CCE peuvent être étendus à d’autres types de cancer.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, le médicament que nous étudions est utilisé pour traiter majoritairement les patients atteints de NMP mais aussi comme traitement d’autres maladies. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes responsables de l’induction de CCE sous ce traitement pourrait être bénéfique pour l’ensemble de ces patients et pourrait déboucher sur la mise en place d’essais cliniques et aboutir à la publication de nouvelles recommandations préventives et curatives dans les CCE induits par ce traitement.

Procédures

L’induction de la maladie sera faite par injection des cellules cancéreuses dans la veine de la queue (cancer du sang) ou sous la peau (mélanome). Cela sera fait sur souris éveillée et dure moins de 5 min. Pour induire les CCE, nous utiliserons le modèle déjà bien décrit dans la littérature scientifique. Les souris seront traitées avec des molécules chimiques (application à l'aide d'une pipette sur la peau du dos à jour 0 et jour 18 pour l’une des molécules et deux fois par semaine de la semaine 4 à la semaine 40 pour l'autre molécule) afin d’induire des lésions pré-cancéreuses et des tumeurs cutanées. Cette procédure est rapide (< 2 min par souris) et indolore ; elle ne nécessite pas d’anesthésie. Pour le modèle de cancer du sang, des prélèvements sanguins seront effectués sur souris éveillées au niveau de la veine de la joue (durée : 2 min). Une fois les différentes maladies induites, les traitements seront administrés par gavage oral ou par injection dans l’abdomen. Le gavage oral s’effectuera à l‘aide de sonde en plastique sur souris éveillées (1 min par souris). Les injections dans l’abdomen s’effectueront également sur souris éveillées (< 1 min par souris). Le suivi du développement des tumeurs de la peau (CCE ou mélanome) sera réalisé par mesure de la taille à l’aide d’une règle spéciale (pied à coulisse) sur souris éveillée (durée : 1 min).

Impact sur les animaux

Pour les modèles de cancer de la peau induit par application de molécules chimiques ou par injection de cellules cancéreuses, les effets indésirables pouvant être observés sont une perte de poids, une diminution de l’activité de base de l’animal (alimentation, locomotion, toilettage) et une tumeur de volume important, ulcérée, infectée. Pour le modèle murin de cancer du sang en dehors des complications citées précédemment liées à la CCE, les effets indésirables pouvant être observés sont des risques de formation de caillots de sang et/ou de saignements et le développement du cancer. L'administration des traitements (gavage, injection dans l'abdomen.) peuvent induire un stress (contension) et des lésions (tube digestif, au niveau de l'abdomen) en raison de leur répétition dans le temps.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure. Les tumeurs et différents organes du système de défense de l'organisme (rate, moelle osseuse) seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Les modèles de culture en trois dimensions permettant de mimer à la fois les tumeurs solides et les cancers hématologiques in vitro (sans utilisation d'animaux) ne permettent pas de récapituler toute la complexité des interactions entre les différents types de cellules (normales, cancéreuses) observées aux cours du développement de ces pathologies. Ils ne permettent notamment pas d’explorer l’effet des thérapies (distribution dans l'organisme), c’est pourquoi nous aurons recours à des modèles animaux déjà validés dans la littérature scientifique pour valider nos hypothèses.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum. Nous avons pour cela utilisé des logiciels de calcul statistique.

Raffinement

Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect du bien-être animal. En particulier, les animaux sont hébergés dans une structure adaptée avec un enrichissement des cages (papier kraft pour la fabrication de nid et buchette de bois à ronger). La période d’acclimatation avant manipulation sera respectée. Le suivi des animaux sera évalué de manière visuelle de façon quotidienne et une évaluation clinique à l'aide d'une grille de score prenant en compte l’apparence générale de l’animal, son comportement, ses lésions et la taille/progression de la tumeur sera faite deux fois par semaine. En cas de signe de souffrance, un anti-douleur sera administré et une nouvelle évaluation clinique sera faite le lendemain Si les symptômes persistent, les animaux seront alors immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans ce projet, car de nombreuses publications scientifiques ont décrit le protocole expérimentale pour le CCE. De plus les pathologies développées sont très proches de celles observées chez l'Homme et les traitements utilisés chez les patients produisent les mêmes effets sur la souris. Nous utiliserons des souris d'âge adulte car les maladies induites dans le cadre de ce projet se développent chez l'Homme adulte.

Irradiées, puis greffées avec des cellules souches humaines, puis opérées trente minutes pour recevoir un fragment de peau humaine dans le dos, 1 263 souris portent ensuite des bandages pendant sept jours. Elles sont enfin infectées par des méningocoques en injection intraveineuse, ce qui déclenche une septicémie : 960 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 303 autres un niveau modéré. Profondément immunodéficientes par construction, elles sont décrites par le porteur comme "très sensibles aux infections", et l'irradiation peut provoquer des tumeurs à long terme. Toutes seront tuées, aucune ne pouvant être réutilisée, replacée ni adoptée après avoir reçu des cellules humaines et une infection.

Objectifs

L’étude in-vivo des infections invasives à méningocoques nécessite un modèle murin basé sur la greffe d’un morceau de peau humaine sur le dos de souris du fait de la spécificité de la bactérie pour les vaisseaux humains. Lors de la prise du greffon, les micro-vaisseaux humains contenus dans la peau humaine vont se connecter au réseau vasculaire murin. Ainsi, lorsque l’on injecte des bactéries aux animaux, celles-ci vont se fixer sur la paroi des vaisseaux humains du greffon, se multiplier et induire des lésions vasculaires importantes comme dans la pathologie humaine. Toutefois, une limite majeure de ce modèle est qu’il utilise des souris immunodéficientes, qui sont donc incapable de reproduire la réponse immunitaire complète qui se met en place chez l’Homme. L’objectif de ce projet est donc de développer un modèle hybride combinant l’humanisation du système immunitaire et la présence d’un greffon de peau humaine. Des modèles murins disposant d’un système immunitaire constitué de cellules humaines existent déjà. Leur combinaison avec le modèle de greffe de peau humaine permettrait d’améliorer la compréhension de la pathologie infectieuse et des mécanismes qu’elle implique. De plus, ce modèle pourra être utilisé par la suite pour d’autres applications dans lesquelles la communication entre la peau ou les vaisseaux sanguins humains et le système immunitaire et essentiels. On peut par exemple penser à des maladies auto-immunes cutanées.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à obtenir un nouveau modèle animal, qui permettra de caractériser et comprendre les mécanismes d'infection bactérienne ayant une spécificité d’espèce pour l’humain. Il permettra aussi l’étude du rôle du système immunitaire dans ces pathologies et de manière général au niveau de la peau. En effet, la réponse immunitaire lors d’une infection bactérienne joue un rôle dans le contrôle de la progression de la pathologie. Comprendre ces mécanismes d’action constitue une étape essentielle dans l’amélioration de la prise en charge et le traitement des patients au niveau clinique. De plus la présence du système immunitaire humain permettra le développement et l’évaluation de vaccins dans un contexte très proche de la pathologie humaine. Les modèles animaux reproduisant fidèlement la situation humaine sont rares. Ce nouveau et unique modèle murin permettra également de réduire l’utilisation de modèle primate non humain pour l’étude de ces pathologies humaines.

Procédures

Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes: - irradiation (durée environ 5min, une fois par vie) - prélèvements sanguins sur souris vigile en contention à la main (durée : quelques secondes, fréquence d’un prélèvement tous les 15 jours au maximum) - Injection de cellules (quelques secondes, une fois par vie) - anesthésie chimique et greffe de peau sur le dos par chirurgie (environ 30min, une fois par vie) - port de bandages en période post opératoire (pendant 7 jours, une fois par vie) - infection par des bactérie par injection intraveineuse sur souris vigile dans un tube de contention (infection de 3, 6 ou 16h, une fois par vie)

Impact sur les animaux

Le degré́ de gravité des procédures est considéré́ comme modéré (injections et chirurgie) ou sévère (infection bactérienne systémique). Ainsi, plusieurs effets indésirables sont attendus lors des procédures expérimentales présentes dans ce projet : • Du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. • L’irradiation des animaux peut causer de potentiels effets néfastes à long terme tels que le développement de tumeurs. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). • La piqure de l’aiguille lors des injections pourra entrainer une douleur faible et de courte durée (quelques secondes) • L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. Cette douleur sera contrôlée par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure chirurgicale. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection, les animaux infectés développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (>16h post-infection).

Devenir

A la fin de ces procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort pour l’analyse et la caractérisation de la physiopathologie et la réponse immunitaire induite. Tous les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent être ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés : ils seront greffés avec des cellules humaines, voire infectés.

Remplacement

Ce projet vise à l’établissement d’un modèle expérimental récapitulant l’ensemble des mécanismes induits par une inflammation (bactérienne, virale, auto-immune) au niveau de la peau ou des vaisseaux sanguins humains. Si des études sur des cellules en culture ou des organes sur puce permettent d’obtenir des informations sur les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie, il est encore impossible de reproduire in vitro la complexité de l’organisme et le rôle du système immunitaire. Un modèle murin humanisé peut fournir ce niveau d’information et représente donc un modèle de choix. Par ailleurs, il permet une alternative aux modèles historiques d’études des infections humaines que sont les primates non-humains. En proposant comme alternative la souris humanisée pour le système immunitaire et la peau, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. La répartition des animaux sera faite grâce à un outil statistique afin de créer des groupes expérimentaux homogènes. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Notre expérience sur les procédures mises en œuvre nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs du projet. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle.

Raffinement

L’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité́ des procédures permet de réduire le stress et la souffrance éventuelle des animaux. De façon générale, les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, une alimentation hydratante et un suivi régulier des animaux sont inclus dans nos protocoles. De manière plus spécifique concernant la procédure de greffe de peau humaine, les animaux sont prémédiqués avec l’injection d’antalgiques. La chirurgie est réalisée sur un tapis chauffant (37°C), sur des animaux anesthésiés. Avant d’être placés en cage de réveil (cage propre placée sous une lampe chauffante), les animaux greffés sont réhydratés. Un gel de réhydratation est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie en supplémentant les gels de réhydratation avec une solution buvable. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité, perte d’embonpoint…), les animaux sont mis à mort. Durant les 3 premiers jours suivant la chirurgie, une évaluation quotidienne des animaux permettra de détecter des signes éventuels de souffrance et de vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Dans le cas des animaux infectés, les cages contiennent systématiquement un dôme, du coton, du gel de réhydratation et la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée et leur cout est relativement faible. Leur système vasculaire est proche du système vasculaire humain, ce qui permet l’interconnexion des deux réseaux lors de la greffe de peau. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre la génération de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe immunitaire humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire sont générées par injection de cellules souches humaines dans des souriceaux nouveau-nés (

4 215 rongeurs, 3 510 souris et 705 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, et chacun subit jusqu'à 28 prises de sang, certains aussi jusqu'à 51 séances d'imagerie sous anesthésie et 56 injections sans anesthésie. Tous reçoivent une greffe de tumeur, dans le cerveau lors d'une chirurgie de 30 minutes ou sous la peau, et la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques ou des difficultés à se déplacer. Selon les traitements testés s'ajoutent jusqu'à huit ouvertures de la barrière hémato-encéphalique d'une heure au plus, une ablation de la tumeur ou une radiothérapie, et tous sont tués à un temps défini ou dès qu'ils atteignent les points limites, pour des prélèvements après la mort. Le porteur présente les rongeurs greffés comme "en quelque sorte des avatars de patients", et renvoie à des études cliniques ultérieures l'évaluation chez l'humain des traitements qu'il espère identifier.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.

Procédures

Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes, 51x maximum, animal anesthésié). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).

Impact sur les animaux

La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.

Devenir

Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.

Remplacement

Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.

Réduction

4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.

Raffinement

Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.

Choix des espèces

Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.