Procédures sévères
Etude pilote : Mise en place d’un modèle d’induction de la senescence in vivo
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Trois injections d'un agent anticancéreux en six jours suffisent à provoquer chez la souris une sénescence et un vieillissement prématuré, avec cardiotoxicité, hématotoxicité et hépatotoxicité attendues. 120 souris âgées de huit à douze semaines vont être utilisées dans cette étude pilote, 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 60 un niveau sévère. Toutes sont tuées à des moments définis pour prélever foie, cœur, poumon, muscle, cerveau et rein. Le porteur présente ce vieillissement induit chimiquement comme "privilégié par les chercheurs en raison de sa source pratique, du temps de modélisation court et de l'effet de vieillissement relativement contrôlable", la recherche sur le vieillissement naturel étant selon lui "longue, laborieuse et coûteuse".
Objectifs
Avec l'augmentation globale de la population âgée, l'amélioration du traitement des maladies liées au vieillissement et l'allongement de la durée de vie en bonne santé sont devenus quelques-unes des questions médicales actuelles les plus importantes. Le vieillissement est le principal facteur de risque de cancer, de maladies cardiovasculaires, de diabète et de troubles neurodégénératifs. La sénescence, qui est un phénomène cellulaire que nous étudions au laboratoire, est également une cause majeure du vieillissement et des maladies liées à l'âge. Pour comprendre les mécanismes de la sénescence, du vieillissement et des troubles liés à l’âge, les modèles animaux sont essentiels. L’objectif de cette étude est de mettre en place un modèle d’induction de la sénescence et du vieillissement prématuré par injection d’un agent anti-cancéreux.
Bénéfices attendus
L’induction de la sénescence par chimiothérapie permet d’accélérer le processus naturel de vieillissement et les bénéfices sont multiples. En effet, la recherche sur le modèle de vieillissement naturel est longue, laborieuse et coûteuse, avec de grandes variations individuelles. Ainsi, le modèle de vieillissement accéléré, induit chimiquement, est privilégié par les chercheurs en raison de sa source pratique, du temps de modélisation court et de l'effet de vieillissement relativement contrôlable. Ce modèle nous permettra de mieux étudier le rôle de la sénescence dans le développement normal, le vieillissement et les maladies liées à l’âge ou encore la croissance tumorale. Il pourra aussi être utilisé dans des études de composés anti-âge visants à éliminer les cellules sénescentes. Enfin il permettra d’étudier et de mieux comprendre les effets secondaires des chimiothérapies qui peuvent subsister encore longtemps après l’arrêt du traitement et la rémission du cancer.
Procédures
Chaque animal (120 au maximum pour cette étude pilote) subira trois injections administrées à trois jours d’intervalles chacune, soit une au jour zéro, une au jour 3 et une au jour 6. Les injections se feront sur animaux vigiles en contention rapide et seront réalisées par du personnel qualifié et ne prendra que quelques secondes par souris.
Impact sur les animaux
L'injection d’un agent anti-cancéreux chez des souris pour induire la sénescence cellulaire est une approche couramment utilisée dans les recherches sur le vieillissement et le cancer. Cette induction du vieillissement prématuré n’est pas sans conséquences pour la souris. Elle présente plusieurs effets indésirables, tant à court qu'à long terme, qui doivent être pris en compte lors de l'expérimentation. Les principaux effets néfastes attendus chez les souris sont la cardiotoxicité, l’hématotoxicité et l’hépatotoxicité. L’utilisation d’injections fractionnées (petites doses sur plusieurs jours) par rapport à une dose unique devrait permettre aux souris de mieux tolérer le traitement et favoriser une sénescence progressive et soutenue, plus proche des conditions chroniques. Les effets indésirables apparaissent généralement dans des délais relativement courts après l'administration. Un suivi rigoureux des signes cliniques et physiologiques, avec l’utilisation d’une grille de score, sera essentiel pour détecter une toxicité éventuelle et garantir le bien-être des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à différents moments bien précis , afin de prélever les organes d'intérêts (foie, coeur, poumon, muscle, cerveau, rein) pour des analyses supplémentaires. Au total 120 souris.
Remplacement
La souris est un bon modèle pour étudier la sénescence car elle partage des similitudes biologiques et génétiques importantes avec l'humain. Elle permet d'étudier la sénescence dans un contexte systémique, incluant les interactions entre les cellules, les tissus et le système immunitaire. Enfin, son usage est soutenu par une large disponibilité d'outils génétiques et de modèles transgéniques, facilitant l'étude des mécanismes moléculaires de la sénescence. Le modèle murin reste irremplaçable pour étudier la sénescence car il permet une compréhension globale et dynamique des mécanismes cellulaires, tissulaires et systémiques. Bien que des modèles alternatifs puissent compléter ces recherches pour explorer des mécanismes spécifiques, ils ne peuvent pas reproduire la complexité physiologique et les interactions multi-systémiques nécessaires pour des applications translationnelles.
Réduction
Nous nous attendons à ce que les effets de la chimiothérapie soient grands. Nous allons donc constituer des groupes de 10 animaux (5 mâles et 5 femelles) par condition. Ce nombre est calculé de telle sorte à réduire au maximum le nombre de souris utilisées tout en obtenant des résultats statistiquement fiables. Il a été démontré que la chimiothérapie est capable d’induire la sénescence aussi bien chez les femelles que chez les mâles, ainsi nous utiliserons les animaux des deux sexes. Les croisements seront réalisés de telle sorte à ce que 100% des animaux produits pourront être utilisés pour cette étude.
Raffinement
L’induction du vieillissement prématuré par injection d’un agent anti-cancéreux n’est pas sans conséquences pour la souris. Elle présente plusieurs effets indésirables, tant à court qu'à long terme. Il faut donc adopter des stratégies pour réduire la douleur et le stress, gérer les effets secondaires de la chimiothérapie, connue pour ses effets toxiques potentiels et enrichir l’environnement des animaux. Les souris seront regroupées à plusieurs dans des cages ventilées afin de préserver les interactions sociales, avec un nid comme enrichissement de milieu et elles pourront s’alimenter et s’abreuver ad libitum. En cas de besoin, de la nourriture en gel et des croquettes enrichies seront placées dans la cage directement afin de faciliter la nutrition de l’animal. Très rapidement les premiers signes du vieillissement seront visibles et ils seront probablement accompagnés de signes de toxicités spécifiques de la chimiothérapie tel que la cardiotoxicité. Dans le cadre de cette étude pilote, l’utilisation d’une grille de score du bien-être animal est essentielle pour surveiller et évaluer quotidiennement l’état des souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier la sénescence car elle partage des similitudes biologiques et génétiques importantes avec l'humain. De plus, son usage est soutenu par une large disponibilité d'outils génétiques et de modèles transgéniques, facilitant l'étude des mécanismes moléculaires de la sénescence qui présentent, eux aussi, de fortes similitudes entre l’humain et la souris. Nous utiliserons des souris jeunes adultes, mâles et femelles, âgées de 8 à 12 semaines. À cet âge, les souris ont atteint leur maturité physiologique, mais elles n'ont pas encore accumulé de dommages liés au vieillissement. Cela permet de distinguer clairement les effets de la chimiothérapie sur l'induction de la sénescence cellulaire, sans que les effets ne soient perturbés par les processus naturels de vieillissement. De plus, les souris plus jeunes peuvent mieux tolérer le traitement que des souris âgées, qui pourraient être plus vulnérables aux effets secondaires.
Evaluation de nouvelles thérapies immuno-modulatrices via des modèles de transfert de cellules immunitaires humaines ou murines chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
5 975 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, chacune pouvant recevoir jusqu'à quatre administrations par semaine pendant huit semaines, trois prises de sang et dix séances d'imagerie sous anesthésie. 2 180 d'entre elles subissent des procédures classées sévères, 3 270 modérées, 525 légères. Elles sont irradiées ou traitées chimiquement, puis greffées de cellules immunitaires humaines qui attaquent leurs propres tissus et provoquent une inflammation de la peau, du foie et du système digestif, une perte de poids et une baisse d'activité environ trois semaines après la transplantation. Le porteur annonce des traitements plus efficaces des maladies auto-immunes et une aide à l'obtention d'autorisations de mise sur le marché, et affirme que les cultures cellulaires ne peuvent pas reproduire la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
Les maladies auto-immunes touchent environ 5 à 8 % de la population mondiale et sont de plus en plus fréquentes. Des exemples de ces maladies incluent le diabète de type 1, la sclérose en plaques, le lupus et la polyarthrite rhumatoïde. Elles sont complexes et les traitements actuels ne fonctionnent pas toujours de la même manière pour tout le monde. Ce projet vise à développer de nouvelles approches pour traiter ces maladies en utilisant des modèles de souris avec des cellules humaines. Les modèles de transfert de cellules immunitaires sont très importants en recherche médicale, surtout pour étudier les maladies auto-immunes. Ils permettent de transférer des cellules immunitaires d'un donneur à une souris, ce qui aide à comprendre comment ces cellules interagissent et réagissent dans un environnement contrôlé. Les modèles de maladie du greffon contre l'hôte sont particulièrement utiles. Ils imitent les situations où les cellules immunitaires du donneur attaquent les tissus de la souris, reproduisant ainsi les mécanismes des maladies auto-immunes. Cela permet de comprendre en détail les processus inflammatoires et auto-immuns, et d'identifier les éléments clés impliqués. En utilisant ces modèles, nous pouvons tester de nouvelles thérapies pour voir si elles sont efficaces et sûres avant de les utiliser chez les humains. De plus, ils nous aident à explorer des stratégies pour rendre le système immunitaire plus tolérant, ce qui est crucial pour traiter les maladies auto-immunes. Ce projet nous aidera à mieux comprendre les mécanismes des maladies auto-immunes et à développer des traitements plus efficaces et personnalisés, offrant ainsi de nouvelles perspectives pour les patients.
Bénéfices attendus
Utiliser des modèles de souris avec des cellules immunitaires humaines est très utile pour la recherche sur les maladies auto-immunes et inflammatoires. Ces modèles recréent un environnement similaire à celui du corps humain, ce qui est essentiel pour étudier comment les cellules interagissent et comment les maladies se développent. Cela aide à créer de nouvelles stratégies de traitement. Ces modèles sont prometteurs pour mieux comprendre le système immunitaire, découvrir des traitements innovants plus rapidement et s'assurer que les thérapies sont sûres et efficaces pour les patients. Les études utilisant des techniques d'imagerie permettent d'observer les traitements en temps réel sans intervention invasive. Les données obtenues grâce à ces modèles augmentent les connaissances scientifiques sur les processus immunitaires et inflammatoires dans diverses maladies humaines. Ces résultats seront publiés et partagés avec la communauté scientifique, contribuant ainsi à l'avancement de la recherche. De plus, ces données soutiennent l'entrée des nouveaux traitements en phase d'essais cliniques et aident à obtenir les autorisations nécessaires pour leur mise sur le marché. L'imagerie pourrait également être utilisée pour le diagnostic ou le suivi des maladies.
Procédures
Administrations réalisées sur animal vigile, environ 10 secondes, réalisée au maximum 4 fois par semaine sur 4-8 semaines Prises de sang sur animal vigile, environ 15 secondes, répétées 3 fois sur 8 semaines maximum. Analyse par imagerie sur animal anesthésié : Durée : Environ 5-15 minutes par session d’imagerie sur 10 temps, au maximum.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : Réaction de greffe contre l'hôte : Ce phénomène se produit lorsque les cellules immunitaires humaines attaquent les tissus de la souris, causant une inflammation et des dommages principalement à la peau, au foie et au système digestif. Cela entraîne une perte de poids et une baisse de l'activité générale environ 3 semaines après la transplantation. Perte de poids temporaire : Cela est dû à la préparation des souris par irradiation ou traitement chimique avant la greffe des cellules humaines.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour les prélèvements d’organes nécessaires à l’atteinte des objectifs de l’étude.
Remplacement
Utiliser des modèles de souris avec des cellules immunitaires humaines ou de souris est essentiel pour développer et tester de nouveaux traitements pour les maladies inflammatoires et auto-immunes. Ces modèles recréent un environnement immunitaire dans les souris, ce qui permet d'étudier les interactions cellulaires et les mécanismes des maladies auto-immunes de manière unique. Les souris immunodéficientes utilisées pour ces transferts surmontent les limites des modèles traditionnels, offrant un système plus pertinent pour la recherche. Bien que des méthodes alternatives en laboratoire (in vitro) et par simulation informatique (in silico) soient explorées, elles ont des limites importantes. Les tests en laboratoire, comme les cultures cellulaires, permettent d'étudier les réponses cellulaires dans un environnement contrôlé, mais ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier. Par exemple, les cultures de cellules immunitaires, comme les globules blancs, peuvent fournir des informations sur les réponses immunitaires spécifiques, mais ne peuvent pas simuler les interactions dynamiques dans le corps. Les modèles informatiques, qui utilisent des simulations pour prédire les réponses biologiques, sont également limités par la complexité des systèmes biologiques et la qualité des données disponibles. Bien qu'ils soient utiles pour générer des hypothèses et réduire le nombre d'expériences animales nécessaires, ils ne peuvent pas remplacer les études sur des organismes vivants en raison de leur incapacité à capturer toutes les variables biologiques et environnementales. La complexité des interactions immunitaires dans les maladies inflammatoires et auto-immunes nécessite encore l'utilisation de modèles animaux pour obtenir des données pertinentes et applicables à l'humain. Les modèles de souris permettent de recréer un environnement immunitaire humain, indispensable pour évaluer l'efficacité et la sécurité des nouveaux traitements.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est basé sur des publications scientifiques et optimisé par un biostatisticien en fonction des objectifs de l’étude. Des méthodes statistiques sont appliquées pour minimiser le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats fiables et en réduisant les biais expérimentaux. Seules les molécules ayant montré en amont une activité anti-inflammatoire in vitro sont testées sur les animaux (in vivo). L’utilisation de techniques précises comme la cytométrie en flux, l’analyse de biomarqueurs, l’histologie et l’imagerie permettra d’obtenir des données détaillées à partir de petits échantillons. De plus, on pourra avoir un suivi non invasif et multiparamétrique des animaux pour mesurer la distribution des composés et l’évolution de la réponse inflammatoire, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Les modèles décrits dans ce projet sont choisis pour leur pertinence clinique, réduisant ainsi le besoin de tests supplémentaires sur d’autres animaux.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Nous utiliserons également une litière adaptée (douceet un enrichissement qui favorise l’expression des comportements normaux de la souris ( abri, enfouissement, nidification…). Les souris immunodéficientes sont hebergées en conditions stériles dans des rack ventilés afin d’éviter tout risque d’infection. Les techniques de manipulation douce, telles que l’utilisation de tunnels et la préhension dans le creux des mains, sont mises en œuvre pour réduire le stress et l’angoisse des animaux. Un apport nutritif pourra être mis en place 1 semaine avant le début de l’étude pour faciliter l’accès des animaux. Les animaux pourront être hébergés dans des cages spéciales capables de détecter 24h/24 toute anomalie dans l’activité des animaux (hypoactivité ou hyperactivité ou stéréotypies) permettant de mettre en place très rapidement les actions pour la prise en charge vétérinaire. Les études sont encadrées par des recommandations internes et validées par la structure du bien-être animal relatives à l’utilisation des animaux (hébergement, soins, manipulation, expérimentations) et ayant pour objectif de prévenir toute douleur ou détresse chez l’animal. Une grille de score a été mise en place afin de permettre la définition et l’application de points limites, généraux et spécifiques à la procédure, une fréquence accrue des observations et ainsi intervenir de manière anticipée pour éviter toute douleur ou dommages pour les animaux au-delà de la classe de gravité définie pour la procédure. Les protocoles expérimentaux seront continuellement améliorés pour minimiser la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix en pharmacologie. Elles partagent une grande partie de leur génome avec les humains, permettant de modéliser les maladies humaines et d'étudier les effets des médicaments. Leur petite taille et leur cycle de reproduction rapide facilitent les études à long terme et les expériences génétiques. Les souris, étant des mammifères, ont des systèmes biologiques comparables à ceux des humains, rendant les résultats plus pertinents. Les souris adultes (à partir de 8 semaines d’âge) sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge. De plus le système immunitaire est complètement mature à partir de 6 semaines d’âge chez la souris.
Pré-conditionnement rénal par un inhibiteur de la protéine SerRS, impliqué dans la résistance à l’ischémie dans un modèle porcin de donneur en mort encéphalique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
59 porcelets de deux à trois mois vont être utilisés et tués, une partie opérée sous anesthésie sans jamais se réveiller, les autres dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Un animal greffé passe ses sept à dix premiers jours postopératoires seul en cage métabolique, puis y retourne quatre à sept fois pour 24 heures jusqu'au 90e jour, avec jusqu'à onze prises de sang sur animal vigile et dix biopsies sous anesthésie. Dix-huit d'entre eux sont utilisés uniquement comme donneurs de rein : chirurgie de 2 h 30, deux prises de sang, mise à mort en fin d'intervention. Le porteur décrit le passage chez le gros animal comme une étape "indispensable" avant la clinique humaine, et déclare le retour à l'élevage impossible pour raisons sanitaires, ce qui condamne tous les survivants.
Objectifs
Ce projet vise à concevoir une nouvelle génération d'inhibiteurs pharmacologiques capables de contrecarrer les conséquences d'un épisode ischémique. Ils ciblent une protéine que nous avons récemment identifiée et qui est impliquée dans la résistance des organes à l'ischémie. L'application clinique visée est la transplantation rénale. La transplantation rénale est le traitement optimal de l’insuffisance rénale terminale. Au cours de la transplantation, les phénomènes liés à l’ischémie-reperfusion (séquence intrinsèque du processus de la transplantation d’organes solides) sont à l’origine de lésions qui induisent une dysfonction du greffon à la phase précoce et peuvent faciliter le rejet de ce dernier. L’ischémie correspond à la phase où l’organe est privé de la circulation sanguine. La reperfusion de l'organe se traduit par la reprise de la circulation sanguine et donc des apports en nutriments et oxygène. L’ischémie-reperfusion est impliquée également dans les mécanismes de lésions chroniques à plus long termes. Il est donc nécessaire de développer des moyens de protéger les organes afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion, afin améliorer la qualité du greffon et sa survie à court et long terme. Des travaux récents ont permis d’identifier une cible d’intérêt, une protéine régulée durant l’ischémie-reperfusion rénale. Notre objectif est d’évaluer un produit thérapeutique ciblant cette protéine, afin de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion rénales et ainsi améliorer la qualité du greffon, dans un modèle de transplantation de rein chez le porc. A terme, ces travaux permettront d’optimiser les protocoles de transplantation d’organe chez l’homme et de fournir des organes de meilleure qualité garant d’une survie plus longue.
Bénéfices attendus
Actuellement la transplantation rénale est la meilleure solution pour le traitement de l’insuffisance rénale terminale, moins coûteuse pour la société et moins contraignante pour le patient que la dyalyse chronique. Malheureusement, la durée de vie d’un greffon rénal est limitée et les lésions précoces, dues à l’inévitable succession d’ischémie (arrêt de l’irrigation sanguine oxygénée) et reperfusion (reprise de l’irrigation sanguine oxygénée), sont en grande partie responsables de la reduction de cette durée de vie. L’utilisation des machines de perfusion des greffons a permis d’élargir les critères d’acceptabilité d’un greffon mais n’a pas permis d’améliorer la durée de vie des greffons. Pour l’instant la meilleure façon de réduire les lésions d’ischémie – reperfusion est de réduire au maximum la durée d’ischémie et réaliser la greffe le plus rapidement possible. L’inhibiteur de la protéine étudiée a montré in vitro et sur organe de petit animal une activité intéressante qui permet de réduire les lésions d’ischémie reperfusion. Il est donc indispensable de passer par l’étape de modèle pré-clinique chez le gros animal avant de pouvoir le proposer chez l’homme.
Procédures
Pour les 18 animaux donneurs : procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 2h30) , avec 2 prises de sang au cours de la chirurgie, puis mise à mort en fin de procédure. Pour les animaux de groupes d’étude (n=30) : procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec analgésie postopératoire et surveillance, d'une durée de 1h30 à 2h30. 2 prises de sang sous anesthésie générale en début et fin de chirurgie. 9 prélèvements sanguins sur animal vigile, à l’aide d’un cathéter laissé lors de la procédure initiale (durée 5 minutes). 10 prélèvements d’urine en cage métabolique. Hébergement individuel en cage métabolique durant les 7 premiers jours post greffe, puis 4 fois 24 heures à J10, J14, J30 et J90. 3 prélèvements de tissus par biopsie sous anesthésie générale (durée 20 minutes chacun). Pour les 2 animaux de l'avenant : procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec analgésie postopératoire et surveillance, d'une durée de 3h30. 2 prises de sang sous anesthésie générale en début et fin de chirurgie. 11 prélèvements sanguins sur animal vigile, à l’aide d’un cathéter laissé lors de la procédure initiale (durée 5 minutes). 11 prélèvements sanguins sous anesthésie. 17 prélèvements d’urine en cage métabolique. 10 prélèvements de tissus par biopsie sous anesthésie générale (durée 20 minutes chacun). Hébergement individuel en cage métabolique les 10 premiers jours post greffe, puis 7 fois 24 heures à J10, J28, J42, J56, J71, J84 et J90.
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont prévisibles : - stress lors de la réalisation des prises de sang et des transferts - douleur postopératoire - limitation de la possibilité de déplacement car la surveillance sera effectuée en cage métabolique. Les injections intraveineuses peuvent provoquer un hématome. Comme pour toute intervention chirurgicale, une infection, un hématome au site d'intervention pourraient survenir. Néanmoins dans notre expérience c'est rare (moins de 5% des cas).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures. En effet, pour des raisons sanitaires, le retour à l'élevage est impossible en fin d'expérimentation.
Remplacement
La transplantation et l’appreciation de l’évolution post-greffe d’un organe ne peut être faite autrement que sur un animal vivant. Nous avons naturellement commencé par des études en vitro (cultures cellulaires) puis des études sur des organes chez le petit animal. Le projet est arrivée à l’étape pré-clinique, de mise en situation complète chez le gros animal.
Réduction
Nous avons effectué des études pour calculer la dose à tester afin de ne pas utiliser plusieurs dosages de la molécule testée. Le nombre d’animaux a été déterminé en s’appuyant sur un score de lésions histologiques très sensible et en prenant en compte le taux de reduction des lésions observées in vitro. Le calcul des effectifs a été fait pour réduire le plus possible le nombre d’animaux utilisés, en s’appuyant sur les methodes statistiques définies pour les petits effectifs qui utilisent les tests non-paramétriques. Nous avons estimé le nombre d’animaux (porcs de race commune) utilisés dans ce projet à 57. Il y a 30 animaux dans les 5 groupes précisés plus haut, dont la taille a été calculée en se basant sur des tests statistiques non paramétriques (très petits échantillons). En plus des animaux étudiés, il nous faut des donneurs SLA (Swine Leukocyte Antigen (comme le HLA chez l’homme)) compatibles de la même fratrie. Le fait de vérifier la compatibilité SLA permet de ne pas utiliser d’immunosuppression et d’éviter le phénomène de rejet. Il y a 4 groupes d’animaux qui reçoivent une transplantation rénale, donc en théorie il faudrait 24 donneurs. Nous avons calculé l’effectif total avec seulement 18 donneurs, car dans le groupe contrôle, on effectue l’ablation d’un rein, rein qui peut être conditionné et tranplanté ensuite à un receveur. Cela nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. En plus des groupes d’étude nous avons prévu 4 animaux test pour la mise en place chirurgicale du projet, qui seront mis à mort immédiatment à la fin de la procédure et 5 animaux en réserve, en cas d’échec de la procédure chirurgicale. 2 animaux supplémentaires sont demandés pour l'avenant.
Raffinement
Les animaux seront sous anesthésie générale lors des chirurgies. Un suivi quotidien sera mis en place pour évaluer et réduire la douleur animale. Des analgésiques et des antibiotiques seront administrés systématiquement au moment des procédures et occasionellement pendant la période du suivi si l’état de l’animal l’impose. Les animaux seront logés en case individuelle avec des cloisons ajourées pour qu’ils puissent interagir avec les congénères. L’enrichissement du milieu sera réalisé à l’aide de paille, de bidon ou autres jouets. Une surveillance vidéo des animaux sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle porcin de transplantation rénale est un modèle largement utilisé, reconnu et proche de la tranplantation rénale chez l’homme. C’est de loin le modèle de gros animal le plus utilisé en transplantation rénale ce qui nous permettra d’identifier toute anomalie d’évolution post-opératoire et d’obtenir des résultats robustes. Les animaux utilisés seront des porcelets de 2-3 mois d’âge (25-40kg), issus de la même fratrie et compatibles SLA (Swine Leukocyte Antigen). Cette tranche d’âge est utilisée à cause de la possibilité chirurgicale (greffe plus ou moins proche de celle chez l’homme) tout en laissant la possibilité de manipuler facilement l’animal 3 mois après la transplantation.
Régénération de cellules productrices d’insuline chez la souris à partir des cellules intestinales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
480 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une trentaine d'injections, dont celles d'un composé qui provoque le diabète, subit une ou deux transplantations d'organoïdes intestinaux sous anesthésie et 22 prélèvements sanguins, dont un par semaine pendant quatorze semaines. Il s'agit de savoir si des cellules intestinales reprogrammées sécrètent bien de l'insuline dans un organisme vivant, l'application chez les personnes diabétiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que le recours aux animaux est "essentiel" parce que le diabète ne peut pas être modélisé entièrement en laboratoire sans eux, et retient des souris privées de défenses immunitaires pour que les greffes ne soient pas rejetées.
Objectifs
Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules β pancréatiques responsables de la production d'insuline. Cette destruction entraîne des hyperglycémies chroniques, pouvant entraîner de graves complications vasculaires. Nous avons précédemment montré que la surexpression d'un gène appelé Pax4 dans les cellules α productrices de glucagon (une hormone permettant d'augmenter la glycémie) du pancréas induit leur régénération et leur conversion en cellules β fonctionnelles. Ces nouvelles cellules β peuvent produire de l'insuline et rétablir une glycémie normale chez la souris diabétique. Il est intéressant de noter que ce phénomène de conversion a également été observé dans l'intestin. Cependant, il est encore difficile de savoir si l'amélioration de la glycémie chez ces souris provient du pancréas ou de l’intestin. L’objectif de notre étude est donc de comprendre quelle contribution chaque organe apporte à cette amélioration. Pour ce faire, nous allons réaliser des expériences de transplantation et de retrait d’organoïdes intestinaux (structures tridimensionnelles créées à partir de cellules de l’intestin, imitant les propriétés de l’organe) dans un modèle de souris diabétiques. Cela nous permettra d’étudier spécifiquement la fonction des cellules de type β provenant de l'intestin. Pour ce projet, nous aurons besoin de 480 souris. Nous suivrons les principes des 3R pour respecter le bien-être des animaux : Remplacement (nous utilisons des animaux parce que le diabète ne peut pas être modélisé entièrement en laboratoire sans eux); Réduction (nous limiterons le nombre d'animaux au minimum nécessaire et ajusterons nos expériences en fonction des résultats obtenus); Raffinement (nous utiliserons une grille de score pour surveiller le stress et la souffrance des animaux, avec des mesures prises précocement en cas de besoin).
Bénéfices attendus
L’objectif de ces travaux est de montrer, dans un modèle vivant, que les cellules de type β provenant de l’intestin sont capables de produire de l’insuline en réponse à un apport en sucre. Nous cherchons ainsi à démontrer que les cellules de l’intestin, une fois reprogrammées, pourraient devenir une source de cellules de type β capables de produire de l’insuline, et ainsi aider à rétablir une glycémie normale chez les patients atteints de diabète de type 1.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, des transplantations et des retraits d’organoïdes intestinaux seront effectués. Chaque intervention durera environ 20 minutes par animal. Selon le groupe, chaque animal subira une ou deux interventions, espacées de 10 semaines. Avant chaque intervention, les animaux seront mis à jeun pendant une période définie et recevront une anesthésie d’une durée d’environ 30 minutes. Concernant les injections, le protocole prévoit environ 32 administrations par animal sur une période de plusieurs semaines. Chaque injection durera environ 30 secondes. Pour surveiller l’évolution des paramètres biologiques, un prélèvement sanguin de faible volume sera effectué chaque semaine pendant 14 semaines. En fin de procédure, des prélèvements supplémentaires seront réalisés, portant le total à 22 prélèvements, incluant un prélèvement initial. Chaque prélèvement durera environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les souris immunodéficientes utilisées dans cette étude sont particulièrement sensibles aux infections, qu’elles proviennent de germes courants, opportunistes ou de leur propre flore intestinale. Les transplantations et retraits d’organoïdes intestinaux prévus nécessitent une période de jeûne et une anesthésie, ce qui peut entraîner des effets secondaires comme une douleur postopératoire, de légers saignements, un risque d’infection et un stress lié à la manipulation. Pour induire un diabète modéré, les souris recevront, sur plusieurs jours, des injections d’un composé capable de provoquer cette condition. Ces injections peuvent provoquer un inconfort au site d’injection, de légères douleurs et un faible risque de complications. D'autres injections administrées sur plusieurs semaines peuvent également causer un inconfort similaire. À fortes doses, un léger gonflement temporaire peut apparaître, mais cet effet est indolore et sans impact sur la santé ou le comportement des animaux. Un test de tolérance au glucose sera également réalisé. Il nécessitera une période de jeûne suivie d’une injection destinée à augmenter temporairement la glycémie. Après cette injection, plusieurs prélèvements sanguins de faible volume seront effectués à intervalles réguliers. Ces prélèvements peuvent entraîner une douleur légère et passagère ou un inconfort local. Toutefois, le risque d’infection sera minimisé grâce à des procédures strictes d’asepsie.
Devenir
À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.
Remplacement
Dans cette étude, l’utilisation de modèles animaux est essentielle pour comprendre comment les cellules intestinales reprogrammées en cellule de type β peuvent contribuer à réguler la glycémie. Ce processus est complexe et implique l’interaction de plusieurs organes, ce qui ne peut pas être entièrement reproduit en laboratoire. Bien que nos premières expériences réalisées ex vivo soient encourageantes, seule une étude sur des animaux vivants (in vivo) permet de tester de manière complète et fiable l’efficacité de ces cellules pour traiter le diabète.
Réduction
Nous nous engageons à limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés pour nos recherches. Des analyses préalables ont montré que 15 animaux par groupe sont suffisants pour obtenir des résultats fiables, sans avoir besoin de répéter inutilement les expériences.
Raffinement
Un anesthésique sera utilisé pour réduire le stress et l’anxiété des animaux, tout en garantissant une anesthésie stable pendant les procédures chirurgicales. Avant l’anesthésie, un analgésique sera administré pour prévenir toute douleur pendant et après l’intervention, assurant ainsi un meilleur confort postopératoire. La glycémie sera mesurée à partir d’une goutte de sang prélevée dans la veine caudale. Avant l’incision, une crème analgésique à base de lidocaïne sera appliquée sur l’extrémité de la queue pour assurer une anesthésie locale. La ponction sera réalisée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Pour les injections intrapéritonéales, la zone d’injection sera désinfectée avant et après chaque administration afin de limiter les risques d’infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour minimiser la douleur et les traumatismes tissulaires. Les volumes injectés seront ajustés pour éviter tout inconfort. Les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive afin de détecter d’éventuels signes de détresse. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront un accès permanent à de l’eau stérilisée et à des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Pendant toute la durée de l’étude, une grille de score sera utilisée pour évaluer objectivement la souffrance éventuelle des animaux, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous cherchons à comprendre si les cellules de type β issues de l’intestin peuvent fonctionner correctement, c’est-à-dire sécréter de l’insuline, dans un organisme vivant. Pour cela, nous utilisons des souris immunodéficientes. Ces souris sont idéales pour ce type de recherche, car elles permettent, d’une part, de greffer des cellules sans risque de rejet et, d’autre part, elles facilitent l’étude de la reprogrammation cellulaire dans un contexte vivant. Cela offre ainsi la possibilité d’évaluer précisément la fonctionnalité des cellules de type β intestinales et de suivre leur évolution à long terme. Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 10 et 20 semaines. Ces âges correspondent au stade adulte, ce qui est optimal, car les souris à ce stade ne sont plus influencées par les changements métaboliques liés au sevrage. En sélectionnant deux groupes d’âges différents, nous pourrons également examiner si l’âge ou le vieillissement a un impact sur la capacité des cellules intestinales à se régénérer et à produire de l’insuline.
Etudes de l’implication de la boucle fronto-pariétale au cours de la mémoire de travail 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées sous anesthésie pour une injection virale dans le cerveau, parfois suivie de la pose d'un implant pendant deux heures trente, les souris sont ensuite isolées en cage individuelle pour treize semaines au plus. Vient la restriction hydrique, huit à douze semaines au maximum, destinée à les motiver à exécuter les tâches, puis trois injections espacées de deux jours et les séances en tête restreinte. 3 000 souris vont être utilisées dans ce premier volet, dont 2 880 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, pour des enregistrements d'électrophysiologie in situ et des analyses histologiques.
Objectifs
La mémoire de travail est une des fonctions cognitives les plus importantes car elle assure la continuité entre le passé immédiat et les actions à venir en agissant comme carrefour d’échanges entre les informations sensorielles entrantes, la mémoire long-terme et la prise de décisions. Le cortex préfrontal a été proposé comme étant l’unique siège de la mémoire de travail depuis les années 70. Cependant de plus en plus d’études chez les primates non-humains et cliniques mettent en avant la nature distribuée de la mémoire de travail, notamment au niveau du cortex pariétal postérieur dans le réseau fronto-pariétal. Néanmoins, l'interaction fonctionnelle entre ces deux aires corticales au niveau des réseaux neuronaux et cellulaires a été très peu étudiée. Cette méconnaissance est principalement due aux limitations méthodologiques d'enregistrement. L’utilisation de modèles génétiques chez la souris couplée à des méthodes d’enregistrement électrophysiologique de large population de neurones permet de cibler de plus en plus finement les populations neuronales et les synapses d’intérêts dans le système nerveux central. De plus, le développement de nouveaux outils cellulaires permet l’expression d’outils moléculaires par les cellules et synapses impliquées spécifiquement durant la mémoire de travail. Une grande variété d’action est alors possible afin de bloquer, augmenter ou moduler dynamiquement des processus cellulaires et synaptiques d’intérêts. L’objectif général de notre projet, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, est d’investiguer l’activité neuronale dans le réseau fronto-pariétal pendant la mémoire de travail afin d’élucider son rôle spécifique ainsi que les mécanismes généraux y orchestrant. Ceci pourrait nous éclaircir sur la physiopathologie et le développement de nouvelles cibles thérapeuthiques pour des maladies comme la dépression et les troubles de l’attention où la mémoire de travail est particulièrement affectée.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de réseaux et cellulaires qui soutiennent la mémoire de travail et ainsi la manière dont notre cerveau traite cette tâche cognitive. De par les résultats qui en découlent, nous nous attendons à apporter de nouvelles connaissances dans la compréhension de l’organisation du réseau neuronal. Ces connaissances nous aideront donc à mieux comprendre non seulement comment la mise en place de la mémoire de travail s’effectue, mais également comment des maladies ou des troubles psychiatriques liés à une altération de cette mémoire peuvent se mettre en place. L’intérêt scientifique majeur de ce projet est d’utiliser de nouveaux outils cellulaires pour répondre directement à de nombreuses questions sur les mécanismes cellulaires mis en jeu lors de la mobilisation de la mémoire de travail en faisant le lien entre physiologie synaptique et activité de réseau. Pour cela, nous avons mis en place des approches multidisciplinaires allant de la physiologie synaptique à l’analyse d’activité de réseau. Nos données seront utilisées pour alimenter des réseaux de neurones artificiels pour mettre en lumière les mécanismes fondamentaux de la mémoire de travail afin de mettre en œuvre de meilleures stratégies pour contrebalancer son altération dans des maladies neuropsychiatriques telles que la schizophrénie.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, l’ensemble des animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour infection virale (30 min) avec ou sans implantation (2h30). La pose d’implant nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour la totalité de l’expérimentation, soit pour une durée de 13 semaines maximum, afin d’éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. Le test comportemental requiert le jeûne hydrique de 8-12 semaines maximum pour motiver les animaux à effectuer la tâche. Lors des tests comportementaux de mémoire de travail, réalisés dans le second établissement utilisateur, les animaux subiront 3 injections (30 min/injection, 1 injection/2 jours). Les animaux effectueront différentes taches comportementales se faisant sur 8-12 semaines consécutives maximum. Les animaux subiront 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant euthanasie et 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant l’imagerie intrinsèque.
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entraînent des effets indésirables sur les animaux : l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, les différentes implantations et la réalisation des points de sutures.L’animal subit également un stress lié à la diminution de comportements sociaux suite à l'isolement des animaux après implantations et lors du contrôle hydrique ou alimentaire. Un stress physique est également induit lors des contentions et lors de la tâche comportementale en tête restreinte. L'injection dans le péritoine provoque un stress physique dû à la contention et entraîne un effet indésirable de l’injection.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure pour réaliser des expériences d’electrophysiologie in situ ou pour des analyses histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques tel que le t-test, pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien-être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie implantaire est réalisée sous anesthésie gazeuse. Un contrôle de la respiration et de l’absence de réflexe sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une injection d’un anti-inflammatoire non stéroïdien est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 12 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra une injection quotidienne d’un anti-inflammatoire non stéroïdien jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux mâles et femelles de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Étude des mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets du stress de contrainte et de l’inflammation sur le vieillissement des cellules souches hématopoïétiques murines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immobilisées deux heures d'affilée sans pouvoir bouger, manger ni boire, et pour certaines sept jours de suite, les souris subissent ensuite une irradiation, une injection imitant une infection virale et une greffe de cellules souches. 1 692 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 116 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur cherche à savoir si l'accumulation d'épisodes de stress vieillit prématurément les cellules souches du sang, et rapproche la contention forcée de la situation des patients placés en isolement protecteur après une greffe. Il écrit que ce temps d'immobilisation "est suffisant pour induire de la peur ou de l'anxiété, sans causer de blessures physiques", et annonce par ailleurs perte de poids, agressivité, anxiété et dépression parmi les effets attendus.
Objectifs
5.5.2. Le processus de formation du sang, appelé hématopoïèse, repose sur les cellules souches hématopoïétiques (CSH), définies par leur capacité à se renouveler et à produire d’autres cellules sanguines. Les CSH résident dans la moelle osseuse, où elles sont protégées des influences extérieures et se trouvent le plus souvent dans un état non prolifératif. En raison du besoin constant de renouvellement du système sanguin, il est essentiel de maintenir le nombre et le potentiel des CSH tout au long de la vie. L’accumulation d’inflammation est l’un des facteurs qui poussent les CSH au repos à proliférer, ce qui altère leurs capacités, un phénomène observé dans le processus de vieillissement. Le vieillissement du système hématopoïétique peut entraîner un dysfonctionnement de l’hématopoïèse et augmenter la susceptibilité à diverses pathologies hématologiques telles que la myélodysplasie, la leucémie et le lymphome. Nos résultats précédents ont montré qu’en inhibant l’inflammation médiée par une protéine, les CSH restent dans un état non prolifératif, conservent mieux leur capacité de différenciation et présentent un effet anti-inflammatoire lié au vieillissement. Nous supposons que le vieillissement physiologique résulte de l’accumulation d’épisodes de stress. Dans ce projet, nous testerons l’hypothèse selon laquelle les signaux de stress provoquent certains changements communs constituant l’identité du vieillissement des cellules souches sanguines. Étant donné que nos souris à faible inflammation montrent des signes réduits de vieillissement, nous examinerons si cette réduction de l’inflammation peut partiellement compenser les effets du stress sur le vieillissement des CSH.
Bénéfices attendus
La croissance constante du nombre de personnes âgées est l'une des principales préoccupations socio-économiques des sociétés occidentales. Cette augmentation de la population âgée s'accompagne d'une hausse des maladies liées à l'âge. Tout au long de leur vie, les individus sont soumis à une accumulation de stress, qu'il soit physique ou mental, ce qui peut conduire au développement de diverses maladies. Cependant, la relation entre ces différents facteurs, le processus de vieillissement et le développement des maladies reste ambiguë. Ce projet vise à éclaircir un aspect de cette problématique, en se concentrant sur l'impact du stress psychologique et des infections sur la prolifération et la différenciation des cellules souches sanguines, ainsi que sur la possibilité que la réduction des niveaux d'inflammation puisse inverser ces effets, apportant ainsi des éléments de compréhension sur la manière de minimiser les effets du vieillissement sur le bien-être.
Procédures
- Stress aigu dû à la contention : 1 fois, 2 heures - Stress chronique lié à la contention : 1 fois, 2 heures par jour pendant 7 jours. - Infection : 1 fois (15 secondes), injections intrapéritonéales (polyI:C ou NaCl 0,9) - 2 irradiations à 4 et 6 heures d'intervalle pour une durée de 5 minutes. - 1 injection intraveineuse de cellules (15 secondes) - 3 analyses de sang à 4, 8 et 12 semaines après l'injection des cellules (15 secondes)
Impact sur les animaux
Un stress intense sera induit par des tests de contrainte aiguë (2 heures) ou chronique (7 x 2 heures), au cours desquels les animaux seront immobilisés et ne pourront ni bouger, ni manger, ni boire. Ce temps minimal est suffisant pour induire de la peur ou de l'anxiété, sans causer de blessures physiques. Effets secondaires liés au stress : perte de poids, agressivité, anxiété, dépression. L’injection, qui imite une infection virale, sera réalisée par injection intrapéritonéale et pourra entraîner des rougeurs ou un léger gonflement au site d’injection. Effets secondaires liés à l’affaiblissement du système immunitaire dans les 24 heures suivant l’irradiation : infections possibles. Réactions inflammatoires (rougeurs et gonflements) au site d’injection intraveineuse des CSH pour la transplantation. Possibilité de rejet de greffe après la transplantation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'isoler et d'étudier les cellules souches hématopoïétiques.
Remplacement
Nous avons envisagé la possibilité de modéliser les effets du stress en laboratoire, en utilisant des cultures cellulaires. Cependant, cette approche ne permettrait pas d'analyser pleinement les dynamiques complexes de l'hématopoïèse, qui se produisent à l'échelle de tout l'organisme. La réponse au stress psychologique implique une interaction complexe entre le système nerveux, le système endocrinien et le système immunitaire, avec des effets sur l’ensemble du corps. C’est pourquoi il est essentiel d'étudier ces effets chez un être vivant, et plus précisément sur les cellules souches sanguines. L'ajout d'hormones de stress dans une culture cellulaire ne suffit pas à reproduire la physiologie complète d'un organisme vivant. En outre, la différenciation des cellules souches sanguines dépend étroitement de leur environnement dans la moelle osseuse, un facteur impossible à reproduire en dehors du corps. Enfin, le stress par contrainte, comme celui subi par les patients en isolement protecteur après une transplantation, offre une meilleure modélisation de ces effets physiologiques complexes.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé afin de limiter la variation inter-individuelle et d’atteindre un niveau statistiquement validé par une analyse prédictive. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour récupérer la quantité de matériel requise pour l'expérience et obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous réaliserons deux répétitions pour vérifier si la variation entre les conditions est significative. Si les deux premières expériences donnent des résultats identiques, la troisième expérience sera annulée afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de surveiller le bien-être des animaux pendant notre procédure expérimentale et de limiter autant que possible toute douleur et/ou souffrance non nécessaire, nous avons établi une grille d'observation. Cette grille définit les points de terminaison les plus précoces et les plus précis à partir desquels des actions seront entreprises pour limiter toute souffrance et/ou douleur inutile. Elle indique également les mesures que nous prendrons dès l'apparition des premiers signes de douleur. Toutes les souris irradiées et transplantées seront traitées avec des antibiotiques afin de prévenir le risque d'infection. Elles seront contrôlées et notées pendant 5 jours après la transplantation, ainsi que pendant les jours de travail de la deuxième semaine. Au cours des semaines suivantes, elles seront notées deux fois par semaine. En cas de légère fatigue ou de difficulté à se déplacer, de la nourriture hydratée sera mise à disposition dans la cage.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles idéaux pour étudier la production des cellules sanguines, car leur système est très similaire à celui des humains. Le vieillissement des cellules sanguines chez les souris suit un processus bien défini, et il existe une correspondance d’âge entre les souris et les humains. Des études antérieures ont montré que le stress psychologique peut influencer les signaux chimiques dans le corps et modifier l’expression des gènes chez les souris. Nous supposons donc que le stress, qu’il soit dû à des contraintes physiques ou à une infection, pourrait également affecter les cellules souches responsables de la production des cellules sanguines chez les souris. Cela pourrait nous aider à mieux comprendre les effets du stress sur ces cellules chez les humains. De plus, l'isolement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) murines est bien défini, et ces cellules peuvent être conservées dans leur niche en maintenant leur quiescence. Les procédures comme la transplantation sont également bien maîtrisées chez les souris, grâce aux protocoles d’irradiation en place. Les animaux utilisés dans l'étude seront répartis en deux groupes : jeunes (4-6 mois) et d'âge moyen (10-14 mois), afin de déterminer si le stress affecte davantage les individus plus âgés. Ces âges correspondent à ceux des jeunes adultes (20-30 ans) et des adultes d'âge moyen (40-45 ans) chez l'humain. Toutes les souris recevant la transplantation auront 3 mois, un âge optimal pour une transplantation efficace. L'expérience de transplantation nous permet d’étudier la capacité des cellules souches hématopoïétiques à s'auto-renouveler et à repeupler la moelle osseuse. Cette étude porte uniquement sur les cellules, indépendamment des souris receveuses. Nous utilisons des animaux âgés de 3 mois pour garantir une transplantation réussie et efficace.
Caractérisation et suivi longitudinal par imagerie métabolique, morphologique et fonctionnelle d’une exérèse de glioblastome avec injection ou non d’un hydrogel de chitosane
- Recherche appliquée
- Cancers
Six examens d'imagerie sous anesthésie en vingt-neuf jours, entre deux chirurgies du cerveau : 21 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués après la dernière séance. Une tumeur leur est greffée dans le tissu cérébral à J0, puis retirée partiellement à J10, la cavité opératoire étant laissée vide ou tapissée d'un hydrogel de chitosane. Le porteur décrit la chirurgie comme "assez invasive" et prévoit de tuer tout animal montrant des signes neurologiques, l'exérèse étant programmée avant l'apparition des signes cliniques. Le rat Fischer F344 est retenu pour la taille de son cerveau, suffisante pour l'implantation stéréotaxique et pour la résolution des appareils d'imagerie, et parce que les cellules tumorales F98 proviennent de cette même souche, ce qui écarte le rejet.
Objectifs
Les tumeurs intracérébrales représentent la forme la plus agressive des tumeurs du système nerveux central sans possibilité curative. Une infiltration des cellules tumorales dans le tissu cérébral sain favorisent inévitablement la récurrence. Le traitement standard actuel consiste en une résection chirurgicale accompagnée d’une radiochimiothérapie concomittante. Le projet proposé s’appuie sur un modèle de tumeurs cérébrales chez le rat. Après avoir implanté la tumeur dans le cerveau des animaux, celle ci est retirée chirurgicalement (exérèse) et partiellement (comme dans le cas d'une chirurgie chez l'être humain). Les cellules résiduelles sont à l'origine de la récidive survenant après l'opération. Lors de la chirurgie d'exerèse, la cavité formée lors du retrait de la masse initiale sera laissée telle quelle (non comblée) ou un hydrogel sera déposé à l'intérieur (tapissant ainsi la cavité opératoire). L'objectif de ce projet est ainsi de caractériser par imagerie le comportement de cet hydrogel mais aussi de caractériser la récidive tumorale. Pour ce faire, nous réaliserons d'une part des examens TEP (Tomographie par Emission de Positons) via l'injection d'un traceur radioactif afin de visualiser les foyers de récidive tumoraux. D'autre part, le comportement de l'hydrogel sera évalué grâce à l'outil d'imagerie par IRM (Imagerie à Résonance Magnétique) via un suivi longitudinal permettant d'estimer l'évolution du volume tumoral et des paramètres fonctionnels au cours du temps.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet initial permettront en première intention de caractériser le modèle syngénique opéré F-98 en présence ou non d'un hydrogel marqué au gadolinium. Le phénomène de récidivie tumorale inhérant à la chirurgie ainsi que le comportement de l'hydrogel déposé au sein même de la cavité opératoire pourront ainsi être appréhendés respectivement grâce à l'imagerie TEP et aux acquisitions IRM. Cette étape de caractérisation est indispensable avant même de pouvoir proposer l'application d'un hydrogel dans la cavité opératoire comme nouvelle voie de stratégie thérapeutique pour la recherche clinique. Le bénéfice attendu est donc à plus long terme d'utiliser l'hydrogel comme vecteur thérapeutique et adapter à posteriori son utilisation en oncologie humaine.
Procédures
- Induction tumorale : greffe des cellules tumorales dans le tissu cérébral (modèle orthotopique) à J0 (1 itération/1h) - Dégreffe : chirurgie d'exerèse à J10 (1 itération/1h) - examens TEP : J22/J29 (2 itérations/50 min par temps cinétique) - examens IRM : J9, J14, J21, J28 (4 itérations/1h30 par temps cinétique)
Impact sur les animaux
Chirurgie de xenogreffe (implantation des cellules tumorales) et chirurgie opératoire (exérèse) classées sévères mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux (cf description détaillée des procédures). Le développement de la tumeur (modèle infiltrant) peut engendrer des symptômes neurologiques mais la chirurgie d'exerèse se fait assez précocément bien avant l'apparition de signes cliniques (J10). La chirurgie opératoire est assez invasive mais une surveillance accrue des animaux sera réalisée afin de garantir leur bien-être. Tout animal présentant des signes neurologiques ou des signes de mal-être suite à l'opération sera mis à mort. Si toutefois l'analgésie se révèle insuffisante pour soulager la douleur et le bien-être, l'animal sera sacrifié. Les sessions IRM et TEP nécessiteront des anesthésies répétées, cependant les nuisances associées à ce type d'imagerie seront maitrisées via l'utilisation d'un tapis chauffant pour maintenir la chaleur de l'animal et les rats seront sous monitoring pour évaluer les fréquences respiratoires et cardiaques et ajuster le débit d'anesthésique selon la profondeur de l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort selon les méthodes en vigueur à l'issue des imageries (après la dernière imagerie prévue à J+29), selon les mêmes conditions et le même timing aussi bien pour les animaux dont la cavité opératoire est laissée telle quelle (procédure 1) que pour les anaimaux dont celle-ci est comblée par un hydrogel (procédure 2)
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible car le développement et la réponse au traitement in vivo de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques extrêmement complexes (intravasation, extravasation, envahissement du parenchyme cérébral, angiogenèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, cellules immunitaires, microglie locale, composition matricielle du stroma tumoral...). L’ensemble de ces facteurs dynamiques ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
En prenant en considération les contraintes du projet et en utilisant un logiciel de simulation afin d'établir l'effectif des animaux à inclure dans l'étude, il s'avère que 21 animaux au total seront nécessaires, pour une répartition de 7 animaux par groupe. Cet effectif intègre la perte possible d'un animal par groupe suite à l'intervention chirurgicale. Cet effectif est le minimum requis pour permettre des analyses statistiques pertinentes.
Raffinement
Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de papier craft et de buchettes en bois à ronger et bénéficieront d'un cycle jour/nuit inversé dans leur salle d'hébergement. Ils seront hébergés par 2 ou 3 et les expérimentations ne débuteront qu'après une semaine d'acclimatation suite à la réception des animaux. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur et après son retrait chirurgical (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement et la motricité, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Des points limites précoces sont définis (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement) afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. A noter que la salle d'hébergement des animaux et les salles dédiées aux chirurgies ou aux imageries sont situées sur le même site (rattaché à 1 seul etablissement utilisateur), ce qui évite un stress lié à un transport éventuel hors de la plateforme.
Choix des espèces
Les modèles animaux majoritairement utilisés pour les études en oncologie sont les modèles murins : souris et rats. Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante pour une implantation stéréotaxique de la tumeur dont le volume deviendra suffisamment important pour s'affranchir des limitations de résolution offertes par l’imagerie et permettre une injection de l’hydrogel de chitosane. Les rats immunocompétents Fischer F344 présentent l'avantage d'avoir un système immunitaire intégralement préservé (immunocompétents) et sont une souche de référence utilisée pour le développement d’un modèle syngénique murin de GBM. De plus, les cellules F98 ont été isolées d’une tumeur chez le rat Fischer, il n'y a donc pas de risques de rejet des cellules tumorales. Des rats âgés de 6 semaines seront utilisés à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Watson. George Paxinos, Keith B.J. Franklin, MA, PhD (eds). The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6th Edition. Elsevier Science Publishing Co Inc, (2007).
Etudes de l’implication de la boucle fronto-pariétale au cours de la mémoire de travail 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Craniotomie, injection stéréotaxique dans le cerveau, pose d'un implant crânien de deux heures trente : 3 000 souris subissent ces interventions, 2 880 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Les animaux implantés vivent seuls pendant treize semaines au maximum pour éviter la perte de l'implant, et une restriction hydrique pouvant durer huit à douze semaines les motive à exécuter la tâche. L'objectif déclaré est de décrire l'activité du réseau fronto-pariétal pendant la mémoire de travail, les retombées annoncées sur la schizophrénie étant renvoyées à de futures stratégies. Le RNT parle de "différentes tâches comportementales" en tête restreinte, sans jamais dire lesquelles.
Objectifs
La mémoire de travail est une des fonctions cognitives les plus importantes car elle assure la continuité entre le passé immédiat et les actions à venir en agissant comme carrefour d’échanges entre les informations sensorielles entrantes, la mémoire long-terme et la prise de décisions. Le cortex préfrontal a été proposé comme étant l’unique siège de la mémoire de travail depuis les années 70. Cependant de plus en plus d’études chez les primates non-humains et cliniques mettent en avant la nature distribuée de la mémoire de travail, notamment au niveau du cortex pariétal postérieur dans le réseau fronto-pariétal. Néanmoins, l'interaction fonctionnelle entre ces deux aires corticales au niveau des réseaux neuronaux et cellulaires a été très peu étudiée. Cette méconnaissance est principalement due aux limitations méthodologiques d'enregistrement. L’utilisation de modèles génétiques chez la souris couplée à des méthodes d’enregistrement électrophysiologique de large population de neurones permet de cibler de plus en plus finement les populations neuronales et les synapses d’intérêts dans le système nerveux central. De plus, le développement de nouveaux outils cellulaires permet l’expression d’outils moléculaires par les cellules et synapses impliquées spécifiquement durant la mémoire de travail. Une grande variété d’action est alors possible afin de bloquer, augmenter ou moduler dynamiquement des processus cellulaires et synaptiques d’intérêts. L’objectif général de notre projet, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, est d’investiguer l’activité neuronale dans le réseau fronto-pariétal pendant la mémoire de travail afin d’élucider son rôle spécifique ainsi que les mécanismes généraux y orchestrant. Ceci pourrait nous éclaircir sur la physiopathologie et le développement de nouvelles cibles thérapeuthiques pour des maladies comme la dépression et les troubles de l’attention où la mémoire de travail est particulièrement affectée.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de réseaux et cellulaires qui soutiennent la mémoire de travail et ainsi la manière dont notre cerveau traite cette tâche cognitive. De par les résultats qui en découlent, nous nous attendons à apporter de nouvelles connaissances dans la compréhension de l’organisation du réseau neuronal. Ces connaissances nous aideront donc à mieux comprendre non seulement comment la mise en place de la mémoire de travail s’effectue, mais également comment des maladies ou des troubles psychiatriques liés à une altération de cette mémoire peuvent se mettre en place. L’intérêt scientifique majeur de ce projet est d’utiliser de nouveaux outils cellulaires pour répondre directement à de nombreuses questions sur les mécanismes cellulaires mis en jeu lors de la mobilisation de la mémoire de travail en faisant le lien entre physiologie synaptique et activité de réseau. Pour cela, nous avons mis en place des approches multidisciplinaires allant de la physiologie synaptique à l’analyse d’activité de réseau. Nos données seront utilisées pour alimenter des réseaux de neurones artificiels pour mettre en lumière les mécanismes fondamentaux de la mémoire de travail afin de mettre en œuvre de meilleures stratégies pour contrebalancer son altération dans des maladies neuropsychiatriques telles que la schizophrénie.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, l’ensemble des animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour infection virale (30 min) avec ou sans implantation (2h30). La pose d’implant nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour la totalité de l’expérimentation, soit pour une durée de 13 semaines maximum, afin d’éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. Le test comportemental requiert le jeûne hydrique de 8-12 semaines maximum pour motiver les animaux à effectuer la tâche. Lors des tests comportementaux de mémoire de travail, réalisés dans le second établissement utilisateur, les animaux subiront 3 injections (30 min/injection, 1 injection/2 jours). Les animaux effectueront différentes taches comportementales se faisant sur 8-12 semaines consécutives maximum. Les animaux subiront 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant euthanasie et 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant l’imagerie intrinsèque.
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entraînent des effets indésirables sur les animaux : l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, les différentes implantations et la réalisation des points de sutures.L’animal subit également un stress lié à la diminution de comportements sociaux suite à l'isolement des animaux après implantations et lors du contrôle hydrique ou alimentaire. Un stress physique est également induit lors des contentions et lors de la tâche comportementale en tête restreinte. L'injection dans le péritoine provoque un stress physique dû à la contention et entraîne un effet indésirable de l’injection.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure pour réaliser des expériences d’electrophysiologie in situ ou pour des analyses histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques tel que le t-test, pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien-être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie implantaire est réalisée sous anesthésie gazeuse. Un contrôle de la respiration et de l’absence de réflexe sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une injection d’un anti-inflammatoire non stéroïdien est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 12 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra une injection quotidienne d’un anti-inflammatoire non stéroïdien jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux mâles et femelles de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Identification et caractérisation de biomarqueurs circulants innovants d’efficacité et de suivi thérapeutique des brûlures radiologiques dans un modèle murin d’irradiation localisée
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 540 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une irradiation de vingt-cinq minutes du membre inférieur sous anesthésie, jusqu'à neuf prélèvements de sang, jusqu'à neuf séances d'imagerie et une injection intramusculaire, avant un prélèvement terminal. Le porteur situe le pic de la brûlure radio-induite vers deux semaines après l'irradiation et ne signale qu'un léger ralentissement de la prise de poids, sans conséquence notable sur le comportement. Il affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" pour valider des biomarqueurs sanguins et fixe l'effectif à dix par groupe, ce qui suppose soixante-douze groupes sans qu'il en donne le détail.
Objectifs
Ce projet continue un travail précédent de notre laboratoire qui a identifié des biomarqueurs chez la souris. Ces biomarqueurs peuvent prédire et évaluer la gravité des brûlures causées par des radiations. Le but est de trouver de nouveaux biomarqueurs pour suivre et évaluer le traitement des lésions avec des cellules souches adultes ou des vésicules extracellulaires (VE). Nous utiliserons un modèle de brûlure radiologique chez la souris pour analyser les microARN, les métabolites et les vésicules extracellulaires dans le sang après irradiation et traitement. Nous étudierons aussi la réponse des tissus au traitement pour voir comment ces biomarqueurs évoluent pendant la réparation des lésions.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mettre en évidence des biomarqueurs innovants dans la circulation sanguine qui permettraient d’évaluer l’efficacité des traitements testés. L’ensemble de ces recherches vise à transférer sur le long terme ces découvertes vers une application clinique, afin de les utiliser concrètement pour améliorer le suivi des individus susceptibles de développer de telles lésions après un accident d’irradiation, ou pour le suivi médical des patients traités par radiothérapie.
Procédures
-Prélèvements répétés de sang sous anesthésie (max 9 fois) : 30 secondes - Irradiation du membre inférieur sous anesthésie (1 fois) : 25 min - Injection unique intra-musculaire sous anesthésie générale : environ 1 min/injection -Prélèvement terminal de sang sous anesthésie générale : 30 secondes - Imagerie non invasive sous anesthésie (max 9 fois) : 20 min L’ensemble de ces interventions seront réalisées sur la totalité des animaux de l’étude (720 souris).
Impact sur les animaux
L’irradiation à forte dose du membre inférieur conduit à une lésion radio-induite dont le pic de sévérité est atteint vers 2 semaines post-irradiation, suivi d’une phase de cicatrisation. Un léger ralentissement dans la prise de poids a été observé dans les premières semaines après irradiation, sans conséquence notable sur le comportement des animaux.
Devenir
Afin de réaliser les différents prélèvements pour les analyses des tissus, l’euthanasie de tous les animaux est nécessaire.
Remplacement
Pour identifier de nouveaux biomarqueurs sanguins liés à l'efficacité et au suivi des traitements des lésions radio-induites, nous devons utiliser un modèle in vivo. Ce modèle est essentiel car il permet d'évaluer globalement la réponse de l'organisme aux traitements, en reproduisant les interactions biologiques complexes. Contrairement aux modèles in vitro ou ex vivo, il permet d'étudier la réponse biologique complète dans un organisme vivant, incluant les interactions entre différents systèmes biologiques, conduisant à des changements dans la composition du milieu sanguin en termes de biomarqueurs circulants. Utiliser un modèle in vivo est donc nécessaire pour valider la pertinence des biomarqueurs circulants dans un contexte biologique complet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet, une étude statistique a été menée. Le nombre minimum d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 10 par groupe. Cet effectif nous fournira des résultats statistiquement robustes.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées aux procédures réalisées afin de limiter au minimum les impacts sur les animaux. Selon les retours d’expérience avec ce modèle, il n’est pas attendu de douleur pendant l’irradiation. Suite à l’irradiation, une rougeur avec ou sans œdème peuvent être observées. Il n’est pas attendu d’impact important sur l’état général des animaux. Les animaux sont observés tous les jours. Si un des indicateurs du bien-être n’était plus respecté, l’euthanasie pourrait s’avérer nécessaire. Si un hématome ou une lésion oculaire est observée en lien avec les prélèvements sanguins répétés, les prélèvements seront stoppés. De même, il n’est pas attendu de douleur pendant les imageries.
Choix des espèces
La souris est un modèle expérimental de référence pour les études précliniques. Les animaux utilisés dans cette étude seront âgés de 7 à 9 semaines (stade adulte, mâle et femelle). Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge et assurer la maturité des systèmes physiologiques.
Intérêt thérapeutique d’ARN longs non-codants dans la progression de la MASH dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Nourries pendant trois à trente-deux semaines avec un régime destiné à leur faire développer une stéatohépatite, une fibrose du foie puis un cancer hépatique, 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. La majorité, 504 d'entre elles, subit des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 80 un niveau léger et 16 un niveau modéré. Elles sont pesées deux fois par semaine et reçoivent des injections hebdomadaires d'un inhibiteur pendant quatre à huit semaines, pour vérifier si le blocage de certains ARN longs non-codants freine la fibrose du foie. Le porteur annonce l'induction d'une obésité prononcée, d'un syndrome métabolique et d'un hépatocarcinome, sans décrire à aucun moment ce que la croissance de cette tumeur fait subir aux souris.
Objectifs
La maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique a pour déclencheur une accumulation des lipides dans le foie et peut évoluer vers un état inflammatoire appelé stéatohépatite associé à un dysfonctionnement métabolique (MASH). La MASH conduit à une fibrose hépatique et, à terme, à la cirrhose qui représente un facteur de risque majeur dans le développement du cancer du foie. Les stratégies thérapeutiques pour limiter les lésions de fibrose associées à la MASH sont toujours limitées et reposent principalement sur des changements du mode de vie (alimentation équilibrée, activité physique). Ainsi, cibler la fibrose hépatique et appréhender les mécanismes moléculaires de la progression de la MASH sont des enjeux majeurs afin de développer des nouvelles options thérapeutiques efficaces. Dans une étude précédente, nous avons démontré que certaines molécules régulant l’expression des gènes sont impliquées dans la fibrose idiopathique pulmonaire et que le blocage de ces derniers non seulement prévient mais limite également la progression de la fibrose pulmonaire. Plus récemment, des résultats préliminaires similaires ont été obtenus dans différents modèles murins de fibrose hépatique. Ces données suggèrent donc que ces molécules sont des acteurs clé de la fibrose hépatique et que leur ciblage représenterait une approche thérapeutique pertinente pour limiter la progression de la MASH. Les objectifs de notre projet sont donc d’évaluer l’expression de ces molécules dans la progression de la MASH et d’évaluer leur potentiel thérapeutique dans la limitation de la progression de la MASH. Ces deux objectifs seront menés dans un modèle d’induction progressive de la MASH basé sur deux régimes alimentaires occidentaux (riches en graisse et en sucre) et considéré comme le plus représentatif de la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’intérêt thérapeutique d’une molécule dans la progression de la MASH en traitant la fibrose hépatique, le potentiel anti-fibrotique ayant été démontré dans des modèles cellulaires et dans des modèles animaux au préalable (dans la fibrose pulmonaire et dans la fibrose hépatique). A terme, ce projet devrait permettre d’obtenir la preuve de concept de l’utilisation de ce type de molécules dans la prise en charge des patients atteints de MASH pour lesquels les options thérapeutiques restent à l’heure actuelle très limitées.
Procédures
Lot 1: 80 souris recevront une injection de l’inhibiteur de la molécule ou son contrôle (30 sec). Elles seront pesées 2 fois (1 min). Durée totale : 5 jours. Lot 2: 16 souris recevront 2 injections par semaine, pendant 4 semaines, de l’inhibiteur de la molécule ou son contrôle (30 sec). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 5 semaines (1 min). Durée totale = 5 semaines. Lot 3: A: 140 souris recevront le 1er régime alimentaire et seront pesées 2 fois par semaine pendant 14, 24, 28 ou 32 semaines (1 min). Durée totale = 32 semaines. B: 112 souris recevront le 2ème régime alimentaire et seront pesées 2 fois par semaine pendant 3, 8, 12, 15 ou 24 semaines (1 min). Durée totale = 24 semaines. Lot 4 : 42 souris recevront le 1er régime alimentaire et seront pesées 2 fois par semaine pendant 30 semaines (1 min). Après 25 semaines, les souris recevront une injection par semaine pendant 4 semaines de l’inhibiteur ou son contrôle (30 sec). Durée totale = 30 semaines. Lot 5 : A: 42 souris recevront le 2ème régime alimentaire et seront pesées 2 fois par semaine pendant 13 semaines (1 min). Après 8 semaines, les souris recevront une injection par semaine pendant 5 semaines de l’inhibiteur ou son contrôle (30 sec). Durée totale = 13 semaines. B: 168 souris recevront le 2ème régime alimentaire et seront pesées 2 fois par semaine pendant 21, 22, 23 ou 24 semaines (1 min). Après 8 semaines, les souris recevront une injection de l’inhibiteur ou son contrôle par semaine pendant 8 semaines (30 sec). Durée totale = 24 semaines. Certains gestes sont communs à plusieurs lots : - L'ensemble des animaux (600 souris) subira un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. - Lots 3+4+5 (462 souris): Le développement de tumeurs hépatiques sera contrôlé par imagerie sur les animaux sous anesthésie gazeuse (30 min). Une injection sera réalisée sous anesthésie gazeuse (1 min). - Lots 4+5 (252 souris): les souris recevront une injection de glucose (30 sec) et un prélèvement de sang au niveau de la queue sera réalisé à différents temps pour évaluer leur tolérance au glucose (30 sec). Le test est réalisé 2 (lot 4) ou 5 (lot 5) fois.
Impact sur les animaux
Notre projet implique l’induction d’une fibrose hépatique et d’un cancer du foie. Les souris développeront une obésité prononcée (augmentation du tissu adipeux) et montreront des caractéristiques du syndrome métabolique (augmentation de la glycémie à jeun et altération de la tolérance au glucose) ainsi que des marqueurs sanguins élevés traduisant des lésions hépatiques.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes (reins et foie) dans le but d’étudier l’expression des molécules impliquées dans la fibrose dans ces organes et d’évaluer l’effet de leur inhibition dans la limitation de la progression de la MASH.
Remplacement
Des résultats antérieurs in vivo et in vitro obtenus au sein de notre laboratoire nous ont permis de : - démontrer l’implication de certaines molécules régulant l’expression des gènes dans la fibrose. - démontrer que leur inhibition prévient et améliore les lésions de fibrose pulmonaire et hépatique - pouvoir sélectionner deux candidats médicaments afin d’évaluer leur potentiel préventif et thérapeutique sur la progression de la MASH Cependant, les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le développement des lésions de fibrose, ni de la MASH. En effet, le processus de fibrose est un processus dynamique qui met en jeu de nombreux types cellulaires. De plus, compte tenu des nombreux facteurs induisant de la MASH ainsi que des différentes cellules impliquées, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier et de ce fait nécessite de recourir à l’expérimentation animale. Par ailleurs, la biodisponibilité d’une molécule pharmacologique in vivo n’est pas la même qu’in vitro. Les études chez la souris sont donc une étape pré-clinique indispensable pour évaluer l’utilisation d’une molécule en thérapie.
Réduction
Nos études in vivo antérieures nous ont permis de réduire significativement le nombre de molécules d’intérêt à tester et, de ce fait, de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour notre recherche. Nous avons utilisé des outils statistiques adaptés et à notre disposition afin d'évaluer au mieux le nombre minimal d'animaux nécessaires afin d'obtenir des résultats scientifiques robustes. De plus, les modèles utilisés dans ce projet sont complémentaires et utilisent des procédures déjà mises au point et couramment décrites. Les différentes procédures mises en œuvre pour ce projet ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Pour la mise en œuvre de ce projet qui durera 5 ans, le nombre total d'animaux estimé est de 600 souris.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi avec des cotons de nidification et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin de réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés de manière adaptée avant les procédures pouvant induire un stress ou une angoisse chez l’animal. Une surveillance régulière des animaux sera effectuée afin de déterminer toute douleur ou souffrance éventuelle et des points limites pertinents seront définis. Une grille d’évaluation de score sera établie de manière à pouvoir évaluer l’état de santé des animaux au cours des différentes procédures (dans lesquelles les grilles seront détaillées). Les principaux paramètres évalués seront les suivants : - Comportement, - Poids, alimentation, - Apparence, - Anémie, - Appareil digestif et urinaire Cette liste de critères permet d'alerter le personnel expérimenté sur l'état des animaux en les comparant notamment aux animaux contrôles et à l'état de leurs cages Lorsqu’un score de 6 est atteint et persiste pendant 24h ou que l’un des points limites (défini comme le niveau 3 de chaque critère observé) est atteint, les animaux seront mis à mort. Cette mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Le modèle murin constitue un modèle de choix pour l’étude de la fibrose et la MASH, de par notamment les nombreuses similitudes avec la pathologie observée chez l’homme. Les souris seront utilisées au stade jeunes adultes (8 semaines). Cet âge est idéal car la souris n’est plus en croissance ce qui permet un suivi plus rigoureux des signes vitaux (poids, comportement, …). De plus, les souris, dans le cadre de l’expérimentation, développeront un hépatocarcinome après plusieurs mois sous régime de type occidental. Ainsi, elles ne seront pas trop âgées non plus, ce qui évitera le développement de tumeurs spontanées et un environnement inflammatoire trop favorable au développement tumoral qui ne seraient pas liés à notre modèle.
Exposition chronique aux additifs et contaminants alimentaires inorganiques de la vie in utero à l’âge adulte chez la souris: impact d’une infection à Salmonella sur la réponse du système immunitaire systémique et l’homéostasie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Fournir aux instances réglementaires des données sur l'E551, un additif alimentaire à base de nanoparticules de silice : 88 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Exposées à l'additif de la vie in utero jusqu'à 130 jours après la naissance, elles reçoivent ensuite une injection unique de Salmonella. Le porteur indique que cette infection peut provoquer une morbidité et une mort rapide au bout de cinq jours, et écarte tout recours aux analgésiques et aux anesthésiques au motif qu'ils fausseraient les paramètres immunitaires mesurés. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet de recréer les dialogues inter-organes et conclut que le principe de remplacement est "inapplicable".
Objectifs
Ce projet fait suite aux résultats obtenus dans un précédent projet montrant une altération de la réponse immunitaire intestinal et systémique après exposition des animaux à l’additif E551 constitué de nanoparticules de dioxyde de silice. Ces données suggèrent une susceptibilité accrue aux infections chez les animaux exposés à cet additif. Ainsi, ce projet a pour but d’évaluer la susceptibilité des animaux exposés au E551 à une infection systémique induite par inoculation de la bactérie Salmonella.
Bénéfices attendus
Le projet permettra la mise en évidence de l'impact de l'additif dioxyde de silice sur la réponse des défenses immunitaires des suites d'une infection systémique à une bactérie pathogénique possiblement retrouvée dans l'alimentation (Salmonella). Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques de type Silice.
Procédures
Les animaux auront été exposés au préalable à l'additif alimentaire contenant des nanoparticules de dioxyde de silice à une dose encadrant l'exposition humaine et ce de manière périnatale et pendant 130 jours post-natal. Puis ils seront infectés à Salmonella délivrée par une injection unique nécessitant une contention d’environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
L'injection de Salmonella s'effectue après contention de l'individu et peut engendrer un stress lié à la manipulation de l'animal et à l'injection en elle-même. L'infection par Salmonella de degré sévère peut conduire à une morbidité et une mortalité rapide au bout de 5 jours.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements permettant d'étudier la réponse immunitaire contre Salmonella.
Remplacement
Le projet étudie la réponse à une infection à Salmonella Typhimurium, après une période d'exposition à un nanomatériel alimentaire allant de la périnatalité au stade adulte sur un organisme. L'utilisation du modèle animal est nécessaire afin d'avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus l'étude portera sur des impacts de l'axe intestin-réponse immunitaire systémique. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues inter-organes. Du fait de ces 2 raisons majeures, le recours à l'animal est donc nécessaire et le principe de remplacement inapplicable.
Réduction
Pour optimiser le nombre d'animaux utilisés, une étude pilote sera effectuée pour déterminer l'inoculum optimale et le temps d'observation post-injection et ainsi réduire le nombre de groupes. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids significative ou une diminution de la prise alimentaire seront écartés de l'étude et des soins adaptés leur seront donnés. L'infection par Salmonella peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur mise à mort. L'emploi d’analgésiques et d’anesthésiques perturberait la réponse à l'infection par Salmonella et influerait sur les paramètres immunitaires mesurés, rendant leur utilisation incompatible avec notre étude.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils et savoirs sont développés afin d'étudier le système immunitaire et la réponse à une infection, notamment par Salmonella. Des résultats préliminaires concernant l'exposition in utero et chronique aux additifs alimentaires ont déjà été obtenu sur une lignée murine. Cette même lignée a aussi été utilisé par d’autres équipes de recherche et montre une sensibilité à l’infection par Salmonella. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l'âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.
Evaluation de l’efficacité thrombolytique de vésicules extracellulaires fibrinolytiques sur des thrombi de différentes compositions moléculaires dans le contexte du sepsis
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
231 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs percent leur intestin terminal au cours d'une chirurgie de dix minutes, ce qui déclenche une infection généralisée, avec fièvre, douleur, perte de poids et prostration. L'objectif est de décrire la composition des caillots qui se forment pendant un sepsis et de tester si des vésicules extracellulaires les dissolvent. Le porteur justifie le recours aux souris par le fait que "la réglementation interdit de faire ce type de recherche sur des humains en bonne santé".
Objectifs
Objectif 1 : Il s'agit de comprendre de quoi sont faits les caillots qui se forment dans les organes pendant une infection grave Objectif 2 : L'idée est de tester si de petites particules biologiques peuvent dissoudre ces caillots, et de voir si leur efficacité dépend de la composition des caillots
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce travail, une description de la composition moléculaire des caillots dans le modèle murin d'infection grave pour pouvoir comprendre pourquoi les patients réagissent de manière différente aux traitements habituellement utilisés en clinique.
Procédures
C'est une procédure chirurgicale courte (10 min) pendant laquelle les animaux sont endormis et ou l'on perce la partie terminale de l'intestin ce qui a pour conséquence d'induire une infection grave. La souffrance induite par cette intervention sera évaluée et maitrisée à l'aide d'antalgiques.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus pour les animaux sont: une douleur au niveau de la zone d'incision, l'infection grave provoquée peut causer une perte de poids, du stress et de la douleur, de la fièvre, une fatigue intense de l'animal, et une diminution de réactivité.
Devenir
La procédure chirurgicale réalisée induit une infection grave, avec une réponse inflammatoire généralisée. En raison de la gravité de l'infection et pour éviter une souffrance inutile, à l'issue de la procédure l'ensemble des animaux seront mis à mort.
Remplacement
Dans notre programme de recherche nous utilisons des tests in vitro pour étudier comment certaines substances affectent la dissolution des caillots sanguins. Ces tests sont complémentaires et nous ont permis de réduire le nombre de souris utilisées bien qu'ils ne puisse pas complètement remplacer les expériences sur les animaux. En effet pour comprendre comment les petites particules biologiques agissent sur les caillots qui se forment dans le corps pendant une infection grave et vérifier qu'elles ne sont pas dangereuses pour la santé, il est nécessaire de maintenir une partie des expériences sur l'animal. Cela est lié au fait que la réglementation interdit de faire ce type de recherche sur des humains en bonne santé et que nous avons besoin d'un modèle animal déjà bien connu.
Réduction
Les études sur les animaux peuvent donner des résultats différents d'un individu à l'autre, c'est pourquoi il faut un nombre suffisant pour chaque expérience. Ce nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, nous avons recours à des tests en laboratoire qui nous permettent de mesurer et comparer les effets de traitements utilisés à l'hopital sur des caillots modélisés sans avoir à utiliser des animaux
Raffinement
Pour limiter la souffrance animale durant cette procédure, nous avons mis en place plusieurs mesures pour réduire la nuisance du procès sur le bien être animal. Avant l'intervention chirurgicale, les animaux recoivent une anesthésie locale pour réduire la douleur directement à l'endroit ou la chirurgie va avoir lieu. L'opération sera la plus courte possible
Choix des espèces
La souris est le modèle in vivo disponible le plus simple à exploiter aux vues des données existantes dans la littérature, de sa taille et de sa disponibilité pour l'étude de la composition moléculaire des caillots dans les infections graves. Les animaux seront utilisés à l'age de 6-8 semaines car cet âge permet d'obtenir des modèles d'infection qui sont similaires à ceux décrits dans les études scientifiques et ce qui permet de travailler sur des modèles déjà bien connus et documentés.