Lapins

Environ 10 % des animaux n'ayant pas suivi la procédure entière seront gardés en vie et réutilisés ailleurs, tous les autres seront tués pour analyse des yeux. 1 600 souris, 1 600 rats et 1 600 lapins vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance légère, pour installer une rétinopathie diabétique par injection de produits de glycation. Selon les cas, l'injection se fait dans l'abdomen, dans la veine ou directement dans l'œil, avec jusqu'à huit instillations oculaires par jour et des examens ophtalmologiques hebdomadaires sous anesthésie légère. Le porteur écrit que les maladies de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'être humain et transpose cette conclusion à l'animal, tout en annonçant une altération permanente de la vision de l'œil traité.

Objectifs

La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'œil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. L'objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de rétinopathie diabétique afin de tester des traitements potentiels qui pourraient améliorer la pris en charge de cette pathologie. Une étape clé dans l’installation de cette maladie et la détérioration des parois des capillaires sanguins de la rétine. Les capillaires sanguins perdent leur étanchéité ce qui induit une augmentation de la perméabilité vasculaire et une rupture de la barrière hématorétinienne, des hémorragies et des exsudats qui lèsent la rétine et altèrent son fonctionnement neuronal. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine essentielle pour la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. L'excès de sucre dans le sang (l’hyperglicémie) génère des produits dérivés appelés les produits avancés de glycation : les AGEs. Ces AGEs sont impliqués dans le développement des complications du diabète. Une stratégie pour reproduire l’atteinte vasculaire de la rétinopathie diabétique consiste en l’injection de AGEs exogènes chez les rongeurs et le lapin. Selon les protocoles disponibles dans les publications scientifiques, l’injection peut se faire par différentes voies : injection intra veineuse, intra vitréenne, intrapéritonéale. Dans un premier temps nous souhaitons induire le modèle par injection intrapéritonéale de AGEs chez les rongeurs, en cas d'échec, s'il n'y a pas eu d'induction et que les signes cliniques ne sont pas présents, les injections intraveineuses seront envisagées ou encore l'injection intravitréenne (à l'intérieur de l'œil) chez les 3 espèces. Les durées des études peuvent être différentes selon le mode d'administration : 1 à 2 semaines pour les injections quotidiennes intrapéritonéales et intraveineuses et quelques heures à quelques jours pour les injections uniques intravitréennes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements agissants sur la composante vasculaire de la rétinopathie ou neuroprotecteurs de la rétine chez les diabétiques.

Procédures

Le déclenchement du modèle est dû à une injection par piqûre intrapéritonéale, ou intraveineuse ou une injection intravitréenne, un seul mode d'induction par animal. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour (on estime un maximum de 8 fois). Les injections (intrapéritonéale, sous cutanées...) peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, avec une procédure qui dure cinq minutes tout au plus, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine sur maximum deux semaines. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt (durée de moins d'une minute pour le prélèvement). De manière générale, les études auront une durée variable qui pourra aller d'1 jour à deux semaines.

Impact sur les animaux

Les maladies vasculaires ou neurodégénératives de la rétine ne sont pas douloureuses chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux intéractions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animaux en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

Pour installer dans l'établissement un modèle de décollement de la rétine, 1 600 lapins, 1 600 rats et 1 600 souris vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Le décollement est provoqué par une injection sous la rétine, suivie d'examens oculaires hebdomadaires, d'instillations quotidiennes, d'injections dans l'œil une à deux fois par semaine et de prises de sang. Le porteur affirme que le décollement de rétine n'est pas douloureux chez l'être humain et transpose ce constat aux autres animaux, tout en indiquant que l'œil injecté subira une altération permanente de la vision. Les animaux qui suivent la procédure entière sont tués pour analyse des tissus, les autres, environ 10 %, sont gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure.

Objectifs

La rétine est un tissu photo sensible nécessaire à la vision. Elle tapisse l’intérieur de l’œil, reçoit les informations lumineuses, les transforme en signaux nerveux et les transmet au cerveau. Certains troubles de la vision peuvent être dus à un décollement de rétine. Les causes du décollement rétinien peuvent être variées (myopie, opérations de la cataracte, diabète, tumeurs de l’œil, forte inflammation, vieillissement des structures de l’œil, un coup porté à l’œil, ou encore hérédité…). Le mécanisme impliqué est le plus souvent une accumulation de liquide sous la rétine, qui pénètre par des trous ou des déchirures de la rétine. Lors de ce décollement la rétine est séparée physiquement de son support, si cette séparation persiste les cellules de la rétine meurent, la zone décollée ne fonctionne plus. Sans traitement par l’ophtalmologiste le décollement s’étend, pouvant ainsi entrainer des lésions irréversibles de la rétine et même la cécité. L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle de décollement rétinien chez les rongeurs et le lapin, afin de tester des traitements qui vont permettre la survie de la rétine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de participer à la recherche de nouveaux traitements neuroprotecteurs de la rétine dans les cas de décollement rétiniens.

Procédures

Le déclenchement du modèle expérimental est dû à une injection sous rétinienne. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques (imagerie, observations au biomicroscope, électrorétinogramme) réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes et se produit une fois par semaine Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois par jour. Les injections peuvent être quotidiennes pendant une durée d’une semaine. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leur fréquence est limitée, une à deux fois par semaine. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt.

Impact sur les animaux

Les maladies neurodégénératives de la rétine et les décollements ne sont pas douloureux chez l'homme, et par transposition chez l’animal. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue. Elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant, de lampe chauffante ou d’armoire de réveil chauffée en fonction des espèces.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Les animaux n’ayant pas reçu la totalité de la procédure expérimentale (estimé à environ 10%) pourront être gardés en vie et réutilisés dans une autre procédure, après avis du vétérinaire si besoin.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. La possibilité d'induire les deux yeux sera étudiée pour limiter le nombre d'animal en étude si cela est compatible avec le mode de traitement. L'induction de la pathologie dans l'œil entraine une altération partielle et permanente de la vision, nous avons déjà expérimenté ce modèle dans notre laboratoire, il n'a pas été observé d'altération de comportement des animaux envers leurs congénères ou concernant la prise alimentaire. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés par deux au minimum en première intention, avec enrichissement à ronger et un abri pour les rongeurs plateforme pour les lapins. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction de la quantité et des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.

Réutilisés jusqu'à trois fois, 8 lapins sont utilisés pour nourrir des tiques déposées sur leurs oreilles sous anesthésie, cinquante nymphes ou dix couples d'adultes par oreille, avec une collerette maintenue pendant le gorgement. 200 souris reçoivent chacune cinquante à cent larves et restent isolées jusqu'à sept jours avec un enrichissement appauvri, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les souris sont tuées après la collecte des tiques, faute d'être réutilisables ou adoptables selon le porteur, alors que quatre lapins sont réutilisés et quatre adoptés. Sur le remplacement, il décrit des systèmes de gorgement artificiel jugés prometteurs mais pas encore prêts, avec 57 % de femelles pondeuses, et annonce une veille documentaire régulière.

Objectifs

Le but de ce projet est de maintenir une lignée de tique, afin de disposer de lignées de laboratoire au fond génétique commun. Ces tiques constituront un matériel pour : - Analyser la transmission de différents microorganismes aux animaux. En effet, bien que l'inoculation des microorganismes soit possible à la seringue, celle-ci reproduit de façon très imparfaite la transmission des agents infectieux par les tiques et ne permet pas de l’étudier. - Elles permettront également d’analyser les déterminants susceptibles de provoquer une attractivité plus importante des tiques chez certains individus.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de maintenir pour fournir des tiques possédant un fond génétique commun afin de réaliser plusieurs expériences dont les principaux axes sont les suivants : - Étude des déterminants favorisant l’attractivité des tiques. Chez les moustiques, une attractivité différentielle entre individu a été mise en évidence. En effet, certains individus sont plus « attracteurs » que d’autres définissant ce que l’on peut appeler une « peau à moustiques ». Les déterminants chimiques de cette attractivité sont en partie connus et seraient liés au microbiote cutané. Empiriquement, une attractivité différentielle entre individus est observée pour les tiques. Les déterminants de cette dernière demeurent inconnus. Un des buts de l’élevage est d’étudier les déterminants de cette activité in vitro en utilisant les tiques de l’élevage. - Mesure de la compétence vectorielle et analyse de la transmission des microorganismes. Les tiques hébergent différents microorganismes susceptibles d’être transmis à l’homme. Disposer de tiques de laboratoires dont le fond génétique est commun et maitrisé permet de savoir si ces microorganismes sont d’abord effectivement transmis lors du repas sanguin, c’est-à-dire si cette espèce est un vecteur compétent. Une fois la compétence vectorielle affirmée, nous nous intéresserons aux modalités de cette transmission (localisation des microorganismes lors des phases de diapause des tiques ou lors du repas sanguin), ainsi qu’aux déterminants permettant cette transmission. Pour cela les tiques seront nourri sur animaux porteur du microorganisme d’intérêt. Ces projets feront l’objet d’autorisations spécifiques séparées de la présente saisine.

Procédures

- Lapin : dépôt des tiques (50 nymphes ou 10 couples d’adultes/oreille) confection du manchon en tissu et fixation à l’aide d’un sparadrap médical. Gestes réalisés sous anesthésie générale (protocole décrit dans la procédure - Souris : dépôt des tiques (50 à 100 larves/individu) sur animal vigile. La durée de gorgement est de maximum 10 jours pour les lapins et de maximum 7 jours pour les souris.

Impact sur les animaux

Concernant les lapins les effets indésirables sont concomitants au repas sanguin, des réactions inflammatoires locales à la piqure de tiques peuvent s’observer jusqu’à 4 semaines après le repas sanguin : - inconfort lié au port de la collerette - irritation du cou à cause du port de la collerette et irritation de la base des oreilles - au site de piqure, les tiques peuvent provoquer une réaction inflammatoire locale susceptible de démanger le lapin. - Les procédures peuvent induire de la fièvre. Concernant les souris, les effets indésirables sont concomitants au repas sanguin et correspondent à des réactions locales inflammatoire à la piqure des tiques. A noter que lors du repas sanguin (5-7 jours) les souris seront isolées avec un enrichissement apauvri. Un tunel transparent et un barreau à rongé seront néanmoins à leur disposition.

Devenir

Concernant les lapins, il n'ont pas été en contact avec des tiques porteuses de microorganismes, les lapins peuvent petre adoptés. De plus, ils ont été en contact avec l'homme pendant leur vie. Il font d'excellent candidats à l'adoption. Concernant les souris, elle ne peuvent être réutilisée et son difficilement adoptable, elles seront donc mise à mort.

Remplacement

Les systèmes de gorgement artificiel pour tiques, bien qu'étudiés, ne sont pas encore commercialisés et présentent des limites qui empêchent le remplacement des hôtes animaux pour l'élevage de tiques. Des travaux, montrent que le nourrissage artificiel nécessite une grande expertise, avec des résultats variables avec seulement 57% des femelles qui ont pondu. Des recherches similaires confirment ces résultats sans pour autant détailler l'efficacité sur les générations successives ou le taux de développement des tiques. Les comparaisons entre les tiques nourries artificiellement et celles sur des hôtes animaux révèlent des taux de réussite inférieurs pour la reproduction et le nourrissage dans le cas d'un nourrissage artificiel. Une étude apporte une contribution significative en explorant tout le cycle d'Ixodes ricinus mais soulève des questions sur l'approche statistique utilisée et l'impact des antibiotiques sur le microbiote des tiques, un aspect crucial pour la conservation de lignées en laboratoire. En conclusion, bien que prometteurs pour certaines recherches, les systèmes de nourrissage artificiel ne sont pas encore prêts pour remplacer l'élevage sur animaux en laboratoire. Une veille scientifique sur le site de l’ECVAM concernant ce point sera régulièrement réalisée et présentée en SBEA.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisés pour le maintien de l’élevage de tiques est minimisé au mieux. L’expérience des années précédentes sur l’élevage de tiques ainsi que l’expérience de nos collègues de Neuchatel nous permet d’estimer à 100 souris/an et 4 lapins par an pendant la durée de ce protocole. Afin de minimiser l'utilisation des lapins, ils seront utilisés 3 fois.

Raffinement

Durant la procédure, les souris sont isolées pour un maximum de 7 jours, avec des contrôles réguliers pour évaluer leur état et collecter les tiques gorgées, tout en maintenant un contact olfactif avec leurs congénères. Elles disposent d'un tunnel, d'un barreau à ronger et de coton. L'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques. Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Les souris sont euthanasiées après la collecte des tiques, sans dépasser 7 jours. Les lapins, quant à eux, suivent un entraînement bi-quotidien de 20 minutes incluant la contention, l'habituation à des manipulations et à la collerette, et l'introduction de récompenses pour encourager les comportements désirés. En outre, ils bénéficient de minimum une heure d'activité quotidienne dans un enclos de 1m² pour leur bien-être physique. Pour le dépôt des tiques, une sédation est administrée aux lapins. Cette approche assure le bien-être animal tout en facilitant les procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et les nymphes de tiques. Les lièvres ou les lapins sont piqués par des tiques (toutes les stases, y compris les femelles) dans la nature. Le lapin de laboratoire constitue donc une bonne alternative pour le repas sanguin des stases nymphales et adultes et les souris permettent le gorgement à la fois des nymphes et des larves. A noter que nous allons privilégier les lapins pour les stases nymphales car ces derniers sont réutilisés et adopté au terme des procédures. Cela limite donc le nombre de souris. Age pas d’impact. Nous pourrons utiliser les animaux disponibles à l’animalerie

3 000 lapereaux subissent une biopsie de tissu, répétée une fois à une semaine d'intervalle, pour trier ceux qui portent la modification génétique permettant de produire un médicament dans le lait de lapines. Ils relèvent d'un niveau de souffrance léger, la biopsie provoquant une douleur légère et un stress transitoire à la préhension, sur des animaux âgés de cinq à douze jours. Le remplacement de la biopsie d'oreille par un prélèvement de follicules pileux est à l'étude dans l'établissement, sans être assez avancé pour arrêter les biopsies. Les lapereaux reconnus non transgéniques sont tués au plus tard au sevrage, le porteur invoquant un risque de modification génétique partielle ou non détectable, tandis que les transgéniques sont gardés pour la reproduction et la traite.

Objectifs

Notre objectif est de produire des protéines recombinantes thérapeutiques (protéines produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) avec l’objectif de soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales et nous produisons ces protéines dans le lait de lapines transgéniques. Ce projet a pour objectif de génotyper des lapereaux que nous créons par transgénèse ou par croisements, afin de déterminer ceux qui portent la modification génétique souhaitée.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de connaitre le statut génétique des animaux que nous générons pour notre objectif final : produire des protéines recombinantes pour soigner l’Homme, dans le lait de lapines transgéniques. Ce projet participe donc à la production de protéines médicaments dans le lait de lapines pour soigner des maladies rares humaines.

Procédures

Les lapereaux subiront un prélèvement minime de tissu (1 à 2 fois selon les résultats, à 1 semaine d’intervalle).

Impact sur les animaux

La nuisance attendue sur les animaux est la douleur, légère, due à la biopsie, ainsi qu’un stress léger et transitoire lors de la préhension pour biopsie.

Devenir

Les lapereaux déterminés comme non transgéniques seront euthanasiés, au plus tard au moment du sevrage, car il subsiste toujours un risque de modification génétique partielle ou non détectable dans ces animaux. Les lapereaux transgéniques seront gardés pour être mis en reproduction, pour obtenir du lait des femelles. Leur matériel génétique sera cryoconservé sous forme de sperme ou d'embryons.

Remplacement

La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques permet de produire des protéines de structure complexe, compatible avec leur utilisation chez l’humain comme médicament. Le médicament que nous avons produit à partir de nos lapines transgéniques est plus efficace et plus sûrs que « concurrents » car il n’est pas dérivé du plasma humain, n’entraine pas une surexposition du corps à de trop fortes concentrations car son élimination est rapide, ne contient pas d’autres protéines que celle souhaitée ni de virus ou protéines potentiellement dangereux. En tant que mammifère, la lapine synthétise des protéines similaires à celles de l’Homme, (en quantité et qualité) ce qui est permet une meilleure efficacité du traitement auprès des patients, ce qui n’est pas le cas des protéines produites par des bactéries ou des levures. Nous travaillons actuellement sur le remplacement de la biopsie d’oreille par le prélèvement de follicules pileux mais nos travaux ne sont pas encore finis. Nous n’avons pas testé à ce stade assez d’échantillons pour pouvoir arrêter les biopsies d’oreilles.

Réduction

Pour l'optimisation de la production des protéines, nous avons mis au point des tests prédictifs d'efficacité de nos vecteurs dans des lignées cellulaires. Nous testons tous les vecteurs de nos cibles génomiques afin de pouvoir présélectionner les plus efficaces avant de passer à la micro-injection dans des embryons au stade 1 cellule. Cela nous permet de diminuer le nombre total d’animaux utilisés et de ne pas faire naître des animaux qui n’ont pas d’intérêt scientifique. Lorsqu’une portée nait, il ne nous est pas possible de réduire le nombre d’animaux à génotyper, car nous sommes dans l’attente d’obtenir un ou des animaux transgéniques. En revanche, nous sommes très attentifs à ne pas créer inutilement des portées à génotyper, préférant garder des animaux transgéniques dont nous n’avons pas besoin sur le moment, plutôt que de générer une nouvelle portée si le besoin apparaissait plus tard. Il s’agit ici d’une gestion raisonnée, mais aucune approche statistique n’est utilisée.

Raffinement

Les lapins sont surveillés quotidiennement et des points limites précoces sont strictement appliqués. Ils reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent, ce qui leur permet d’interagir. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de pouvoir se cacher, un de leur comportement naturel. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux, et elle est associée à la lumière et la présence des techniciens animaliers. Depuis quelques mois, nous avons abandonné l’identification par tatouage. Tous les lapereaux sont contrôlés au minimum une fois par jour, le matin après le passage de la mère dans le nid pour l’allaitement de sa portée. Nous vérifions si les lapereaux ont bu le lait de leur mère par la présence d’ une poche de lait dans leur abdomen. S’ils n’ont pas bu ou pas assez, nous préparons de l’allaitement artificiel ou leur donnons du lait d’une autre lapine afin de les complémenter. Nous pouvons également faire adopter les lapereaux issus de trop grandes portées par une femelle ayant eu une portée plus petite.

Choix des espèces

Pour la production de protéines recombinantes dans le lait, le lapin a été choisi par notre société car : - courte période de gestation (30 jours), - maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), - important volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), - synthèse de protéines complexes et en quantité importantes par la glande mammaire (glycosylation et gamma carboxylation similaires à celles de l’Homme). Les animaux seront utilisés très jeunes : le prélèvement invasif aura lieu entre 5 et 12 jours de vie. Il est impératif de savoir rapidement si un animal est transgénique dans le but de planifier ou non de nouvelles procédures ou des accouplements.

Réduire les troubles digestifs du sevrage et l'usage d'antibiotiques dans les élevages de lapins : c'est à cette fin qu'une phéromone de synthèse est testée sur 6 lapines et 48 lapereaux, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque lapereau est immobilisé et piqué à la veine d'une patte arrière à l'état éveillé, jusqu'à six fois à raison d'une par semaine, et trente-deux d'entre eux vivent seuls en cage grillagée pendant trente-cinq jours, vingt-trois heures par jour en semaine et vingt-quatre le week-end. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel peut provoquer des comportements anormaux et une baisse d'activité, et que la collecte hebdomadaire de leurs fèces molles les prive d'un aliment qu'ils consomment normalement. Les 48 lapereaux sont tués au trente-cinquième ou au soixante-dixième jour pour prélever leur intestin, les 6 mères étant gardées vivantes, jeunes et en bonne santé, pour de futures procédures.

Objectifs

Le bien-être des lapins domestiques est une préoccupation croissante en Europe. Qu'ils soient des animaux de compagnie ou d'élevage, ils sont souvent soumis à des situations stressantes comme la manipulation, les changements d'environnement, les rencontres avec d'autres lapins, les déplacements ou les visites chez le vétérinaire. Il est crucial d'améliorer l'élevage des lapins pour les rendre plus résistants et mieux adaptés à leur environnement. Aujourd'hui, l'élevage vise à assurer leur bien-être, à optimiser leur alimentation, à renforcer leur système immunitaire et à réduire l'usage des antibiotiques. Le microbiote (l’ensemble des virus, bactéries, champignons) intestinal des lapins joue un rôle vital dans ces objectifs. Il influence la digestion, le métabolisme, la santé intestinale, l'immunité et même le fonctionnement cérébral. Les premières semaines de vie sont essentielles pour le développement du microbiote car c'est à ce moment-là que l'intestin des lapins est colonisé par des micro-organismes. Ce projet de recherche examine si l'utilisation de phéromones apaisantes maternelles durant les premières semaines de vie des lapereaux, notamment lors de moments tels que la séparation de la mère, le sevrage et le mélange d'animaux, peut réduire le stress et influencer la composition du microbiote intestinal. Des études antérieures suggèrent que les phéromones pourraient influencer le microbiote. Cette recherche vise à approfondir ces connaissances en examinant l'effet des phéromones sur différentes espèces d'élevage, y compris les lapins, qui sont particulièrement sujets à des problèmes intestinaux. Réduire l'usage d'antibiotiques dans l'élevage des lapins nécessite de nouvelles approches pour maintenir leur santé, en particulier pour prévenir les troubles digestifs après le sevrage, liés à des déséquilibres dans le microbiote intestinal et/ou à une immaturité de l'intestin et/ou du système immunitaire. Cette étude vise à déterminer si l'exposition des lapereaux aux phéromones pendant leurs premières semaines de vie peut favoriser le développement d'un microbiote intestinal sain, ainsi que la maturation et le bon fonctionnement de leur système digestif et immunitaire. Pour ce faire, différents aspects seront étudiés, comme la composition du microbiote intestinal, la fonction immunitaire, la structure de l'intestin, la capacité de l'intestin à agir comme barrière protectrice, les capacités digestives, ainsi que le comportement des animaux.

Bénéfices attendus

Le bien-être des lapins de compagnie et d'élevage est de plus en plus important en Europe. Par exemple, dans les élevages de lapins, les maladies intestinales restent une grande menace. Le stress peut affaiblir le système immunitaire, entraînant des réponses immunitaires moins efficaces. Cela peut causer des problèmes digestifs après le sevrage, une période de grands changements pour les lapins. Leur système immunitaire n'est pas encore complètement développé à ce stade. Le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans le développement du système immunitaire et digestif. Une idée intéressante pour améliorer la santé des lapins, et prévenir les maladies intestinales, est de favoriser un bon microbiote. Utiliser une phéromone apaisante maternelle de lapin pourrait aider à réduire le stress et à améliorer leur bien-être. Ce projet vise à montrer comment cette phéromone peut aider à développer un microbiote intestinal sain et diversifié, renforçant ainsi les défenses immunitaires et digestives et réduisant les effets du stress. À long terme, cela pourrait réduire l'utilisation d'antibiotiques chez les animaux domestiques, contribuant ainsi à lutter contre l'antibiorésistance et à améliorer les pratiques d'élevage, conformément au concept "Une seule santé".

Procédures

Tous les lapereaux (48 au maximum) subiront au moins une fois une immobilisation et un prélèvement sanguin réalisé sur animaux éveillés. Cette intervention (immobilisation et prise de sang) devrait être d'une durée inférieure à 10 minutes/lapin. Pour deux tiers des lapereaux (32 au maximum), cette intervention (immobilisation et prise de sang) sera répétée encore 5 fois, à raison d'une fois/semaine, jusqu'à la fin de la procédure au 70ème jour. Deux tiers des lapereaux (32 lapereaux au maximum) seront hébergés individuellement, toutefois sans isolement visuel, olfactif et auditif d'avec les autres lapins, et dans des cages métalliques grillagées spacieuces fournies avec du matériel d'enrichissement, pendant 35 jours, à raison de 23h maximum par jour les jours de semaine, et 24h par jour le week-end. En effet, les lapereaux issus d’une même portée (pour assurer la compatibilité avec les autres lapins) seront sortis de leurs cages et regroupés dans un « parc d’activités » (enclos sur 2 niveaux, avec paille, matériel à ronger, jouets, tunnel, rampe, cabane) pour leur permettre exercice physique et socialisation avec les autres lapins et les habituer à la manipulation, à raison d’1h/jour minimum, tous les jours de semaine.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les nuisances attendues pour les animaux sont représentées par : (i) les conditions d’hébergement puisque dans la phase 2 de l’étude, les animaux seront hébergés individuellement (sans isolement visuel, auditif et olfactif) au-delà de 24h. Cela peut conduire à l’apparition de comportements anormaux chez les animaux, une baisse de leur activité physique et à une altération de leur bien-être ; (ii) par la privation d’une partie de leurs fèces molles lors des prélèvements hebdomadaires de ceux-ci, empêchant leur consommation si celle-ci se met en place avant la fin de l’étude, pouvant possiblement altérer les apports nutritionnels au lapin ; (iii) par la manipulation et la contention des lapereaux lors des pesées et prises de sang dans la phase 2, possiblement sources de stress psychologique; (iv) par l’introduction d’une aiguille dans la veine de la patte arrière sur animal éveillé lors des prises de sang dans la phase 2, qui peut être source de douleur et possiblement créer un hématome sur le site du prélèvement; (v) par la piqûre pour l'anesthésie préalable à l’injection d’euthanasiant lors de la mise à mort des animaux (au 35e et 70e jour) qui peut être source de douleur.

Devenir

Les 6 lapines gestantes puis mères n'auront subi qu'une procédure légère (exposition au traitement pendant 45 jours, et seulement pour la moitié d'entre elles de surcroit, le groupe placebo n'étant pas exposé à la phéromone apaisante), elles seront encore jeunes, attendues en bonne santé, et donc pourront être réutilisées dans de futures procédures. Tous les laperaux (48 individus au maximum) seront mis à mort au cours de la procédure (soit au 35ème jour pour 1/3 d'entre eux, soit au 70ème jour pour 2/3 d'entre eux) car l'étude implique des prélèvements léthaux, qui seront réalisés post-mortem: tissus intestinaux (section et muqueuse de l'iléon) et contenu intestinaux (digesta du caecum et de l'iléon). Ces prélèvements seront utilisés dans des analyses biologiques visant notamment à déterminer la composition du microbiote (proportion et identité des différentes bactéries), la présence de certaines espèces bactériennes favorables, la structure/architecture de la muqueuse intestinale, à mesurer l'expression de certains gènes modulant le système immunitaire et la fonction barrière intestinale.

Remplacement

Il s’agit d’une étude de recherche fondamentale investiguant les effets de la phéromone apaisante de lapin sur le comportement, les paramètres d'élevage, la physiologie des systèmes digestifs et immunitaires, et le microbiote (communauté des micro-organismes) du lapin, le tout formant des systèmes biologiques interdépendants et s’influençant mutuellement. En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement phéromonal est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle. Cela nécessite donc l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des lapins.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans l'étude est déterminé par des calculs statistiques pour détecter un effet significatif du traitement, basés sur des études précédentes. En fonction des données et des tests, 3 à 12 unités par traitement sont nécessaires pour observer une différence significative entre les groupes (placebo vs. phéromone). Dans la phase 1, les lapereaux sont logés ensemble, donc l'unité est la cage/portée en raison de la collecte des fèces qui ne peut être individualisée. Chaque groupe comprendra au moins 3 lapines gestantes pour garantir une variété génétique et une représentativité des résultats et permettre l’analyse statistique. Cela signifie que 18 à 24 lapereaux naîtront ensuite dans chaque groupe (selon le taux de naissance et de mortalité des lapereaux). A la fin de la phase 1 et avant la phase 2, un tiers des lapereaux sera mis à mort, laissant 12 à 16 lapereaux pour être logés individuellement et collecter leurs fèces de manière individuelle. Tous les paramètres mesurés seront alors rapportés à chaque lapereau qui est ici l’unité. Les analyses statistiques compareront les traitements sur les paramètres biologiques. Des modèles statistiques seront utilisés, avec des analyses multivariées dans la phase 2. Des précautions seront prises pour éviter les biais (randomisation, aveuglement des traitements, etc.).

Raffinement

Les cages, métalliques à barreaux, sont fournies d’une litière, une plateforme/abri, du matériel à ronger (buchettes en bois, boules en osiers, balles de foin, balle en plastique). Dans la phase 1, une boite à nid à rebords hauts avec litière est fournie aux lapines gestantes. Dans chaque salle sont réglés les paramètres nécessaires à l’espèce en termes de température, luminosité, ventilation et humidité. Pour compenser l’hébergement individuel dans la phase 2, les cages seront les unes à côté des autres pour permettre le contact visuel, olfactif et auditif entre les lapins. De plus, lors de cette phase, les lapereaux issus d’une même portée seront sortis de leurs cages et regroupés dans un « parc d’activités » (enclos sur 2 niveaux, avec paille, matériel à ronger, jouets, tunnel, rampe, cabane) pour leur permettre exercice physique et socialisation et les habituer à la manipulation, à raison d’1h/jour minimum, tous les jours de semaine. Afin de limiter la réaction de peur des lapins, l’opérateur frappe 3 fois à la porte pour avertir de son entrée. Aussi, des séances de socialisation (caresser les lapins dans leur cage) seront prévues pour limiter la peur des lapins durant la sortie de la cage et des manipulations. Les prélèvements sanguins respectent les recommandations en termes de volumes et fréquences, et sont effectués par un vétérinaire et/ou un opérateur expérimenté, toujours en binôme avec un autre operateur formé à la contention. Les prises de sang se déroulent dans une salle différente à l’élevage, loin des autres lapins, dans une ambiance calme. Pour éviter la réaction de douleur du lapin à la perforation de la peau, un gel anesthésique local est appliqué avant la ponction sanguine. Une serviette pourra être utilisée pour mieux contenir le lapin et diminuer sa peur. La pesée des lapins provoque peu de stress car les animaux sont introduits dans une boite qui est posée sur la balance, évitant ainsi la contention des animaux. La pesée servira aussi à suivre la croissance des animaux et détecter d’éventuels problèmes de santé. De même, lors du recueil des féces molles au crépuscule des lapins, l’opérateur notera si des comportements anormaux (par exemple, rongement des barreaux) se manifestent à ce moment particulier d’activité plus élevée des lapins.

Choix des espèces

La phéromone apaisante testée est une version artificielle de la phéromone que les mères lapines produisent pour calmer leurs petits après la naissance. Nous avons choisi d'étudier les lapins car ce sont des mammifères herbivores à un seul estomac, souvent utilisés en laboratoire et pour lesquels nous disposons de nombreuses méthodes d'analyse validées. Les résultats de cette recherche pourraient également être appliqués et bénéficier aux lapins de compagnie et d'élevage en améliorant leur santé intestinale et leur bien-être. Nous utilisons des lapines gestantes adultes car elles sont sexuellement matures, et des lapereaux juvéniles, depuis la naissance jusqu'à 10 semaines, avant qu'ils ne soient sexuellement matures. Cette période d'âge jeune est cruciale pour le développement de leur microbiote intestinal, influencé par la génétique, l'alimentation, l'hygiène, l'environnement et le stress. Le sevrage, qui marque le début de l'alimentation solide, peut être stressant pour les lapereaux, perturbant leur flore intestinale et leur santé digestive et immunitaire. Nous couvrons donc tous les moments importants pour comprendre comment le microbiote intestinal se forme et influence le développement des systèmes digestif et immunitaire.