Lapins

Produire des sérums contre le virus West Nile, la fièvre catarrhale ovine et la fièvre aphteuse suppose ici d'immuniser 20 lapins, un par antigène, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit trois injections sous-cutanées espacées de trois semaines et subit quatre prises de sang à la veine de l'oreille. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable, alors qu'il décrit une douleur à l'injection et une réaction inflammatoire locale. La procédure se termine par une ponction de 50 mL dans le cœur sous anesthésie, prélèvement dont le volume impose la mise à mort de l'animal avant tout réveil.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire des anticorps dirigés contre des virus d’intérêt en santé publique et/ou vétérinaire tels que les virus West Nile, de la fièvre catarrhale ovine, de la fièvre aphteuse. Ces virus émergents ou à risque d’émergence ont des impacts sanitaires et économiques importants. Dans le but d’assurer et de garantir une surveillance optimale de ces infections virales chez les espèces sensibles, l'amélioration des outils de diagnostic et de recherche est nécessaire. Cette activité nécessite notamment la constitution de banque de réactifs biologiques tels que des sérums issus d’animaux ayant produit des anticorps spécifiques aux virus d’intérêt, bien caractérisés. Pour permettre la production d’anticorps, des antigènes qui sont des molécules reconnues, comme par exemple des protéines virales, par l’organisme comme étant étrangères et contre lesquelles l’organisme va combattre en produisant des anticorps dirigés (immunisation), seront utilisés. Les antigènes (protéines virales ou virus ne pouvant pas se multiplier) seront donc injectés à des lapins qui produiront des anticorps dirigés contre ces antigènes. Les anticorps produits sont dits « polyclonaux » car ils sont un mélange d’anticorps dirigés contre différentes parties des antigènes. Afin de récupérer ces anticorps précieux, le sérum (phase du sang sans les globules rouges), dans lequel se trouvent les anticorps, sera collecté en fin de procédure. Ainsi, les sérums obtenus après immunisation de lapins avec des protéines (et en présence d’adjuvant) ou de virus non réplicatifs pour cette espèce serviront au développement et à la validation d’outils de diagnostic sérologiques. Les lapins sont utilisés pour leur capacité à produire des grandes quantités de sérums et donc d’anticorps dirigés contre des antigènes d’intérêt, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux requis pour cet objectif.

Bénéfices attendus

L’obtention d’anticorps spécifiques nous permettra de développer et de valider des outis sérologiques de diagnostic et de recherche pour les virus d’intérêt en santé publique et vétérinaire.

Procédures

Trois injections par la voie sous-cutanée à 3 semaines d’intervalle seront réalisées. Les prélèvements prévus sont au total 4 prises de sang à la veine de l’oreille (2mL par prélèvement) à 3 semaines d’intervalle. Le temps de prélèvement est de quelques secondes (inférieur à 1 min). En fin de procédure, un prélèvement d’un volume de 50 mL sera réalisé en ponction intra-cardiaque sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les lapins peuvent ressentir de la douleur lors des injections de l’antigène par la voie sous-cutanéée. Une légère réaction inflammatoire locale peut être observée sans conséquence pour le bien-être de l’animal. Nous n’attendons pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

En raison du gros volume de sang prélevé en fin de procédure sous anesthésie, les lapins seront mis à mort avant le réveil.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif pour la production de sérum contenant des anticorps polyclonaux dirigés contre des virus d’intérêt. La production synthétique reste actuellement moins performante. Le but de cette étude est d’avoir un panel d’anticorps dirigés contre des antigènes viraux issus de nouveaux virus émergents et/ou non commercialisés à visée de diagnostic ou de recherche.

Réduction

Dans le but de réduire la nombre d’animaux, nous avons décidé d’utiliser 1 lapin par antigène. Nous avons au total 20 antigènes pour lesquels nous avons besoin de sérum polyclonal. Un lapin permet l’obtention de sérum de bonne qualité et en quantité suffisante. Cette procédure permet de générer du matériel biologique et aucune analyse statistique sera réalisée.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés par paire dans des cages doubles munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). En cas d’agressivité observée, les lapins seront placés en hébergement individuel avec contat visuel et odorant (séparation des cages faites avec des plaques en plexiglas transparentes et ajourées). Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les prélèvements terminaux de sang en vue de la récupération des sérums contenant les anticorps polyclonaux seront effectués sous anesthésie, avec une surveillance permanente des animaux, puis mise à mort avant le réveil.

Choix des espèces

Les lapins sont utilisés pour leur capacité à produire des grandes quantités de sérums et donc d’anticorps dirigés contre des antigènes d’intérêt, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux requis pour cet objectif. Les animaux utilisés seront des adultes afin d'avoir un système immunitaire mature pour une production optimale d'anticorps

Pour vérifier qu'un lot de vaccin ne contient pas de substance provoquant de la fièvre avant sa mise sur le marché, 80 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque essai commence par l'introduction d'une sonde thermique par voie rectale, puis une injection du produit dans la veine de l'oreille. Un produit est testé sur trois lapins, avec jusqu'à trois séries supplémentaires de trois animaux en cas de résultat intermédiaire, pour environ seize tests prévus. Le porteur indique que l'objectif européen est le remplacement complet des lapins en 2026, et précise que les animaux dont la température monte de plus de 1,2 °C sont mis à mort, les autres étant gardés jusqu'à trois mois pour être réutilisés dans d'autres contrôles.

Objectifs

L'essai des pyrogènes est un essai de sécurité requis pour la libération de lots sur le marché de certains vaccins. Il permet de s'assurer que les lots mis à disposition des patients ne contiennent pas de substances susceptibles d'induire de la fièvre et de nuire à leur santé.

Bénéfices attendus

La conformité des résultats de l'essai est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins concernés, c'est à dire avant la mise à disposition des patients.

Procédures

Les lapins sont soumis aux interventions suivantes: -introduction d'une sonde de température enduite de vaseline par voie rectale: mise en place de 10 à 30 s. - injection dans la veine de l'oreille: une administration par lapin et par essai: durée entre 30s et 2 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'inconfort lié à la contention, au port de la sonde rectale et à la vaccination par voie intraveineuse. La vaccination peut causer une légère douleur transitoire. En cas de produit non conforme contenant des substances pyrogènes, une augmentation transitoire de la température corporelle peut se produire.

Devenir

Les lapins n'ayant pas présentée une élévation de température supérieure à plus de 1,2°C sont gardés en vie en fin de test pour pouvoir éventuellement être réutilisé dans les 3 mois suivants pour le contrôle d'un ou ou plusieurs autres produits (fonction des réceptions des échantillons et des délais de libération de lots). Les lapins arrivés depuis environ 3 mois et ceux pour lesquels la réponse indiviuelle lors d'un essais est supérieure à 1,2°C sont mis à mort.

Remplacement

Progressivement des méthodes alternatives à l'essai des pyrogènes sont validées pour les différents types de vaccin chez les fabricants et en parallèle dans nos laboratoires. L'objectif européen est le remplacement complet de l'utilisation des lapins en 2026.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot est réglementairement fixé. Le test d'un produit se fait sur 3 lapins. En cas de résultat intermédiaire (supérieur à la limite de conformité mais inférieur à la limite de non conformité) un à 3 retests peuvent être effectués à chaque fois sur un lot de 3 lapins différents pour un total de 12 animaux. Environ 16 tests sont prévus pour la durée du projet.

Raffinement

Les lapins sont habitués très progressivement à la contention (période d'environ 3 semaines entre la réception dans nos locaux et l'utilisation en essai): mise en place d'abord d'une collerette dans la cage puis habituation progressive aux boites de contention.

Choix des espèces

L'’essai des pyrogènes doit être réalisé sur des lapins adultes de plus de 1,5 kg. Nous commandons les lapins à 10 semaines environ, donc adultes ce qui correspond à des lapins d’un poids d’environ 2 kg. Des lapins plus jeunes, donc plus vifs, s’habitueraient moins bien à la contention. Des lapins trop âgés ne tiendraient pas dans les boîtes de contention et seraient trop gênés par la collerette.

Cinq lapins reçoivent dans l'œil, à quatre reprises, un laser dont l'éclairement dépasse d'un facteur dix la limite fixée par la norme ISO, avec une lame de verre posée sur la cornée. Ces séances de quarante-cinq minutes se déroulent sous anesthésie générale et relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des ulcères de l'épithélium cornéen, des lésions de l'endothélium et une cataracte par effet thermique comme atteintes possibles, et précise que l'étude est faite "justement" pour en constater la survenue. Tous les lapins sont tués pour histologie oculaire, leurs os et leur cochlée partant à d'autres équipes, afin qu'une startup française puisse déposer un dossier d'autorisation pour son appareil.

Objectifs

Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) nommée LC-OCT permettant d'effectuer des images proche de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer la safety sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.

Bénéfices attendus

Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte ou prise de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme des selles liquides.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'oeil sous sédation et l'animal sous anesthésie général. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT durera 5 minutes.

Impact sur les animaux

L'éclairement du laser du LC OCT est de 820 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35). Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires. D'autres équipes de recherche récupéreront les os et la cochlée des animaux.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.

Réduction

Tout d'abord nous utilisons l'oeil gauche de chaque animal comme oeil contrôle réduisant de moitié le nombre d'animaux nécessaire. Ensuite, Compte tenu de la faible variabilité interindividuelle habituellement observée dans les études ophtalmologiques utilisant l'imagerie non invasive, ainsi que de notre objectif de comparer, par suivi clinique et histologie post-mortem, l'état des tissus oculaires des yeux contrôles (OG) et des yeux analysés (OD) pour chaque animal à l'aide d'une échelle de graduation semi-quantitative, et afin d'obtenir un échantillonnage suffisant pour effectuer une analyse statistique avec des tests de rangs non paramétriques (OG vs OD), nous avons déterminé qu'un minimum de 5 animaux est nécessaire pour tirer des conclusions valables. En effet, avec moins de 5 lapins, les tests statistiques perdent de leur pertinence, tandis qu'un nombre supérieur à 5 semble excessif.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (sédation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

Immunisés cinq à plus de seize fois par an, puis saignés jusqu'à vingt et une fois par an pour produire du sérum, 1 500 lapins, 1 000 cobayes, 30 chèvres et 30 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués une fois le titre d'anticorps et le volume de sérum jugés suffisants, après un dernier prélèvement plus important. Les anticorps polyclonaux obtenus alimentent des tests de diagnostic vendus dans le monde entier, le porteur mentionnant jusqu'à un test utilisé par seconde et un nombre d'animaux fixé par le "Donneur d'ordre". Il indique que la réaction inflammatoire au point d'injection disparaît en quelques jours et qu'aucune conséquence néfaste n'est observée ensuite, description difficile à tenir pour des animaux immunisés et ponctionnés pendant deux ans avant d'être tués.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l'immunisation des animaux afin d’obtenir des anticorps polyclonaux. Après immunisation et prélèvement du sang, le sérum obtenu contient les anticorps polyclonaux spécifiques de l’antigène utilisé. Après purification, les anticorps servent à produire différents tests par exemple : hémostase, thrombose, infections inflammatoires, détermination des groupes sanguins (utilisés pour les transfusions et les transplantations…). Ces tests de laboratoire permettent de doser les facteurs concernés dont le déficit est responsable des troubles cliniques dans le suivi des patients en thérapie ou en postopératoire. Les tests peuvent aussi permettre de confirmer des résultats sérologiques faibles ou peu clairs avant une transfusion ou une transplantation… Les tests immunologiques produits à l’aide des anticorps polyclonaux purifiés à partir des sérums des animaux hyperimmunisés sont marqués CE, ou enregistrés IVDR pour l’Europe, ou FDA (510(k)) pour les USA, ainsi que dans les systèmes règlementaires de la majorité des pays, afin de pouvoir les utiliser dans les hôpitaux pour le diagnostic et le suivi des pathologies. Le projet est principalement à visée humaine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la production d’anticorps polyclonaux, sont la mise à disposition des laboratoires hospitaliers et cliniques de tests diagnostiques performants et précis, utilisant directement ou indirectement la technologie immunologique. L’utilisation du processus d’immunisation sur animaux permet d’obtenir des anticorps polyclonaux, d’isotype IgG, reconnaissant l’ensemble de la structure de la protéine (utilisée comme antigène), avec une grande affinité, c’est-à-dire une réaction spécifique et très forte avec cette protéine. Cela permet de l’identifier, de la quantifier ou de l’extraire dans un milieu très complexe, comme le sang, tout liquide biologique (ascites, liquide céphalo-rachidien, urines, etc…), ou un lysat cellulaire. Deux applications importantes sont mises en œuvre dans le projet : a) test l’utilisation des anticorps pour la production de tests de diagnostic médical, permettant de quantifier précisément une protéine ou un anticorps dans un liquide provenant du corps humain, à des fins de diagnostic, de pronostic, ou de suivi de traitement thérapeutique. b) Extraction spécifique d’une protéine d’un milieu complexe, comme le plasma humain, afin de produire un plasma déficient en cette protéine. Ce plasma est ensuite utilisé dans des trousses de diagnostic, pour doser l’activité de la protéine concernée, apportée par le plasma à tester. Le bénéfice est très important car une faible quantité de sérum permet de fournir une très grande quantité de tests, ils sont utilisés au niveau mondial à très grande échelle (jusqu’à un test utilisé par seconde dans le monde).

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur une durée de 2 ans maximum : Prélèvements sur animaux vigiles : 1 prélèvement de sang sain. Immunisations sur animaux vigiles : 5 à plus 16 par an. Prélèvements sur animaux vigiles : 1 à plus 21 prélèvements sanguins par an pour la production sérum. Lorsque le titre des anticorps et le volume de sérum seront jugés suffisants, le protocole d’immunisation sera arrêté et les animaux euthanasiés après prélèvement d’un volume sanguin plus important.

Impact sur les animaux

L’expérience acquise avec ces protocoles permet de dire que la principale nuisance sur les animaux concerne la réponse au processus d’immunisation, qui peut induire une réaction inflammatoire au point d’injection. Cette réaction inflammatoire disparait généralement en quelques jours, et aucune conséquence néfaste n’est observée ensuite. Les autres nuisances possibles concernent la contention et l’introduction de l’aiguille sous la peau des animaux pendant le prélèvement, pouvant provoquer de l’inconfort, une sensibilité légère limitée à la durée du prélèvement. L'anesthesie a répétition chez le cobaye. Cette étape n’a pas d’autre conséquence particulière sur les animaux.

Devenir

Tout animal ayant étaient immunisés sera mis à mort car l'immunisation ne permet pas de les utiliser dans d'autre procédures.

Remplacement

A chaque fois que cela est possible, des anticorps monoclonaux produits par culture cellulaire, ou des anticorps recombinants, sont utilisés, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés pour la production d’anticorps polyclonaux. Toutefois, les anticorps polyclonaux présentent des caractéristiques uniques par leur grande affinité vis-à-vis de la protéine utilisée pour leur immunisation, et par la reconnaissance globale des structures de cette protéine. A l’inverse, les anticorps monoclonaux ou recombinants, ne reconnaissent qu’une seule structure de la protéine, et si cette structure est affectée par une mutation génétique, la reconnaissance et perdue, et le variant n’est pas détecté. Les anticorps obtenus par immunisation des animaux permettent ainsi d’obtenir des caractéristiques uniques pour les besoins du laboratoire et la mise à disposition d’outils de diagnostic performants. Le client s'engage à faire la production in vitro lorsque cela est possible et respecte les normes réglementaires de diagnostic.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu résulte de 2 contraintes : a) Utiliser un nombre suffisant d’animaux pour réduire la variabilité inter-animaux de la réponse immunitaire. b) Utiliser le nombre requis pour obtenir la quantité de sérum suffisante pour la quantité d’immunoglobulines IgG purifiées nécessaires pour répondre aux besoins. Le nombre d'animaux utilisés correspond au minimum en fonction des volumes souhaités, définis par le Donneur d'ordre. La ré-immunisation des animaux au long terme permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. En moyenne, nous pouvons produire 26 litres de sérum par an avec 6 moutons ou 6 caprins, 130 litres de sérum par an avec 300 lapins et 13 litres de sérum par an avec 200 cobayes.

Raffinement

Les animaux sont tous contrôlés de façon journalière, ils ont à disposition des enrichissements adaptés et variés avec des roulements périodiques si possible (Lapin: bloc de cellulose à ronger, bout de bois.../Ovins, caprins:balai, un gros ballon, sapin perchoir(tronc d'arbre).../Cobayes: petite balle, bloc de cellulose...).- Pour les lapins, les cages disposent de mezzanines et de petits trous sur les parois leurs permettant de voir et de sentir les lapins dans les cages voisines . Les prélèvements se font dans une pièce séparée des hébergements. Après chaque prélèvement les lapins sont placés dans une piscine remplie de copeaux et de balles en plastique le temps du prélèvement d’un autre lapin.- Les ovins et caprins,sont dans une bergerie qui leurs est dédiée avec accès sur 2 hectares de prairie. Ils sont hébergés dans un box recouvert de paille. L'alimentation est composée de foin, pierre à sel, graines d'orge et d'avoine. Les prélèvements se font dans une partie dédiée, séparée de l'enclos. -Les cobayes sont hébergés dans une unité indépendante dans des cages par groupes sociaux harmonieux (2ou 3) avec mise à disposition d'une maison . Après chaque prélèvement ou immunisation ils reçoivent une récompense .Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être provoqué lors des procédures avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Des isolements de quelques minutes seront appliqués le temps des immunisations. Les volumes prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations du Gircor. Un tableau d’évaluation des points limites est mis à disposition pour suivre l’évolution d’un animal qui présente des signes cliniques. (voir arbre décisionnel et critères d'arrêt des souffrances en pièces jointes). Les administrations ou les prélèvements s’arrêteront si un animal atteint un score de 3 sur la grille d’évaluation. Le dernier prélèvement est réalisé sous anesthésie générale , (excepté s' il y a contre-indication scientifique). Dans ce cas, l’animal ne se réveille pas, il est mis à mort dans la foulée du prélèvement .

Choix des espèces

Les lapins, les ovins, caprins et cobayes font partis des espèces les mieux documentées et les plus appropriées pour la production d’anticorps polyclonaux selon les recherches des donneurs d’ordres L'un des facteurs qui influence la production d'anticorps est la nature de l'immunogène utilisé (spécifique à chaque espèce). Le lapin est facile à manipuler et à prélever, il produit des volumes suffisants d'antisérum à titre élevé et à forte affinité. Les ovins et caprins ont une longue durée de vie, sont facile à manipuler et le prélèvement sanguin est facile à réaliser (veine jugulaire). La grande taille des animaux apporte un volume important d'immunsérum et réduit par la même occasion le nombre d'animaux. Les lapins ont au minimum deux mois et demi à la première immunisation et 5 mois aux premiers prélèvements. Les ovins et caprins ont au minimum trois mois à la première immunisation et 5 mois et demi aux premiers prélèvements. Les cobayes ont au minimum trois mois à la première immunisation et de 4 mois et demi aux premiers prélèvements. Cet âge à l’avantage de permettre une bonne acceptation des administrations par les animaux avec le développement d’une réaction immunitaire correcte et de permettre prélever une quantité intéressante de sang.

Pour constituer le dossier préclinique d'un pansement liquide avant son marquage CE, 18 lapins subissent chacun quatre plaies cutanées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale de trente à quarante-cinq minutes, chaque lapin reçoit quatre plaies et quatre pansements, et quatre anneaux de silicone sont suturés à sa peau au fil non résorbable pour empêcher la rétraction, anneaux qui restent en place les trente jours de l'étude. Les deux semaines précédant l'opération, les lapins sont habitués à porter un gilet de protection, jusqu'à dix heures consécutives le dernier jour. Tous sont tués à trente jours pour prélever la plaie cicatrisée, le porteur affirmant que "3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement" dans une étude qu'il présente par ailleurs comme pilote et destinée surtout à de l'imagerie.

Objectifs

La peau est le plus étendu des organes du corps humain qui assure plusieurs fonctions vitales pour l’organisme. Cet organe est soumis tout au long de la vie à de nombreux dommages, provoqués par des facteurs extérieurs d’origine physique (coupures), mécanique (ulcères), thermique (brûlures) et/ou chimique (radiations). La sévérité des dommages couplés à d’autres facteurs, tels que l’âge, le diabète et la nutrition, peuvent conduire à une mauvaise voire non-cicatrisation des plaies, appelées les plaies chroniques. Elles impactent fortement la qualité de vie des patients, jusqu’à engager leur pronostic vital. Ce problème de santé publique est amené à s'accroître avec le vieillissement de la population et l'augmentation de la prévalence du diabète et de l'obésité. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de différentes solutions de pansement liquide nouvelle génération développées par notre laboratoire (comparativement à des techniques utilisées couramment) le soin de plaies cicatrisant par seconde intention (plaies chronique ou aigüe) 1 – évaluer la qualité de la cicatrisation en fin du processus cicatriciel : un prélèvement histologique sera réalisé à J30 à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie. 2 – évaluer la durée de cicatrisation : un contrôle visuel 2 fois par semaine permettra d’évaluer le stade de cicatrisation de la plaie. Parmi les modèles de cicatrisation cutanée qu'on retrouve dans la littérature, nous avons retenu celui faisant appel à une biopsie cutanée suivie de la mise en place de disque de silicone permettant d’éviter la rétraction spontanée de la peau. Ce modèle présente l’avantage de refléter au mieux le phénomène de cicatrisation humaine. Par ailleurs, les tests précliniques sont indispensables à l’évaluation d’un dispositif médical avant le passage aux tests cliniques chez l’Homme. La formule sélectionnée pourra alors passer à l’étape suivante du marquage CE : l’étude clinique

Bénéfices attendus

Au travers de cette étude, nous espérons observer une diminution du temps de cicatrisation avec nos formulations comparativement aux pansements standard. Mais également une amélioration de la qualité de la cicatrise via une observation histologique en fin de cicatrisation. Par ailleurs, ces essais nous permettrons d’obtenir des preuves précliniques qui seront utilisées dans le cadre de la demande d’autorisation de mise sur la marché.

Procédures

Procédure chirurgicale induction des plaies et pansement sous anesthésie générale. L’anesthésie durera 30-45 min. 1 injection d’anesthésique 4 injections d’anti-inflammatoire 4 plaies cutanées 4 poses de pansement Suture de 4 anneaux sur la peau au fil non résorbable. Ces anneaux resteront en place durant toute la durée de l’étude

Impact sur les animaux

Hypothermie liée à l'anesthésie Douleur post opératoire Perte d’appétit, deshydratation

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort. A 30 jours, à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie, les animaux seront mis à mort et un prélèvement de la plaie cicatrisée sera réalisé pour évaluer la qualité de la cicatrisation.

Remplacement

Les plaies cicatrisants par seconde intention sont des plaies complexes qui touchent les différentes structures de la peau (allant de l’hypoderme à l’épiderme) et qui subissent des forces mécaniques qui peuvent être importantes en fonction de la localisation de la plaie. Par ailleurs, les méthodes d’analyse in vitro ne prennent pas en considération l’environnement locale et systémique impliqués dans le processus de cicatrisation. Il n’existe donc pas de modèles in vitro permettant de prendre en compte tous ces paramètres. De plus, dans le développement d’un dispositif médical innovant, il est nécessaire de tester les formulations sélectionnées sur des modèles animaux afin d’appréhender la biocompatibilité et l’efficacité des dispositifs avant le passage chez l’Homme. .

Réduction

Cette étude est une étude pilote qui nous permet principalement de faire de l’imagerie pour observer les différences sur le processus cicatriciel en fonction de la solution de pansement utilisée. Pour chaque formule trois réplicas seront réalisés afin de pouvoir observer et comparer la cicatrisation sur 3 individus (lapins). Ces 3 réplicas nous permettrons également de comparer la différence de temps de cicatrisation entre différentes solutions de suture. 3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement sur l’étude. 4 plaies seront réaliser sur le dos d’un animal afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude.

Raffinement

Les animaux bénéficient de plateforme dans leurs cages, de jouets et de morceaux de bois à ronger dans leur environnement de vie. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne de la naissance à la mort par le personnel animalier. Ainsi qu’une visite quotidienne la première semaine post opératoire puis deux fois par semaine de la part de l’opérateur de l’étude. Au cours de l’étude, l’animal devra porte un gilet de protection des pansements. Les 2 semaines précédant la chirurgie, les animaux sont progressivement habitués au port du gilet. Jour 1 : le gilet est déposé dans la cage quelques minutes, Jour 2 : le gilet est mis en place sur l’animal 2 minutes. La durée augmente graduellement sur 2 semaines. Le dernier jour de l’habituation, l’animal porte le gilet 10 heures consécutives. L’animal sera placé sous anesthésie générale lors de la chirurgie. Les animaux recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique les 3 premiers jours post opératoire qui permettra de réduire la douleur ressentie. Le traitement pourra se poursuivre en fonction des signes cliniques observés quotidiennement les jours suivants. Les animaux seront suivis quotidiennement durant environ 30j (le temps de la cicatrisation) puis seront mis à mort. Au cours de l’anesthésie, l’animal pourrait se refroidir. Pour pallier cet inconfort qui pourrait engendrer une mauvaise récupération des suites de l’anesthésie, l’animal sera placé sur un tapis chauffant tout le long de la chirurgie, jusqu’à son réveil.

Choix des espèces

Les modèles animaux préférentiellement utilisés dans la littérature dans ce type d’expérimentation sont les rongeurs, le lapin ou encore le porc. Les rongeurs ont tendance à retirer/arracher tout corps étranger présent sur leur peau, ce qui empêche toute chance de conclusion sur l’efficacité d’un système de pansement de plaie. Chez le lapin, il est possible de protéger la zone lésée grâce à un gilet de protection conçu sur mesure. Ce gilet permet à la plaie de cicatriser sans sollicitations de l’animal. Animaux choisis : adulte, 2.5kg Poids des animaux adaptés au gilet de protection fait sur mesure pour des animaux matures. Surface (cm²) du dos adaptée à la réalisation des 4 pansements. Animal mature avec structure anatomique de la peau et système immunitaire adaptés au besoin de l’étude.

Une vingtaine de minutes pour aspirer le gel qui remplit l'œil et le remplacer par un substitut, puis des examens oculaires deux fois par semaine pendant une durée qui peut atteindre six mois : 1 155 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le composé à tester leur est administré dans le vitré ou sous la rétine au cours de l'opération, et le suivi comprend lampe à fente, mesure de la pression intraoculaire, électrorétinographie sous anesthésie générale et angiographie après injection de fluorescéine. Le porteur range parmi les effets possibles des inflammations oculaires et des décollements de rétine qu'il décrit comme indolores mais susceptibles d'atteindre la vision, et prévoit un hébergement individuel jusqu'à six mois quand la mesure des consommations l'exige. Tous les lapins sont tués à l'issue pour analyse des tissus, dans un projet qui sert aussi de support de formation professionnelle et alimente des dossiers d'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Le but du projet est d'adopter une technique de vitrectomie chez le lapin afin de tester des dispositifs médicaux à injecter sous la rétine ou de tester des substituts de vitré. Le vitré est le gel aqueux normalement transparent qui remplit l'œil et qui se situe entre le cristallin et la rétine. La vitrectomie est l'ablation du vitré par un appareil adapté, le vitréotome qui aspire le vitré. La vitrectomie permet d'avoir un accès direct à la rétine, elle est nécessaire dans le traitement de certaines maladies de la rétine, comme des hémorragies vitréennes, des décollements de rétine, ou des traumatismes oculaires. Le vitré est remplacé par un gaz, un liquide physiologique ou de l'huile de silicone selon le cas à traiter. L'intérêt d'avoir un accès direct à la rétine est de pouvoir administrer près de la cible, des traitements potentiels dans les pathologies de la rétine.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer la toxicité locale et la pharmacocinétique de molécules qui deviendront potentiellement des médicaments ciblant les affections de la rétine.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet auront une vitrectomie : chirurgie qui consiste à remplacer le vitré par un substitut physiologie, cette opération dure une vingtaine de minutes sous anesthésie générale. Au cours de cette opération sera administré le composé à tester soit directement dans le vitré soit sous la rétine. Puis une série d'examen sera pratiquée : observation en lampe à fente, mesure de la pression intra oculaire pour suivre les éventuelles complications ou effets indésirables. Ces examens se font sur animal vigiles, 2 fois par semaine, ils ne durent que quelques secondes ou minutes. Selon le type d'appareil utilisé la mesure de la pression intra oculaire peut nécessiter une anesthésie locale de la cornée. D'autres types d'examens nécessitent un immobilisme complet de l'animal comme l'électrorétinographie et se feront sous anesthésie générale. Selon le produit testé il est possible de devoir suivre son effet sur les vaisseaux de rétine, pour cela une angiographie, après injection de fluorescéine sera réalisée. Cet examen peut s'effectuer sur lapins vigiles ou anesthésiés car il n'est pas invasif, sans contact avec l'animal qui est placé devant une caméra. Ces types d'examens se font une fois par semaine. La durée de l'étude peut varier de 1 semaine à 6 mois. Pour une étude longue la fréquence des examens nécessitant une anesthésie ou l'injection de fluorescéine sera réduite à une fois toutes le 2 semaines. En première intention les lapins seront hébergés en binôme mais s'il existe un risque de contanination lors d'un test de traitement entre deux animaux invalidant l'interpretation des résultats ou si la consommation en nourriture et en eau doit être mesurée individuellement, les lapins seront hébergés individuellement sans restriction de la taille des cages et en maintenant un contact olfactif, visuel et auditif entre les congénères sur toute la durée de l'étude soit maximum 6 mois.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles, à la suite de la vitrectomie avec ou sans administration de produit sont des irritations ou des inflammations des tissus oculaires des rougeurs conjonctivales et potentiellement des décollements de rétine qui sont indolores mais qui peuvent impacter la vision. Malgré le soin et la vigilance apportés à la manipulation des animaux, un stress est toujours possible au moment de leur manipulation lors des observations, de l’administration de l’anesthésie ou des traitements.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité...), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif. Les études qui font l'objet de ce projet, toxicité locale et pharmacocinétique du produit, font partie des étapes de développement d'un médicament, elles sont requises dans les dossiers de demande d'autorisation de mise sur le marché de médicament qui réclame des études réalisées in vivo chez des mammifères avant de pouvoir tester la molécule chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur la présence ou l'absence d'effet de la molécule testée sur le paramètre étudié. Ce nombre est adapté des informations recueillies dans la bibliographie. Les résultats des mesures seront analysés par des tests de comparaisons multiples; chaque groupe traité sera comparé à un groupe témoin non traité. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives des structures internes de l'œil par des techniques d'imagerie ou de mesure de la fonctionnalité de la rétine sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. Dans la mesure du possible nous proposons de coupler les études de toxicité locale et de pharmacocinétique pour un même produit de manière à diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les lapins seront placés préférentiellement par deux si les conditions expérimentales le permettent dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture rationnée et enrichissement. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de méthode alternative. De nombreuses études sur la pression intraoculaire sont réalisées chez le lapin en raison des similitudes avec l'œil humain (taille de l'œil, structures) permettant de recueillir des résultats extrapolables à l'humain et de tester des traitements ou des dispositifs médicaux directement transposables chez l'homme. Nous avons donc choisi cette espèce pour mener à bien le projet. Les lapins sont de jeunes adultes et ont minimum 8 -12 semaines, âge minimum pour la maturation de l'œil.