Lapins
- Amphibiens
- Autres mammifères
- Carnivores
- Céphalopodes
- Mammifères "de rente"
- Oiseaux
- Poissons
- Primates
- Reptiles
- Rongeurs
Évaluation toxicocinétique d’un mélange de contaminants environnementaux chez le lapin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
24 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration unique d'un mélange de perturbateurs endocriniens, phtalates et phénols, par voie orale ou intraveineuse, restent quarante-huit heures en cage à métabolisme, subissent trois prélèvements de sang de six millilitres, puis sont tuées pour récupérer leur sang chargé de métabolites. Cette étude toxicocinétique préliminaire vise à fixer les doses reproduisant chez la lapine l'exposition de femmes enceintes, le porteur la qualifiant d'"indispensable". Il affirme qu'aucune étude in vitro ne peut prédire le devenir de ces molécules dans un organisme.
Objectifs
La population générale, incluant les femmes enceintes, est exposée à de nombreux perturbateurs endocriniens, tels que les phtalates et les phénols synthétiques (PSP). Les objectifs du projet de recherche sont de déterminer si l’exposition maternelle à un mélange de PSP perturbe la fonction placentaire et affecte la santé de la descendance avec des réponses sexe-spécifiques. Pour cela, ce projet s’appuiera sur le modèle biomédical du lapin, pertinent en termes de placentation, de production d'hormones pendant la vie fœtale, de toxicité fœtale et d’effets métaboliques à long terme chez les descendants. Grâce à ce modèle, les effets de l'exposition maternelle, par ingestion, à un mélange de PSP, mimant l’exposition des mères de la cohorte SEPAGES (cohorte mère-enfant, dédiée à la surveillance de l'exposition aux PSP pendant la grossesse et de leurs effets sur la santé des enfants), seront évalués sur le développement et la croissance fœto-placentaire mais aussi sur la santé postnatale, en tenant compte du sexe des individus. Le mélange de PSP sera défini grâce aux données de la cohorte SEPAGES où des concentrations élevées de phénols, de phtalates et de leurs métabolites ont été détectées dans des échantillons issus de prélèvements répétés d'urine chez les femmes enceintes. Une étude est en cours pour définir, à partir de cette cohorte, les composés associés positivement ou négativement à une modification du poids placentaire, de l’efficacité placentaire et/ou du poids de naissance qui définiront le mélange d’exposition. L’objectif de l’étude préliminaire toxicocinétique qui fait l’objet de cette saisine est de déterminer les doses des PSP qui, administrées quotidiennement par voie orale, permettront de reproduire chez le lapin une exposition aux PSP, représentative de l’exposition de la femme enceinte, en termes de concentrations plasmatiques et urinaires.
Bénéfices attendus
Ce projet aboutira à une meilleure compréhension des effets d'un mélange de PSP sur la santé des mères et de leur progéniture via une exposition par voie orale. Ce projet contribuera à décrypter les mécanismes épigénétiques, et la façon dont ils peuvent induire des effets intergénérationnels comme des troubles cardio-vasculaires, métaboliques ou un dysfonctionnement gonadique. Les résultats obtenus aideront au suivi clinique des enfants SEPAGES après l'âge de 7 ans. De plus, ce projet va générer des informations relatives à la toxicité de l'exposition maternelle aux PSP et aux effets à long terme sur la descendance, ce qui représente un défi pour les autorités publiques telles que l'ANSES/EFSA, en termes de recommandations et d'évaluation des risques, pour les femmes enceintes et les nourrissons. L'étude toxicocinétique est indispensable pour déterminer le protocole d'administration des PSP qui permettra de reproduire chez la lapine l'exposition des femmes enceintes.
Procédures
Dans le cadre de la procédure 1, 24 lapines recevront une administration intraveineuse unique (N=12) ou une administration orale unique (N=12). Les lapines seront hébergées pendant 48h avant ou suivant l'administration dans une cage à métabolisme pour permettre le recueil de la totalité des urines produites à des intervalles de temps définis. Trois prélèvements de sang d'un volume de 6ml seront réalisés par lapine. La durée des administrations intraveineuses varie de 30 secondes à 2 minutes. La durée des prélèvements sanguins varie de 20 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Risques de stress liés à la manipulation pour l’exposition par voie orale ou à la contention pour les prélèvements de sang (durée : le temps de la contention) - Une douleur peut apparaître au point de prélèvement de sang en raison de l’utilisation d’une aiguille (durée : le temps du prélèvement). Une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone de prélèvement pour réduire la douleur associée à la ponction.
Devenir
Les lapines seront mises à mort à l'issue de la procédure afin de collecter un volume important de sang contenant l'ensemble des métabolites des substances administrées, dont les métabolites actifs. Le plasma isolé sera ultérieurement utilisé in vitro pour exposer des cellules placentaires en culture et évaluer les effets de l'ensemble des métabolites sur la fonction placentaire.
Remplacement
Pour l’ensemble du projet, il n’est pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants car le devenir d’une molécule dans un organisme (toxicocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu (absorption, destruction par la flore intestinale, métabolisme par le foie, élimination par les reins, …).
Réduction
Une réduction très importante du nombre d’animaux sera permise par l’administration des PSP en mélange. En effet, l’administration simultanée de 10 PSP permettra d’évaluer sur les mêmes animaux le devenir des 10 PSP et de réduire d’un facteur 10 le nombre d’animaux. La méthode d'analyse utilisée ne s'appuie pas sur des tests statistiques mais sur des modélisations spécifiques qui permettront d'estimer avec précision quel est le devenir dans l'organisme des substances étudiées en optimisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
La méthode d'analyse des données qui sera mise en oeuvre permettra de réduire à trois le nombre de prélèvements par animal. En effet, contrairement aux méthodes classiques d'analyse qui nécessitent d'obtenir un grand nombre de données sur le même animal, cette approche permettra d'analyser simultanément toutes les données obtenues avec des animaux différents. Pour l’enrichissement, les cages contiennent une chaînette, des mobiles suspendus, une plateforme et des blocs de foin compressé à ronger. Pour le confort de l’animal, les cages disposent de repose-pattes. Les animaux sont en cage individuelle mais positionnées les unes à côté des autres afin que les animaux soient en contact visuel et olfactif. Les salles d’hébergement disposent de blocs de phéromones maternelles (secure rabbit), qui diminuent les sources de stress et apaisent des animaux -L'état de santé des animaux sera surveillé tous les jours (niveau d’activité, comportement, posture au repos, pelage, alimentation, mouvements à la sollicitation). Si un animal présentait une altération de ces critères, une évaluation de la douleur serait réalisée avec la grille dédiée à l’établissement d’un score. Selon le score, une analgésie serait mise en place. Si la douleur persistait, l’euthanasie pourrait être envisagée en concertation avec le vétérinaire. Avant la procédure, les lapines seront habituées à être placées dans une boîte de contention. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d'injection afin de limiter la douleur. Un produit sera utilisé sur la zone de prélèvement de sang pour induire la dilatation des vaisseaux sanguins et faciliter la cathétérisation. Les animaux seront habitués au contact avec les expérimentateurs et une surveillance accrue des lapins par ces mêmes expérimentateurs sera réalisée lors de l’hébergement des lapins dans les cages à métabolisme. Pendant la période d'acclimatation, les animaux seront également habitués à séjourner dans une cage à métabolisme afin de les entrainer à coopérer lors des manipulations. Pour cela, ils seront placés dans les cages métaboliques pendant une durée croissante, soit successivement 1h, 2h, 4h et 8h par jour. Le contact visuel et olfactif ainsi que l'enrichissement seront maintenus lors de l'hébegement dans les cages métaboliques.
Choix des espèces
L’espèce lapin a été choisie pour plusieurs raisons: i/ type de placentation plus proche de celle de l’humain que celle des rongeurs ii/ taille qui permet de réaliser un suivi de la gestation par échographie iv/ espèce pertinente pour étudier la toxicité sur le développement du fœtus et évaluer les effets à long terme v/ espèce plus appropriée à des fins de toxicocinétiques car, chez le lapin comme chez l'humain l'élimination urinaire prédomine pour les polluants organiques, contrairement à d'autres espèces, comme le rat et le chien, qui sont plutôt des excréteurs biliaires vi/ espèce pertinente car la production de stéroïdes gonadiques pendant la vie fœtale est similaire à celle de l’humain L'étude sera réalisé chez des lapines adultes car elle a pour objectif de définir les doses des composés mimant l’exposition des femmes en âge de procréer qui seront utilisées ultérieurement chez des lapines adultes pour évaluer les effets de cette exposition sur la santé néonatale.
Utilisation d’animaux à des fins de formation
- Formation professionnelle
Rats : 40
Cochons d'Inde : 50
Hamsters dorés : 400
Gerbilles de Mongolie : 10
Lapins : 20
Chats : 40
Chiens : 25
Cochons : 100
Chèvres : 30
Moutons : 50
Bovins : 50
Poules : 400
Dindes : 100
Autres oiseaux : 100
Déjà utilisés pour la plupart dans des procédures expérimentales de gravité légère ou modérée, ou en surnombre dans des élevages, 1 915 animaux non-humains de quinze espèces vont être utilisés pour former le personnel d'un établissement dont les études visent la mise sur le marché de vaccins et de médicaments vétérinaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Parmi eux figurent 500 souris, 400 hamsters dorés, 400 poules, 100 cochons et 100 dindes, et aussi des bovins, des moutons, des chèvres, des chiens, des chats, des lapins, des cobayes, des rats et des gerbilles. Sous tutorat, les apprenants s'exercent à la contention, aux administrations et aux prélèvements, sur des individus éveillés ou anesthésiés, et le porteur décrit un acte pratiqué juste avant la mise à mort de fin de procédure expérimentale. La majorité est ensuite mise à mort, et les jeunes individus commandés exprès "pourront être réutilisés ou placés", selon le porteur, alors que le champ du devenir n'en déclare aucun placé et 50 réutilisés, tous chiens, chats, cochons, chèvres, moutons ou bovins.
Objectifs
Le projet a pour objectif de former le personnel sur les actes techniques pratiqués sur toutes les espèces de l’établissement utilisateur. La plupart des actes de formation s’effectuent sous tutorat lors des procédures expérimentales. L’acte est évalué sans gravité pour l’animal et est pratiqué juste avant une euthanasie de fin de procédure expérimentale. Dans la mesure du possible les animaux utilisés dans ce projet proviennent de procédures expérimentales de gravité « Léger » ou « Modéré ». Dans le cas de formation sur jeunes animaux, les animaux seront commandés spécifiquement pour ce projet et ceux-ci pourront être réutilisés ou placés. Des animaux surnuméraires de procédures expérimentales ou d’élevages pourront être utilisés dans ce projet après avoir étudié toutes les possibilités d’utilisations ou de placement.
Bénéfices attendus
L’objectif étant de former du personnel compétent pour utiliser les modèles animaux à des fins scientifiques et garantir la fiabilité des études qui premettent de commercialiser des vaccins et des produits pharmaceutiques vétérinaires.
Procédures
Toutes les formations s’effectuent sous tutorat. Les actes de formation peuvent porter sur la contention de l’animal, des apprentissages d’administrations ou de prélèvements. En fonction des actes l’animal peut être vigile ou anesthésié. Tous ces actes s’effectuent en quelques minutes et en respect de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter une légère augmentation de stress due aux actes techniques et aux manipulations.
Devenir
Dans la majorité des cas les animaux sont euthanasiés après leur réutilisation en formation. Dans quelques cas, les animaux peuvent être utilisés plusieurs fois en formation.
Remplacement
La formation du personnel est assurée par du tutorat lors de procédures expérimentales ou sur des modèles n’utilisant pas l’animal (silicone, informatique, tissus…). Néanmoins, il est parfois indispensable d’avoir recours à des animaux lorsque cet objectif ne peut être atteint par d’autres approches.
Réduction
Il n’y a pas de justification à augmenter les effectifs d’animaux pour la formation, le nombre sera donc réduit au plus juste. Les animaux utilisés pour la formation sont des animaux qui ont déjà été utilisés dans la grande majorité des cas.
Raffinement
L’utilisation d’animaux pour des formations spécifiques ne sont mises en œuvre que lorsque la formation souhaitée ne peut être acquise autrement. La période de formation est toujours supervisée par un tuteur. L'acte de formation est pratiqué sur animal vigile une fois que l'acte est maitrisé sur cadavre ou animal anesthésié, ceci permet au tuteur d'évaluer la maitrise de l'opérateur en condition d'étude. A ce niveau l'acte ne requiert aucune anesthésie ou analgésie. Les points limites mis en place sont des points limites généraux liés à l'espèce. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Tous les animaux utilisés pour la formation sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
La formation doit se faire sur l’espèce concernée Le stade de développement des animaux utilisés pour ce projet, sera identique à celui des animaux utilisés dans les procédures expérimentales
Rôle de la protéine Heat Shock B5 (HSPB5) au cours de la pneumopathie à pneumocoque ventilée chez le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
23 lapins vont être utilisés, anesthésiés puis tués avant tout réveil, dans des procédures menées sous anesthésie générale continue. Chacun est intubé et ventilé mécaniquement pendant 24 heures, infecté dans la trachée par le pneumocoque, puis reçoit un traitement testé avant l'autopsie par injection létale d'anesthésiques. Le porteur maintient les animaux sous curare et anesthésie pour éviter tout réveil et prélève poumons, foie et rate, pour évaluer un inhibiteur de la protéine HSPB5 sur l'infection pulmonaire. Il retient le lapin plutôt que de plus petits rongeurs parce qu'il permet une ventilation prolongée par les voies naturelles, les retombées pour les patients en réanimation restant au conditionnel.
Objectifs
Objectifs du projet : L’objectif principal de cette étude vise à évaluer l’effet d’une injection par les veines d’un inhibiteur de la protéine HSPB5 (Heat Shock Protein B5) sur la capacité du lapin à éliminer les bactéries au cours de l’infection du poumon par la bactérie pneumocoque, sous ventilation mécanique à l’aide d’un respirateur. Objectifs secondaires : Evaluer l’effet d’une injection par les veines d’un inhibiteur d’HSPB5 sur : - L’amélioration du fonctionnement immunitaire - L’amélioration du fonctionnement des organes (poumon, foie) - La modulation du processus de fibrose du poumon (phénomène de cicatrisation anormale du poumon)
Bénéfices attendus
L’infection du poumon par la bactérie pneumocoque demeure associée à une forte mortalité et des séquelles pulmonaires, malgré les traitements anti-infectieux. Ces expériences permettront d’évaluer un nouveau traitement inhibant la protéine HSPB5 pour savoir si il améliore la capacité de l’organisme à éliminer les bactéries et permet une résolution plus rapide de l’inflammation. Ainsi ce travail permettra de préciser le rôle de la protéine HSPB5 dans la capacité de l’organisme à se défendre au cours de l’infection pulmonaire par la bactérie pneumocoque.
Procédures
Les lapins seront soumis, par ordre chronologique durant l’expérimentation : - Intubation orotrachéale par les voies naturelles sous anesthésie générale par un cathéter préalablement posé dans une veine, pour mise en place d’une sonde d’intubation afin de pouvoir pratiquer la respiration artificielle par ventilation mécanique (20’). - Ventilation mécanique utilisant des paramètres ventilatoires similaires à ceux utilisés en pratique clinique dans les services de réanimation pour les patients qui souffrent d’infections pulmonaires graves (24 heures). - Inoculation dans la trachée de la bactérie pneumocoque, par la sonde d’intubation, chez l’animal endormi, sous anesthésie générale continue (2’) - Injection du traitement (inhibiteur d’HSPB5) ou du traitement contrôle (composé sans effet sur HHSPB5) par le cathéter (5’) à H4 - Prélèvements de sang effectués en utilisant le cathéter veineux (2’) - Autopsie à 24 heures du début de l’expérimentation après injection létale d’anesthésiques (30’)
Impact sur les animaux
Des études antérieures montrent qu’une ventilation mécanique prolongée (jusqu’à 48 heures) avec des paramètres de ventilation plus agressifs que ceux utilisés dans cette étude, n’entraine pas de risque vital pour le lapin. Dans une précédente étude, ce même modèle, avec une ventilation plus protectrice pour le poumon, n’induisait pas non plus d’infection grave et de dissémination des bactéries dans le sang. Néanmoins l’ensemble des animaux sous respirateur pour effectuer la ventilation mécanique, seront sous anesthésie générale pendant l’ensemble de l’expérimentation (absence de réveil). Le cathéter veineux préalablement posé sous anesthésie générale permet un contrôle précis de l’administration des différents traitements et la réalisation des prélèvements de sang sans causer de douleur à l’animal. Les animaux seront présents à l’animalerie la veille du début de l’expérimentation. Les animaux resteront sous anesthésie générale pendant toute la durée de la manipulation, afin d’éviter toute douleur et tout réveil intempestif. Les animaux bénéficie aussi d’un traitement permettant d’immobiliser les muscles, comme lors de la prise en charge des patients en réanimation, et permettant une ventilation sans difficulté et sans aucun ressenti pour l’animal, comme réalisé dans nos précédents travaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure sous anesthésie générale, suivi d’une injection létale d’anesthésiques. Différents prélèvements seront effectués afin de réaliser les différentes mesures immunitaires, métaboliques, et afin d’évaluer les dysfonctions des organes. → Lavage broncho-alvéolaire : mesure de paramètres immunitaires et des concentrations d’HSPB5 → Prélèvement de tissu pulmonaire : histologie pour apprécier les dommages tissulaires, bactériologie pour apprécier la clairance microbienne, extraction de protéines pour mesures immunitaires et des concentrations d’HSPB5. → Prélèvement de foie et rate : bactériologie, extraction de protéines pour mesure des concentrations immunitaires et d’HSPB5. Ainsi, ces différentes mesures permettront d’évaluer l’effet de l’anti-HSPB5 sur le devenir de l’infection du poumon par la bactérie pneumocoque, sous ventilation mécanique.
Remplacement
Le Remplacement du modèle animal est limité pour ce type d’expérimentation. L’utilisation de modèles d’étirements de cellules de poumon ne permet pas de reproduire l’infection, la réponse immunitaire et les conséquences sur le reste de l’organisme qui conduisent au décès. Le lapin est un modèle privilégié pour réaliser une ventilation mécanique prolongée par les voies naturelles. La ventilation mécanique de plus petits animaux nécessite en effet des procédures plus invasives telles que l’ouverture vers l’extérieur de la trachée, ne peut être conduite plus de 6 heures, et se complique fréquemment. Les complications de cicatrisation anormale du poumon (fibrose pulmonaire) dans les suites d’une pneumonie surviennent essentiellement en réanimation où la pneumopathie a nécessité une ventilation prolongée. Ce modèle de ventilation mécanique chez le lapin apparait pour ce projet particulièrement pertinent.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum, tout en respectant nos objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux est déterminé sur la base de nos précédents travaux représentera le nombre minimal d’animaux permettant de produire des résultats qui peuvent être analysés avec des tests statistiques. Au total, le nombre maximal de lapins sera de 23 : - N = 10/groupe (20 lapins au total) +/- 15% de perte attendue (23 lapins)
Raffinement
Chaque procédure est réalisée sous anesthésie générale. Un cathéter veineux maintenu par un gilet permet de s’affranchir de ponctions veineuses itératives et assure une anesthésie constante. Les animaux sont hébergés à température réglée. L’intubation et l’inoculation se font sur un animal préalablement anesthésié par le cathéter veineux. Un délai de 5 min est observé avant toute intervention. L’animal est pré-oxygéné. Un laryngoscope pédiatrique permet d’exposer les cordes vocales à la vue et d’insérer sous contrôle de la vue un guide semi rigide à bout mousse atraumatique entre les cordes vocales et par la suite la sonde d’intubation. En cas de mouvements moteurs lors de la stimulation de la bouche au début de la procédure, l’animal est reposé et une nouvelle dose de mélange anesthésique est administrée. L’intubation ne doit souffrir d’aucune résistance de la part de l‘animal. L’anesthésie est entretenue à l’aide d’un pousse seringue électrique pendant toute l’expérimentation et jusqu’au décès. Un médicament appelé curare permet de maintenir l’animal immobile pendant toute la durée de l’expérimentation, évitant tout risque d’extubation (retrait de la sonde d’intubation de la trachée de l’animal). Les animaux sont positionnés sur un tapis chauffant, hydratés par perfusion continue de sérum physiologique et les yeux hydratés puis occlus. Le rythme cardiaque est enregistré en continu pour dépister les variations de fréquence cardiaque et ainsi une possible dysfonction du système d’anesthésie pour y remédier rapidement. Cette surveillance est particulièrement importante dans les heures qui suivent le début de l’anesthésie générale, après l’intubation, pour détecter des défauts de fonctionnement de l’administration des traitements par le cathéter. Un passage systématique toutes les 8 heures sera effectué pour recueillir les constantes de l’animal, juger de l’efficacité de l’anesthésie et changer la seringue d’anesthésique. La mise à mort sera effectuée au terme de la durée d’expérimentation (24 h) par une injection létale d’anesthésiques administrée par le cathéter veineux. En dehors de complications possibles au moment de l’induction de l’anesthésie, nous n’attendons pas de mortalité avec ce modèle d’après nos précédents travaux, et ceux d’autres équipes. En cas de décès, l’animal sera sous anesthésie générale, sans réveil possible. Idem lors de l’autopsie programmée à 24 ou 48 heures. Une évaluation rétrospective sera effectuée à la fin du projet.
Choix des espèces
La ventilation prolongée est maitrisée sur de grands animaux (porc, singes). Les modèles sur petits rongeurs (souris, rat), ont de nombreuses limites qui rendent l’interprétation des résultats difficile : - Ventilation invasive par trachéotomie, source de complications (stress de l’animal, hémorragie, décès possible). - Contrôle difficile des volumes du fait de la taille de l’animal (une variation de volume peut entrainer des différences importantes en termes de lésions pulmonaires). - Durée de ventilation limitée (maximum 6h), l’information sera alors incomplète, car ne renseignant que sur les premières heures du processus. Le modèle du lapin permet une ventilation prolongée par les voies naturelles, sans entrainer de répercussion vitale et sur les paramètres d’échange gazeux. Lorsqu’ils auront obtenu un poids entre 2,8 et 3,3kg, environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont nécessaires. La filière respiratoire haute doit être suffisamment large pour permettre une intubation atraumatique (intubation plus difficile lorsque l’animal fait moins de 2,5kg). Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.
Pose de cathéter veineux central chez le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
33 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Ils subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, destiné à faciliter les prélèvements et injections d'études ultérieures de pharmacocinétique, de toxicité ou d'efficacité menées en prestation pour d'autres chercheurs. Le porteur reconnaît un risque de perte importante de sang pendant l'opération mais affirme que les lapins supportent "très bien" le cathéter et le gilet, sans douleur attendue. Il justifie le recours au lapin par sa taille commode pour poser le matériel et présente le remplacement comme difficile, l'effectif pouvant augmenter selon la "demande d'industriels".
Objectifs
Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 33 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2023.
Bénéfices attendus
La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.
Impact sur les animaux
La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Durant cette dernière, les animaux sont susceptibles de perdre une quantité importante de sang pouvant entrainer une mauvaise récupération post-opératoire. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.
Devenir
Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.
Remplacement
Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.
Réduction
Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 33 sur 1 an.
Raffinement
Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.
M_OI_17030 : Utilisation d’animaux pour la formation des techniciens en contrôle qualité M_OI_17030 : Utilisation d’animaux pour la formation des techniciens en contrôle qualité
- Formation professionnelle
Rats : 400
Cochons d'Inde : 10000
Lapins : 20
Furets : 10
26930 animaux non-humains, dont 16500 souris et 10000 cobayes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures à la souffrance déclarée modérée à sévère, 2500 souris étant classées en gravité sévère. Ils servent à former et requalifier des techniciens de contrôle qualité aux prélèvements sanguins, aux injections par de multiples voies et aux mises à mort par dislocation cervicale ou section des carotides. Le porteur affirme n'attendre aucun signe clinique et indique commencer par des mannequins en plastique et des cadavres avant de recourir aux animaux vivants. Il présente cette formation comme "indispensable" et "incontournable", liée au contrôle qualité des vaccins imposé par les pharmacopées.
Objectifs
Le projet consiste en la formation du personnel aux techniques standards de prélèvements de sang, d’injections de substances et d’euthanasie chez la souris/souriceaux, le rat/raton, le cobaye, le lapin, et le furet. La formation concerne tout nouveau personnel, toute personne ayant à réaliser une nouvelle technique, toute personne ayant à réaliser la requalification périodique et toute personne nécessitant une nouvelle formation suite à une déqualification. D’autre part une absence de plus de 6 mois d’un technicien nécessite la réévaluation par son manager du besoin de requalification aux gestes techniques, une absence de plus de 12 mois rend obligatoire sa requalification complète. Le programme de formation est établi en fonction de la mission de chacun au sein du Contrôle Qualité et de son niveau d’expérience et de technicité. Le programme est développé en lien avec les responsables d’équipes, les responsables de la mise en œuvre du projet, le responsable de la formation et les vétérinaires.
Bénéfices attendus
La formation du personnel est nécessaire et obligatoire dans le cadre de nos activités de contrôle qualité des vaccins qui requièrent des tests in vivo, imposés par les différentes pharmacopées. Cette formation ne peut pas être effectuée sans le recours à l’animal de laboratoire. Ce projet a pour objectif d’encadrer la formation des nouveaux techniciens animaliers et les réévaluations régulières des personnes déjà formées aux manipulations « in vivo » standards sur les souris/souriceaux, les rats/ratons, les cobayes, les lapins, et les furets, sous la responsabilité de manipulateurs référents expérimentés (système de compagnonnage). Ce système de formation permet aux personnes en charge des gestes techniques d’être parfaitement formées et compétentes et de travailler de façon harmonisée.
Procédures
Le projet consiste en la formation du personnel aux techniques standards de prélèvements de sang et d’injections de substances chez la souris/souriceaux, le rat/raton, le cobaye, le lapin, et le furet. Le programme de formation d’un collaborateur est établi de façon individuelle en tenant compte de sa mission ainsi que de son niveau d’expérience et sa technicité. Les techniques comprises dans ce projet sont les suivantes : - Injections intrapéritonéales, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, intraveineuse, intracardiaque (sous anesthésie), intracérébrales (sous anesthésie), - Prélèvements sanguins à la veine submandibulaire, à la veine jugulaire, à la veine saphène, à la veine marginale de l’oreille, à la veine caudale latérale, par ponction intracardiaque (sous anesthésie). - Méthodes liées à la mise à mort des animaux telles que la dislocation cervicale et la section des carotides et jugulaires sous anesthésie chez le rat et la souris. Les animaux peuvent être réutilisés pour une procédure du présent projet uniquement si la procédure initiale était de degré au maximum modéré et après évaluation par un vétérinaire et avec un maximum d’une seule réutilisation par animal. Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés pour ce projet, un même animal peut servir à l’acquisition de plusieurs gestes, par exemple : anesthésie par injection intramusculaire, puis injection intrapéritonéale d’un produit non irritant, prélèvement de sang par ponction cardiaque puis euthanasie par injection intracardiaque. Cette rationalisation se fait en concertation avec le vétérinaire.
Impact sur les animaux
Aucun signe clinique n’est attendu dans le cadre de ce projet. Dans le cas où un animal présenterait des signes cliniques suite à une mauvaise manipulation, l’animal sera immédiatement pris en charge par un vétérinaire. Les contraintes appliquées sur les animaux dépendent de chacun des gestes techniques appliqués. En particulier, chacun des gestes techniques décrits nécessite une contention (d’une durée inférieure à 30 secondes) suivie d’une effraction cutanée (afin de réaliser une injection ou un prélèvement). Le degré de gravité des procédures est évalué de léger à sévère selon les critères suivants : - LEGER : Contention et effraction cutanée évaluée légère pour prélèvement ou injection sur animal vigil ou anesthésié par une personne en formation => les gestes concernés sont le prélèvement à la veine submandibulaire sur souris (avec anesthésie), et les injections intra-musculaires, intra-péritonéales, intraveineuses (avec anesthésie pour la veine submandibulaire, la saphène, la jugulaire et veine cave crâniale et sans anesthésie pour la veine caudale), intradermiques et intranasales sur toutes les espèces - MODERE : Contention et effraction cutanée évaluée modérée pour prélèvement ou injection par une personne en formation => les gestes concernés sont la ponction cardiaque, la section des carotides et jugulaires, l’intracérébrale sous anesthésie et la dislocation cervicale pour souris sans anesthésie - SEVERE : Contention et effraction cutanée évaluée modérée pour prélèvement ou injection par une personne en formation => le seul geste concerné est l’injection intra-cérébrale sans anesthésie sur souriceaux.
Devenir
A l’issue des procédures décrites dans le projet, les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
La formation théorique à l’aide de photos ou vidéos est toujours réalisée en première intention. Pour certaines espèces, des modèles d’imitation en plastique sont utilisés pour les premières étapes de formation pratique aux injections. L’usage de cadavres est possible lorsque ceux-ci sont disponibles et afin d’appréhender le geste pour une personne novice (formation initiale au geste). Lorsqu’il est incontournable d’utiliser des animaux vivants, le nombre est minimisé au maximum afin de garantir la maîtrise du geste par le technicien. Tous les gestes techniques ont été revus et sont approuvés par la SBEA. Un travail de veille (via la bibliographie et la participation aux congrès) est réalisé afin de faire évoluer les techniques et intégrer des techniques de remplacement.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dépend : - du nombre de personnes à former, - de l’expérience préalable de ces personnes, - du nombre de techniques à apprendre, - de leur difficulté technique, - du nombre de techniques réalisables sur un même animal et sur la base des expériences terrain comme étant le minimum pour s’assurer que la personne formée maîtrise les gestes techniques. Dans la mesure du possible, des animaux supplémentaires issus d’autres procédures ou des animaux classées en catégories légère ou modérée pourront être utilisés pour ces formations. De plus, dès que possible, la réévaluation ou la qualification aux gestes techniques s’effectue directement lors du test afin d’éviter de commander des animaux spécifiquement pour la formation. Pour les souris et les cobayes : Un strict minimum de 15 animaux est nécessaire afin de maîtriser le geste et assurer sa reproductibilité pour les tests de contrôle qualité pour une personne en formation initiale. Un minimum de 5 animaux est nécessaire afin d’assurer la requalification du personnel à la fréquence définie par le laboratoire (tous les ans à tous les 3 ans en fonction des techniques).
Raffinement
Des moyens sont entrepris au niveau du projet ou des procédures pour réduire le stress et le niveau de souffrance : anesthésies raisonnées pour certaines techniques, choix des techniques en fonction de l’avantage expérimental procuré par rapport à la souffrance occasionnée. Un programme d’enrichissement est en place pour toutes les espèces. De plus, des techniques additionnelles telles que l’imagerie permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés via la visualisation quasi simultanée du site d’injection.
Choix des espèces
Il est indispensable d’utiliser des animaux vivants afin de se former (et maintenir ces qualifications) aux techniques d’injections et de prélèvements et ainsi, pouvoir s’assurer qu’aucun impact clinique et ou scientifique n’est constaté suite à la réalisation des gestes techniques. Certains gestes peuvent être pratiqués sur des animaux morts après (euthanasie des animaux de fin de test) ou sur des modèles d’imitation en matière plastique. Les formations sont indispensables pour s’assurer de la compétence technique et de la connaissance des bonnes pratiques des expérimentateurs avant de réaliser les tests en autonomie. Les études peuvent comporter un grand nombre d’animaux et il est indispensable d’utiliser des animaux en formation pour vérifier la maitrise et la répétabilité du geste afin d’éviter une mauvaise technicité qui conduirait à une interruption ou une répétition des tests sur animaux. D’autre part une absence de plus de 6 mois d’un technicien nécessite la réévaluation par son manager du besoin de requalification aux gestes techniques, une absence de plus de 12 mois rend obligatoire sa requalification complète
Evaluation de la rémanence d’un produit injecté en intra articulaire chez le lapin. EU 1/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
68 lapins vont être utilisés puis proposés à l'adoption, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des injections dans les deux genoux puis jusqu'à neuf séances d'IRM sous anesthésie répétée, pour évaluer la durée de présence d'un produit contre l'arthrose. Le porteur indique que la répétition des anesthésies constitue la principale nuisance et affirme une bonne tolérance du produit, testée au préalable. Il précise qu'aucun prélèvement terminal n'est prévu et que tous les animaux devraient être adoptés, sous réserve d'autorisation, l'étude servant le développement commercial d'un produit.
Objectifs
Ce projet de recherche et de développement a pour objectif d’évaluer au cours du temps la rémanence d’un produit administré au niveau de la région synoviale articulaire du genou chez le lapin par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). La rémanence se définit par un maintien dans le temps des effets d’une action ou d’un phénomène. Dans le cadre de notre projet, l’objectif est d’évaluer le maintien dans le temps de produits à action prolongée injectés en intra articulaire dans le traitement de l’arthrose et cela grâce à une quantification du volume de produit présent dans l’articulation à des temps définis. D’après l’organisation mondiale de la santé, l’arthrose est l’une des dix maladies les plus invalidantes dans les pays développés. A l’échelle mondiale, environ 10% des hommes et environ 20% des femmes âgés de 60 ans en souffrent. Dans les prochaines décennies, le vieillissement de la population, couplé à des facteurs de risques tels que l’obésité, laisse suggérer que le nombre de personnes atteintes d’arthrose va continuer d’augmenter. Cette pathologie, d'étiologie plurifactorielle, est caractérisée par la présence de lésions du cartilage associée à des anomalies pathologiques diverses au niveau des articulations. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de traitement médicamenteux permettant de régénérer le cartilage, les produits sur le marché ne permettant que de soulager et retarder l’avancée de la maladie avant une éventuelle chirurgie (prothèse). Ainsi, l’étude de produit innovant, notamment à base d’Acide Hyaluronique (HA), permettant notamment de restaurer les propriétés viscoélastiques du liquide synovial, la capacité d’absorption des chocs et de lubrification de la région synovial est donc un enjeu majeur. Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux) et dont le certificat sanitaire le permet pourront être placés sous réserve de trouver des adoptants pouvant leur offrir une retraite dans le respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement et à la mise sur le marché de nouveaux produits contre l’arthrose, avec notamment une meilleure rémanence des produits.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés (induction en fixe puis relais en volatile) et intubés pour les injections intra articulaire (sous condition stérile) puis pour chaque session d’imagerie selon la durée totale de l’étude et le nombre de délai d’imagerie applicable. Un total de 10 interventions seront prévues au maximum (injection, puis 9 délais d'imagerie avec une première session 24h à 48h après, puis 7 jours de délai au minimum entre chaque session suivante d'imagerie).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les lapins seront essentiellement dus à la répétition des anesthésies réalisées premièrement par une injection intramusculaire puis l’animal sera maintenu sous anesthésie gazeuse par intubation. Cette procédure d’anesthésie sera régulière selon la durée totale de l’étude et le nombre d’IRM applicables, espacées de 24h minimum entre chaque temps par animal. Aucune nuisance ou effet indésirable de l’injection intra-articulaire n’est attendu étant donné que la tolérance du produit aura été testé au préalable et qu’il aura été démontré une bonne tolérance du/des produits injectés. Cependant, le transport jusqu'au lieu de réalisation des examens d’imagerie pourrait induire également un stress.
Devenir
Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal. Il est prévu à ce jour de faire adopter tous les animaux, aucun prélèvement terminaux n’étant prévus.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… L'articulation du genou étant une zone très spécifique (mouvements, isolement du reste de l'organisme, ...), les méthodes in vitro ou in silico ne permettent pas à ce jour à mimer de manière fiable le comportement d'un produit injecté dans cette zone sur le long terme.
Réduction
Une étude pilote permettant de valider la bonne visualisation et la bonne quantification par imagerie des produits injectés à 24h et 48h post injection sera réalisée sur 4 animaux. Si le produit candidat n’est pas visible ni quantifiable à ces temps courts post injection, la/les étude(s) principale(s) ne seront pas réalisées. La tolérance du produit a déjà été testée préalablement in vitro/in vivo. Ainsi, les 2 genoux seront injectés. L’injection dans les 2 genoux de chaque lapin permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation des animaux et ainsi réduire leur nombre nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes (nombre de lapins réduits à son strict nécessaire pour avoir 8 genoux par groupe soit 12 lapins). Avec 8 genoux comparables par groupe, une approche statistique est prévue : si un test paramétrique peut être utilisé, un test t de Student sera utilisé pour comparer 2 groupes et une Anova avec test de Dunett sera utilisé pour comparer un groupe versus un groupe contrôle ou test de Newman-Keuls pour comparer des groupes entre eux 2 à 2. Si un test non paramétrique doit être utilisé, un test de Wilcoxon sera utilisé pour comparer 2 groupes et un test de Kruskall-Wallis sera utilisé pour comparer n groupes versus un groupe contrôle et un test de Friedman pour comparer n groupes entre eux 2 à 2.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 4 jours minimum sera respectée. Toutefois, une période d’acclimatation de 7 jours sera privilégiés dès que cela sera possible. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles, abris, bois à ronger, …). L’injection du produit stérile par voie intra articulaire ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante seront réalisés sous anesthésie induite en IM puis maintenue par voie volatile, afin d’éviter tout stress aux animaux. Les sites d’injection seront suivis à minima pendant 8 jours après administration intra articulaire. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et un suivi clinique avec grille de scoring seront réalisés minimum 1 fois par semaine. Tout signe clinique d’appel (voir §4, grille de scoring) sera remonté au vétérinaire, si l’animal présente des douleurs ou un inconfort, le vétérinaire pourra prescrire un antalgique (exemple : meloxicam à 0.4mg/kg). Enfin, tout examen clinique complet témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. Le projet se déroulant sur deux établissements utilisateurs, des transports sont prévu entre les deux établissements. La température sera adaptée et suivie (environ 20°C, avec sonde de température) et les cages de transports seront suffisamment grandes pour assurer le bien-être des animaux pendant le trajet. De la nourriture et de l'eau pourront être mis à disposition à l'arrivée des animaux et une période de calme sera respectée à l'arrivée avant tout anesthésie afin de limiter au maximum le stress.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce couramment utilisée comme modèle pour les pathologies de l’arthrose et du genou. En effet, la taille du genou facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des espèce plus petites. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). [McCoy AM. Animal Models of Osteoarthritis: Comparisons and Key Considerations. Veterinary Pathology. 2015; 52(5):803-818. doi:10.1177/0300985815588611] Des lapins adultes de 11 semaines minimum seront utilisés dans ce projet pour avoir des articulations et des cartilages matures sur des animaux n’étant plus en forte période de croissance osseuse.
Production d’anticorps pour l’identification des bactéries du genre Brucella
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par des souches vivantes de Brucella pour leur faire produire des anticorps, puis mis à mort par ponction cardiaque afin de récupérer leur sang et leurs organes. Le porteur indique que l'infection provoque une fièvre intermittente, une baisse d'appétit et une perte de poids, et présente cette production de sérums mutualisée en Europe comme visant à limiter le nombre de lapins utilisés. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode in vitro" de production de ces anticorps, tout en évoquant une piste à partir des cellules de rate pour "s'affranchir" à l'avenir de l'animal.
Objectifs
La brucellose est une maladie qui se transmet de l'animal à l'homme, et vice versa, causée par la bactérie Brucella, qui touche un très large spectre d’hôtes, incluant les hommes, de nombreuses espèces de mammifères et même les amphibiens. L'une des étapes du diagnostic consiste en l’identification de la souche de Brucella responsable de la maladie par un test rapide d'identification sur lame appelé typage bactériologique. Ce typage nécessite l'utilisation de sérums contenant des anticorps dirigés spécifiquement contre une espèce de Brucella, dit sérums monospécifiques. Notre premier objectif est la préparation de sérums monospécifiques contre quatres espèces de Brucella : deux espèces lisses de Brucella (B. abortus et B. melitensis), une espèce rugueuse (B. ovis) et une nouvelle espèce (BO3). Il permettra également de produire un sérum négatif (sans anticorps) pour la validation du biotypage (contrôle négatif) permettant l’identification du genre Brucella. L’expérimentation permettra également la production d’un sérum négatif indispensable pour la validation du biotypage. La production de sérums mono-spécifiques est mutualisée à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale de lapins vivants et devrait permettre d’obtenir une quantité de sérum visant à maintenir les capacités européennes de typage bactériologique pour 7 à 10 ans. Cette préparation de sérums monospécifiques sera réalisée en trois étapes : immunisation/inoculation de lapins au moyen de suspensions bactériennes vivantes de Brucella non atténuées ; prélèvement du sang des animaux infectés et des contrôles négatifs pour arriver à obtenir une concentration en anticorps suffisante pour la suite des étapes ; et élimination des anticorps non-spécifiques des sérums afin d’obtenir un sérum spécifique d’une seule espèce bactérienne. Ce projet permettra également de collecter les organes (foie, poumons, ganglions lymphatiques et organes reproducteurs) des animaux après mise à mort afin de constituer une collection de tissus positifs pour chacun des genres de Brucella qui serviront de contrôles positifs pour la validation des méthodes de diagnostic. Enfin, les cellules de la rate qui produisent des anticorps mono-spécifiques seront utilisées afin de développer un protocole de production in vitro d’anticorps mono-spécifiques et ainsi réduire si possible la nécessité d'utiliser des animaux.
Bénéfices attendus
Le projet vise à produire des réactifs (sérums monospécifiques et témoin négatif) permettant l’identification de l’espèce bactérienne de Brucella lors d’une suspicion de brucellose. Quatre sérums monospécifiques seront produit grace à ce projet, chaque sérum monospécifique étant constitué d’anticorps dirigés spécifiquement contre une espèce de Brucella. Un sérum « contrôle négatif » (sans anticorps) sera également produit. Ces sérums sont indispensables pour le typage bactériologique, et notamment pour une espèce récemment décrite (souche zoonotique de Brucella BO3) qui n’est à ce jour pas identifiable à l'aide des sérums existants, et pour laquelle les anticorps ne sont pas détectables par les méthodes d’immuno-sérologie classiques. Ces sérums seront utilisés comme réactifs par l’ensemble des laboratoires de référence de l’Union Européenne pour les diagnostiques de brucelloses animales. À ce jour, il n'existe pas de méthode in vitro de production d'anticorps et le recours à une infection expérimentale est le seul moyen d'obtenir ces anticorps spécifiques. Un autre bénéfice attendu du projet est d’obtenir à partir de la rate des lapins infectés des cellules productrices d’anticorps spécifiques contre le genre Brucella qui pourraient permettre de faire évoluer le protocole vers une production in vitro des sérums mono-spécifiques avec l’objectif de s’affranchir d’une expérimentation animale à l’avenir.
Procédures
Tous les animaux utilisés (12 animaux au mimimum et 15 animaux au maximum) seront soumis à des prélèvements sanguins (1 mL) avant infection (à J-5), puis à J6 post-infection et éventuellement à J8 et J10 selon les résultats de la concentration sérique des prélèvements. Pour ce faire, les lapins sont tranquillisés par une injection intra-musculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg) pendant 5 - 10 minutes. Soit au maximum 4 prélèvements par animal. À J0, les animaux dans l’animalerie A3 (8 animaux, par série de 2 animaux à la fois) seront infectés par une des 4 souches de Brucella dédiées (2 animaux infectés pour chaque souche). Pour ce faire, les lapins sont tranquillisés par une injection intramusculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg) pendant 5 minutes. Soit une seule injection par animal. La technique de mise à mort est appropriée pour les lapins (selon l’annexe IV). Les lapins sont anesthésiés par un mélange Xylazine (35 mg/Kg) et de Kétamine (10 mg/Kg) injecté par voie intramusculaire pendant 15 minutes. L’anesthésie est confirmée par les tests de réflexe de retrait de la patte et de réflexe de la paupière. La mise à mort des lapins est assurée par une injection intracardiaque de 5 mL de barbiturate (Doléthal) après exsanguination par ponction cardiaque. Soit deux injections pour la mise à mort par animal.
Impact sur les animaux
Les lapins sont des animaux sensibles à l’infection par Brucella spp. Les lapins de race New Zealand White sont choisis comme animal de laboratoire standard, avec une réaction connue à l'infection par Brucella spp.. La dose proposée est calibrée en fonction de la réaction du système immunitaire des lapins pour provoquer une forte réponse immunitaire (production d’anticorps par l’organisme) mais la durée de l’infection n’est pas suffisante pour que des symptômes non spécifiques se développent. D’après les expériences similaires décrites dans la littérature, la courte période de l’expérimentation et la dose infectieuse utilisée nous attendons chez les lapins les effets indésirables suivants : une fièvre intermittente de quelques jours, baisse d’appétit et par conséquent perte de poids. Après inoculation des agents pathogènes, l'état clinique des animaux sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.
Remplacement
La production de sérums monospécifiques n’est possible qu’à partir de l’immunisation d’animaux au moyen de suspensions bactériennes vivantes de Brucella non atténuées. En effet, la production d'anticorps spécifiques nécessite la stimulation de l'ensemble du système immunitaire pour la maturation des anticorps dans un modèle animal vivant sous conditions contrôlées. Cette production n’est réalisée que rarement, tous les 10 ans en moyenne, en mutualisant l’utilisation des réactifs à l’échelle européenne, afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux. Nous profiterons de cette série de production pour isoler les cellules de rate, productrices des anticorps spécifiques contre la souche de Brucella inoculée, et les immortaliser. Cette étape pourrait nous permettre de faire évoluer le protocole vers une production in vitro des sérums mono-spécifiques et ainsi de s’affranchir d’une expérimentation animale à l’avenir.
Réduction
La production de sérums monospécifiques est mutualisée à l’échelle européenne afin de limiter l’utilisation expérimentale d’animaux vivants. Le modèle lapin a été choisi au regard de la quantité de sérum qui pourra être produite (50 mL de sérum monospécifique attendu pour un prélevement de sang total de 80 mL par lapin) et qui sera suffisante pour couvrir les besoins en sérum monospécifiques pour une longue durée tout en utilisant le moins d’animal possible. Le nombre minimal de lapins a été calculé pour chaque sérum monospécifique (2 lapins infectés et 1 animal témoin pour chaque espèce de Brucella), avec l’objectif d’obtenir une quantité de sérum permettant de maintenir les capacités européennes de typage bactériologique pour 7 à 10 ans, correspondant à une quantité d’environ 100 mL pour chaque sérum monospécifique.
Raffinement
A leur arrivée à l’animalerie les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins étant très sensibles à la manipulation, ils seront surveillés et approchés quotidiennement pendant les sept jours d’acclimatation par les animaliers et les expérimentateurs pour les habituer à leur présence et aux manipulations. Après la periode d’acclimatation, les lapins destinés à l’infection seront transférés dans la zone confinée de niveau de sécurité biologique 3 de l’animalerie et placés dans des cages avec des branches en bois et des branches végétales comme enrichissement. Durant l’expérimentation, l'état clinique des animaux sera contrôlé quotidiennement, afin de suivre l’évolution de la température corporelle, l’évolution du poids, la prise de nourriture et l’état général des animaux. Avant tous prélèvements sanguins, prise de température et pesée, les animaux seront tranquillisés par une injection en intramusculaire de Xylazine (5 mg/Kg) et d’acépromazine (0,75 mg/Kg).
Choix des espèces
Les lapins sont sensibles à l’infection par de nombreux agents pathogènes, dont les espèces classiques du genre Brucella. Les lapins de race New Zealand White sont choisis comme animal de laboratoire standard, avec une réaction connue à l'infection par Brucella spp. Les lapins utilisés pour l’expérimentation sont des adultes (race New Zealand White) présentant un poids de 3,5 à 4 Kg afin d’optimiser la quantité de sérum obtenue par animal.
Evaluation de la rémanence d’un produit injecté en intra articulaire chez le lapin EU 2/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
68 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans être tués à l'issue, le porteur prévoyant de les faire adopter faute de prélèvement terminal. Chaque animal reçoit une injection dans les deux genoux puis jusqu'à dix anesthésies successives pour des séances d'IRM, les deux genoux servant à tester deux produits par lapin. Le porteur indique n'attendre aucun effet indésirable de l'injection et rattache les nuisances à la répétition des anesthésies. Il affirme qu'aucune méthode ne modélise le comportement d'un produit injecté dans un "organisme entier vivant" et décrit un projet de développement de produits contre l'arthrose.
Objectifs
Ce projet de recherche et de développement a pour objectif d’évaluer au cours du temps la rémanence d’un produit administré au niveau de la région synoviale articulaire du genou chez le lapin par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). La rémanence se définit par un maintien dans le temps des effets d’une action ou d’un phénomène. Dans le cadre de notre projet, l’objectif est d’évaluer le maintien dans le temps de produits à action prolongée injectés en intra articulaire dans le traitement de l’arthrose et cela grâce à une quantification du volume de produit présent dans l’articulation à des temps définis. D’après l’organisation mondiale de la santé, l’arthrose est l’une des dix maladies les plus invalidantes dans les pays développés. A l’échelle mondiale, environ 10% des hommes et environ 20% des femmes âgés de 60 ans en souffrent. Dans les prochaines décennies, le vieillissement de la population, couplé à des facteurs de risques tels que l’obésité, laisse suggérer que le nombre de personnes atteintes d’arthrose va continuer d’augmenter. Cette pathologie, d'étiologie plurifactorielle, est caractérisée par la présence de lésions du cartilage associée à des anomalies pathologiques diverses au niveau des articulations. Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de traitement médicamenteux permettant de régénérer le cartilage, les produits sur le marché ne permettant que de soulager et retarder l’avancée de la maladie avant une éventuelle chirurgie (prothèse). Ainsi, l’étude de produit innovant, notamment à base d’Acide Hyaluronique (HA), permettant notamment de restaurer les propriétés viscoélastiques du liquide synovial, la capacité d’absorption des chocs et de lubrification de la région synovial est donc un enjeu majeur. Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement et à la mise sur le marché de nouveaux produits contre l’arthrose, avec notamment une meilleure rémanence des produits.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés (induction en fixe puis relais en volatile) et intubés pour les injections intra articulaire (sous condition stérile) puis pour chaque session d’imagerie selon la durée totale de l’étude et le nombre de délai d’imagerie applicable. Un total de 10 interventions seront prévues au maximum (injection, puis 9 délais d'imagerie avec une première session 24h à 48h après, puis 7 jours de délai au minimum entre chaque session suivante d'imagerie).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sur les lapins seront essentiellement dus à la répétition des anesthésies réalisées premièrement par une injection intramusculaire puis l’animal sera maintenu sous anesthésie gazeuse par intubation. Cette procédure d’anesthésie sera régulière selon la durée totale de l’étude et le nombre d’IRM applicables, espacées de 24h minimum entre chaque temps par animal. Aucune nuisance ou effet indésirable de l’injection intra-articulaire n’est attendu étant donné que la tolérance du produit aura été testé au préalable et qu’il aura été démontré une bonne tolérance du/des produits injectés.
Devenir
Le devenir des animaux dépendra des procédures réalisées durant l’étude. Les animaux qui n’auront subi aucuns prélèvements terminaux (prélèvements d’organes ou prélèvements de sang trop important pour le rétablissement des animaux), dont le certificat sanitaire le permet et sous réverse d’une autorisation par les autorités réglementaires, pourront être placés chez des adoptants qui leur fourniront une retraite dans le respect du bien-être animal. Il est prévu à ce jour de faire adopter tous les animaux, aucun prélèvement terminaux n’étant prévus.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal… L'articulation du genou étant une zone très spécifique (mouvements, isolement du reste de l'organisme, ...), les méthodes in vitro ou in silico ne permettent pas à ce jour à mimer de manière fiable le comportement d'un produit injecté dans cette zone sur le long terme.
Réduction
Une étude pilote permettant de valider la bonne visualisation et la bonne quantification par imagerie des produits injectés à 24h et 48h post injection sera réalisée sur 4 animaux. Si le produit candidat n’est pas visible ni quantifiable à ces temps courts post injection, la/les étude(s) principale(s) ne seront pas réalisées. La tolérance du produit a déjà été testée préalablement in vitro/in vivo. Ainsi, les 2 genoux seront injectés. L’injection dans les 2 genoux de chaque lapin permet d’administrer 2 traitements différents par animal, ce qui permet d’optimiser l’utilisation des animaux et ainsi réduire leur nombre nécessaire pour atteindre des données scientifiques robustes (nombre de lapins réduits à son strict nécessaire pour avoir 8 genoux par groupe soit 12 lapins). Avec 8 genoux comparables par groupe, une approche statistique est prévue : si un test paramétrique peut être utilisé, un test t de Student sera utilisé pour comparer 2 groupes et une Anova avec test de Dunett sera utilisé pour comparer un groupe versus un groupe contrôle ou test de Newman-Keuls pour comparer des groupes entre eux 2 à 2. Si un test non paramétrique doit être utilisé, un test de Wilcoxon sera utilisé pour comparer 2 groupes et un test de Kruskall-Wallis sera utilisé pour comparer n groupes versus un groupe contrôle et un test de Friedman pour comparer n groupes entre eux 2 à 2.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 4 jours minimum sera respectée. Toutefois, une période d’acclimatation de 7 jours sera privilégiés dès que cela sera possible. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles, abris, bois à ronger, …). L’injection du produit stérile par voie intra articulaire ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante seront réalisés sous anesthésie afin d’éviter tout stress aux animaux. Les sites d’injection seront suivis à minima pendant 8 jours après administration intra articulaire. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et un suivi clinique seront réalisés minimum 1 fois par semaine. Tout signe clinique d’appel sera remonté au vétérinaire, si l’animal présente des douleurs ou un inconfort, le vétérinaire pourra prescrire un antalgique. Enfin, tout examen clinique complet témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. Le projet se déroulant sur deux établissements utilisateurs, des transports sont prévu entre les deux établissements. La température sera adaptée et suivie et les cages de transports seront suffisamment grandes pour assurer le bien-être des animaux pendant le trajet. De la nourriture et de l'eau pourront être mis à disposition à l'arrivée des animaux et une période de calme sera respectée à l'arrivée avant tout anesthésie afin de limiter au maximum le stress.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce couramment utilisée comme modèle pour les pathologies de l’arthrose et du genou. En effet, l’anatomie du genou du lapin est proche de celle de l’homme et sa taille facilite les analyses histologiques et d'imagerie par rapport à des plus petites espèces. De plus, il s'agit d'un animal couramment employé en expérimentation animale, permettant ainsi d'une part de gérer plus facilement son bien-être au cours de l'étude et d'autre part de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Des lapins adultes de 11 semaines minimum seront utilisés dans ce projet pour avoir des articulations et des cartilages matures sur des animaux n’étant plus en forte période de croissance osseuse.
Etude du devenir de la spironolactone et ses métabolites dans les structures oculaires pour le traitement de maladies des segments antérieur et postérieur de l’œil
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
180 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des instillations répétées de collyre, une partie subissant en plus une chirurgie oculaire ou une injection intraoculaire sous anesthésie, dont un modèle de retrait de l'épithélium cornéen. Le porteur affirme, sur la foi d'études préliminaires chez le rat, que le collyre est "très bien toléré" et n'attend pas de nuisances. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne détermine la pharmacocinétique et que le lapin reste "l'espèce de choix" pour l'œil, les globes étant énucléés après la mise à mort.
Objectifs
Le récepteur minéralocorticoïde (MR) est classiquement exprimé dans le rein où il est impliqué dans la régulation des canaux/pompes ioniques via la liaison à l’aldostérone contribuant à la réabsorption du sodium et le maintien de la pression artérielle, mais est aussi exprimé dans le cœur, les vaisseaux, le tissus adipeux, etc. Une activation chronique excessive du MR est liée à l’inflammation, le stress oxydant et la fibrose. Le MR est également exprimé dans l’œil où son activation est pathologique et l’antagonisme pharmacologique du MR a montré des effets bénéfiques. Des études in vitro ont montré que l’aldostérone augmente la prolifération et la formation de tubules des cellules endothéliales des capillaires rétiniens, ce qui a été réduit par la spironolactone, l’un des antagonistes pharmacologiques du MR. La signalisation de la voie minéralocorticoïde a également été impliqué dans la choriorétinopathie séreuse centrale (CSCR) dans laquelle l’antagonisme du MR a montré une résolution rapide du décollement de la rétine et la vasodilatation choroïdienne. Nous avons récemment montré que l’antagonisme du MR est bénéfique dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge de type néovasculaire. Dans un modèle expérimental de néovascularisation choroïdienne induite par le laser, il a été montré que le MR jour un rôle fondamental dans l’angiogenèse choroïdienne. La spironolactone a réduit l’inflammation précoce et induit des effets anti-angiogéniques. Le MR est également exprimé dans l’épithélium cornéen et néovaisseaux cornéens (données non publiées). Dans un modèle de souris knock-out pour le MR dans les cellules endothéliales vasculaires,
Bénéfices attendus
Nous avons montré que l’antagonisme pharmacologique du récepteur minéralocorticoïde a des effets bénéfiques dans l’œil. La spironolactone est un antagoniste très puissant du MR mais peu spécifique ce qu’entraine des effets indésirables lorsqu’elle est administrée par voie orale, la seule voie d’administration utilisée à ce jour. C’est pour cela que nous avons développé des formulations oculaires de spironolactone afin de pouvoir traiter des maladies oculaires des segments postérieur et antérieur de l’œil. Des prérequis sont cependant nécessaires avant la mise sur le marché d’un médicament. Les études de pharamcocinétique (PK) sont nécessaires et permettent de décrire le comportement et le devenir du produit dans l’organisme. L’objectif de cette étude est d’étudier les différents paramètres de la PK et la cinétique de libération de la spironolactone et ses métabolites dans l’œil ce qui permettra d’étudier sa distribution dans les tissus et milieux oculaires et connaître la concentration efficace du traitement dans les tissus cibles afin d’adapter les posologies. A l’issu de cette étude, nous aurons plus de connaissances sur le comportement de la libération de la spironolactone et espérons pouvoir ainsi avancer vers la mise dans le marché d’un nouveau traitement pour des affections oculaires.
Procédures
Les instillations des collyres se font sur animal vigile, avec contention physique manuelle ou dans une serviette. 3 fois à 6 fois par jour pendant une journée sur 72 animaux. Puis, dans un deuxième temps et suivant les résultats de l’étude préliminaire, les animaux, au total de 20, recevront les instillations des collyres 3 ou 6 fois par jour pendant 3 ou 5 jours. Les animaux (au total de 36) ont une chirurgie oculaire sous anesthésie générale qui dure 15 minutes une seule fois puis ont des instillations de collyres 3 fois à 6 fois par jour pendant une journée. Une injection intraoculaire est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 10 secondes pour l’injection, une seule fois, sur 52 animaux.
Impact sur les animaux
Dans les études préliminaires réalisées au laboratoire, l’instillation du collyre dans les yeux de rats pendant 7 jours n’a pas entrainé des signes cliniques d’inflammation ou de rougeurs de la surface oculaire dont la cornée et la conjonctive et des études en ex-vivo de la cornée ont montré une absence de marqueurs de l’inflammation et de stress oxydant montrant que le collyre est très bien toléré par l’œil de rat. On peut donc s’attendre à ce que le collyre n’entraîne pas de nuisances et effets indésirables sur les animaux. Concernant le modèle de dés épithélialisation cornéenne, les animaux recevront un antidouleur pendant 3 jours. Il n’y a pas de risque de perforation de la cornée. Seul l’épithélium cornéen est retiré à l’aide d’un scarificateur qui est un objet non tranchant. Il s’agit d’un modèle qui a été mis au point par le laboratoire de recherche. Pour l’injection intravitréenne, la tolérance a été évaluée dans les yeux de rats qui n’ont développé aucun signe d’inflammation et irritation. L’injection en elle-même peut cependant entraîner une hémorragie au point de l’injection ou si elle touche d’autres tissus dont le cristallin. La tolérance des nanosphères n’a pas encore été étudiée dans les yeux de rats mais des études antérieures ont montré que les excipients de la formulation n’entraînent pas ou très peu d’effets indésirables. Les doses sont faibles étant donné que les formulations sont administrées localement. La quantité de produit qui traverse les barrières oculaires et se retrouve dans le sang est négligeable.
Devenir
A l’issue des 3 procédures, tous les animaux sont euthanasiés, les yeux seront énucléés puis les milieux et tissus oculaires seront prélevés et congelés pour des études analytiques par HGPLC-MS afin de quantifier la libération de spironolactone et ses métabolites dans l’œil.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle in vitro ne permet de déterminer les propriétés pharmacocinétiques des molécules. Dans ce projet, le lapin sera utilisé pour nos études de PK car reste l’espèce de choix pour l’évaluation des composés ophtalmiques aux vues des caractéristiques anatomiques de l’œil qui possèdent des similarités avec celle de l’Homme, de la facilité à le manipuler et de sa fiabilité pour l’évaluation de la cinétique oculaire. Dans cette étude, il est impératif de passer par l’animal avant de procéder à des tests cliniques chez l’homme.
Réduction
Au total, un maximum de 180 lapins seront utilisés dans ce projet. Une étude de la littérature ainsi qu’une estimation grâce à l’algorithme fourni par le logiciel statistique ont été réalisées pour s’assurer de la faisabilité du projet ainsi que pour estimer le nombre d’animaux nécessaire. Une analyse a priori a été réalisée afin de calculer la taille des échantillons. Un test d’hypothèse a été réalisé et le seuil de significativité a été fixé à 0,05. La taille d’effet permettant de montrer l’importance de l’ampleur de l’effet a été calculée en prenant en compte les variables d’autres études et expériences précédentes dans la littérature. En fixant une puissance à 0.80, le logiciel nous a permis de calculer un nombre d’animaux égal à 5 par groupe avec une puissance réelle de 0.87. De plus, une étude préliminaire sera réalisée afin de s’assurer que les formulations libèrent le principe actif dans le temps avant de commencer les vraies études de PK.
Raffinement
Les lapins seront placés dans des cages individuelles avec enrichissement du milieu jouets en caoutchouc, buchettes de bois à ronger, cubes de foin) afin que ces derniers soient dans un environnement qui leur soit le plus adapté possible. Ils seront suivis quotidiennement pendant les périodes d’évaluation, ainsi que pendant les phases «de repos » afin de s’assurer de leur bien-être et de pouvoir apporter rapidement des soins le cas échéant. Les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé générale et la tolérance locale du traitement. Les animaux auront une anesthésie générale et une administration d'anesthésique locale dans l'oeil au cours des interventions. Les animaux recevront également un anti-douleur (oioïde) 2 fois par jour pendant 3-5 jours. Prostration des animaux dans leur cage, difficulté à ouvrir les yeux, yeux rouges, très fort larmoiement sont des indices d’intolérance oculaire et de gène physique : dans ce cas, la procédure est arrêtée, l'animal est exclus de l’étude et gardé en vie jusqu’à la fin du protocole. Si les troubles du comportement persistent plus de 2 jours sans amélioration, l’animal est mis àmort.
Choix des espèces
Dans cette étude, le lapin sera utilisé. Ce modèle animal a été utilisé car il reste l’espèce de choix pour l’évaluation des composés ophtalmiques aux vues des caractéristiques anatomiques de l’œil qui possèdent des similarités avec celle de l’Homme notamment en termes de turn-over de l’humeur aqueuse et de volume vitréen, de la facilité à le manipuler et de sa fiabilité pour l’évaluation de la cinétique oculaire. Pour l’étude de la pharmacocinétique de formulations sous forme de collyre pour le segment antérieur, des lapins albinos Néo-Zélandais seront utilisés et pour le segment postérieur, des lapins pigmentés Fauve de Bourgogne seront utilisés. Les lapins jeunes âgés de 3 mois environ (jeune adulte) seront utilisés pour les expériences. L’âge choisie est en accord avec ce qui est fait dans la littérature pour des études de pharmacocinétique.
Etude de pharmacocinétique aprés une administration oculaire chez le lapin
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
30 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vingt-huit reçoivent le dépôt d'un produit test dans les deux yeux, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever les structures oculaires, deux lapins de réserve pouvant être replacés s'ils ne servent pas. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable du produit, de la classe infectiologie, et prévoit une surveillance des yeux pour repérer rougeurs et gonflements. Il conclut qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang et qu'il est donc "nécessaire de recourir à l'animal dans son ensemble".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'un produit test aprés une simple administration oculaire dans les deux yeux chez le lapin et de mesurer la tolérance, l'impact de ce produit au niveau structural.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres PK de la formulation test et de démontrer la bonne tolérance de cette formulation au niveau des structures oculaires. Cela sera bénéfique pour l'homme dans le cadre des infections au niveau de l'oeil.
Procédures
Les animaux seront contentionnés pour réaliser l'administration oculaire. L'administration consiste à un simple dépôt (50 µL dans chaque oeil en utilisant une micropipette et cônes adaptés). Durée estimée de l'ordre de quelques minutes. Puis les animaux seront anesthésiés durant le temps du prélèvement sanguin. De l'ordre de quelques minutes également. Les animaux seront euthanasiés pour pouvoir collecter les structures oculaires par administration d'un euthanasique. Durée de l'injection de l'euthanasique: de l'ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Le produit test fait partie de la classe thérapeutique infectiologie. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus. Un suivi quotidien (et plusieurs fois par jour le jour des administrations) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général) plus particulièrement observation des mouvements de tête. Observation au niveau des yeux comme rougeurs, gonflements, présence au non de larmes....
Devenir
Dans ce projet 30 animaux seront inclus. 28 animaux seront administrés et 2 animaux seront des animaux de réserves. Si les animaux de réserve ne sont pas utilisés ils pourront être replacés. Les 28 animaux administrés seront mis à mort pour récupérer un échantillon de sang et les structures oculaires pour être analysés.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang et aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'impact de la formulation à testée au niveau oculaire sur du tissus vivant il est donc nécessiare de recourir à l'animal dans son ensemble.
Réduction
30 animaux seront inclus dans ce projet. 28 animaux seront administrés et 2 animaux de réserve sont prévus. Les animaux seront réparti en 7 groupes de 4 animaux. 4 animaux par groupe est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats significatifs par rapport aux paramètres pharmacocinétiques et par rapport aux éventuelles modifications tissulaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en boxes collectifs dés l'arrivée jusqu'à la fin de la phase animale. 6 boxes de 5 animaux. Cet hébergement collectif est nécessaire durant l'étude pour un contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, milieu enrichi adapté à l'espèce (copeaux, cachette, buchette à ronger ..) Toutes les manipulations sur les animaux seront faites par un personnel formé, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront observés pendant la phase de réveil. Un suivi quotidien (et plusieurs fois par jour le jour des administrations) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général) plus particulièrement observation des mouvements de tête. Observation au niveau des yeux comme rougeurs, gonflements, présence au nom de larmes.... L'animal sera préalablement anesthésié avant la réalisation du prélèvement sanguin et avant de ce fait avant d'être euthanasié. Les points limites stricts et spécifiques de ce projet seront appliqués à savoir: - Douleurs ( animal prosté, oreilles en arrières, grattage au niveau de la gueule, oeil mi-clos) - Rougeurs, gonflements, grattage au niveau des yeux - Ecoulement oculaire important - Oeil complètement fermé - Lésions tissulaire oculaire
Choix des espèces
Le lapin est une espèce fréquemment utilisée en recheche pre-clinique pour le développement de médicaments destinés à l'homme et la taille de cet animal permet de le manipuler assez facilement. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes afin de ne pas avoir de pathologies liées au vieillissement au niveau des structures oculaires.
Evaluation de nouveaux agents d’embolisation chez le lapin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
720 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère, la majorité tués à l'issue et une soixantaine réutilisés. Ils subissent jusqu'à quatre interventions, implantation d'une tumeur au foie, embolisation d'une artère avec ou sans réveil, et des séances d'imagerie répétées jusqu'à dix fois sous anesthésie. Le porteur indique un risque de perte de mobilité voire de paralysie d'une patte, une ischémie de zones non ciblées et le développement de métastases hépatiques et pulmonaires. Il précise que beaucoup d'animaux sont tués pour ne pas atteindre les points limites ou parce qu'ils souffriraient de séquelles lourdes après des embolisations multiples, le projet testant des agents d'embolisation internes ou de partenaires.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité et la facilité d’utilisation d’agents d'embolisations divers sur différents territoires et différentes pathologies. Ce sont des produits qui peuvent être issus de la recherche interne ou de partenariats académiques ou privés.
Bénéfices attendus
L'embolisation est une pratique courante en clinique permettant une alternative à la chirurgie qui est invasive, douloureuse et parfois non réalisable. Cette procédure permet une récupération beaucoup plus rapide pour les patients et une durée d’hospitalisation plus courte. Dans ce contexte, proposer aux praticiens des solutions diverses répondant à toutes les utilisations potentiellement éligibles à l'embolisation est un problème de santé publique.
Procédures
4 procédures chirurgicales et des prélèvements sont prévus dans ce projet. - L’implantation tumorale hépatique (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois - L’embolisation artérielle sans réveil (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois mais ils peuvent avoir subi une implantation tumorale au préalable - L’embolisation artérielle avec réveil (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois mais ils peuvent avoir subi une implantation tumorale au préalable - L’imagerie Rayon X, échographique ou IRM (10, 20 et 50 minutes respectivement sous anesthésie générale). Cette procédure peut être répétée jusqu’à 10 fois mais avec des délais leur permettant de récupérer entre 2 procédures d’imagerie. Ces lapins auront tous subi une procédure d’embolisation avec réveil au préalable plus, éventuellement, une implantation tumorale. - Les prélèvements sanguins seront réalisés à l’oreille (quelques secondes en vigile) sur tous les animaux ayant eu une procédure d’embolisation avec réveil, pour les dosages de biomarqueurs ou de produit.
Impact sur les animaux
La chirurgie au niveau de l’artère fémorale peut potentiellement entrainer une perte de mobilité, voire une paralysie de la patte arrière chirurgiquée. Celle ci se produit dans de rares cas ou le catheter inséré dans l'artère fémorale bloque de façon prolongée la vascularisation collatérale de celle ci. C'est potentiellement le cas lors d'une imagerie prolongée avec injection dans le système d'imagerie. Une ouverture du plan cutané au niveau abdominal peut se produire dans les 24 heures suivants l'opération si l'animal ote accidentellement ces points de suture une fois réveillé dans sa cage. L'embolisation avec des matériaux solides (microsphères) peut atteindre des zones non ciblées et générer une petite ischémie de ces zones. L'anesthésie prolongée peut provoquer une deshydratation de l'animal. Le développement de la tumeur hépatique conduit à terme à l'apparition de métastases hépatiques et pulmonaires. Enfin, les anesthésies répétées diminuent les prises hydriques et alimentaires des lapins.
Devenir
La majorité des animaux du projet sera euthanasiée afin de ne pas atteindre les points limites pour les lapins porteurs de pathologies évolutives (tumeur) ou parce qu'une étude histologique sera nécessaire afin de déterminer les effets du traitement ou encore parce que les animaux auront eu des embolisations multiples, pour diminuer le nombre total d'animaux du projet, mais ne pouvant pas être réveillés car ils souffriraient de sequels lourds.. Certains animaux (une soixantaine) pourront être réutilisés car ils n'auront subi qu'une procédure modérée (embolisation partielle et transitoire d'un organe) et qu'un suivi sur un mois aura été fait (paramètres sanguins) pour s'assurer de l'absence d'effets secondaires.
Remplacement
La réussite d'une embolisation est dépendante de différents paramètres. Il y a tout d'abord les paramètres intrinsèques à l'agent embolisant (taille, stabilité, viscosité ...) qui seront déterminés in vitro pour faire un premier tri des molécules. En parallèle, des études sur des systèmes en flux donneront des premiers renseignements sur le pouvoir embolisant des différents produits et permettront de réduire le nombre d'agents d'embolisation à tester in vivo. Passée cette préselection, seule l’expérimentation in vivo, permettra d'évaluer l'efficacité attendue chez l'homme. En effet, il est nécessaire de prendre en compte toutes les interactions entre l'agent d'embolisation et le vaisseau comme le flux, la tortuosité des vaisseaux, les interactions avec la paroi vasculaire, les systèmes de coagulation .....
Réduction
Chaque étude évaluant un nouvel agent d’embolisation, sera composée par 2 groupes d’animaux (n= 6 animaux par groupe) : le premier groupe aura le but d’évaluer le nouvel agent d’embolisation qui sera comparé à une référence clinique (deuxième groupe). Un animal pourra être utilisé pour plusieurs indications, c'est-à-dire, l'embolisation de divers organes afin de réduire le nombre d'animaux inclus dans ce projet. Un seul groupe d’animaux contrôle sera utilisé comme référence pour tous les agents d’embolisation d’une même classe (liquide, solide …). De plus, les animaux ayant reçu des agents d'embolisation transitoire sur un seul organe (1 seul rein, un lobe de foie ....) seront réutilisés pour le même ou un autre projet. Enfin, certains animaux permettront de tester l'efficacité de plusieurs agents d'embolisation sur un territoire ou d'un seul agent sur plusieurs territoires. Le nombre de 6 animaux par groupe est nécessaire et suffisant pour réaliser des analyses statistiques et comparer ainsi le l'efficacité des traitements
Raffinement
Une prémédication avec un antidouleur de la famille des morphines est systématiquement mise en place 1 heure avant chirurgie ou embolisation avec réveil de l’animal. Pour pallier aux nuisances et effets indésirables liés à la chirurgie les mesures suivantes sont mises en place: une hydratation sous cutanée (50 mL) est réalisée avant la chirurgie ,une injection locale d'anti douleur sur le site d’incision et une injection IV d'anti coagulant sont réalisés pour compléter les mesures anti douleur et prévenir les complications post opératoires. Une couverture anti inflammatoire est également mise en place sur les 16 heures post réveil de l’animal. Les lapins subissant chirugie abdominale porteront une collette pendant 5 jours post opération pour éviter qu’ils ôtent leur suture et soient opérés de nouveau pour la refaire. De même la tablette présente en temps normal dans la cage est retirée pendant 5 jours pour ne pas gener les déplacements de l'animal porteur de collerette et éviter de frotter sur la suture. Du foin (appétant pour les lapins) et une eau gélifiée sont placés dans la cage leur permettre de récupérer plus rapidement post chirurgie. Les objets (balle, morceaux de bois) sont conservés dans la cage. Le comportement des animaux opérés et embolisés est observé par les zootechniciens chaque jour de la semaine. Les points limites ont été définis sur la perte de poids de l'animal, sa mobilité, son comportement, la taille de la tumeur pour les animaux porteurs de tumeurs hépatiques,
Choix des espèces
Le lapin a été choisi car du fait de sa taille, il répond à tous les critères permettant de réaliser l'ensemble des procédures. La mesure du flux sanguin est accessible par les méthodes non invasives (échographie, IRM) ou mini invasives (fluoroscopie) et la réalisation de l'embolisation sélective se fait comme en clinique par montée de cathéter via l'artère fémorale. C'est également le modèle le plus référencé dans la littérature. Il est donc déjà validé et cela nous permettra de comparer nos résultats à ceux des autres agents embolisants. Enfin, l'expérience acquise dans le laboratoire sur cette espèce et avec des procédures similaires permet de s'assurer la meilleure inclusion des animaux. Animaux matures de plus de 10 semaines, d'environ 3.0 kg. Les animaux doivent avoir atteint leur taille adulte pour avoir des calibres artériels suffisants pour réaliser la procédure de cathétérisation.
Production d’anticorps polyclonaux chez la poule et le lapin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Poules : 240
390 lapins et poules vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections destinées à leur faire produire des anticorps, puis des prélèvements sanguins répétés, avant d'être mis à mort pour récupérer la quasi-totalité de leur sang. Le porteur décrit des réactions locales possibles, gonflement ou abcès, et générales, fièvre, perte de poids, baisse d'activité. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est assez efficace, écartant la production d'anticorps par criblage de phages jugée "décevante" malgré son existence depuis 1990.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de poules et lapins. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic… Ce projet respecte la réglementation relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques en vigueur.
Bénéfices attendus
1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générales (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.
Devenir
Les animaux inclus dans ces études seront mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité du volume sanguin circulant selon les besoins et surtout de respecter le principe de précaution.
Remplacement
La production d'anticorps (AC) polyclonaux nécessite 1 immunisation de l'animal dans le cadre de ce projet. Il n'existe actuellement aucune méthode substitutive assez efficace pour répondre aux objectifs du projet. Une nouvelle approche a été publiée en 1990 pour le développement d'AC par un système de criblage de collection de phage qui ne nécessite pas l'immunisation d'animaux, mais les résultats restent très décevants. En effet, depuis 1990, aucun anticorps n'est utilisé en thérapie ou en diagnostic clinique malgré un certain nombre de publications scientifiques utilisant cette technologie. Seuls 1 AC anti-TNFα et plus récemment des AC neutralisants du SARS-Cov-2 ont été développés à partir de collection de donneurs humains dont les derniers sont des donneurs ayant été en contact avec le virus, donc immunisés. A ce jour, l'alternative aux immunisations animales consiste à développer des AC synthétiques à partir de banques ou "Library" synthétique pour le criblage d'un nombre important de fragments de molécules ("binders"), ayant une bonne interaction avec l'antigène. Ces fragments sont plus petits que les AC et peuvent réagir avec une certaine affinité avec l'antigène mais aussi tout autre antigène ayant une structure proche de celle recherchée. Ces réactions croisées sont, parmi d’autres inconvénients, souvent rencontrées par cette approche synthétique. Un autre inconvénient majeur, est que le fragment ne reconnait qu’1 seul épitope (partie d'une molécule capable de stimuler la production d'un anticorps), alors qu’un sérum polyclonal est multi-épitope, ce qui permet d’augmenter la sensibilité de la détection et aussi faciliter son développement dans le temps. Tous les AC synthétiques développés et publiés à ce jour sont dirigés contre des protéines recombinantes qui ont été utilisées pendant les étapes de criblage. Leur utilisation est très limitée et ne dépasse pas l’étape de résultats préliminaires, puisqu’ils ne reconnaissent pas les protéines endogènes (élaborées par l'organisme) qui ont des structures natives et conformationelles. Les AC synthétiques ne reconnaissent pas certaines modifications des protéines qui leur donnent telle ou telle fonction biologique. C'est pourquoi la majorité de ces anticorps n'est pas utilisée par la communauté scientifique qui continue de travailler et publier avec les anticorps conventionnels. L'approche de criblage par phage est testée en parallèle pour comparer les performances et valider ou non cette alternative.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. Entre 2 et 6 animaux (poule ou lapin) seront inclus par étude. Le nombre sera choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Pour les poules, un nombre de 8 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 240 poules sur 5 ans (calcul à partir de 6 poules par étude). Pour les lapins, un nombre de 5 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 150 lapins sur 5 ans (calcul à partir de 6 lapins par étude). La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée.
Raffinement
Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : lapins = bois à ronger, foin/paille, de quoi grimper et se cacher... ; poule = perchoir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et un enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce particulièrement immunoréactive, permettant ainsi d’obtenir un sérum disposant d’une concentration importante en anticorps, avec des anticorps de forte affinité. En plus de leur immunoréactivité importante, les poules disposent d’anticorps spécifiques, les immunoglobulines Y, notamment extraits à partir du jaune d’oeuf. Ainsi, l’immunisation de poules permet de contrôler facilement le taux d’anticorps en limitant la contrainte imposée aux animaux. De plus, il existe des différences de séquences entre la partie constante des immunoglobulines Y et des immunoglobulines G. L’utilisation d’immunoglobulines Y permet ainsi de réduire le bruit de fond, les réactions croisées et les signaux aspécifiques. Les anticorps de poules sont également une alternative aux anticorps de lapin pour les expériences nécessitant des anticorps provenant de plusieurs hôtes différents. Le choix de l’espèce se fera donc en fonction de l’utilisation prévue des anticorps. Les lapins seront âgés de 6 semaines à 2 ans environ et les poules d'1 jour à 2 ans environ, car c’est à ces stades qu’ils sont entièrement immunocompétents.