Lapins

49 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la pose d'un capteur télémétrique sous anesthésie, un tatouage, trois injections vaccinales et onze prélèvements de sang, deux groupes recevant des doses d'antigène plus élevées pouvant provoquer une réaction inflammatoire ou toxique plus forte. Toutes seront mises à mort au 84e jour pour analyse du site d'injection et récupération d'anticorps. Le porteur teste un vaccin contre Clostridioides difficile et indique que cette étude sur un "non-rongeur" est requise pour le dossier réglementaire de mise sur le marché.

Objectifs

Clostridioides difficile est une bactérie non pathogène, présente dans la flore intestinale. Elle est le principal agent étiologique de la diarrhée nosocomiale chez les patients sous antibiothérapie, des personnes immunodéficientes et les nouveau-nés. C. difficile se développe dans une flore intestinale affaiblie par l’antibiothérapie et secrète deux toxines, A et B. La toxine A est une entérotoxine, elle provoque l’altération de la perméabilité de l’épithélium intestinal. La toxine B est une cytotoxine qui s’attaque directement aux cellules de l’épithélium. L’effet combiné des deux toxines est la diminution du temps de transit intestinal et de l’absorption intestinale, ce qui provoque une diarrhée. Lors d’une étude réalisée en 2021, plusieurs combinaisons de vaccins ont été testées chez la lapine. Ces vaccins étaient composés des 2 toxines détoxifiées et d’adjuvant, de nature et dose différentes. Les résultats ont permis de définir une formulation vaccinale conférant une immunité protectrice contre C. difficile. L'objectif de cette étude est de compléter les résultats dans les même conditions expérimentales (modèle lapine de 8 semaines) en évaluant l’innocuité de cette formulation dans différentes conditions de stockage (durée et température). Après une validation chez la souris, ce projet permettra l'évaluation préclinique formelle de la toxicité chez les non-rongeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir d’une part l’innocuité de la formule vaccinale mais également les conditions de stockage optimales (durée et température). Ce projet réalisé sur un modèle non rongeur est nécessaire pour la constitution du dossier réglementaire de mise sur le marché du candidat vaccin (le dossier requiert des études sur 2 modèles animaux : un rongeur et un non-rongeur). Ce projet permettra également de consolider les données obtenues lors des expérimentations précédentes en modèle murin.

Procédures

Les 49 animaux du projet seront soumis aux 4 gestes techniques suivants : 1) Pose capteur télémétrique 1 seule fois 7 jours avant la première injection du vaccin (J0). Moins de 5 minutes par animal. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. 2) Identification de la zone d’injection par tatouage 1 seule fois 7 jours avant la première injection du vaccin. 5 à 10 minutes par animal. Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures. 3) Immunisation : 3 injections intramusculaire de vaccin (volume de 0.5 mL) à J0, J14 et J28. Moins de 5 minutes par animal. Le site d’injection (cuisse) est nettoyé avec de la vétédine® savon puis désinfecté avec de la vétédine® solution ou de l’alcool 70° avant injection avec du matériel stérile Il est possible que cette zone soit douloureuse localement dans les 24 à 48 heures due à une réaction inflammatoire. 4) Prélèvements de sang : 11 prélèvements de sang seront réalisés à J-7, J0, J1, J14, J15, J21, J28, J29, J42, J63 et J84. Le volume maximal prélevé est de 6 ml/kg par prélèvement sanguin. Après avoir appliqué une crème anesthésiante et contentionné le lapin grâce à un gilet, une aiguille de 25-26G est insérée parallèlement à la veine. La veine peut être vasodilatée en appliquant un peu d'eau tiède ou sous une lampe (en vérifiant la température avec un thermomètre).

Impact sur les animaux

La formulation vaccinale utilisée dans les groupes 1 à 5 a déjà été testée dans la précédente étude : aucun effet indésirable n’a été notifié. Les animaux n’ont pas présenté de signes d’agressivité inhabituelle, ni de comportement de prostration ou de souffrance. Aucun retour négatif n’a été reporté de la part du personnel animalier qui était en charge des soins et du suivi quotidien des animaux. Les groupes 6 et 7 recevront des vaccins contenant des doses d’antigènes plus élevées. Il est possible que les animaux de ces groupes développent soit une réponse inflammatoire (locale et systémique) plus importante, soit une réaction liée à la toxicité. Des visites seront réalisées 2 fois par jour afin de surveiller l’état de santé des animaux ainsi que les points limites. La toxicité systémique pourra être évaluée en mesurant la température corporelle des animaux. Au moment de la pose des puces télémétriques, une petite douleur locale peut être observée dans les 24 à 48 heures après implantation. Les prises de sang peuvent induire une petite douleur localement et éventuellement un hématome.

Devenir

Tous les animaux (n = 49) seront mis à mort à la fin de l’étude (J84). Le site d’injection est prélevé pour analyses histologiques. Un maximum de sang est prélevé sur certains animaux pour constituer une réserve d’anticorps. Si, au cours du projet, un animal présente des signes de souffrance (anomalie physique, état de santé dégradé), la décision de les mettre à mort avant J84 sera prise en accord avec le responsable scientifique, les concepteurs du projet et la vétérinaire de l'établissement utilisateur. Cette décision sera également prise si 3 points limites sont observés dans un délai de 48h.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ou ex vivo ne peut se substituer totalement à ce type d’expérimentation afin de tester l’innocuité et l’immunogénicité d’un vaccin et de son adjuvant. Des vaccins composés de toxines détoxifiées ont déjà été validés chez la souris, une évaluation préclinique formelle de la toxicité chez les non-rongeurs doit être réalisée. Une étude précédente a permis de tester différentes formulations vaccinales. Ce projet a pour objectif de valider l’innocuité de la formulation vaccinale retenue ainsi que les conditions de conservation optimales.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant une étude de faisabilité. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature, sur les données expérimentales obtenues chez la souris et également sur celles obtenues lors de l’étude précédente réalisée dans les conditions identiques. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe (enrichissement social, caresses et voix douce zootechnicien) dans des parcs avec enrichissement du milieu de vie (repose-pattes, tunnel, tasseaux de bois à ronger et des nids). Au delà des conditions d'hébergement, plusieurs mesures de raffinement seront mises en place :1) Une période d’acclimation d’une semaine est prévue entre l’arrivée des animaux et les premiers actes (pose de puce télémétrique et prise de sang sous anesthésie générale) 2) De la crème anesthésiante sera appliquée sur la zone à tatouer, sur la zone d'implantation de la puce et avant chaque prise de sang 3) A J-7 (7jours avant la première injection de vaccin) : les animaux seront anesthésiés pour la pose de la puce télémétrique, la 1ère prise de sang et le tatouage. La taille de l’effraction cutanée est de 2-3 mm. Par mesure de précaution, un point de suture pourra être prévu en cas de rejet de la puce ou si la taille d’effraction est supérieure à 3 mm. 4) A l’issue de chaque prélèvement de sang, de petites poches de glace seront appliquées pour réduire l’hématome. Les prises de sang se feront sur l’oreille droite et gauche afin de ne pas aggraver d’éventuelles lésions. En cas d’apparition d’hématome, une crème décongestionnante pourra être appliquée. Une vigilance particulière sera mise en place lorsque les prises de sang sont réalisées de manière rapprochée (J0/J1, J14/J15 et J28/J29). Pour les autres prises de sang, un délai minimum d’une semaine est mis en place entre 2 prélèvements. 5)Pour chaque prise de sang, les animaux seront contentionnés à l’aide de gilets de contention spécifiques pour limiter le stress des animaux. 6) Une récompense alimentaire sera donnée après les prises de sang et les vaccinations.

Choix des espèces

Des études ont déjà été réalisées chez les rongeurs (souris) mais aussi chez le lapin (modèle utilisé pour tester l’innocuité de l’adjuvant) et le porc (modèle proche de l’homme au niveau immunitaire ; étude de l’immunogénicité). L’objectif de ce projet est de compléter les résultats de l’étude réalisée sur le lapin (test d’innocuité et évaluation de l’efficacité suite à différentes conditions de conservation). Les animaux seront âgés de 8 semaines à leur arrivée. Ils auront 10 semaines lors de la première injection. Il est en effet, considéré que les lapins sont immunocompétents à 10 semaines d’âge. L’allotement se fait en fonction des poids des animaux à leur arrivée.

300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont sédatés, reçoivent une injection unique de fer dans le muscle, puis sont tués pour prélever et analyser ce muscle, dans le cadre d'un test exigé par la Pharmacopée Chinoise pour commercialiser des produits vétérinaires en Chine. Le porteur affirme qu'aucune méthode substitutive n'existe, tout en indiquant qu'un objectif du projet est de démontrer que les contrôles physico-chimiques français suffiraient à s'affranchir de ces lapins. Le protocole prévoit deux lapins par lot testé, soit 300 animaux sur cinq ans.

Objectifs

Les injections de fer sont très souvent utilisées chez les jeunes animaux de rente (porcins, ovins, caprins, bovins…) dans le cadre de la prévention et du traitement de l’anémie ferriprive après la naissance. Dans le cadre de l’élevage porcin, les injections de fer sont presque systématiquement réalisées dans les 3 jours suivant la naissance. La Chine est le 1er producteur de porcs au monde et un marché important pour les industries pharmaceutiques vétérinaires. Ce projet est réalisé dans le cadre de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) en Chine de produits vétérinaires injectables composés de fer, possédant déjà des AMM en France. A chaque libération d’un nouveau lot de ces produits en France, un contrôle qualité est réalisé à l’aide de différents tests physico-chimiques décrits dans la Pharmacopée Européenne. Pour la commercialisation sur le marché chinois, les autorités chinoises demandent la réalisation d’un test in vivo d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin. Ce test fait partie des tests de contrôle qualité réalisés lors de la libération de lots de produits contenant du fer en Chine. Il permet de valider la qualité du lot en analysant l’absorption du fer après une injection unique et de s’assurer que la quantité de fer non absorbée au niveau du point d’injection ne dépasse pas 20% de la quantité injectée. Le but de cette vérification est de s’assurer que chaque lot commercialisé est conforme, et que le produit est sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. Ce projet a donc 2 objectifs : 1) la réalisation du test d’absorption de fer au point d’injection demandé par les autorités chinoises dans le cadre d’une demande d’AMM. 2) démontrer que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapins lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Bénéfices attendus

1) Obtenir l’autorisation de mise sur le marché en Chine des produits testés. Ainsi, chaque lot commercialisé et autorisé sera conforme et sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. En effet, ce projet va permettre de valider en Chine des produits permettant de lutter contre l’anémie ferriprive rencontrée dans les élevages. 2) Prouver que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapin lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Procédures

Les animaux utilisés seront sédatés avant de recevoir une injection unique de produit testé. La sédation va permettre de diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention. Ceci facilitera également l’injection qui doit être réalisée précisément dans le muscle vaste médial. Après euthanasie des animaux, des prélèvements du muscle étudié seront réalisés afin d’analyser ce muscle et obtenir les résultats du test d’absorption. Les interventions seront de courte durée et ne seront réalisées qu'une seule fois par animal puisqu'ils seront in fine euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser le muscle injecté étudié. Ces prélèvements de muscle sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet.

Remplacement

Le test d’absorption du fer au point d’injection est une procédure expérimentale in vivo demandée par la réglementation chinoise, dans le cadre de la commercialisation sur le marché chinois de produits vétérinaires composés de fer. L’absorption de fer est un processus dynamique nécessitant le passage de la molécule étudiée du site d’absorption vers le sang pour pénétrer dans la circulation systémique. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer que les contrôles qualité réalisés en France sont suffisants pour permettre à terme de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour chaque nouvelle libération de lot. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la Pharmacopée Chinoise, dans laquelle il est stipulé qu’il faut utiliser 2 animaux par lot testé, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre de lots à tester sur la durée du projet). Sur 5 ans, il a été estimé que 150 lots seraient testés (environ 30 par an) soit 300 lapins au total.

Raffinement

Méthodes de raffinement: 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (foin/paille, bois à ronger, chaînette, de quoi se cacher et grimper...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la contention pour l’injection, l’animal sera sédaté avec un produit adapté. Il est primordial dans ce projet que l’injection soit réalisée précisément au niveau du muscle vaste médial et pour cela l’animal ne doit pas bouger durant l’injection. 4) Surveillance accrue de l’animal durant la sédation et l’injection. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, la manipulation sera réalisée dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi pour ce projet car c’est cet animal qui est demandé et décrit dans la Pharmacopée Chinoise pour la réalisation de tests d’absorption du fer au site d’injection. Conformément à la Pharmacopée Chinoise, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 1,5 et 2,5 kg.

175 animaux, lapins, souris, rats et hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à la formation continue du personnel aux gestes techniques, prélèvements sanguins, injections et parfois chirurgie sous anesthésie, sans autre finalité que l'entraînement. Le porteur indique que ces animaux seront tués faute de pouvoir être inclus dans un autre protocole et qu'une partie provient d'animaux de réforme ou surnuméraires. Il reconnaît l'existence de simulateurs en plastique mais affirme qu'une formation sur "animal entier vivant" reste nécessaire.

Objectifs

Conformément à la réglementation, tous les personnels impliqués en expérimentation animale, quelle que soit leur fonction, doivent suivre une formation continue, afin d'assurer le maintien et l’actualisation de leurs compétences, et ce, tout au long de leur carrière. L’objectif de ce projet est de décrire tous les gestes techniques utilisés dans le cadre de formation et d’entraînement. Dans le but d'assurer une traçabilité complète de l'apprentissage des gestes techniques réalisés sur des animaux de réforme ou animaux commandés, le présent projet vise à décrire des méthodologies et des gestes techniques. Ces formations, réalisées en interne au sein de l’établissement utilisateurs seront validées par le Responsable du suivi des compétences de l’établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

L'entraînement continu des personnels développe une pratique plus sûre des actes sur les animaux, permettant de réaliser ces actes avec le minimum de douleur et de stress pour les animaux. Les résultats obtenus lors des expérimentations suivantes seront donc fiables.

Procédures

Il n’y a pas de dommage escompté dans le cas de prélèvement sanguin unique. Dans le cas de prélèvements sanguins répétés, une attention particulière sera apportée au niveau des sites de prélèvement afin d’éviter tout point de nécrose pouvant entrainer une douleur chez l’animal. Un seul type de prélèvement sera effectué par animal afin de limiter au maximum le stress chez l'animal. Pour chacun des gestes techniques d'administration ou de prélèvement, le temps est estimé à 5 minutes par animal dans le cas d'une manipulation vigile. Dans le cas où l'animal devrait être anesthésié, ce temps est estimé à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le tuteur veille au respect des règles de contention des animaux et à la bonne exécution des manipulations/gestes réalisés ; le stress et la souffrance sont donc très limités. La surveillance de l'animal par le tuteur durant la manipulation/gestes exécutés permet le cas échéant d'interrompre ceux-ci s’ils induisent un stress ou une souffrance chez l'animal. Les administrations et les prélèvements (fréquences et volumes) seront effectués selon les recommandations en vigueur pour respecter le bien-être animal et sont détaillés dans chaque procédure. Il n’y a pas de dommage escompté dans le cas de prélèvement sanguin unique. Dans le cas de prélèvements sanguins répétés, une attention particulière sera apportée au niveau des sites de prélèvement afin d’éviter tout point de nécrose pouvant entrainer une douleur chez l’animal. Les manipulations les plus invasives (exemple : administration intradermique, pose de cathéter, prélèvement de biopsies seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture antalgique en cas de nécessité. Une surveillance particulière sera portée sur l’état général de l’animal en cas de réveil, des tapis chauffants peuvent être utilisés durant la phase de révail. Certains actes nécessitent la pratique d’une chirurgie et portent atteinte à l’intégrité physique par l’incision. Elle requière des compétences particulières qui s’acquièrent par des connaissances de base et un apprentissage des gestes auprès de personnes compétentes et habilitées à la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des étapes de formations car ils ne pourront pas être inclus dans un autre protocole scientifique.

Remplacement

Un modèle d'expérimentation artificiel a été conçu utilisant un matériau de type plastique permettant à l’expérimentateur d'acquérir les compétences préliminaires nécessaires pour manipuler un rat ou une souris de manière éthique, sans la nécessité d'utiliser un animal vivant. Néanmoins, il n’existe pas de méthode de remplacement permettant de se substituer à la totalité des gestes techniques, une formation sur animal entier vivant reste nécessaire avant la réalisation des procédures expérimentales incluant des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, ces formations / maintien des compétences sont réalisées dans la mesure du possible sur des animaux surnuméraires ou issus d’un projet précédent avec avis favorable du vétérinaire, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux nécessaires. Le nombre d'animaux utilisés est réduit au maximum tout en permettant la répétition des actes expérimentaux dans le respect des volumes et du nombre d’administration tolérés.

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des sites d'injection...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Lors des gestes sur les animaux, des anesthésiques et analgésiques seront employés en fonction du geste pratiqué. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, une grille de score permettant d'évaluer les points limites est établie en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement: - Changement du poids corporel (Normal : 0, perte de poids 20 % du poids normal maintenue sur 72h : 3) - Apparence physique (Normale : 0, manque de toilettage : 1, pelage terne et écoulements nasaux et lacrymaux : 2, pilo érection, dos arrondi :3) - Abreuvement et alimentation (Normal : 0, incertain: 1, diminution: 2, aucune prise d'aliment et de boisson: 3)- Examen clinique (Normal : 0, Faibles modifications de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 1 , modifications modérées de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 2, modifications importantes de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 3). Grille allant de 0 à 12 points. De 0 à 3 : observation attentive des animaux, de 4 à 8 : souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement l'animal et demander un deuxième avis, de 9 à 12 : souffrance sévère considérer que les points limites sont atteints entrainant une mise à mort de l'animal. A cela il faudra également veiller aux points suivants : plaie nécrosée, purulente ou exsudative, animaux voutés, yeux mi-clos, faiblesse de membres.

Choix des espèces

Les rats, souris, hamsters et lapins sont les animaux les plus utilisés dans notre société pour réaliser des études chez l'animal. Nos projets d'étude utilisant des animaux adultes, les gestes techniques s'effectueront sur des animaux de 6 semaines minimum.

21 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation de bioprothèses mammaires, avec chez une partie un prélèvement de graisse réinjecté, puis des pesées et échographies deux fois par semaine pendant quatre à neuf mois avant mise à mort. Le porteur indique un stress aux pesées, des pertes de poids après chaque anesthésie, des douleurs post-opératoires et des démangeaisons, pouvant s'aggraver si la prothèse est mal tolérée. Il affirme qu'aucun test in vitro ne permet de prédire la tolérance de la bioprothèse ni le temps de son absorption.

Objectifs

Le cancer du sein est le 1er cancer de la femme dans le monde, avec plus de 58000 nouveaux cas diagnostiqués en France en 2018. La qualité de vie des patientes touchés par un cancer du sein fait partie intégrante de leur plan de soins. 40% des patientes bénéficient d’une ablation totale du sein, induisant des séquelles physiques et psychologiques. Des études récentes mettent en évidence une amélioration significative de la qualité de vie des patientes lorsqu’une reconstruction mammaire est réalisée. Elle est effectuée soit au cours de la même chirurgie que la mastectomie totale, soit lors d’une 2ème intervention chirurgicale avec un bioprothèse mammaire (ou prothèse à changer tous les 10-15 ans), ou par greffe utilisant les tissus de la patiente avec un risque d’évolution asymétrique entre les deux seins à court et moyen terme, entraine des cicatrices au niveau des zones de prélèvement mais l’évolution à long terme sera plus naturelle et symétrique par rapport à l’autre sein, sans nécessité de nouvelles chirurgies dans le temps). C’est dans ce contexte qu'une bioprothèse biodégradable, favorisant la régénération tissulaire grâce à une greffe de graisse sera testée dans ce projet qui cherche à évaluer le temps d’absorption d’une bioprothèse de taille humaine et la qualité de l’infiltration de la bioprothèse par le tissu graisseux.

Bénéfices attendus

L’ablation d’un sein pour une femme est assimilé à une amputation. Les méthodes pour pallier cette chirurgie sont lourdes. La bioprothèse testée ici pourrait permettre un retour à la normal pour la femme moins douloureux et plus naturel.

Procédures

Les animaux seront pesés et échographiés 2 fois par semaine pendant 4 à 9 mois. Ils subiront une chirurgie sous anesthésie générale avec antidouleur (2 incisons de la peau de 4 cm) qui durera entre 45 min et 1h15. Une partie des animaux sera anesthésié pour un prélèvement de graisse qui sera réinjectée dans la bioprothèse (environ 30 min).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress lors de chaque pesée qui devraient diminuer au cours du temps. Chaque anesthésie (chirurgie, Prélèvement et réinjection de graisse différé) entraine une perte de poids car l’animal s’alimente moins pendant un jour avec un retour à la normal rapide. Parfois, l’animal ne reprend pas son alimentation. Il est alors traité le lendemain et reste donc moins de 48 h sans manger et boire. La chirurgie peut entrainer des douleurs post opératoire au niveau de l’incision malgré les antalgiques (probabilité faible). Le processus de cicatrisation entraine des démangeaisons. Si la bioprothèse est mal tolérée, les démangeaisons seront plus importantes et des douleurs pourront être engendrées par une inflammation. Le prélèvement de graisse pour injection dans la bioprothèse bien que réalisé sous anesthésie et antidouleur peut générer une douleur passagère.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort car les bioprothèses et tissus nouvellement formés seront prélevés pour analyses.

Remplacement

De nombreux tests in vitro ont été réalisés : tests biomécaniques, tests de colonisation cellulaire, test de résistance à la radiothérapie. Cependant, il n’est pas possible de prédire la tolérance de la bioprothèse qui nécessite l’intervention complexe du système immunitaire ni le temps d’absorption et la colonisation par le tissu graisseux qui font intervenir de nombreux mécanismes.

Réduction

La première partie du projet consistera à mettre au point de la technique et ne donnera pas lieu à une étude statistique. C’est pourquoi 3 lapins seront mis à mort à chaque temps (4, 6, 9 mois). Au cours de la seconde procédure, le diamètre des bioprothèses sera également mesuré. Les diamètres seront comparés entre bioprothèse avec et sans greffe de graisse.

Raffinement

Dès l’acclimatation, les animaux auront des temps de jeux dans un espace plus grand que leur cage avec de nombreux enrichissements leur permettant d’exprimer leur comportement de curiosité (temps de 20-30 min max). Après la chirurgie, les animaux se réveilleront seuls dans leur cage et seront remis ensemble (par deux) dès l’observation de la reprise d’alimentation (pesées quotidiennes de l’aliment). Si une consommation faible d’aliment est observée pour un groupe d’animaux, ils seront également séparés afin d’identifier l’animal et de prendre les mesures nécessaires. L’animal sera réchauffé à l’aide d’un tapis chauffant durant l’anesthésie et de l’air chaud le réchauffera pendant le réveil. Les mêmes procédures d’anesthésie et antidouleur que chez l’homme seront utilisées pour la chirurgie et la greffe de graisse. Si le processus de cicatrisation engendre des démangeaisons, la cicatrice sera massée ave une pommade cicatrisante. Un scoring simple à mettre en œuvre permettant de déceler facilement un problème chez l’animal sera utilisé quotidiennement.

Choix des espèces

Le modèle lapin est le plus petit animal sur lequel des bioprothèses de taille « humaine » peuvent être implantées. La taille de 75 cm3 correspond à la plus petite taille nécessaire afin d’observer une recolonisation par les cellules graisseuses. Les animaux seront adultes et de grandes tailles afin de disposer d’un abdomen suffisamment grand pour placer les deux bioprothèses.

20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie générale la création d'un défaut osseux de 15 mm à la mâchoire, comblé ou non par un greffon prélevé sur d'autres lapins issus d'un élevage de production d'anticorps, avant une mise à mort à un, trois ou six mois. Le porteur décrit de nombreuses atteintes possibles, dont des douleurs neuropathiques, des lésions de morsure de la lèvre, des troubles de la mastication et des hémorragies, un animal atteignant le point limite étant tué plus tôt. Il affirme que l'expérimentation est "irréalisable chez l'homme" et que le recours à une espèce mammifère est "obligatoire".

Objectifs

Les pertes de substance mandibulaires sont majoritairement d’origine traumatique ou tumorale (lésions bénignes mais agressives ou tumeurs malignes). Elles peuvent aussi faire suite à une infection, un traitement par radiothérapie ou chimiothérapie. Lorsque ces pertes de substance sont de taille supérieure à 15 mm, l’os ne peut se régénérer seul et nécessite d’être reconstruit. Cette reconstruction est un challenge sur le plan fonctionnel et esthétique. Le traitement de référence pour les pertes de substance pluritissulaires complexes repose actuellement sur le transfert d’un lambeau libre micro-anastomosé, c’est-à-dire le prélèvement d’os et de tissus mou à partir d’un site donneur qui est ensuite transféré avec les vaisseaux qui le vascularisent sur le site à reconstruire. Cette technique présente un taux de réussite compris entre 95% et 98% selon les études. Cette intervention ne peut se justifier que chez des patients dont l’état général est compatible avec une chirurgie longue et complexe, qui implique une morbidité importante au niveau du site donneur et des complications parfois graves au niveau du site receveur. En cas d’échec, cette technique peut mettre en péril la vie du patient. L’objectif de ce projet est donc de mettre au point une solution alternative pour la reconstruction des pertes de substance mandibulaires, plus sûre et moins complexe d’un point de vue technique. L’étude vise à montrer la faisabilité de la génération in vivo de tissu mandibulaire au sein d’une matrice aortique.

Bénéfices attendus

Tous les ans en France, 11 610 nouveaux cancers de la cavité buccale sont diagnostiqués. Ils sont classés au 8ème rang de tous les cancers en termes de fréquence. Leur pronostique est sombre avec une survie à 5 ans entre 44 et 68%. Cette étude vise à améliorer la prise en charge de la reconstruction chirurgicale de ces patients en mettant au point une technique moins complexe, plus rapide et plus sûre que le traitement actuel de référence.

Procédures

Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée sur l’ensemble des lapins. Elle consistera en la réalisation d’un défect osseux de 15 mm au niveau de la mandibule en avant des prémolaires de manière unilatérale. Selon le groupe d’appartenance de l’animal, la région sera comblée ou non avec un greffon de matrice aortique préalablement prélevé sur des lapins destinés à la production d’anticorps et cryoconservée. La mandibule sera ensuite stabilisée par plaque transvissée. La fermeture sera réalisée par suture avec fil résorbable. La durée prévue est de 30 minutes par intervention. Les lapins recevront dans les suites post opératoires un traitement antibiotique en prise unique et des traitements antalgiques en intra musculaire afin de sécuriser leur prise en charge. Ils pourront être nourris à la seringue pendant les premiers jours si leur prise alimentaire s’avère insuffisante. A la fin de l’échéance : 1 mois, 3 mois ou 6 mois en fonction des groupes, les lapins seront mis à mort. La mandibule sera prélevée. Des coupes fines seront réalisées sur la région d’intérêt puis envoyer en analyse radiologique et anatomopathologique

Impact sur les animaux

En per opératoire : • Stress aigu durant le temps péri opératoire, douleur à l’injection intramusculaire des drogues et à la mise en place du cathéter au niveau de l’oreille • Sous dosage anesthésique pouvant entrainer douleurs, agitation, mouvements cliniques, tachycardie (bpm > 300) • Sur dosage anesthésique pouvant entrainer une bradycardie (bpm < 100), une bradypnée, des râles respiratoires, une désaturation avec hypercapnie, un arrêt cardiorespiratoire. • Une hémorragie per opératoire, contrôlable par les moyens chirurgicaux disponibles (ligature chirurgicale, compression) ou incontrôlable par rupture d’un vaisseaux cervicales type carotide ou jugulaire. • Toutes lésions accidentelles des tissus mous du site opératoire durant la chirurgie En post opératoire : • L’anesthésie du territoire innervé par le nerf intra alvéolaire inférieur sera constante. Elle pourra entrainer des douleurs neuropathiques, des difficultés à la prise du bol alimentaire, un prurit, des lésions de morsure au niveau de la lèvre inférieure. • Un trouble de l’articulé dentaire et donc de la mastication sera possible par mauvaise stabilisation per opératoire de la mandibule. • Une hémorragie post opératoire ainsi qu’une infection post opératoire (douleur, rougeur, chaleur, œdème), complications communes à toutes chirurgies, seront possibles et peuvent nous amener à réaliser un nouvel acte chirurgical en urgence. Une désunion de cicatrice ainsi qu’une exposition, un déplacement ou un défaut du matériel d’ostéosynthèse pourront aussi nous conduire à une nouvelle intervention. • La douleur à la prise alimentaire par lésion des muqueuses intrabuccales (sensibles au chaud) ainsi qu’à la mastication (sensible à la prise d’aliments durs en raison de l’ostéotomie). Cette douleur pourra être à l’origine d’un trouble de l’alimentation, d'une asthénie, d’une perte de poids, d’une agitation post opératoire, d’une insomnie, d’un retard du transit.

Devenir

Une mise à mort sera réalisée à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement de la mandibule et l’analyse osseuse. La mise à mort sera réalisée plus précocement pour les animaux ayant atteint le point limite douloureux.

Remplacement

Le modèle animal assure une expérimentation irréalisable chez l’homme. Notre projet vise à démontrer le potentiel de régénération osseuse à partir de cellules souches apportées par de la matrice aortique. Sa réalisation nécessite un environnement tissulaire et hormonal complexe ne pouvant être approché par des modèles numériques ou in vitro. Le choix d’un modèle animal possédant une anatomie et une physiologie proche de l’homme est essentiel. L’utilisation d’une espèce mammifère est obligatoire.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires, la première étape qui correspond au prélèvement des greffons aortiques sera réalisée sur des lapins adultes récupérés d’une autre étude (production d’anticorps) qui n'entrent pas en compte dans le nombre de sujet necessaire. Concernant le nombre de sujets nécessaires, 18 lapins semblent suffisants à l’obtention de résultats significatifs. En effet, la plupart des études expérimentales de ce type en chirurgie maxillo-faciale décrivent des protocoles expérimentaux sur des cohortes de 15 à 20 lapins. Nous ajoutons aux 18 lapins 2 lapins d’essai afin de garantir des résultats significatifs en cas de décès dans notre cohorte. Cet effectif a été abaissé au minimum afin de garantir des résultats exploitables.

Raffinement

La chirurgie et l’hébergement des animaux se feront sur le même site, ce qui limite les transports et l’angoisse que ceux-ci pourraient générer. Les règles d’asepsie chirurgicale chez l’homme seront respectées à l’identique chez le lapin. Une antalgie efficace sera administrée. La procédure chirurgicale se déroulera sous anesthésie générale. Pendant le geste, nous réaliserons une anesthésie locale complémentaire par infiltration des deux nerfs alvéolaires inférieurs. Aucune procédure invasive ne sera réalisée lors de la phase observationnelle afin de minimiser le risque de nouveau stress chez l’animal. Les animaux seront nourris de manière adaptée pendant les 10 premiers jours postopératoires, avec une alimentation humidifiée et molle sans aucune restriction. Les dents seront particulièrement surveillées et coupées si nécessaire. En cas de non reprise d’appétit spontanée, nous réaliserons une réalimentation assistée par gavage à la seringue. L’environnement post-opératoire respectera les normes en vigueur. La douleur et le comportement de l’animal seront évalués de manière pluriquotidienne. Tout animal montrant des signes de souffrance non soulagée sera mis à mort.

Choix des espèces

La population cible pour la reconstruction osseuse à partir de matrice aortique est une population adulte. Nous avons besoin d’étudier la régénération osseuse sur un os mature. Nous utiliserons donc des lapins adultes, ayant un poids compris entre 2.5 et 4.5 kg. Le choix du lapin est justifié : sa phylogénie est proche de l’homme, son anatomie et sa physiologie sont comparables, sa taille permet d’obtenir des échantillons tissulaires exploitables. Les critères comportementaux sont essentiels : le lapin est un animal facile à approcher et à soigner dans la mesure où il subira des soins. Son taux de reproduction élevé et l’intervalle de génération relativement court lui ajoute une qualité supplémentaire. Le lapin est déjà utilisé dans le domaine de la cancérologie et de la chirurgie maxillo-faciale. Notre étude implique une procédure chirurgicale. L’anatomie de sa mandibule permet d’effectuer une résection de plus de 15 millimètres. A l’inverse, la mandibule du lapin est suffisamment petite pour permettre d’obtenir une section transversale complète sur une coupe histologique. La génération osseuse est comparable chez le lapin et chez l’homme, ce qui permettra de transposer les résultats obtenus chez l’homme.