Lapins

192 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis replacés à l'issue sans être tués. Ils sont élevés en verger de pommiers pour tester l'association arboriculture-élevage, avec prélèvements de poil, prises de sang à l'oreille et observations de comportement. Le projet cherche à mesurer les bénéfices réciproques entre lapins et pommiers, le porteur évoquant l'amélioration du bien-être des animaux non-humains et le désherbage. Il affirme qu'il n'est pas possible de répondre aux ambitions du projet sans recourir aux animaux, la modélisation manquant de données à ce stade.

Objectifs

Il s'agit projet transdisciplinaire qui ambitionne de démontrer la faisabilité et la plus-value de l’association arboriculture-élevage « lapins en verger de pommiers » en agriculture biologique. L’hypothèse générale est que l’association entre arbres et animaux pourrait induire des bénéfices réciproques pour les différentes composantes du système (désherbage, fertilité des sols, bien-être des animaux, etc.), mais également un impact négatif de l'association lapins-pommiers : dégâts de lapin sur les pommiers, attraction de prédateurs ou maladies pour les lapins. L'objectif est de concevoir un système d'élevage de lapins au verger. Les animaux vont donc tester des conditions d'hébergement et avoir un suivi de leur comportement, bien-être, santé, croissance. Un groupe de lapins sera élevé en bâtiment pour avoir un élément de comparaison et mieux apprécier les effets de l'accès à l'extérieur.

Bénéfices attendus

Le projet doit permettre de déterminer les conditions d'hébergement au verger optimales pour les lapins et les pommiers : respect et amélioration du bien-être animal, expression des comportements, vie en groupe, valorisation et entretien de l'herbe, fertilisation des arbres, protection des lapins par le couvert du verger.

Procédures

Les animaux vont être exposés à la vie en extérieur avec une moindre maîtrise des conditions d'ambiance (aléats climatiques, température). Ils vont tester différents types de logements de façon à déterminer les hébergements optimaux. Ils vont subir un petit prélèvement de poil (carré de 5 cm de côté) au niveau du dos à l'aide d'une tondeuse pour doser le cortisol (hormone du stress). Ils subiront une prise de sang à la veine de l'oreille pour réaliser des analyses sanguines pour évaluer leur santé. Des observations de comportement seront réalisées : observations à distance ou réalisation de séquences vidéos.

Impact sur les animaux

Les prélèvements de poil seront sans incidence (pas de douleur, pas de stress) pour les animaux. Le prélèvement sanguin fait à la veine de l'oreille est peu douloureux et de faible volume (maximum 1 ml). Une compression de la veine sera réalisée pour arrêter le saignement et éviter la formation d'un petit hématome. La vie à l'extérieur peut exposer les lapins à des maladies et des aléats climatiques.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie car leur bien-être sera préservé tout au long du projet. Ils seront replacés après l'essai.

Remplacement

Le projet a pour ambition de tester la compatibilité et le caractère éventuellement cumulatif des vertus de deux élevages alternatifs : l’agriculture biologique et l’intégration culture-élevage. L’agroforesterie et en particulier l’association arboriculture-élevage est très prometteuse en termes de bénéfices réciproques, mais très peu étudiée en zone tempérée. L’association entre l'arboriculture fruitière et l'élevage de lapins est novatrice. Le projet porte donc sur l’évolution des systèmes de production d’aliment nécessaire à la transition écologique. Vu le caractère en rupture du projet et l’absence d’information scientifique sur ce sujet, il n’est pas possible de répondre aux ambitions du projet sans le recours aux animaux. La modélisation n’est pas possible à ce stade par manque de données permettant la construction des modèles.

Réduction

Le projet est structuré avec 3 phases de prototypage impliquant un petit nombre d'animaux (une vingtaine) de façon à optimiser le schéma expérimental de l'essai final et de raffiner les conditions de vie des lapins. Les tests statistiques varient en fonction de la variable étudiée. Pour l'essai final, nous utiliserons plusieurs lots d'animaux de façon à avoir suffisament d'unités statistiques pour réaliser les comparaisons entre les differentes conditions de vie (avec et sans arbres ou élevage en cage).

Raffinement

Le projet est structuré avec 3 phases de prototypage de façon à raffiner les conditions d'hébergement avant de déployer l'essai final. Seuls les animaux en parfaite santé seront engagés dans l'essai en extérieur. Les animaux plus faibles ou malades pendant les essais seront hébergés dans une infirmerie chauffée, le temps d'être soignés et guéris selon les problèmes relevés. Le sevrage sera réalisé entre à 6 semaines afin d'améliorer la santé digestive des animaux. Les fratries seront préservées pour éviter des stress de séparation. Lors du transport (5h de voyage), les animaux auront du foin à disposition pour ingérer des fibres longues et éviter un impact négatif du stress de transport sur le transit intestinal (ex: arrêt de transit). Chaque groupe sera placé dans l'hébergement extérieur après quelques heures de repos : abreuvement, nourissage, vérification que les animaux s'alimentent et éliminent. Chaque hébergement sera doté d'une épaisse litière en paille pour permettre aux animaux d'être confortables et isolés de la fraîcheur. L'accès à l'enclos sera libre, les animaux pouvant entrer et sortir à leur guise dans l'enclos de 25 m2. Des relevés de température seront réalisés quotidiennement pour vérifier que les animaux ont suffisament chaud. En cas d'accident climatique extrême (alerte rouge ou vague de froid intense), les animaux seront rentrés dans un bâtiment. La santé des lapereaux sera controlée quotidiennement. Chaque semaine, les animaux seront pesés et auront un examen clinique complet ainsi qu'un controle du niveau de parasitisme (examen des crottes au microscope). Les animaux seront protégés des prédateurs par une double clôture électrique qui entoure la zone de l'essai. Toutes les manipulations des animaux seront faites avec calme et bienveillance. Les animaux seront sociabilisés à l'homme. Lors de la prise de sang à l'oreille, une petite compression sera réalisée sur le lieu de la ponction pour arrêter le saignement et éviter la formation d'un hématome. Lors des traitements des arbres, les animaux seront déplacés sur une autre parcelle.

Choix des espèces

L’hypothèse générale est que l'accès à l'extérieur peut apporter une amélioration du bien-être des lapins et être utile pour la culture des arbres (désherbage, fertilisation). Pour tester cette hypothèse le choix du lapin présente des avantages techniques et éthiques. Herbivore de petite taille (entre 1 et 5 kg), le lapin est capable de tolérer des niveaux élevés de cuivre (utilisé en traitement phytosanitaire en arboriculture biologique) par rapport aux ovins tout en étant capable d’apporter la même aide au déherbage et à la fertilisation. Le projet concerne l'élevage des lapins du sevrage à l'âge de la commercialisation (soit 10-12 semaines) Nous utiliserons 192 lapereaux de 42 jours (sevrage) mâles et femelles élevés au champ.

600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur injecte dans un œil, puis dans l'autre une semaine plus tard, une solution salée concentrée qui fait monter la pression intraoculaire pendant près de quatre heures, pour tester des molécules candidates contre le glaucome. Le porteur mesure la pression au tonomètre et pose un cathéter dans l'artère de l'oreille pour des prises de sang, et affirme que la hausse de pression 'ne devrait pas' provoquer de douleur. Il décrit l'œil du lapin comme le 'modèle de référence' et conclut qu'aucune méthode in vitro ne peut le remplacer.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester chez le lapin les effets de nos molécules sur une hypertension intraoculaire transitoire provoquée par une injection dans l'oeil d'une solution saline hypertonique.

Bénéfices attendus

La cause principale du glaucome (diminution irréversible du champ visuel, 2ème cause de cécité) est une augmentation de la pression intraoculaire à l’origine de la destruction des cellules du nerf optique. Les traitements existants (bêta-bloquants, analogues des prostaglandines…) ont une efficacité limitée et peuvent présenter des effets indésirables. Ainsi, le bénéfice attendu de ce projet est le développement d’une nouvelle classe thérapeutique pour traiter le glaucome qui touche plus de 800 000 personnes en France.

Procédures

Les lapins vont recevoir sous anesthésie locale une injection d'une solution saline concentrée dans un seul oeil qui va être à l'origine d'une augmentation de la pression dans le globe oculaire. Cette augmentation de pression intraoculaire va durer moins de 4 heures. Plusieurs mesures de la pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre vétérinaire vont être effectuées : 5 avant l'injection et 6 durant les 4 heures suivant l'injection. Ces mesures sont non invasives et indolores. Le lapin recevra avant l'injection intraoculaire une administration (par gavage, par application locale sous forme de collyre, par injection intrapéritonéale) des molécules à tester. Après une semaine de récupération, une autre session pourra être réalisée en utilisant le 2ème oeil. Des prélèvements sanguins pourront être effectués à des fins de pharmacocinétique. Un cathéter sera mis en place au niveau de l'artère centrale de l'oreille. Sur une durée de 24 heures maximum, pas plus de 8 prélèvements de 1 mL seront effectués.

Impact sur les animaux

Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -Le stress lié à la contention et à la réalisation des mesures de pression intraoculaire (geste non invasif et non douloureux) : pour limiter cet effet, les animaux auront une période d’habituation à la préhension, manipulation des yeux et des mesures de pression -L’augmentation de la pression intraoculaire : selon la technique utilisée, l’augmentation de la pression devrait être modérée (aux alentours de 40 mmHg) et ne devrait pas générer de douleur. Cependant, nous avons mis en place un protocole de suivi et d’identification de points limites permettant de mettre en place un traitement en cas d’apparition de douleurs ou d'anomalies oculaires.

Devenir

Après que chaque œil a fait l’objet d’une injection intraoculaire de solution saline hypertonique, les animaux sont mis à mort. En effet la procédure ne peut pas être répétée plusieurs fois sur un même œil. De plus au sein du laboratoire ces lapins ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.

Remplacement

L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de nouvelles molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. De plus il n’existe pas actuellement de méthode alternative.

Réduction

L'amplitude et variabilité des réponses obtenues sur le(s) paramètre(s) d'intérêt selon des résultats précédemment publiés indiquent un effectif compris entre 5 et 8 lapins par groupe expérimental comme étant raisonnable et suffisant pour effectuer une analyse statistique pertinente des données. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, l'expérimentation sera réalisée sur un oeil puis sur l'autre oeil du même lapin à une semaine d'intervalle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour de l'expérimentation. Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une balle en plastique, une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Du foin est mis à disposition de manière journalière ce qui permet de créer un contact régulier avec le lapin et de le familiariser avec l'expérimentateur. Sans traitement particulier, les animaux ne doivent pas présenter de signes de douleur à ce stade expérimental. Toutefois, le personnel zootechnicien est sensibilisé pour communiquer directement à l’expérimentateur tout comportement « suspect » d’un animal anxieux, soit observé durant la période d’acclimatation (un animal qui tape systématiquement fortement du pied lors d’une entrée dans la pièce ou lorsque l’on s’approche près de sa cage), soit le jour même de l’expérimentation au moment de sa manipulation pour la sortie (comportement excessif de fuite, vocalisation…). Une semaine avant l'injection intravitréenne, des mesures journalières de pression intraoculaire à l'aide d'un tonomètre seront effectuées afin de familiariser l'animal avec le dispositif et l'expérimentateur. Les mesures de la pression intraoculaire sont effectuées à l'aide d'un tonomètre "à rebond" qui n'engendre aucune souffrance chez l'animal. Chaque mesure de la pression intraoculaire sera associée à une récompense (friandise "mini treats" goût fruité, Plexx, Hollande). La souffrance liée à l'injection intravitréenne d'une solution saline hypertonique va être limitée par l'administration sous forme de gouttes d'un anesthésique local chez un lapin au préalable sédaté.

Choix des espèces

Les modèles in vitro modélisant la chambre oculaire et la physiopathologie des hypertensions oculaires ne permettent pas de tester les efficacités des molécules thérapeutiques. L'oeil du lapin par sa physiologie et sa taille proche de celle de l'oeil humain est le modèle de référence pour étudier les propriétés de molécules sur la pression intraoculaire. Cette taille de l'oeil permet une injection intravitréenne reproductible et facilite également la mesure de la pression intraoculaire à l'aide de tonomètres vétérinaires. L'expérimentation sera réalisée sur des lapins adultes. Le glaucome est une pathologie apparaissant avec l'âge, il n'y a aucune raison de travailler sur des individus en cours de développement.

3 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants puis replacés ou proposés à l'adoption. Ils sont maintenus en contention environ 45 minutes, trois fois en une semaine, pour tester la tolérance d'une lentille de contact connectée, avec une pose sur l'œil et un contrôle à la lampe à fente, gestes non invasifs mais décrits comme stressants. Le projet accompagne le développement d'un dispositif de suivi du regard déjà testé chez l'humain. Le porteur affirme que l'œil du lapin est proche de l'œil humain et qu'aucune alternative non animale ne permet ce test.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer la tolérance au port de la lentille de contact par le lapin. La lentille développée par la société LCS permet d'avoir un dispositif embarqué qui l'active grâce au port d'une lunette de vue classique. La lentille a déjà été portée sur les premiers tests chez l'homme. Aucune irritation est à prévoir ni modification de performances optiques. La lentille est composée d'un circuit électronique composé de polyimide, d’une capacité et de deux VCSEL encapsulé dans une lentille sclérale. A cette lentille est associée une paire de lunettes embarquant une bobine encastrée autour du « verre » des lunettes et un circuit électronique au niveau de la tempe. Le circuit sur la tempe sert à gérer l’alimentation / le courant traversant la bobine. Lorsque les lunettes sont branchées par un câble micro-USB à une source d’alimentation, un courant traverse alors la bobine sur les lunettes. De ce courant, est créé un champ magnétique qui est alors capté par le circuit sur la lentille. Ce champ magnétique va ainsi alimenter le circuit sur la lentille et permettre aux VCSEL d’émettre de la lumière Infrarouge. Ce laser est ensuite utilisé pour suivre le regard de la personne qui porte les lentilles sans avoir besoin de caméra ou de puissance de calcul.

Bénéfices attendus

La mesure de la direction de regard ("eye tracking" en anglais) est utilisée dans de nombreux domaines, de la recherche sur le système visuel au marketing en passant par la psychologie ou les interfaces homme-machine (IHM). Les dispositifs actuels présentent toutefois un certain nombre de faiblesses (sensibilité aux conditions d'imagerie, encombrement, principe de calibration, performances, etc.) qui limitent leur utilisation pour diverses applications : par exemple en salle d'opération lorsque le chirurgien porte des loupes, ou pour la rééducation visuelle de malvoyants. En matérialisant la direction du regard, le dispositif proposé, permet de résoudre ces difficultés et ouvre de nouvelles possibilités en termes d'IHM. Dans le cadre de ce projet, nous nous intéresserons particulièrement au potentiel d’un pointeur laser encapsulé sur une lentille de contact (CLP) pour la restauration de la vision et la rééducation visuelle (en collaboration avec l’institut de la Vision).

Procédures

Examens sur animaux vigiles : environ 45 minutes 3 fois en une semaine.

Impact sur les animaux

Les animaux seront examinés vigiles. Du stress est à prévoir. La contention des animaux est à prévoir pendant environ 45 minutes, 3 jours en une semaine (lundi, mercredi et vendredi). Cela inclut : - la mise en cage de contention, - l'arrivée en salle de tests puis la pose de lentille, - test pendant 15 minutes, - contrôle à la lampe à fente, - préparation de la lunette à proximité, - 15 minutes de tests avant retour au parc d'hébergement. Tous ces gestes sont non invasifs mais font que les lapins soient stressés.

Devenir

Les lapins seront replacés OU adoptés.

Remplacement

La mise sur le marché d’un nouveau dispositif médical même non invasif oblige à mener une étude préclinique sur au moins une espèce avant de lancer la phase d’étude clinique. Les yeux du lapin sont proches morphologiquement de l’œil humain, ce qui en fait un modèle de choix. Il n'y a pas d'autre alternative non-animale pour tester ce dispositif. Le dispositif prévoit de mesurer la pression intraoculaire, un modèle in-vitro est donc inenvisageable dans ce cas.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est basé sur des données antérieures ainsi que sur des données de la littérature. Les mesures réalisées sur un peil sont comparées à l'oeil controlatéral qui sert de contrôle en cas de doute, réduisant ainsi le biais possible et le nombre final d'animaux à utiliser.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en charge dès leur arrivée. Une personne habituée au travail avec les lapins est en charge de leur réception et surveillance quotidienne. Les conditions d'habituation et d'hébergement sont prévues pour assurer un maximum le bien-être des animaux. Nous prévoyons l'installation de ces 3 lapins en parcs et non en batteries d'hébergement. Cela permet de garantir une surface plus grande avec un enrichissement supplémentaire et la possibilité de réaliser de l'exercice à souhait. Ce type d'hébergement au sol avec de la paille permet d'avoir les lapins plus détendus. La personne en charge de leur bien-être a une grande habitude des lapins, et s'occupera de les suivre tous les jours. Une période d'habituation est prévue afin de permettre aux lapins de prendre connaissance avec la cage de contention et de s'y rendre plus facilement. Des caresses et récompenses aident à cette habituation qui durera une semaine. Les gestes techniques nécessaires à l'étude sont bien réfléchis et le timing prévu au plus réel afin de ne pas avoir des temps de latence qui imposeraient une contention plus longue que le strict minimum. Des récompenses sont également prévues à la fin des tests.

Choix des espèces

Le lapin est un animal dont l’œil permet d’adapter relativement aisément la lentille « homme » développée par LCS. Les lentilles de contact sont réalisées sur mesure pour le lapin puis à terme pour l’Homme par des fabricants nationaux appliquant un processus de qualité médical certifiés dans les standards qualité. Mâle. La dispersion des rayons de courbure est plus grande. Elle est estimée 3 fois plus grande chez le mâle que chez la femelle.

24 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intraveineuse de stimulation hormonale et une échographie, avant d'être mises à mort pour prélever les cellules épithéliales de leur glande mammaire, dans un projet visant à modéliser in vitro la glande mammaire afin de produire des protéines thérapeutiques dans le lait de lapines transgéniques. Le porteur qualifie les nuisances de "minimes". Il affirme que la production de protéines recombinantes dans le lait de lapines est le "principe fondateur" de sa société et qu'elle n'est "pas remplaçable".

Objectifs

Notre société est intéressée par la production des protéines recombinantes thérapeutiques (protéines produites par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique) avec l’objectif de soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales et a choisi de produire ces protéines dans le lait de lapines transgéniques. La lapine a été séléctionné parce qu’elle synthétise des protéines en qualité (nécessaires pour soigner efficacement ces patients) et en quantité, que l’on ne peut obtenir par d’autres systèmes d’expression (bactéries ou levures). Pour la création des animaux transgéniques, nous devons modifier le génome des lapins par micro-injection dans des embryons de lapine avant de les transférer dans des receveuses. Comme la production de ces protéines dépend de la modification effectuée, nous devons utiliser plusieurs stratégies de modification génomique. Nous avons mis en place des cultures cellulaires commerciales afin de sélectionner les meilleures stratégies. Nous avons déterminé la présence et l’integrité de l’ARNm correspondant à la protéine recombinante cible pour chaque stratégie, mais nous ne pouvions pas estimer l’efficacité de production des ARNm ou de la protéine produite dans le lait. Ces critères sont impératifs afin de poursuivre des études precliniques.. Il n’existe pas de lignées de cellules de glande mammaire de lapines, commerciales ou non, avec lesquelles nous pourrions étudier les différentes stratégies pour la production des protéines d’intérêts. Nous souhaiterions mettre au point des systèmes cellulaires en deux dimensions (2D) pour quantifier les ARNm codant pour les protéines d’intérêts et dans un deuxième temps trois dimensions (3D, organoïde) afin d’analyser les protéines d’intérêts produites. La génération d’un tel système mammaire modélisant les processus de lactation peut être utile pour estimer la quantité de la protéine recombinante produite et sélectionner les meilleures protéines pouvant être produire dans le lait des lapines. Avec ce système, nous pensons pouvoir diminuer d’au moins 75 pour cent le nombre d’animaux utilisés pour la création des animaux transgéniques produisant des protéines recombinantes thérapeutiques. Pour réussir le plus rapidement possible la mise au point de ces systèmes, nous collaborons avec une équipe ayant de l’experience sur la glande mammaire et les cellules souches, nécessaires à la création des cultures cellulaires 3D.

Bénéfices attendus

Notre société s’est focalisée sur le traitement enzymatique substitutif pour soigner des patients ayant des maladies génétiques orphelines létales. Nous avons déjà produit des protéines thérapeutiques dont un médicament autorisé et nous voulons produire de nouvelles protéines thérapeutiques par l’intermédiaire de lapines trangéniques. La mise au point de systèmes cellulaires 2D/3D pour modéliser in vitro la glande mammaire de lapine en lactation va nous permettre de tester plusieurs constructions génétiques pour multiplier les chances de produire en grande quantité des protéines thérapeutiques. Nous pourrons ainsi commencer des études précliniques pour vérifier l’efficacité de ces protéines à soigner différentes maladies, tout en diminuant le nombre d'animaux dont nous aurions besoin pour produire ces médicaments. Jusqu’à présent, nous avons besoin d’euthanasier 4 lapines pour récupérer des embryons au stade 1 cellule pour les microinjecter avec une construction génétique puis d’utiliser 4 lapines receveuses des embryons micro-injectés pour être capable d’avoir 1 animal transgénique mosaïque F0 et étudier l’expression de la protéine recombinante d’intérêt sur une géneration F1 et/ou F2. Nous estimons que nous pouvons diminuer au moins 75 pour cent le nombre d’animaux utilisés si nous pouvons tester nos constructions génétiques dans des organoïdes de la glande mammaire de lapines, car nous aurons besoin de juste 1 lapine gestante pour valider nos constructions génétiques.

Procédures

2 injections en intraveineuse d'une durée de 30 secondes environ : une pour la stimulation hormonale, l’autre pour l’euthanasie. 1 échographie de 5 à 10 minutes environ. Prélèvement de glande mammaire sur animal euthanasié.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés subiront des nuisances minimes à savoir : - une injection intra-veineuse mais sur une veine précédemment anesthésiée localement, - une contention lors de l'échographie de conrôle de la gestation.

Devenir

Nous devons euthanasier les lapines pour pouvoir récupérer les cellules épithéliales de la glande mammaire.

Remplacement

La production de protéines recombinantes dans le lait de lapines transgéniques est le principe fondateur de notre société et n’est pas remplaçable. En tant que mammifère, la lapine synthétise des protéines recombinantes complexes, de l’ordre de centaines de milligrammes à plusieurs grammes par litres de lait, dont la glycosylation et la gamma-carboxylation sont nécessaires pour soigner efficacement les patients et que l’on ne peut obtenir en qualité et en quantité par d’autres systèmes d’expression (bactéries ou levures).

Réduction

Pour créer des animaux transgéniques, nous devons modifier le génome de lapins en transférant une construction génétique nécessaire à la production de la protéine recombinante thérapeutique d’intérêt, par des cellules de la glande mammaire. Ce transfert génétique se fait par micro-injection de la construction génétique dans des embryons de lapine au stade une cellule, qui seront ensuite transférés chirurgicalement dans des femelles dites receveuses (transfert d’embryon). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons décidé de tester nos constructions génétiques dans des cultures cellulaires de glande mammaire avant de passer au modèle animal. Actuellement, nous utilisons des cultures de cellules non issues de la glande mammaire de lapines (il n’existe pas des cellules de glande mammaire de lapins, commerciales ou non) pour sélectionner les meilleures constructions génétiques. L’utilisation de ces cultures cellulaires nous a permis de faire un premier tri et de déterminer la présence et l’intégrité de la protéine recombinante, mais nous n’avons pas d’informations sur la quantité de protéine produite (du fait d’un site d’expression différent entre une cellule lambda et une cellule de glande mammaire). C’est pourquoi nous voudrions mettre au point des systèmes cellulaires 2D et 3D pour modéliser in vitro la glande mammaire de lapine en lactation. Quand ces systèmes seront mis au point, nous pensons diminuer d’au moins 75 pour cent le nombre d’animaux que nous utilisons, pour produire des protéines recombinantes thérapeutiques humaines.

Raffinement

Les lapins sont hébergés seuls dans leur cage, reçoivent des enrichissements dès trois semaines de vie, et les parois latérales de leurs cages sont équipées de plexiglas transparent permettant de maintenir un niveau d’interaction entre les individus. Leurs cages sont aussi équipées de plateforme qui leur permettent de pouvoir se cacher. De la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et les bruits environnementaux, et elle est associée à la lumière et la présence des techniciens animaliers. Dans ce projet, il n’y a peu de gestes invasifs : deux intraveineuses mais après application de crème anesthésiante et l’échographie est un peu contraignante pour la lapine mais des mesures sont prises pour atténuer la contrainte : la tête de lapine est cachée par le bras d’une technicienne, ce qui peut la rassurer car le lapin apprécie de pouvoir se cacher, et elle reçoit des caresses de la part de la technicienne qui réalise l’échographie, pour l’apaiser. Certaines lapines se sont endormies dans cette position.

Choix des espèces

Le lapin (de souche New Zealand White) a été choisi pour : sa courte période de gestation (30 jours), sa maturation sexuelle rapide (4 à 5 mois), le volume de lait produit (jusqu’à 10 litres/an/femelle), la synthèse de protéines complexes (glycosylation et gamma carboxylation). Les lapins sont utilisés dès la la maturité sexuelle atteinte, à 4 mois et demi pour les femelles, 5 mois pour les mâles.

11 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de souffrance légère pour cet établissement, qui n'assure que l'hébergement post-opératoire. Un second établissement leur incise le foie et la peau pour y déposer une poudre hémostatique à base d'alginate dont le projet suit la résorption, à titre de preuve de concept d'un futur dispositif médical. Les lapins sont pesés puis tués à deux, treize et vingt-six semaines pour prélever le foie et le muscle. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro les organes et les fluides corporels.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Mais il doit présenter certaines caractéristiques : maintenir la plaie en milieu humide et chaud, être modifié selon les stades de cicatrisation, être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, ne pas être toxique et être hypoallergénique, protéger des chocs, être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées et très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables sont utilisés comme traitement. L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate sous forme de poudre, et de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé et des zones proches. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire et sous-cutané en cours de chirurgie et d’observer sa résorption à la surface du tissu lésé à différents temps post-opératoire. En plus de la preuve de concept sur un organe intra-cavitaire, nous voulons observer le taux de résorption de la poudre hémostatique sur un tissu non lésé (muscle). Pour cela, l’établissement 1/2 réalisera une incision cutanée et introduira entre le plan sous-cutané et le plan musculaire un volume équivalent à celui appliqué sur le foie. Le plan musculaire sera prélevé pour histologie aux mêmes temps que pour le foie. Cette manipulation permet ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisé.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de poudre) sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie et sur un tissu non lésé (muscle) mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.

Procédures

Les animaux seront pesés régulièrement. La pesée est un acte de courte durée. Après euthanasie des animaux, des prélèvements des zones d’intérêts seront réalisés afin de pouvoir effectuer les analyses demandées. Ces prélèvements seront de courte durée et ne seront réalisés qu’une seule fois par animal puisqu’ils seront in fine euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux pour la partie chirurgie sont développées dans la DAP de l’établissement n°1/2. Dans notre établissement, les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à l’arrivée dans un nouvel environnement, stress dû à la contention pour la réalisation des pesées et de l’anesthésie précédant la mise à mort.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort, soit parce qu’ils auront atteint un point limite soit parce qu’ils auront atteint le temps du prélèvement final : J+2 semaines établissement n°1/2, J+13 semaines et J+26 semaines établissement n°2/2. L'étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée et nécessite le prélèvement du foie. Pour obtenir ces prélèvements, il est nécessaire que les animaux soient mis à mort au préalable.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption sur un tissu lésé et un autre non lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique sous forme de poudre, permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire et cutanés en cours de chirurgie et d’observer son intégration sur le tissu à différents temps post-opératoire. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

11 animaux seront utilisés au total, dont 9 animaux répartis en 3 groupes (3 animaux par groupe). Il y a 2 animaux supplémentaires prévus afin de compléter l’un des groupes si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Etant donné que c’est une preuve de concept, il n’y a pas besoin de plus 3 animaux par groupe pour obtenir la réponse au questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter, le projet pourra être stoppé sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, l’Etablissement n°1/2 a d’abord développé la voie chirurgicale dans leur structure sur des animaux décédés, issus de procédures antérieures. Dans un principe de réduction, sur le même animal, une incision cutanée de 1,5 cm sera faite sur le flanc opposé et à distance de l’abord hépatique pour déposer une quantité de poudre hémostatique équivalente à celle mise sur le foie afin de mesurer le taux de résorption sur un tissu non lésé. Il s’agit d’une preuve de concept, ce faible nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement chez nous (établissement n°2/2), les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : foin/paille, bois à ronger, chaînette, de quoi se cacher et grimper…). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Des pesées de suivi seront également réalisées à des fréquences adaptées. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal.

Choix des espèces

Le lapin est un animal de taille intermédiaire, dont le foie a une suffisante pour supporter les scarifications prévues et l’implantation de la poudre hémostatique (le produit) en quantité suffisante pour obtenir l'effet pharmacologique souhaité (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés dans l’établissement n°1/2 à 2,5-3 kg environ pour atteindre 3,5-4 kg environ (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.