Poissons

1 215 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des polluants entre deux et cinq jours après la fécondation, ils sont ensuite élevés jusqu'à trois ou six mois, puis tués pour prélever les cellules de leur moelle et y chercher une multiplication de clones sanguins, stade très précoce d'une leucémie. Le porteur affirme ne pas pouvoir dire à l'avance s'il y aura des nuisances ni lesquelles, et dépose sa demande par précaution, tout en soutenant que cette multiplication clonale est indolore. Il juge le recours à l'expérimentation animale "indispensable" et écrit qu'il est "généralement admis" que l'utilisation de poissons soulève moins de préoccupations éthiques que celle de mammifères.

Objectifs

Des clusters de leucémies pédiatriques font suspecter que des polluants environnementaux pourraient jouer un rôle dans la transformation oncogénique de cellules hématopoïétiques. L’objectif de notre projet est de déterminer si certains polluants environnementaux contribuent à la genèse de leucémies dans un modèle expérimental utilisant le poisson zèbre (Danio rerio). L’utilisation de la lignée de poissons zèbres (PZ) Zebrabow permet de détecter une amplification clonale de cellules du sang, ce qui correspond à un stade très précoce de la transformation leucémique.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d’effet pro-leucémique de polluants chez le poisson zèbre fournira un argument important pour limiter l’exposition des populations humaines. Nos données scientifiques pourront ainsi être utilisées par les instances de régulation pour limiter l'exposition des populations à certains polluants afin de prévenir la survenue de cancers.

Procédures

Les larves seront exposées aux polluants environnementaux de 2 à 5 jours après fertilisation. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour veiller à leur bien-être. Ils seront euthanasiés à 3 ou à 6 mois.

Impact sur les animaux

Nous cherchons à mesurer une amplification clonale des cellules sanguines chez les PZ exposés aux polluants, ce phénomène n’entraîne pas d’effet nuisible pour l’animal. En effet l’amplification clonale des cellules du sang est un phénomène indolore qui survient naturellement au cours du vieillissement. Les tests de toxicité seront réalisés sur les formes larvaires (2-5 jpf). Ceux-ci seront nécessaires pour déterminer les concentrations non-toxiques ; seules les doses sub-toxiques (n'entrainant ni mortalité, ni malformation des larves évaluées à 5 jpf), seront utilisées pour déterminer leur effet sur l’expansion des clones chez les animaux plus âgés. Les animaux seront exposés aux substances toxiques entre 2 et 5 jpf, puis élevés en conditions normales jusqu'à 3 ou 6 mois. La raison de cette DAP repose sur la possibilité que des effets néfastes sur la santé des poissons se développent au delà de 5 jpf. Nous ne pouvons pas indiquer à priori s'il y aura des nuisances et quelle sera leur nature et c'est par précaution que nous déposons cette DAP. L'euthanasie des animaux sera réalisée, après anesthésie, par exposition à des doses létales d’anesthésique.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les cellules de moelle hématopoïétique pour réaliser les analyses des populations de cellules sanguines en cause dans le développement de leucémies.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour évaluer l'effet de substances chimiques sur le développement des stades précoces des leucémies. Toutefois l'utilisation de modèle poisson zèbre reste une alternative préférable à l'usage de modèles rongeurs pour étudier l'effet des polluants sur l'incidence des leucémies. Bien que cela puisse être discuté, il est généralement admis que l'utilisation de poissons dans la recherche soulève moins de préoccupations éthiques que celles associées à l'utilisation de mammifères.

Réduction

Les plans expérimentaux ont été conçus de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés en vue de l'obtention de résultats significatifs et d'éviter les réplicats inutiles. La détermination du nombre d'animaux nécessaires par groupe se base sur des études antérieures.

Raffinement

Les études seront conduites en respectant scrupuleusement les normes en matière de soins des animaux et d'évaluation de la souffrance animale (qui ne devrait pas être causée par nos expérimentations). Les animaux seront maintenus dans des installations récentes et agréées pour assurer leur confort (qualité de l'eau, accès à la nourriture, température, cycle jour/nuit, nombre de poissons par bac...). Nous utiliserons la grille de points limites chez le poisson, présentée en annexe I, pour identifier les animaux à retirer de l'expérimentation et à euthanasier.

Choix des espèces

Bien qu'ayant un degré d'évolution moindre que celui des mammifères, le PZ possède néanmoins un fort degré de conservation avec l'humain, partageant avec lui 70% de son génome et une grande similitude physiopathologique. Le PZ est particulièrement pertinent pour modéliser les phénomènes de leucémogenèse. En effet le système hématopoïétique, ses étapes de développement au cours de l'embryogenèse et les mécanismes moléculaires qui le régulent, sont extrêmement bien conservés entre l'humain et le PZ. On retrouve ainsi chez le PZ toutes les lignées cellulaires du sang : érythroïde, myéloïde (macrophage, monocyte, granulocytes), lymphoïde (B et T), et thrombocytaire (équivalent des plaquettes). Le PZ a de ce fait été utilisé pour modéliser de multiples leucémies myéloïdes ou lymphoïdes humaines ainsi que des myélodysplasies ou syndromes myéloprolifératifs. Les animaux seront utilisés dès les premiers jours après fertilisation des œufs, ce qui correspond au début du développement du système sanguin chez le poisson. Nous exposerons les poissons aux polluants aux stades embryonnaires (entre 2 et 5 jours post fertilisation) afin de mimer l'exposition humaine pendant la grossesse. Nous analyserons ensuite les poissons adultes (à 3 et 6 mois d'âge) lorsqu'il est possible de prélever les cellules de moelle sanguine, et afin de laisser le temps à l'effet inducteur de leucémies des polluants de se manifester

Suivre sur le long terme la colonisation de rivières auparavant vierges de poissons par cinq espèces de salmonidés conduit à capturer 5 500 individus, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Saumons atlantiques, truites communes, ombles de fontaine, ombles chevaliers et saumons coho sont pêchés sur une cinquantaine de rivières, gardés une trentaine de minutes dans des viviers immergés, anesthésiés quelques minutes, mesurés, pesés, privés de quelques écailles, puis remis à l'eau sur leur site de capture après cinq minutes de récupération. Tous sont relâchés, le porteur indiquant vouloir peser le moins possible sur le fonctionnement des populations qu'il étudie. L'effectif tient à deux sites d'échantillonnage par rivière, une cinquantaine de poissons par site et dix poissons par estuaire, un calcul de densité qu'il juge impossible à mener sur moins d'individus.

Objectifs

Ce suivi à long terme des populations de poissons salmonidés permet d'étudier l'adaptation des animaux à des environnements nouveaux, et l'effet du changement climatique sur cette adaptation. Les données et échantillons issus de ce suivi servent à repondre à des questions de recherche en écologie et en résilience de la biodiversité.

Bénéfices attendus

Ce projet contribue à la comprehension des mécanismes d'adaptation mis en jeu lors de l'expansion rapide d'espèces, avec une attention particulière pour la colonisation de milieux post-glaciaires. Les nouvelles données produites permettront de mieux comprendre l'impact des salmonidés sur ces milieux trophiquement pauvres, et de mieux prédire l'adaptation des espèces au changement environnemental.

Procédures

Les animaux seront soumis à des mesures biométriques (taille et poids) et à un prélèvement d'écailles avant d'être rélachés sur leur lieu de capture.

Impact sur les animaux

La manipulation pour les mesures biométriques et le prélèvement d'écailles peuvent générer un stress ponctuel.

Devenir

Notre projet visant à étudier l'évolution des populations dans des environnements naturels, nous remettons tous les animaux en liberté à l'issue de chaque procédure, de façon à générer le moins d'impact possible sur le fonctionnement des populations.

Remplacement

L’objectif de ce suivi à long terme est d’étudier l’évolution de ces vertébrés dans un environnement post-glaciaire, et il n'existe aucune exemple comparable dans la littérature sur la colonisation naturelle de rivières préalablement vierges de poissons par ces espèces de salmonidés. Il est donc impossible de remplacer cette étude par une approche simulatoire in silico, par exemple.

Réduction

Le suivi à long terme de l'expansion des salmonidés impose des captures proportionnelles à cette expansion, en termes de nombre de rivières échantillonnées : nous estimons à 50 ce nombre de rivières, d’après nos données précédentes. Par ailleurs, pour pouvoir estimer les densités locales dans chaque rivière, ainsi que pour pouvoir étudier la variation et l'évolution des structures phénotypiques et génétiques avec des approches statistiquement acceptables, des effectifs minimums par rivière sont aussi requis : nous effectuons deux sites d’échantillonnage par rivière, et en moyenne, une cinquantaine de poissons sont capturés par site. Par ailleurs, nous échantillonnons aussi 10 poissons par rivière dans les estuaires. Cela amène à un nombre approximatif de 5500 individus capturés sur la durée du projet. Réduire ce nombre de capture rendrait impossible les estimations de densité ainsi que les analyses de variation des traits.

Raffinement

Toutes les précautions sont prises afin de limiter au maximum le stress de ces animaux. Suite à la capture, les animaux sont placés dans des viviers placés directement dans la rivière pour éviter les chocs thermiques, enrichis de pierres et ombragés par des couvercles pour protéger les animaux de la lumière et de la vue des expérimentateurs. Leur temps de séjour est réduit au minimum (souvent 30 minutes le temps de finir la pêche du site), il est suivi d’une anesthésie légère pendant quelques minutes, avant la manipulation (mesure de la taille et du poids, prélèvement d’écailles), qui elle dure 1 à 2 minutes. Les poissons sont ensuite placés dans un vivier identique au premier décrit, dans lequel ils auront le temps de récupérer de leur anesthésie (environ 5 minutes), et seront ensuite immédiatement relâchés sur leur site de prélèvement.

Choix des espèces

Le projet s'intéresse à l'adaptation des salmonidés à des environnements nouveaux. Les espèces de salmonidés étudiées sont celles qui ont survécu dans ces environnements post-glaciaires : le saumon Atlantique, la truite commune, l'omble de fontaine, l'omble chevalier, le saumon Coho. Les stades de développement étudiés concernent quasiment la totalité du cycle de vie car il s'agit d'une étude d'écologie ét évolution, il est donc nécessaire de prendre en compte toutes les étapes de la vie des animaux. Seul le stade embryo-larvaire n'est pas pris en compte car nos méthodes et période d'échantillonnage ne nous permettent pas de capturer des oeufs ou des alevins vésiculés.

Nage erratique, spasmes, perte d'équilibre le ventre en l'air : dès l'apparition d'un de ces signes l'expérience s'arrête, et l'animal passe vingt-quatre heures dans un bassin de récupération avant d'être tué. 3 200 larves et juvéniles de poissons capturés dans l'estuaire de Cayenne vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, aucun ne retournant à l'eau. Ils sont exposés à des hausses de température et de salinité poussées jusqu'à des limites sublétales, pour estimer les seuils de tolérance d'une dizaine de groupes taxonomiques et alimenter des modèles de gestion halieutique. Le porteur justifie la mise à mort par le risque que le retour en milieu tidal soit fatal, et juge le nombre d'individus "négligeable" au regard d'une seule ponte, alors qu'il annonce par ailleurs des lots de dix puis cinq individus par espèce.

Objectifs

Le succès du recrutement des populations des poissons à l’état sauvage et l’état des stocks pêchés dépendent principalement des premiers stades de vie et de leur survie car les larves et juvéniles sont les stades les plus sensibles aux variations environnementales et avec les plus hauts taux de mortalité naturelle. Ce projet vise donc à étudier les effets du réchauffement climatique sur les larves et juvéniles des poissons vivants dans les zones nourricières estuarienne et côtières de Guyane. Ce projet combinera des expérimentations en laboratoire avec des mesures in situ pour : i) caractériser la variabilité naturelle des conditions environnementales actuelles, ii) estimer les limites de tolérances salines et de température des principales larves et juvéniles présentes dans le système.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, les résultats obtenus concernant la variabilité des paramètres environnementaux de l’estuaire et les limites thermiques et de salinité des principales espèces considérées seront utilisés pour simuler les effets du changement climatique sur le fonctionnement des réseaux trophiques de l’estuaire de la rivière de Cayenne. Grâce aux connaissances acquises en laboratoire sur les limites de tolérance thermique et de salinité des espèces principales, l’impact de différents scenarios à court terme (5-10 ans) de changement climatique sur les réseaux trophiques pourra être étudié en utilisant les scenarios prévus par le GIEC (Groupe d'experts Intergouvernemental sur l'Evolution du Climat). Ce projet fournira aussi les outils nécessaires pour le développent des futurs modèles couplant les dynamiques de recrutements des juvéniles des espèces à intérêt commercial avec les modèles de populations focalisés sur les adultes pêchés plus au large. Ce type d’outils permettra de mettre en place des mesures de gestion durable pour le maintien des ressources halieutiques et des pêcheries qui les exploitent.

Procédures

sans objet

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress lié à la capture en milieu naturel, le transport, et lors des manipulations. Pendant les expérimentations, la hausse des températures et/ou salinité jusqu’à des limites sublétales va perturber l’animal et changer son comportement (nage erratique, mouvement operculaire réduit, spasme, perte d’équilibre – ventre en l’air). Dès l’apparition d’un symptôme, l’expérimentation sera interrompue et le spécimen placé dans un bassin de « récupération » (à T°C et salinité normales, viables). La mise à mort sera effectuée après 24h dans le bassin de récupération.

Devenir

Après chaque expérimentation, les animaux seront surveillés dans un bassin de récupération pendant 24h et mis à mort. Les animaux ne seront pas relâchés car le transport et le choc environnementale (milieu tidale avec des très forts changement des paramètres de l’eau au cours de la journée) pourra lui être fatal et causer des stress ultérieurs. La quantité d’animaux sacrifié sur 5 ans peut être considérée négligeable par rapport à une ponte d’un seul géniteur et à la mortalité naturelle de ces animaux dans le milieu naturel (>90% la semaine suivant la ponte). Ces détails ont été expliqués dans le document.

Remplacement

Les seuils de tolérance aux variations de température et salinité étant dépendants des espèces, nous ne pouvons pas substituer les espèces et devons faire les expérimentations sur les espèces sauvages locales. Par contre, nous limiterons au maximum le nombre d’individus.

Réduction

Pour chaque espèce, un premier test sera effectué sur 10 individus témoins et 10 individus soumis au réchauffement/changement de salinité. Si les différences inter individuelles ne sont pas significatives, le nombre d’individus sera réduit à 5 pour les expérimentations suivantes. Il ne sera pas possible de réduire davantage le nombre d'individus testés pour des raisons de puissance statistique. Par ailleurs, pour certaine espèce, le nombre d’individus sera probablement tout simplement limité par le nombre d’individus capturés dans la nature. Si moins de 5 individus sont prélevés dans la journée, les animaux seront relâchés directement in situ.

Raffinement

Les individus capturés (larves, post-larves et juvéniles) seront placés dans des conteneurs équipés de bulleurs, par famille (afin d’éviter les attaques de certaines espèces et donc éviter ce stress, voire mortalité), puis rapidement transportés vers la plateforme expérimentale pour être mis dans des aquariums préalablement préparés quelques jours avant leur capture. Afin d’être au plus proche des conditions environnementales naturelles, l’eau des aquariums sera prélevée quelques jours avant sur le site de capture. Les installations et les filtres auront été mis en route avant le démarrage de l’expérimentation et tous les paramètres physiques (T°C, salinité…) contrôlés et stabilisés. L’ensemble des installations sera placé dans une pièce climatisée afin de pouvoir contrôler plus facilement la température des aquariums. Une surveillance accrue sera portée aux animaux à leur arrivée afin de savoir s'ils s'acclimatent et s’alimentent. En cas de comportement anormal, d’absence de prise alimentaire correcte (traduisant d'un état de stress), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

L’objectif de l’étude est d’étudier les effets du réchauffement climatique sur les larves et juvéniles des poissons vivants dans les zones de nurseries estuariennes et côtières de Guyane. Les seuils de tolérance aux variations de température et salinité étant dépendante des espèces, nous ne pouvons pas substituer les espèces et devons faire les expérimentations sur les espèces sauvages locales. L’identification de certaines espèces de larves n’étant pas possible vivantes, à l’œil nu, les expérimentations se feront uniquement sur environ 10 groupes taxonomiques principaux, au niveau soit de l’espèce, du genre ou de la famille. L’étude portant sur la sensibilité des espèces aux variations de température lors de leurs premiers stades de vie, les individus utilisés seront au stade de larve- juvénile selon ce qui sera capturé le jour de l’échantillonnage (filet de mailles entre 500µm et 3mm). Les adultes ne seront ni capturés ni étudiés. Pour certaines espèces seulement, un seul stade de vie sera présent dans l’estuaire car les autres stades se développent dans d’autres types d’habitat.

Pêchés à l'épuisette, anesthésiés par balnéation, amputés d'un morceau de nageoire caudale en cinq minutes, 3 750 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le prélèvement sert à génotyper des lignées génétiquement modifiées et à repérer celles qui portent la combinaison de gènes attendue. Le porteur affirme que la nageoire se régénère complètement en vingt jours et que la douleur au réveil reste légère, et il pratique aussi ce prélèvement sur des larves de trois jours. 2 812 poissons au bon génotype sont gardés comme géniteurs, les 938 autres sont mis à mort.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de garantir la sélection et l’identification par génotypage de lignées de "poisson-zébre" génétiquement modifiées, à phénotype non dommageable.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’optimisation des effectifs des animaux et la gestion des élevages d’animaux génétiquement modifiés nécessaires aux expérimentations des chercheurs. L'élevage de ces modèles permettra de valider de nouveaux traitements contre des maladies neurologiques.

Procédures

Après anesthésie par balnéation, un prélèvement de la nageoire caudale sera réalisé, ce prélèvement est limité au minimum de tissus nécessaire, la nageoire caudale est capable de régénération complète en 20 jours. Temps de la biopsie (anesthésie incluse): 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables suite au prélèvement de tissus de la nageoire caudale sont un stress léger au moment de la pêche par épuisette, de l’anesthésie et une douleur légère suite au réveil associée à la coupure. Ce projet a pour but de minimiser au maximum tout signe de nuisances.

Devenir

Les poissons présentant le génotype d'intérêt sont gardés et utilisés comme géniteurs, les animaux ne présentant pas la bonne combinaison de gènes seront mis à mort.

Remplacement

Le développement du modèle animal poisson-zèbre est pour nous un choix incontournable car l'étude des maladies humaines comme les maladies neurodégénératives nécessite de considérer l'organisme entier. Il n'existe pas de méthode de remplacement pour le génotypage des animaux.

Réduction

Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Les effectifs pour chaque lignée sont discutés avec les utilisateurs, qui ont estimé leurs besoins par des méthodes statistiques. Nous nous appuyons également sur l’expérience zootechnique d’élevage, c’est-à-dire la variabilité individuelle des performances de reproduction. Afin d’améliorer nos pratiques, nous avons également mis au point un protocole de génotypage pour les larves de 3 jours, ce qui permet de sélectionner les animaux portant le génotype correct avant le stade de larve autonom. La croissance de la larve n’est pas altérée du fait des capacités de régénération de la queue en quelques jours. Le nombre d’animaux en élevage est donc réduit. Ce protocole à un stade précoce est limité au génotypage simple, sans séquençage des mutations, soit 1/4 des lignées.

Raffinement

Chez le poisson-zèbre, bien que la cicatrisation et la régénération des tissus de la queue soient rapides, les conditions d’isolement seront maintenues au strict minimum et les capacités de nage et de prise alimentaire seront contrôlées dès les premières heures après la biopsie. Une surveillance accrue au cours des 24h suivantes se fera en surveillant les points limites définis et validés avec la Structure du Bien Etre Animal: la prise alimentaire , le comportement de nage et l'activité globale .

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la création de modèle de pathologie humaine. Son développement embryonnaire rapide et externe, permet de modifier facilement son génome qui présente plus de 70% d’homologie avec celui de l’homme. La possibilité d’étudier les mécanismes biologiques dès les stades larvaires permet de suivre en microscopie à fluorescence et en comportement sensori-moteur, le développement des maladies modèlisées. Ce modèle permet de tester et valider de nouvelles stratégies thérapeutiques, qui pourront être appliquées chez l’Homme. La procédure s'applique aux animaux adultes.

Attrapés à partir de l'âge de deux mois, anesthésiés, amputés d'un fragment de nageoire caudale pour être génotypés, puis isolés jusqu'à 72 heures en attendant le résultat : 2 250 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet porte sur l'entretien de lignées génétiquement modifiées pour l'étude d'une maladie humaine de la coordination des mouvements, dont les retombées thérapeutiques annoncées sont renvoyées à plus de cinq ans. Une quarantaine de reproducteurs et de reproductrices par lignée et par an sont gardés en vie jusqu'à 18 mois, puis remplacés tous les huit mois. Les autres sont tués pour ne pas garder d'animaux "non nécessaires" à la conduite du projet.

Objectifs

La maladie sur laquelle nous travaillons est une maladie génétique caractérisée par une dégradation progressive des fonctions sensorielles et motrices qui conduit à une perte des mouvements volontaires. Celle maladie est due à une diminution d’une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Plusieurs mutations ont été identifiées à ce jour, qui mènent à des symptômes différents d’un patient à l’autre. L'objectif de notre projet est de comprendre comment différentes altérations dans un même gène présentent des pathologies différentes. Nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire à l’Humain et sont transparents au stade où nous allons les étudier. Dans notre projet, nous allons étudier des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine défectueuse équivalente à celle retrouvée chez les patients. De plus, nous utiliserons des poissons présentant une absence du gène en question, entraînant l'absence de la protéine. En comparant ces deux mutations chez le poisson zèbre, nous voulons mieux comprendre comment les altérations du gène associé à la maladie conduisent à la pathologie, dans le but ultime de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur la protéine associée avec cette maladie. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes pathologiques, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Procédures

Le maintien de lignées de poissons-zèbres implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Ainsi, l’identification génétique (génotypage) des individus par prélèvement d’un morceau de nageoire caudale (

Impact sur les animaux

L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs sains. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement de phénotypes dommageables au fil du temps. Nous nous concentrons principalement sur les anomalies qui pourraient être liées à un système nerveux défectueux, comme d’anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) et d’une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité). Lors du maintien de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale (

Devenir

Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.

Remplacement

Le projet vise à mieux comprendre comment les altérations dans notre gène d'intérêt retrouvées chez l’Homme entraînent différentes pathologies. Bien que la maladie affecte les neurones, on s'attend à ce que d'autres types de cellules entourant le neurone malade jouent un rôle important dans la pathologie. Les méthodes de culture cellulaire actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec tous les types de cellules, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.

Réduction

Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au minimum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres porteurs sains nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres porteurs sains nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une quarantaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Les renouvellement des géniteurs/génitrices ne se feront tous les 8 mois afin de réduire le nombre d’animaux. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus.

Raffinement

Seul le strict minimum d’animaux nécessaires au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum en couple le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous porteurs sains et ne présenteront pas de phénotype. Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. Des points limites précis et prédictifs ont été définis, et l’observation qu’un de ces points limites est atteint telles que blessures sur l’animal, anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac...) conduira à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.

Tous les poissons manipulés sont remis à l'eau et réutilisés, transférés en étangs de stockage à la fin de l'expérience. 426 carpes, tanches, gardons et sandres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sur sept mois d'élevage en étangs de 500 m². Ils subissent trois séries de mesures de poids et de longueur, et cinq individus par espèce et par étang perdent un fragment de nageoire caudale de 0,5 cm² sous anesthésie. Les juvéniles nés spontanément dans les étangs et jugés trop petits pour ce prélèvement sont tués pour que leurs tissus soient analysés, sans que leur nombre soit indiqué.

Objectifs

L’expérience prévue s’inscrit dans le cadre d'une thèse qui porte sur la modélisation des relations trophiques dans les systèmes de polyculture. Durant le travail de thèse, une démarche de conception de mélanges d’espèces piscicoles basée sur la modélisation des relations trophiques entre les différentes espèces empoissonnées et les autres compartiments trophiques de l’étang a été élaborée. L’expérience prévue est la validation expérimentale de cette démarche en étangs expérimentaux de 500 m2, par la mesure des performances zootechniques de deux scenarios de mélanges d’espèces piscicoles optimisés obtenus par modélisation, l’une comprenant des carpes Amour, l’autre ne comprenant pas de carpe Amour. Les principaux paramètres mesurés porteront sur la productivité totale en poisson, la croissance de chaque espèce, le recrutement en juvéniles, les paramètres physico-chimiques du milieu et la biodiversité en invertébrés (macro-invertébrés et zooplancton) et en macrophytes. Une modélisation des liens trophiques entre les différents compartiments de l’étang sera menée en analysant les isotopes stables de carbone et de l’azote des différentes espèces présentes dans l’étang. Cette expérience a pour objectif final de valider des outils pour une amélioration de l’empoissonnement des étangs extensifs, pour les rendre à la fois productifs et respectueux de la biodiversité.

Bénéfices attendus

L’expérience prévue doit contribuer à la validation d’une démarche opérationnelle pour la proposition de polycultures de poissons d’étangs, à la fois productive et respectueuse de la biodiversité et de l’environnement. Ce travail doit aussi contribuer à faire avancer les connaissances sur les interactions entre espèces dans le cadre de polycultures de poissons en étang, et la connaissance des réseaux trophiques dans les milieux aquatiques. De façon plus générale, ce travail doit contribuer aux réflexions en cours sur le rôle de la diversité sur la robustesse et la résilience des systèmes d’élevage piscicoles.

Procédures

Mesures biométriques non invasives réalisées trois fois au cours des 7mois d'élevage et prélèvement d'un fragment de nageoire caudale pour analyse de la composition des tissus en isotopes stables de l'azote et de carbone, sur 5 individus par espèce et par étang.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux consistent en trois points : (1) la manipulation en début et fin d’expérience, afin de réaliser des mesures (poids, longueurs) individuelles et les répartir dans leurs structures d’accueil (étangs expérimentaux en début d’expérience, étangs de stockage en fin d’expérience) ; (2) le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale (0,5 cm2) après anesthésie, pouvant induire des douleurs et du stress durant quelques heures ; (3) le prélèvement de tissus après mise à mort si l’individu est trop petit pour le prélèvement de nageoire (cas des juvéniles issus des reproductions spontannées).

Devenir

Les poissons utilisés dans les procédures de contention et biométrie et prélèvement d'un fragment de nageoire sont tous réutilisés.

Remplacement

Cette expérience est principalement à vocation zootechnique. Elle nécessite le recours aux espèces utilisées en élevage classique. Le manque de recul et de modèles sur les interactions entre les espèces aquatiques d’élevage, ne permet pas de réaliser ce type d’expérience in silico. Néanmoins, les données récoltées dans le cadre de l’expérience, ont vocation à alimenter des démarches de modélisation qui vont dans le sens de la limitation au recours aux animaux à l’avenir.

Réduction

Les proportions des différentes espèces et leurs effectifs ont été déterminées pour représenter les pratiques d’empoissonnement en polyculture d’étang courrantes. Il est n’est pas possible de les diminuer sans perdre le caractère représentatif des pratiques. Le nombre de trois répliquats est le minimum que nous pouvons admettre pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances envers les poissons, les conditions de contention sont surveillées, notamment en maintenant un renouvellement d’eau lors des tockages temporaires et le contrôle des comportements. Avant chaque manipulation, les poissons sont anesthésiés, afin de limiter le stress, les risques de chute, limiter la durée hors d’eau en augmentant la rapidité des mesures de biométrie. La phase de réveil est contrôlée dans des bassins séparés par espèce, avec renouvellement d’eau.

Choix des espèces

Les espèces choisies : carpe Amour (Ctenopharyngodon idella), carpe commune (Cyprinus carpio), tanche (Tinca tinca), gardons (Rutilus rutilus) et sandre (Sander lucioperca), sont représentatives des polycultures de poissons d'étangs extensifs ou semi-intensifs en France. Ce sont par ailleurs, des espèces particulièrement tolérantes aux bas niveaux de qualité d’eau ce qui les rend tolérantes aux manipulations. Les carpes communes, les carpes Amour et les sandres sont de petites tailles (un an de croissance), afin d’optimiser leur croissance dans le dispositif. Les tanches et les gardons sont des géniteurs afin d’optimiser leur reproduction.

5 300 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun subissant sous anesthésie le prélèvement d'un morceau de nageoire caudale, puis jusqu'à 72 heures d'isolement en attendant le résultat de son génotypage. L'objet est de créer et d'entretenir des lignées porteuses de mutations reproduisant une maladie humaine de la coordination des mouvements. Une quarantaine de géniteurs et génitrices par lignée sont gardés jusqu'à 18 mois, puis renouvelés tous les huit mois. Tous les autres sont tués, le porteur expliquant qu'il s'agit "de ne pas garder d'animaux non nécessaires à la conduite de ce projet".

Objectifs

La maladie sur laquelle nous travaillons est une maladie génétique caractérisée par une dégradation progressive des fonctions sensorielles et motrices qui conduit à une perte des mouvements volontaires. Celle maladie est due à une diminution d’une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Plusieurs mutations ont été identifiées à ce jour, qui mènent à des symptômes différents d’un patient à l’autre. L'objectif de notre projet est de comprendre comment différentes altérations dans un même gène présentent des pathologies différentes. Nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire à l’Humain et sont transparents au stade où nous allons les étudier. Dans notre projet, nous allons introduire des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine défectueuse équivalente à celle retrouvée chez les patients. De plus, nous utiliserons des poissons présentant une absence du gène en question, entraînant l'absence de la protéine. En comparant ces deux mutations chez le poisson zèbre, nous voulons mieux comprendre comment les altérations du gène associé à la maladie conduisent à la pathologie, dans le but ultime de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur la protéine associée avec cette maladie. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes pathologiques, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Procédures

La création de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Ainsi, l’identification génétique (génotypage) des individus par prélèvement d’un morceau de nageoire caudale (

Impact sur les animaux

L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs sains. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement de phénotypes dommageables au fil du temps. Nous nous concentrons principalement sur les anomalies qui pourraient être liées à un système nerveux défectueux, comme d’anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) et d’une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité). Lors de la création de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale (

Devenir

Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.

Remplacement

Le projet vise à mieux comprendre comment les altérations dans notre gène d'intérêt retrouvées chez l’Homme entraînent différentes pathologies. Bien que la maladie affecte les neurones, on s'attend à ce que d'autres types de cellules entourant le neurone malade jouent un rôle important dans la pathologie. Les méthodes de culture cellulaire actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec tous les types de cellules, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.

Réduction

Afin de réduire au minimum le nombre de poissons de la génération fondatrice, une estimation préalable de l’efficacité des systèmes de modification génétique sera réalisée en amont sur des œufs de poisson zèbre de type sauvage à 24-48h heures post fécondation. Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au minimum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres porteurs sains nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres porteurs sains nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une quarantaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Les renouvellement des géniteurs/génitrices ne se feront tous les 8 mois afin de réduire le nombre d’animaux. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus.

Raffinement

Seul le strict minimum d’animaux nécessaires à la génération et au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum en couple le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous porteurs sains et ne présenteront pas de phénotype. Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. Des points limites précis et prédictifs ont été définis, et l’observation qu’un de ces points limites est atteint telles que blessures sur l’animal, anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac...) conduira à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.