Poissons

Pour estimer combien d'anguilles les stations de pompage agricole aspirent du Rhône vers des canaux fermés à la mer, 7 500 anguilles européennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune est anesthésiée cinq à dix minutes, reçoit sous la peau une puce RFID de 8 millimètres, puis passe une heure en bac oxygéné avant d'être relâchée près de son lieu de capture. Le porteur liste le stress, la perte de mucus et d'écailles, la dessiccation, l'éblouissement et un saignement léger à l'injection. Les individus marqués mesurent tous plus de 40 centimètres, des anguillettes juvéniles aux femelles matures, dans une espèce en danger critique d'extinction que le porteur dit ne pas pouvoir remplacer puisqu'elle est le seul migrateur amphihalin à se reproduire en mer.

Objectifs

Sur le delta du Rhône, il y a une multitude de stations de pompages qui puisent l'eau du Rhône vers des canaux d'irrgation pour la riziculture. Ce pompage peut aspirer des poissons dont l'Anguille et les introduire dans des canaux qui ne sont pas connectés à la mer. L'étude de l'impact du pompage agricole sur les anguilles en Camargue vise à estimer les densités des Anguilles européennes (Anguilla anguilla, L., 1758) présentes dans ces canaux de drainage et comprendre quel est leur devenir, à savoir si leur migration de reproduction vers la mer est possible ou si les individus se retrouvent bloqués dans des systèmes fonctionnant à huit clos. L'étude utilise la technique de Capture-Marquage-Recapture, au travers de captures via des filets et marquage par puces RFID (Radio Frequency IDentification). L'objectif est d'estimer les densités présentes dans le canal du Barcarin, appartenant à l’Association Syndicale Forcée du canal du Japon et dans le canal de Corrège Major situé plus au Nord de l'Etang du Vaccares. Ces milieux seront échantillonnés au verveux chaque année du projet afin de recapturer les anguilles marquées et estimer la densité d'anguilles. Si ces milieux présentent de fortes abondances, il faudra proposer des mesures de gestion visant à limiter l'introduction d'anguilles ou alors des mesures de gestion visant à capturer ces anguilles et les tranférer dans un milieu connecté à la mer.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance des densités d'anguilles présentes dans les canaux de drainage de Camargue et du devenir de ces individus permettra d'engager des mesures de gestion afin de faciliter voire améliorer les possibilités de retour en mer pour cette espèce classée en Danger critique d'extinction.

Procédures

Anesthésie profonde (5-10 minutes), puis implantation d'une puce RFID de 8 mm (environ 1 minute) avec un injecteur unique, suivi d'un réveil et de la remise en contact avec les congénères dans un bac de stabulation puis un bac de surveillance (environ 1h en observation).

Impact sur les animaux

Stress et changement de comportement. Nuisance induite par l'anesthésie : répulsion du produit Nuisance induite par la biométrie : stress des individus, perte de mucus, perte d'écailles, dessication, éblouissement Nuisances induites par le marquage : saignement léger lors de l'injection, stress et douleur/gêne post-opératoire de courte durée

Devenir

Toutes les anguilles capturées sont relâchées dans le milieu naturel, à proximité immédiate de leur lieu de capture.

Remplacement

L'étude vise à étudier le comportement d'individus sauvages dans leur milieu naturel. De plus, l'Anguille est le seul migrateur amphihalin à se reproduire en mer. Il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre

Réduction

Le marquage est limité à 1500 individus par an. Cette approche permet d'estimer des densités par capture marquage recapture et nécessite de marquer toutes les anguilles capturées. Les anguilles de moins de 40cm ne sont pas marquées et sont remises à l'eau.

Raffinement

Le projet prévoit de capturer les anguilles aux verveux car c'est la méthode de pêche connue pour être la moins impactante pour ces poissons. Pose des verveux la veille au soir et relève le lendemain matin pour limiter au maximum le stress des individus. Seules les anguilles de plus de 40cm seront marquées afin de limiter le caractère intrusif des pit tags de 8mm en sous cutané. Les anguilles de moins de 40cm sont triées à l'oeil sans anesthésie et relâchées. Les anguilles de plus de 40cm sont transférées dans un bac permettant une anesthésie profonde (Benzocaïne (50-100 mg/L) ou Tricaïne MS222 (100-150 mg/L, tamponnée avec du bicarbonate de soude)). Avant et après le marquage, de l'enrichissement est proposé aux animaux pour limiter leur stress durant la stabulation (blocs pour se cacher, recouvrement des bacs pour un maintien dans l'obscurité nombre d'individus limité à 5 pour chaque bac). Une fois que les anguilles ont récupéré un comportement normal elles sont placées pendant 1h dans des bacs oxygénés et placés dans l'obscurité avec une température optimale pour les animaux (changement de l'eau du bac si augmentation de température de plus de 2°C). La taille des marques est réduite à 8mm car il n'y a pas besoin de détecter les anguilles sur des antennes fixes qui nécessitent des marques de 23mm. Avant le marquage, les anguilles se verront administrer une solution d'analgésique (Lidocaine 1mg/kg dilué au quart dans du chlorure de sodium, 0,05mL/kg) à proximité de la zone d'insertion du pit tag. La méthode de suivi ici est la recapture et détection par scanette RFID. La recapture se fait les années suivant le marquage uniquement.

Choix des espèces

L'Anguille européenne est le seul migrateur amphihalin dont la reproduction se déroule en mer. En Camargue, les densités et modalités de retour en mer pour les individus présents dans les canaux de drainage sont mal connus. Les anguilles marquées sont des individus de plus de 40cm, soit des "anguillettes" (juvéniles de moins de 3 ans), des "anguilles jaunes" (Femelles stade 1 et 2 immatures), des anguilles jaunes en cours de métamorphose (Femelle stade 3) et des anguilles argentées (Femelle stade 4 et 5 ou males dévalant corresponndant à des anguilles suffisamment matures pour rejoindre a mer et se reproduire). Cette classification des individus a été proposée par la chercheuse Caroline Durif en 2009

Tués dès qu'ils ne portent pas la modification génétique attendue, pour ne pas garder d'animaux jugés "non nécessaires" au projet, la grande majorité des 4 040 poissons zèbres déclarés ne passent pas l'étape de la sélection. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans qu'aucune intervention ne soit déclarée sur eux, la protéine fluorescente s'observant sur l'animal vivant. Les lignées sont créées pour rendre visibles des protéines du cytosquelette des neurones, et le porteur annonce que ces poissons se comporteront comme des animaux sauvages, tout en reconnaissant que la modification touche une protéine du système nerveux et pourrait entraîner une nage anormale ou une prostration. Une vingtaine de mâles et de femelles reproducteurs par an, gardés jusqu'à dix-huit mois, suffit à maintenir ces lignées, sans que l'écart avec l'effectif déclaré soit expliqué.

Objectifs

Le cytosquelette, une structure fibreuse présente dans nos cellules, joue un rôle crucial en agissant comme des piliers de soutien. Son bon fonctionnement est essentiel pour les neurones, mais des anomalies dans ces structures sont associées à diverses maladies neurologiques. Pour mieux comprendre ces structures et leurs rôles, nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire au nôtre et sont transparents à un stade précoce de leur développement. Dans notre projet, nous allons introduire des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine fluorescente. Cela nous permet d’observer précisément où se trouvent les protéines du cytosquelette à l'intérieur du poisson et des suivre leur comportement alors que le poisson grandit et dans un contexte de maladie. L'objectif principal est de comprendre comment ces structures fonctionnent normalement lors du développement des cellules nerveuses, sans perturber le processus naturel. Cette compréhension pourrait éclairer les mécanismes sous-jacents aux maladies neurologiques associées au cytosquelette.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur les fonctions des protéines du cytosquelette au cours du développement. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes physiologiques impliquant les protéines du cytosquelette dans un contexte pathologique, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.

Procédures

Aucun

Impact sur les animaux

D'après les connaissances, la modification de notre protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente n'affecte pas la fonction de cette protéine. Par conséquent, nous nous attendons à ce que les poissons se comportent comme des animaux sauvages et nous ne prévoyons pas de nuisances indésirables pour les poissons génétiquement modifiés. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement d’effets indésirables Comme nous apportons une modification d'une protéine du système nerveux, les effets indésirables pourraient être liées à un système nerveux défectueux, avec des anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) ou une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité).

Devenir

Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.

Remplacement

Le projet vise à mieux comprendre comment les protéines du cytosquelette fonctionnent dans les cellules nerveuses. Ces fonctions dépendent de processus comme la présence de certaines cellules qui protègent les nerfs. Les méthodes actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Pour surmonter ces limitations, nous nous tournons vers des modèles de laboratoire appelés organoïdes, qui sont des petites structures cellulaires qui imitent certaines caractéristiques des tissus réels. Cependant, ces organoïdes sont difficiles à imaginer en direct, ce qui est important pour notre recherche. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec toutes les cellules nécessaires, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.

Réduction

Nous avons utilisé une technique qui nous permet de sélectionner et d’élever uniquement les poissons dont la modification génétique a réussi, et éviter d'élever ceux qui n'ont pas le modification de notre intérêt. Le nombre d'animaux nécessaires est strictement déterminé en fonction de la fréquence à laquelle la modification génétique est transmise à la prochaine génération, ainsi que du nombre de couples de poissons reproducteurs requis. Pour maintenir ces lignées génétiquement modifiées, nous conservons seulement un nombre limité de poissons, environ une vingtaine de mâles et de femelles reproducteurs par an.

Raffinement

Étant donné que la protéine fluorescente est observée sur l’animal vivant, cela nous permet d’éviter d'avoir à effectuer des prélèvements invasifs sur le poisson. Comme la modification génétique ne devrait pas altérer la manière dont les gènes sont exprimés ni les fonctions de la protéine, nous prévoyons que ces animaux se comporteront de la même manière que les animaux sauvages et qu'ils ne présenteront aucun changement dans leur apparence ou leur comportement. Cependant, une surveillance hebdomadaire sera effectuée. De plus, une évaluation sera réalisée lorsque les poissons seront autonomes pour se nourrir (après 5-6 jours) et lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle (environ 12 semaines), en utilisant une grille de score pour détecter toute anomalie éventuelle. Nous avons mis en place des points limites prédictifs et précoces pour identifier les signes de mal être chez le poisson. Les poissons atteignant l’un de ces points limites seront immédiatement mis à mort pour abréger toute souffrance.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.

Évaluer comment des embryons et alevins de poissons encaissent une hausse de température doublée d'une irradiation gamma : 1 475 truites communes et ombles chevaliers vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Les actes déclarés se limitent à des photographies pour la morphologie et à des vidéos pour le comportement, avec un changement de bac. Le porteur attend pourtant une mortalité de 30 % due au stress thermique, et retient des débits de dose allant jusqu'à la valeur maximale mesurée à proximité de Tchernobyl. Les survivants, qui mesurent au plus un centimètre et demi, sont tués par surdose d'anesthésiant pour prélever foie et reins, un seuil de 30 % de perte de poids, estimé à l'œil, déclenchant une mise à mort anticipée.

Objectifs

Le réchauffement climatique à l’échelle de la planète sera compris entre 1,5 et 4,5°C avec des valeurs extrêmes allant jusqu’à 6°C d’ici 2100. Par conséquent, l’écotoxicité de substances chimiques classiques retrouvées dans les écosystèmes aquatiques doit être réévaluée en prenant en compte les effets du stress thermique. Peu de données concernent l’étude combinée des effets de l’augmentation de la T°C et de l’irradiation gamma. Ce type d’irradiation se rencontre suite à un défaut de central nucléaire et pénètre davantage dans l'organisme que les rayonnements alpha et bêta, mais il modifie moins les particules qu'il rencontre. Un précédent projet dans les même conditions d’irradiation et sur les mêmes espèces de poisson avait montré seulement une préciosité de la date d’éclosion. Ce projet permettra d’évaluer le stress lié à une irradiation gamma couplé d’une hausse de température à travers des expérimentations menées en conditions contrôlées de laboratoire, la réponse phénotypique (mortalité/développement/comportement/croissance) et moléculaire de plusieurs espèces de poisson sauvage exposées à différents stress de température (aigue pour mimer les rejets thermiques des centrales nucléaires et chronique pour mimer l’augmentation des températures en amont des centrales nucléaires en lien avec le réchauffement climatique) et à différents niveaux de débits de dose (valeur seuil de protection des écosystèmes aquatiques, valeur maximale mesurée à proximité de Tchernobyl.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait servir à terme à mieux évaluer les capacités de résilience des stades précoces de poissons sauvages face au stress thermique couplé à des effets de rayons ionisants.

Procédures

Les procédures de ce projet (prise de photo pour mesurer la morphologie, vidéo pour le comportement ) n'impliquent qu'un leger stress dû à la manipulation des animaux. Nous nous attendons à ce que ce stress se dissipe rapidement après avoir remis les individus dans leur aquarium.

Impact sur les animaux

Compte tenu des connaissances acquises lors d’études précédentes sur les radiations ionisantes sur l’omble chevalier au stade embryo-larvaires nous nous attendons à ne pas avoir impact sur leur survie. Pour les variations de températures, nous prévoyons une mortalité au cours de l’expérimentation de 30% en raison du stress induit par la température pour les alevins . En outre, les procédures de ce projet (vidéo pour le comportement) n’impliquent qu'un léger stress du au changement de bac. Les animaux seront ensuite mis à mort par surdose d’anesthésie pour les mesures morphologiques et les prélèvements d’organes.

Devenir

A la fin de l'expérimentation les animaux seront mis à mort pour le prélévément des organes (fois et reins) pour le dosages des biomarqueurs de stress (stress oxydatif: catalase, super oxyde dismutase ). La mise à mort sera réalisée par surdose d’anesthésiant (balnéation > 250 ppm de benzocaine ou > 400 ppm de tricaine). L’objectif est d’atteindre une anesthésie de stade 4 (paralysie médulllaire) , caractérisée par une perte totale d’équilibre, une réactivité nulle, un arrêt de la fréquence operculaire et une perte totale de tonus. La mort sera confirmée par une vérification à la loupe binoculaire de l'arrêt permanent de la circulation. Les animaux en fin d’expérimentation mesurant au maximum 1.5 cm.

Remplacement

Le modèle animal n'est pas remplaçable par un modèle in vitro car il nécessite une étude dans un système intégré ( différents tissus fondamentaux, différents organes et notamment système inflammatoire...), de plus les stades embryo-larvaire sont pollu-sensibles. De plus, l’omble chevalier est une espèce patrimoniale et sentinelle des lacs alpins. Ainsi, aucune expérience in vitro ne permettrait de répondre à cette question scientifique qui nécessite l’utilisation d’un organisme entier.

Réduction

L’effectif totale est de 30 individus parconditions thermique et par traitements afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). L’effectif totale est de 30 individus afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction).

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous- alimentation). De plus, dans chaque bassin, des tubes cérémiques seront installées pour permettre aux truites de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience. On considère qu'il y a un effet grave lorsque l'organisme perd 30 % de son poids. On considère qu'il y a un effet grave lorsque l'organisme qu’une perte de poids est estimé par contrôle visuel journalier des individus. Dans ce cas, l'individu sera immédiatement euthanasié par surdose d'anesthésie afin d'éviter toute souffrance à l'animal.

Choix des espèces

La truite commune (Salmo trutta) apparait comme un bon candidat modèle pour plusieurs raisons : i) est une espèce de relevance grâce à sa présence a niveaux mondial, ii) possède un fort attrait économique grâce à l’activité de pêche de loisir et iii) a un intérêt économique avec une production aquacole de 700 tonnes en France et de 19432 tonnes au niveau mondial . L’omble chevalier est une espèce patrimoniale et sentinelle des lacs alpins. Ainsi, aucune expérience in vitro ne permettrait de répondre à cette question scientifique qui nécessite l’utilisation d’un organisme entier. Enfin, ces deux espèces présentent des thermo tolérance faible ce qui en font un bon modèle pour cette étude. Les stades embryo-larvaires ont été ciblés pour cette étude car le test sur les embryons de poisson a été validé compte tenu de son excellente corrélation avec le test de sensibilité aiguë sur les poissons basé sur des poissons juvéniles et adopté comme méthode d'essai standard pour les tests de libération sur les poissons.

Le xénope et le poisson zèbre sont retenus parce qu'ils régénèrent naturellement leur rétine, capacité que les mammifères ont perdue. 600 xénopes et 260 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les poissons reçoivent une injection dans l'œil sous anesthésie générale, 560 têtards sont maintenus dans le noir de sept à trente-cinq jours dans des bains de solution, dont 240 pendant vingt-cinq jours de plus dans une seconde solution, et 40 xénopes adultes reçoivent une injection d'hormones pour déclencher la ponte. Tous les poissons et tous les têtards sont tués pour examiner leur rétine, les 40 adultes restant en élevage et recevant de nouvelles injections hormonales tous les quatre mois, sur une période reproductive que le porteur évalue à quinze ans au moins.

Objectifs

Les maladies dégénératives de la rétine sont dues à la perte progressive et irréversible des cellules de la rétine. Dans le cas de la rétinite pigmentaire ou de la DMLA (Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age), ce sont les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine qui sont affectées, et leur disparition entraine une perte de la vision. Comme ces maladies restent pour la majorité incurable, il est essentiel d’approfondir nos connaissances en recherche fondamentale afin de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. Le xénope et le poisson-zèbre, contrairement aux mammifères, ont la capacité de régénérer leur rétine grâce à leurs cellules gliales de Müller qui se comportent comme des cellules souches en cas de dégénérescence. Chez l’homme, ces cellules ont perdu la capacité de réparer la rétine suite à une lésion. De récents travaux ont néanmoins montré, via l’ajout de facteurs de croissance ou la surexpression de facteurs de transcription, que ces cellules de Müller chez les mammifères ont gardé un potentiel régénératif. Cependant, ce potentiel reste très limité et les cellules de Müller réactivées régénèrent très peu, voire pas du tout, les photorécepteurs, le sous-type même de cellules rétiniennes qui doivent être remplacées chez les patients. Il est donc essentiel de trouver des molécules capables de stimuler la régénération des photorécepteurs, et en particulier des cônes, responsables de notre vision diurne. Nous avons développé récemment un modèle de dégénérescence des cônes chez le xénope) et avons montré que bien que cet amphibien possède la capacité de régénérer les photorécepteurs à bâtonnets, il ne régénère que très peu les cônes dans ce modèle lésionnel, contrairement au poisson-zèbre. Bien que ne représentant que 5% des photorécepteurs chez l’homme, les cônes sont essentiels pour la vision des couleurs. L’objectif du projet est d’étudier les mécanismes responsables de cette différence entre xénope et poisson zèbre afin d'identifier des facteurs capables de promouvoir la régénération des cônes chez les mammifères.

Bénéfices attendus

Ce travail préliminaire a pour but de tester la pertinence du projet visant à comparer les caractéristiques distinctes des cellules de Müller à régénérer les cônes, entre le poisson-zèbre et le xénope. Selon les résultats obtenus, il permettra de décider ou non de poursuivre l’étude. Celle-ci a pour objectif d’identifier les voies de signalisation contrôlant les processus régénératifs à partir des cellules de Müller et ainsi fournir des informations essentielles qui permettraient de stimuler la régénération des photorécepteurs chez les personnes atteintes de pathologies dégénératives de la rétine.

Procédures

- 260 poissons zèbre adultes recevront, sous anesthésie générale, une injection intra vitréenne. La procédure s’effectuera en 30 secondes environ le temps de placer correctement l’animal pour réaliser l’injection. L’injection en elle même ne prendra que quelques secondes. - 560 xénopes au stade têtard seront placés en bain dans une solution dans le noir entre 7 et 35 jours. - 240 d’entre eux seront ensuite placés dans une autre solution pendant 25 jours. Les solutions seront changées tous les 2 à 3 jours. - 40 xénopes adultes recevront une injection sous cutanée. La procédure s’effectuera en 30 secondes environ le temps de placer correctement l’animal pour réaliser l’injection. L’injection en elle-même ne prendra que quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’injection intra vitréenne est un acte de chirurgie légère. Chez l’homme, les effets indésirables décrits sont une irritation de l’œil (ce qui peut se traduire par une sensation de brulure, de grains de sable ou de picotements), un saignement de la conjonctive, la sensation d’un corps étranger ou l’apparition de tâches dans le champ visuel. Cela reste des symptômes bénins qui se résorbent en quelques jours. Afin de maintenir les poissons immobiles pendant la procédure, les animaux seront placés sous anesthésie générale. Les effets indésirables potentiels sont la désorientation passagère lors du réveil et le risque d’asphyxie entrainant la mort de l’animal si l’anesthésie est trop longue en raison de l’arrêt de l’irrigation des branchies. À la dose utilisée, les traitements sont considérés comme étant non toxiques. Les effets indésirables possibles restent l’apparition d’œdèmes. De plus, le fait que les animaux seront conservés dans le noir pendant la durée de certains traitements est susceptible de leur causer du stress (de 7 à 35 jours) ou de la dépigmentation. L’administration d’hormones par injection sous cutanée chez le xénope adulte pour déclencher les pontes n’est pas connue comme entrainant des effets secondaires indésirables. Un court stress est généré le temps de la contention.

Devenir

Tous les poissons seront euthanasiés afin d’étudier la régénération de la rétine. Tous les xénopes adultes utilisés seront maintenus en élevage. Tous les têtards de xénopes seront euthanasiés afin d’étudier la régénération de la rétine.

Remplacement

La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que les cellules de Müller n’ont pas le même comportement in vivo au sein de la rétine et en culture cellulaire. Elles sont en effet fortement influencées par le micro-environnement et en particulier le contexte inflammatoire, qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. Ainsi, il n’est pas possible de se passer de l’utilisation d’animaux et d’utiliser des méthodes alternatives au vu de la finalité de ce projet. L’induction de la ponte chez le xénope constitue la seule façon d’obtenir des ovocytes matures de manière non-invasive (sans chirurgie).

Réduction

L’objet de cette demande d'autorisation de projet est de réaliser des expériences préliminaires à un projet plus large afin de tester la pertinence du projet et minimiser le nombre d’animaux utilisés. - Le nombre d’animaux prévu pour cette DAP correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques individuelles et techniques, nous avons déterminé que chaque lot comprendra 10 animaux pour les lignées sauvgaes et 20 animaux pour les lignées transgéniques et nos expériences seront réalisées en tripliqua. - Nous utiliserons des poissons réformés (poisson de lignée sauvage trop âgés pour continuer à faire de l’élevage) et non utilisable pour d’autres projets. - Nous limiterons le nombre d’animaux adultes transgéniques au minimum requis afin de maintenir une lignée transgénique stable. - Le développement d’une lignée rapportrice fluorescente permettra l’observation des phénotypes de dégénérescence puis de régénération sur animaux vivants en continu et par conséquent permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires. - Les femelles xénopes adultes utilisées pour générer des embryons sont réutilisés tous les 4 mois. Ces animaux ayant une période reproductive longue (au moins 15 ans), ils peuvent être induits de nombreuses fois, ce qui permet de réduire le nombre d’individus utilisés. - Pour les animaux transgéniques, nous avons prévu de ne faire que des fécondations naturelles afin d’éviter de devoir sacrifier des mâles. Les mâles peuvent donc être utilisés plusieurs fois pour la reproduction donc là aussi cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le projet repose sur l’étude de processus de dégénérescence et régénération spécifiques à un organe non-vital et la dégénérescence cellulaire au niveau de la rétine, comme dans la DMLA, est un processus indolore. Les injections intravitréennes chez le poisson se font sous anesthésie générale. Les animaux sont ensuite surveillés jusqu’au réveil puis quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience. L’utilisation des xénopes adultes par roulement (possiblement tous les 4 mois pour les femelles, et tous les mois pour les mâles) permet le renforcement positif lors des manipulations ce qui réduit leur stress. Tout au long des procédures, nous évaluerons en continue l’état des animaux à l’aide de fiches d’évaluation de points limites adaptés à l’espèce et à l’âge des animaux et procéderons à des soins ou à l’euthanasie des animaux si cela s’avère nécessaire. Le développement d’une lignée inductible et réversible permettra de cibler la dégénérescence à une sous population de cellules, et de limiter le traitement dans le temps.

Choix des espèces

L’objet de cette étude vise à étudier et comparer les mécanismes de régénération dans des espèces qui sont naturellement capables de régénérer leur rétine. A ce jour, cela n’a été décrit que chez le poisson, les amphibiens et l’embryon de poulet. Le poisson-zèbre et le xénope constituent des espèces faciles à manipuler et à maintenir en laboratoire et pour lesquels sont établis des protocoles d’élevage et d’utilisation à des fins scientifiques. Par ailleurs, nous disposons des génomes pour les deux espèces et leur analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain (plus de 70% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leurs équivalents chez le xénope et le poisson-zèbre). Les poissons-zèbre seront utilisés soit à l’âge adulte (4-6 mois, taille 3cm), soit au stade juvénile (1 mois, taille 1cm) afin de comparer les capacités de régénération de la rétine à ces deux stades. Les xénopes des lignées transgéniques seront utilisés au stade têtards car l’article de référence sur cette lignée indique qu’à ce stade le phénotype obtenu est plus homogène d’un individu à l’autre. Les xénopes adultes utilisés afin d’établir une nouvelle lignée transgénique seront utilisés à un stade mature sexuellement. Du fait de la longue durée de vie du xénope et de sa longue période de maturité sexuelle, les animaux peuvent avoir entre 2 et 20 ans.

Pour mesurer la durée du cycle de remplacement des dents pharyngiennes lors d'un passage à une alimentation dure, 65 cichlidés Astatoreochromis alluaudi vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est anesthésié par balnéation puis reçoit une injection de marqueur dans l'abdomen, l'ensemble durant une dizaine de minutes, avant d'être tué en fin de projet pour que ses mâchoires soient prélevées et coupées. Les individus qui développent ensuite une hydropisie, des écailles hérissées ou un trouble de la vessie natatoire sont mis à mort par surdose d'anesthésique. Le porteur justifie le choix de cette espèce du lac Victoria par le fait qu'elle est la seule à avoir déjà fait l'objet d'études documentant cette plasticité dentaire, ce qui la rend selon lui "absolument unique" pour le projet.

Objectifs

Le but du projet est de déterminer la durée du cyle de remplacement des dents pharyngiennes chez une espèce de poissons de la famille des Cichlidés mangeur d'escargots non obligatoire afin de mieux comprendre la plasticité dentaire et élaborer des modèles de plasticité dentaire. Cette espèce possède un profil alimentaire varié. Comme beaucoup d'espèce elle possède une machoire pharygienne abritant des dents de différentes formes. En fonction de son alimentation, les dents sont remplacées et la forme des nouvelles dents change. Une alimentation constitué d'aliments durs entraine l'apparition de plus de dents en forme de molaire par exemple. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. Au cours d'un précédent projet, nous avons pu évaluer avec succès la durée du cycle de remplacement lors d'une prise alimentaire standard. Dans la présente demande, nous souhaitons afiner les résultats obtenus en réalisant une étude pour étudier le cycle de remplacement dentaire lors d'une transition alimentaire vers une alimentation dure contenant des escargots.

Bénéfices attendus

Afin d'explorer les mécanismes sous-jacents à la plasticité des modèles numériques de la réponse d’un bourgeon dentaire aux forces mécaniques liées à l’alimentation. Ce projet permettra en particulier de déterminer si le cycle de remplacement des bourgeons dentaires est modifié lors d'une transition d'une alimentation constituée essentiellement d'aliments mous vers une alimentation contenant des aliments durs. Ce projet aura des implications importantes pour notre compréhension du rôle de l'alimentation dans la mise en place des dents. Il permettra l'établissement de modèles numériques permettant d'étudier le développement dentaire.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés individuellement par balnéation et recevront une unique injection dans l'abdomen afin d'injecter un produit qui marquera les dents et permettra de suivre les dents qui n'ont pas été remplacées et de déterminer la longueur du cycle de remplacement des dents. L'intervention durera une dizaine de minutes en incluant l'anesthésie, l'injection et le reveil.

Impact sur les animaux

Faibles. Le projet implique de réaliser, en début de protocole, des injections dans l'abdomen qui peuvent présenter dans de rares cas des séquelles. Une vigilance particulière sera donc apportée lors de la récupération des animaux après ces injections. Après ces injections, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation (hydropisie, écailles hérissées). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou de détresse seront mis à mort par surdose d'anesthésique. Pour le reste du projet, les animaux sont conservés en groupe sociaux et nourris suivant des régimes alimentaires différenciés mais équivalents à ceux qu'ils adoptent dans le milieu naturel. Les animaux présentant des signes de stress seront isolés. Un intérêt particulier sera porté sur les animaux présentant des signes de refus alimentaires ou d'amaigrissement. Ces animaux seront sortis de l'expérimentation.

Devenir

L'analyse de la forme des dents nécessite de prélever les mâchoires des animaux et de réaliser des coupes qui seront analysées au microscope. Ceci nécessite donc la mise à mort de l'ensemble des animaux utilisés dans le projet.

Remplacement

Des approches numériques existent pour l'étude du développement dentaire malheureusement elles ne sont adaptées qu'aux mammifères. Nous souhaitons développer des modèles numériques équivalents mais qui soient adaptés aux espèces que nous étudions. Pour développer ces modèles, il est nécessaire de poursuivre des études in vivo pour fournir les données nécessaires à leur élaboration. Une fois établis, ces modèles pourront être utiliser pour étudier le développement dentaire d'autres espèces de vertébrés.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé pour fournir analyse statistique satisfaisante Un approche statisitique sera utilisée pour mettre en évidence d'éventuelles différences de longueur de cycle entre les dents positionnées au centre et celles positionnées en périphérie de la machoire en fonction du régime alimentaire suivi. Tous les tests du projet seront initiés en même temps ce qui permet de mutualiser les contrôles d'injections et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires de 10 animaux.

Raffinement

L'injection dans l'abdomen en début de protocole sera réalisée sous anesthésie et les poissons seront placés dans des bacs de réveil et surveillés lors de leur sortie d'anesthésie. Par ailleurs, les Astatoreochromis sont maintenus en groupes sociaux dans des bacs qui leur permettent d'exprimer leurs comportements naturels. Afin de favoriser le bien-être des animaux, les aquariums disposent d'un substrat (sable) qui permettent aux animaux d'exprimer leur comportement fouisseur. De même, afin de limiter les possibilités d'agression par les individus dominants, de nombreuses cachettes (gouttières renversées, pots en terre) sont mises à disposition des animaux. Les animaux disposent d'une alimentation variée proche de celle de leur milieu naturel. Autant les régimes alimentaires à base de nourriture molle que ceux à base d'escargots correspondent à des régimes alimentaires que les animaux adoptent dans leurs biotopes d'origine. Les animaux nourris d'escargots reçoivent en plus au minimum un repas constitué d'aliments variés pour éviter tout risque de dénutrition ou de carence. Les animaux sont observés quotidiennement en semaine et les animaux malades ou stressés sont isolés et placés dans un environnement différent. Après l'injection dans l'abdomen, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation au site de l'injection. Les signes de déséquilibres seront observés après l'injection (gonflement, écailles hérissées), ainsi que les signes pouvant indiquer une atteinte de la vessie natatoire (flottabilité positive ou négative). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou d'atteinte à la vessie natatoire seront mis à mort par une surdose d'anesthésique en balnéation.

Choix des espèces

En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; chasseur d'escargot non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire incorporant des escargots entiers provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet. 65 animaux seront utilisés d'une longueur standard de 6 à 8 cm (soit agés environ d'un an). A cet âge, l'injection dans l'abdomen est devient simple à réaliser et les machoires restent de taille raisonnable pour réaliser l'acquisition des données d'imagerie.