Poissons
Utilisation du modèle poisson-zèbre pour évaluer l’efficacité des nanovecteurs ciblant le cancer.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour tester des nanoparticules activées par laser contre le cancer, 7 200 poissons zèbres sont utilisés au stade larvaire dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque larve reçoit une injection de cellules cancéreuses humaines sous anesthésie à deux jours de développement, puis une injection de nanoparticules dans la veine caudale à quatre jours, avant une heure d'anesthésie pour l'observation au microscope confocal et une irradiation laser. Le porteur signale que la croissance tumorale peut provoquer des œdèmes et modifier la mobilité. Toutes les larves sont tuées à l'issue, les expériences devant être arrêtées avant le stade de larve autonome capable de s'alimenter, et l'effectif de 7 200 individus n'est rapporté à aucun calcul.
Objectifs
Actuellement, les campagnes de dépistage ainsi que les progrès technologiques permettent de détecter des cancers de petite taille. Cependant, les traitements proposés ne sont pas toujours adaptés. Dans ce contexte, la thérapie focalisée utilisant des nanoparticules biodégradables, ciblées et par un laser infrarouge peut répondre à ce besoin médical. En effet cette stratégie thérapeutique peu invasive peut permettre de visualiser et traiter un cancer solide de petite taille tel que le rétinoblastome ou le cancer de la prostate. Ce projet concerne le développement de nanoparticules pour une thérapie combinée anti-cancéreuse. Ces nanoparticules peuvent être activées par illumination laser et libérer des facteurs permettant d’inhiber l’expression de protéines impliquées dans le développement de cancer. L'efficacité de ces nanoparticules sera testée sur le modèle de poisson-zèbre.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous pourrons rapidement définir, grâce à l'utilisation du modèle du poisson-zèbre, les critères nécessaires pour obtenir la meilleure efficacité de ces nanoparticules permettant à la fois le diagnostic et la thérapie: cibler les cellules du cancer et administrer des médicaments anticancéreux. Notre projet pluridisciplinaire correspond à des approches transversales basées sur la synthèse de matériaux et procédés nouveaux et innovants tels que les nanoparticules capables de réaliser de l'imagerie, la thérapie sous irradiation à deux photons et l’inhibition de gène. A long terme, cette première étape préclinique permet de poser les bases pour une application en thérapie humaine.
Procédures
Tout d’abord, des cellules cancéreuses seront injectées sous anesthésie au stade embryonnaire, durée de l'injection 3 minutes. Par la suite, les nanoparticules seront injectées également sous anesthésie chez les mêmes larves à 4 jours de développement par la veine caudale, durée de l'injection 5 minutes. Le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules sera observé par microscopie confocale, ce qui implique une anesthésie d'une heure pour la prise d'image et un réveil juste après l'observation. L’efficacité sera évaluée par la résorption des cellules cancéreuses après activation des nanoparticules par rayonnement laser. Bien entendu, l’efficacité de ces nanoparticules sera préalablement établie sur des cellules en culture. Aucun prélèvement ne sera effectué sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont liés à une croissance exagérée des cellules tumorales, ce qui pourrait induire des œdèmes et un changement de mobilité. Cependant, le suivi quotidien des animaux entre 2 et 5 jours de développement permettra de stopper les expériences dans ce cas avant le stade de larves autonomes et la prise alimentaire.
Devenir
A la fin de chaque procédure (irradiation biphotonique et observation au microscope), toutes les larves seront mises à mort et utilisées pour l'analyse des cellules tumorales et des tissus.
Remplacement
Les premières expérimentations sur des cellules tumorales en culture ont d’ores et déjà été réalisées. Les nanoparticules activées par rayonnement laser ont montré une efficacité intéressante en thérapie ciblée. Cependant, les expériences sur cellules en culture ne permettent pas de de suivre le devenir des nanoparticules (bio-distribution) et l’efficacité de ciblage tumoral. Pour cela l’expérimentation animale in vivo, en l’occurrence le poisson-zèbre, devient une étape indispensable et non remplaçable.
Réduction
Avant toute expérimentation avec les larves de poisson-zèbre, des mises au point des conditions expérimentales seront réalisées sur des cellules en culture afin de choisir les nanoparticules qui ne présentent pas de toxicité et qui ont une meilleure activité. Ainsi, nous pourrons choisir les nanoparticules les plus efficientes et réduire par conséquent le nombre de larves à utiliser.
Raffinement
Un suivi quotidien est réalisé dès le début de la procédure et les points limites surveillés plusieurs fois par jour. Dès l'apparition de ces points limites, l'expérience sera interrompue et les larves seront mises à mort avec une surdose d'anesthésique pour éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre présente des avantages en cancérologie ; robustes, reproductibles, faciles d’utilisation et peu coûteux. Il constitue un modèle de choix puisqu’il offre la possibilité de criblage de composés dans un organisme vertébré entier, dont la pertinence est incomparable avec des modèles in vitro de cultures cellulaires. Les animaux utilisés pour ces travaux seront des embryons de poisson-zèbre au cours des premiers stades de leur développement (2 jours post-fécondation) afin de permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans impliquer de phénomène de rejet et suivre la formation des tumeurs et leur traitement après injection des nanoparticules ciblant les cellules tumorales. Ces expérimentations peuvent être menées jusqu'à 15 jours post-fécondation. La procédure décrite implique des stades précoces de larves de poisson-zèbre, permettant ainsi de faire des premières expérimentations précliniques.
Génotypage de poissons zèbres, sans phénotype dommageable, pour l’étude de mécanismes impliqués dans un type de mémoire , l’habituation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
8 000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À deux mois, chaque poisson est anesthésié à la tricaïne par balnéation, puis une extrémité de sa nageoire caudale est coupée sur une surface inférieure à 0,25 mm², en moins de deux minutes. L'objectif déclaré est de repérer les poissons hétérozygotes pour organiser les croisements, les expériences sur la mémoire portant ensuite sur des larves de moins de cinq jours, hors du champ réglementaire. Seuls les hétérozygotes sont gardés vivants pour la reproduction, tous les autres génotypes sont tués, et tout poisson présentant un trouble de la flottabilité, une immobilité, une scoliose ou, pour les femelles, un ventre rempli d'œufs est tué immédiatement.
Objectifs
Le projet est une caractérisation génétique de 8 lignées de poissons âgés de 2 mois, génétiquement modifiés. Ces poissons seront ensuite élevés puis croisés entre eux afin d'obtenir des larves âgées de moins de 5 jous, non soumis à l'expérimenation animale, pour les études afin de comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs. S'il est clair que les souvenirs se forment grâce à la plasticité des réseaux neuronaux, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, dans un circuit neuronal complexe de vertébrés, lesquels et combien de neurones sont soumis à la plasticité ? Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans cette plasticité ? Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l'activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu'il est stimulé par un flash de lumière ou un bruit, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d'éclairs ou de bruits répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire à long terme connu sous le nom d’habituation. Afin d'étudier cette habituation, nous disposons de 8 lignées de poisson zèbre portant des mutations, non dommageables, sur différentes protéines. Ces poissons seront croisés entre eux pour étudier le comportement de leur descendance, âgèe de moins de 5 jours et donc non soumise à l'expérimentation animale. L'étude du comportement des poissons correspondra à l'étude de leur habituation suite à l'extinction de la lumière.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des lignées pour optimisation de la gestion des élevages est nécessaire car l'étude de l'habituation chez le poisson zèbre âgé de moins de 5 jours, nécessite d'avoir tous les génotypes possibles analysés en simultanée dans la même expérience. Par exemple pour un simple mutation, en croisant deux poisson +/-, nous aurons des larves âgées de moins de 5 jours ayant les généotypes +/+;+/- et -/-. Le fait de garder, après génotypage, les parents sous forme +/- est le seul moyen, le plus rationnel, d'avoir les larves âgées de moins de 5 jours avec les 3 génotypes voulus.
Procédures
Les poissons agès de 2 mois, seront génotypés par prélèvement d 'une partie infime de leur nageoire caudale afin de ne garder que les individus hétérozygotes. Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson à la Tricaine; un bout de la nageoire caudale sera coupée . Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Les poissons seront placés rapidement dans un bac de réveil rempli d'eau avant d'être transféré dans son aquarium. Cette procédure concerne tous les poissons de cette demande mais seuls le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffre donnés sont donc des maximums et le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons se fera par découpe d'une extrémité de la nageoire caudale d'une surface inférieure à 0.25 mm2 sous anesthésie dans un délai très court. Les nuisances ou effets indésirables, extrêment rares avec ce protocole établi et utilisé en routine, seront visibles au moment de l'endormissement, du réveil (trop long ou visualisé par une nage inhabituelle), des lésions suite à la biopsie ou de la non repousse, dans des cas exceptionneles, de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Tout phénotype inhabituel entrainera la mise à mort immédiate du poisson.
Devenir
Les poissons une fois génotypés seront divisés en deux catégories. Les poissons hétérozygotes seront maintenus en vie pour être mis en croisement afin de faire des expériences d'habituation sur leurs descendants âgès de moins de 5 jours (non sousmis à une demande) et pour être mis en croisement pour obtenir la génération suivante. Les poissons ayant tous les autres génotypes possibles seront mis à mort car nous souhaitons maintenir les lignées sous forme hétérozygote. En effet, ce n'est que par croisement de poissons hétérozygotes entre eux que nosu obtiendrons des larves (non soumis à une dap) ayant tous les génotypes souhaités.
Remplacement
Au niveau du génotypage aucun remplacement n'est possible pour la biopsie de la nageoire caudale. L'étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. Nous utilisons des lignées transgéniques connues pour être impliquées dans l'habituation afin de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu et mieux caractériser l'action de certaines molécules impliquées dans les défauts de mémoire. Aucun modèle cellulaire in vitro ne peut se substituer à cette étude.
Réduction
Nous faisons une nouvelle génération que les 8 à 10 mois (au lieu de tous les 6 mois) ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre de générations. Un nombre minium de 20 individus est élevé pour maintenir la lignée et obtenir des alevins. Ce chiffre permet d'avoir suffisament de mâles et femelles pour les accouplements. Seul le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffres donnés sont donc des maxima. Nous ne gardons que les poissons hétérozygotes (au lieu de garder des +/+ et -/-) car en le croisant entre eux nous obtenons tous les génotypes voulus pour vos expériences sur des larves de moins de 5 jours. Les études sur la mémoire se font sur des larves âgées de moins de 5 jours, non soumises à une DAP. Les poissons possèdent deux ou trois mutations, nous permettant ainsi de ne pas maintenir des lignées avec une seule mutation. Les lignées non utilisées dans le futur seront cryoconservées.
Raffinement
Tout poisson, quel de soit sont stade de développement, qui présente un comportement anormal, ou un signe de mal être a ou un des points limites tels que problème de flottabilité, immobilité, mouvements anormaux, scoliose, siphose, femelle avec ventre rempli d'oeufs, sera mis à mort immédiatement. Les poissons sont maintenus dans les aquariums en nombre suffisant pour leur permettre de se déplacer en banc. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. Le prélèvement pour le génotypage sera le seul geste invasif fait sur les animaux et une seule fois dans leur vie. Lors du processus de génotypage, les poissons sont maintenus par deux par bac de 700 ml un minimum de temps ne dépassant pas 48h. Durant ces 48h, les poissons sont maintenus deux par deux dans les bacs avec un séparateur entre les deux afin de pouvori les identifier suite au génotypage.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal modèle facile à élever (animal petit, robuste, possédant d'excellentes capacités de reproduction). De plus, 70% des gènes du poisson zèbre ont un équivalent chez l'homme. Enfin, ce génome s'est montré facilement manipulable, ce qui a conduit à la création de milliers de mutants dont ceux utilisés dans ce projet. Les études comportementales associées à des approches d’imagerie sur l’organisme entier, à une résolution pouvant atteindre l’échelle cellulaire (poisson optiquement transparent jusqu'à 4 semaines) fait du poisson zèbre un modèle pertinent. Ces approches d'étude de comportement à haut débit et l'imagerie sur animal entier, ne sont absolument pas applicables en routine sur d'autres modèles vertébrés ce qui fait du poisson zèbre comme modèle vertébré un modèle idéal. Du plus il s'agit d'un modèle dont le cerveau est relativement simple comparativement à d'autres modèles et il est donc plus facile d'obtenir des résultats interprétables Les lignées sont déjà établies. Les génotypages des adultes pour chaque génération se feront au stade 2 mois. A ce stade les poissons sont assez grands pour que le génotypage de la nageoire caudale se fasse sans séquelle, celle-ci étant assez développée
Etude de la connectivité écologique intra-lagunaire : suivi télémétrique RFID des déplacements de l’anguille européenne
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturées dans une lagune au verveux ou à la pêche électrique, qui les paralyse quelques secondes, 1600 anguilles européennes sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe par un bac obscur, un bain anesthésiant de cinq à quinze minutes, une injection analgésique, puis l'ouverture de l'abdomen pour y implanter un transpondeur RFID, refermée par un pansement. Toutes sont remises à l'eau après un réveil surveillé, ce que le porteur juge "primordial" pour l'objectif de l'étude, savoir par où et quand les anguilles argentées repartent vers la mer. Sur le remplacement, il écrit seulement que l'étude portant sur le comportement en milieu naturel, elle ne peut pas "s'affranchir de l'emploi de poissons sauvages", l'espèce étant classée en danger critique d'extinction.
Objectifs
L’anguille européenne est classée « critiquement menacée d’extinction » depuis 2008 par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN) et est inscrite depuis 2009 à l'annexe II de la convention sur le commerce international des espèces de faune et flore sauvages menacées d'extinction (CITES). Des plans de gestion au niveau national et par bassin hydrographique fixent des objectifs pour évaluer le nombre d'individus qui colonisent (recrutement des civelles - juvéniles qui arrivent de la mer) et le nombre d'individus qui s'échappent (dévalaison des anguilles argentées - adultes qui repartent en mer pour aller se reproduire). Ce projet de suivi télémétrique a pour objectifs d'améliorer la connaissance relative aux déplacements de l'anguille à l'intérieur d'un système lagunaire et notamment de mieux caractériser sa migration de dévalaison : par où et quand l'anguille argentée cherchent-elles à repartir en mer ? Ces résultats permettront d'identifier des mesures de gestion pour faciliter son retour en mer.
Bénéfices attendus
L'utilisation de la télémétrie RFID (Radio-frequency identification) permet d'enregistrer in situ le passage d'individus identifiés avec une puce de marquage à des points clés du système étudié. Les résultats permettront de connaître les périodes auxquelles les anguilles argentées cherchent à repartir en mer, les voies empruntées, les éventuels obstacles à la migration et l'identification des facteurs environnementaux d'influence. Les résultats de cette étude permettront de plus d'évaluer l'efficacité d'un projet de restauration de continuité écologique. À terme ces résultats permettront d'affiner la gestion des ouvrages de connexion entre les marais et les étangs, et de faire des recommandations pour d'éventuels projets altérant les continuités hydroécologiques.
Procédures
Capture dans un verveux (nasse) : relève toutes les 24h approximativement, ou capture par pêche électrique : paralysé quelques secondes. Facultatif : Si trop de captures, mise en couve jusqu'à 3 jours maximum. Stabulation dans un bac obscur et aéré : de 5 min à 4h Bain anesthésiant: 5 à 15min Injection analgésique : 2 s Marquage avec une fermeture de la plaie à l'aide d'un pansement hydrofuge : 2 à 5 min Phase de réveil sous surveillance : de 10 à 30 min Stabulation avant relâcher : de 5 min à 2h
Impact sur les animaux
La capture par pêche, leur stabulation dans des bacs, leur anesthésie, la réalisation des mesures biométriques, le marquage par laparotomie, la phase de réveil et de stabulation avant remise à l'eau sont autant d'étapes sources de stress pour les animaux. Une mise en couve des individus (10 par couve) dans leur milieu naturel jusqu'à 3 jours maximum pourra être éventuellement pratiquée, si les captures sont trop nombreuses, ne permettant pas de traiter tout le même jour. Un individu traité sera gardé dans des bacs obscurs avec aération jusqu'à maximum 8h avant d'être relâché dans son milieu d'origine.
Devenir
L’ensemble des animaux sera remis en liberté à la suite de leur marquage, ce qui est primordial pour répondre à l’objectif de l’étude.
Remplacement
L’étude portant sur le comportement de poissons en milieu naturel, l’expérimentation doit être réalisée avec des individus capturés dans le milieu, et ne peut donc s’affranchir de l’emploi de poissons sauvages.
Réduction
L’enjeu de l’étude est de comprendre les déplacements des anguilles supérieurs à 30 cm en fonction de la variation des conditions environnementales, de pouvoir prédire les pics de migration (nombre élevé d'anguilles argentées qui dévalent à la même date) et d'identifier d'éventuels obstacles à la migration. De plus, le marquage des individus permet de récolter des données de capture-marquage-recapture (CMR), des données indispensables pour évaluer les paramètres de dynamique de population (par exemple taux de survie et indice d'abondance). Pour que les modèles de CMR soient robustes et représentatifs de la réalité, il est nécessaire de maintenir un effort de marquage significatif à un pas de temps constant dans le temps sur une période qui couvre le temps de croissance de plusieurs générations. Ainsi, les conclusions attendues par ce présent projet, sur l’étude comportementale de l’anguille, ne peuvent pas s’affranchir de l’emploi des poissons. Au maximum, ce seront 1600 individus au total qui seront marqués sur les 2 années du projet.
Raffinement
Le marquage des individus s'effectue sous anesthésie (benzocaïne) et analgésie (lidocaïne). Pour limiter la surinfection postopératoire, le marquage sera procédé lorsque les températures de l’eau n’excèdent pas 16°C, soit sur la période d'octobre à avril. Les bacs de stabulation seront noirs, de manière à favoriser l'obscurité et diminuer le stress des individus pendant les phases de stabulation (avant leur traitement et pendant la phase de réveil). La densité des individus par bac sera limitée à 0.17kg/L (soit 7kg pour 40L). Et les bacs seront brassés par des aérateurs pour favoriser l'oxygénation de l'eau. Les bacs seront placés à l'ombre pour éviter que l'eau se réchauffe excessivement. Une fois un individu marqué, il pourra être détecté en continu à divers points de passage grâce à des stations d'écoute installée dans le milieu naturel. Le suivi télémétrique constitue un moyen de raffiner le suivi en capture-marquage-recapture, puisqu'il permet de suivre à distance le déplacement d'individus marqués (de recapturer leur signalement) sans avoir à les manipuler à nouveau.
Choix des espèces
L’anguille européenne est une espèce migratrice amphihaline catadrome qui présente un cycle de vie unique, et qui est actuellement menacée d'extinction. Afin de mieux comprendre ses déplacements au sein de système, la dynamique de sa phase de dévalaison, et mettre en place des dispositions pour favoriser sa migration retour en mer, il est indispensable d’étudier des individus de cette espèce. Les anguilles supérieures à 30 cm et ayant un poids suffisamment important (>40g) pour supporter l’implantation d’un transpondeur de 23 mm sans affecter leurs constantes vitales seront utilisées. Il s’agit de stades jaune ou argenté de l’anguille. Les individus de 30 cm qui pèsent au minimum 40 g sont marqués avec des transpondeurs de 23 mm qui ont une masse de 0.6 g. L’impact du transpondeur est négligeable lorsque sa masse est inférieure à 2.5% de celle du poisson, ce qui se vérifie ici.
Impact environnemental d’un rejet d’une eau de production industrielle (saumure) : détermination de sa toxicité chez une espèce de poisson plat, le turbot.
- Protection de l’environnement
Transférés à l'épuisette dans des bacs d'exposition, des turbots juvéniles de trois mois, pesant 2 à 3 grammes, passent jusqu'à 96 heures dans une eau de mer salée de 40 à 70 g/L selon les groupes, les 30 témoins restant à 35 g/L. Ces tests de concentration létale, imposés par la réglementation, visent d'abord à trouver la salinité qui tue 10 % des poissons. 10 autres turbots sont ensuite exposés à cette salinité dans une saumure à 30 °C, chargée de phosphonates et de sous-produits de chloration, pour mesurer l'effet des rejets d'une future production d'hydrogène couplée à l'éolien en mer. Au total, 110 turbots, des poissons plats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, avec des troubles de l'équilibre hydrominéral et une accélération de la respiration qui peuvent durer jusqu'à la fin de l'essai. Tous les turbots sont mis à mort à l'issue, et les tissus des témoins sont utilisés pour des dosages enzymatiques.
Objectifs
La production d’hydrogène couplée à de l’éolien en mer soulève un grand nombre de questions sur l’impact environnemental potentiel des rejets d’eau de production associés à ce procédé. Ce rejet est constitué d’une saumure très salée, concentrée en différentes substances chimiques et dont la température est supérieure à celle du milieu aquatique environnant. La règlementation impose d’évaluer l’impact de ces rejets sur l’environnement en réalisant des tests de concentrations létales de ces rejets sur des poissons selon des normes internationales. Dans ce projet, les tests seront réalisés sur des turbots. Etant donné la composition complexe de cette saumure, deux étapes seront nécessaires dans ce projet. La première va être de déterminer les effets d’une sur-concentration en sel dans l’eau de mer. La concentration la plus forte en sel retrouvée dans la saumure sera d’abord testée. Puis, la concentration en sel induisant une mortalité de 10% sera déterminée. La seconde étape sera d’exposer les poissons à une saumure (température élevée et substances chimiques) présentant la concentration en sel induisant une mortalité de 10% et définie dans l’étape 1.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’anticiper les risques environnementaux potentiels consécutifs au déploiement d’une nouvelle technologie (production d’hydrogène sur des champs d’éoliennes en haute mer) correspondant à la volonté publique de décarbonation des activités industrielles. Ces travaux vont ainsi fournir des informations cruciales sur la sensibilité d’une espèce de poisson modèle à la principale pression environnementale liée au déploiement de cette technologie. Plus globalement, les résultats obtenus dans cette étude serviront à caractériser l’impact environnemental du rejet lié à cette production d’hydrogène via une analyse du risque chimique selon la méthodologie décrite dans les normes internationales. Cette étude servira de base à la réflexion des séquences ERC (Eviter, réduire, Compenser) préalable à toute étude d’impact environnemental d’une activité industrielle.
Procédures
Chaque poisson sera exposé à une saumure pendant au maximum 96 heures et une seule fois. 110 poissons seront utilisés dans ce projet. Parmi ces 110 poissons : - 30 poissons témoins seront exposés à une salinité de 35g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 70g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 40g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 45g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 50g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 55g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 60g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une salinité de 65g/L de sel et une témpérature de 18°C . - 10 poissons seront exposés à une saumure de salinité correspondant à la concentration entrainant la mortalité de 10% des poissons (déterminée précédemment), une témpérature de 30°C, 2mg/L de phosphonates et 5mg/L de sous-produits de chloration.
Impact sur les animaux
Le transport des poissons dans une épuisette du bac de stabulation aux bacs d'exposition peut induire un stress d’intensité faible et qui dure au maximum 1 minute. Concernant les nuisances des eaux de salinités croissantes et de l’exposition à la saumure, nous pouvons émettre l’hypothèse que des effets indésirables de gravité légère à sévère (difficultés à maintenir son équilibre hydrominéral, modification du métabolisme, se traduisant au niveau symptomatique par une augmentation de la fréquence et de l’amplitude des mouvements ventilatoires) allant au maximum jusqu’à 96h (fin de l’essai) peuvent apparaître.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les animaux exposés ne peuvent pas être utilisés dans le cadre d'autres procédures. Les témoins sont mis à mort et leurs tissus utilisés pour des dosages enzymatiques.
Remplacement
Des analyses de toxicité seront effectuées à l’échelle cellulaire pour permettre d’obtenir des informations sur les effets toxiques des différents éléments des saumures. Elles nous permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués mais ne pourront pas remplacer les observations réalisées à l’échelle de l’organisme. A l’heure actuelle, il n’y a pas de données bibliographiques sur les effets de cette saumure qui impacte tous les niveaux trophiques en milieu naturel. Notre travail global aura pour finalité d’apporter des données complémentaires concernant des microalgues, crevettes, bivalves et sur notre modèle poisson, qui fait l’objet de cette demande de projet expérimental. Chaque niveau apporte des données complémentaires car l’impact des saumures ne sera pas le même en fonction de la capacité d’osmorégulation des organismes : ces travaux expérimentaux seront menés en parallèle les uns des autres.
Réduction
Cette procédure se base sur les normes internationales dont les différentes modifications et mises à jour depuis sa création ont permis de réduire au maximum le nombre d’individu nécessaire à l’obtention d’un résultat fiable scientifiquement et statistiquement.
Raffinement
Les bacs de stabulation bénéficieront d’un enrichissement environnemental structurel approprié par ajout de différentes cachettes et un enrichissement occupationnel par la mise en place de courants d’eau variés. Un enrichissement sensoriel sera mis en place par la création de différentes zones d’ombre dans le bac. Dans les bacs d'exposition, seuls les enrichissements occupationnels par courant d’eau et sensoriels (ombre) seront conservés. Le raffinement spécifique aux procédures expérimentales mises en œuvre consistera, pour les animaux exposés à l’eau de mer sur-salée comme à la saumure, à aménager une phase de transition pendant laquelle la composition et/ou la température de l’eau seront progressivement modifiées pour ne pas produire de choc osmotique et thermique trop importants.
Choix des espèces
Le turbot est une espèce de poisson modèle en écophysiologie et en écotoxicologie. Grâce à la maitrise de son cycle de vie, le turbot est une espèce importante en pisciculture et permet à la recherche expérimentale de disposer d’individus issus d’élevage à tous les stades de son cycle de vie. La norme internationale utilisée dans le cadre de ce projet est applicable à l’espèce choisie. Les procédures seront réalisées sur des individus juvéniles âgés de trois mois, d’un poids d’environ 2 à 3g et une taille approximative de 50 mm. L’étude sur le stade de juvénile est requis dans les normes internationales. Les juvéniles de poissons sont couramment utilisés en écotoxicologie en raison de leur plus forte sensibilité aux variations de certains paramètres environnementaux comme la présence de substances chimiques. L’élevage du turbot a mis en évidence sa forte sensibilité aux différences de température et de salinité lors des premiers stades de son cycle de vie post-métamorphose.
Effets de la pollution sur une espèce invasive de poisson (la gambusie : Gambusia holbrooki) et influence sur la dynamique des écosystèmes aquatiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Issues de populations de rivières plus ou moins polluées, des gambusies sont placées dans trente-deux bassins de 1 100 litres où elles se reproduisent sur deux générations. 2 464 poissons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils passent trois mois exposés à un mélange de polluants à dose environnementale, puis sont repris au piège pour être mesurés avant la mise à mort et la dissection de leurs foies. Le porteur écrit que le remplacement n'est pas possible parce que l'étude porte sur une chaîne alimentaire entière, et que le statut d'espèce invasive de la gambusie interdit de relâcher les survivants.
Objectifs
La pollution chimique par l’agriculture, les industries ou d’autres activités humaines est une cause majeure du déclin de la biodiversité. C’est particulièrement vrai dans les rivières qui concentrent toutes ces pollutions (par ruissellement et lessivage des sols, rejets, etc...). Il a été démontré récemment que certaines espèces de poissons de rivières pouvaient s’adapter à certains de ces polluants chimiques, leur permettant ainsi de continuer à vivre dans des milieux pollués. Ces adaptations sont extrêmement rapides (quelques dizaines d’années), ce qui posent la question des mécanismes mis en œuvre au cours de ces adaptations. Par ailleurs, on ne sait pas dans quelle mesure ces adaptations modifient certaines caractéristiques des poissons comme leur capacité à consommer leurs proies, ce qui pourraient en retour modifier l’équilibre des écosystèmes de rivières. L’objectif général du projet est d’étudier les mécanismes de l’adaptation des poissons à la pollution et les conséquences des adaptations pour l’équilibre de l’écosystème. Nous travaillerons sur une petite espèce de poisson qui est une espèce exotique envahissante, établie en France (la gambusie) et qui a colonisé avec succès des rivières pouvant être très polluées. Pour cela nous testerons, dans des écosystèmes artificiels, des poissons de différentes origines (rivières polluées ou non) réagissant différemment à des cocktails de polluants représentatifs des milieux naturels et si ces réactions -par effet cascade- affectent l’équilibre et le fonctionnement des écosystèmes.
Bénéfices attendus
Les données générées seront suffisantes pour produire, à une échéance des 3 années du projet, des avancées significatives dans le domaine de l’écologie scientifique sensu lato. En particulier, ce projet permettra de mettre en évidence les effets directs (écotoxicité) et indirects de la pollution aquatique sur l’adaptation d’une espèce invasive. Il permettra aussi de documenter l’impact de la gambusie sur la dynamique de son écosystème en fonction du niveau de pollution. Bien que cette espèce soit invasive, ces recherches pourront aussi bénéficier à la conservation et la gestion de populations de poissons natifs, puisque nous aurons de meilleures connaissances quant à la possibilité d'adaptation/résilience de ces organismes dans les écosystèmes dégradés pas les humains.
Procédures
Sans un premier temps, les poissons seront soumis à un stress écotoxicologique non-léthal (mélange de polluants) et à dose environnementale pendant une durée 3 mois. Durant cette période, les poissons seront capturés à l'aide de pièges à vairons (types de nasses) afin de les mesurer avant le début de l’exposition aux polluants et avant leur euthanasie en fin de protocole. La capture se fait sur une période courte, les pièges sont installés pendant environ une heure dans chaque système espérimental.
Impact sur les animaux
Le maintien en mésocosmes pourrait être une source de stress pour les animaux. Néanmoins, compte tenu de la grande taille des bacs (1100 litres), la faible densité de poissons par bac (au max 3g pour 100 litres) et l'abondance de nourriture et de caches, les gambusies pourront exprimer leurs comportements sociaux et alimentaires naturels. Par ailleurs, la productivité des bacs et les échanges à l’interface air-eau sont suffisants pour maintenir un niveau d’oxygénation suffisant au bien-être des poissons et représentatif du milieu naturel. Les conditions de l’eau dans les mésocosmes peuvent légèrement différer des conditions naturelles mais les gammes attendues dans les mésocosmes sont totalement cohérentes avec les gammes mesurées en milieu naturel. De plus, les gambusies tolèrent naturellement des gammes extrêmes de conditions physico-chimiques donc nous ne nous attendons pas à ce que ces faibles variations de conditions génèrent un stress. Le stress liés à l'exposition aux polluants et à la capture sont considérer comme léger car (i) il s'agit de doses de polluants que les poissons rencontrent dans l'environnement et (ii) la capture se fait avec un nombre réduit de manipulation sur les poissons.
Devenir
S'agissant d'un espèce invasive, elle ne peut pas être relâchée en milieu naturel. Par ailleurs, compte tenu des besoins de l'étude, les individus seront disséqués post-mortem pour l'analyse des foies. Les individus seront donc euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
Pour tester expérimentalement l’effet combiné de la pollution et des espèces invasives sur la chaine trophique et sur le fonctionnement de l’écosystème, l’utilisation d’animaux est requise et le remplacement n'est donc pas possible. Compte tenu du caractère empirique et fondamental du projet, l’outil de modélisation mathématique et l’utilisation de modèles artificiels ne sont pas pertinents.
Réduction
Le nombre d’individus et de réplicats de mésocosmes prévus se base sur des travaux antérieurs effectués sur ces mêmes infrastructures pour explorer des thématiques similaires. Concernant les effets écosystémiques, l’effectif utilisé dans les analyses statistiques correspond au nombre total de mésocosmes utilisés et requiert donc une importance primordiale. Le traitement statistique à postériori sera basé sur des équations structurelles permettant d’étudier des relations linéaires complexes nécessitant une taille d’échantillon 10 réplica par lien statistique testé. Étant donné que nous disposons au total de 32 mésocosmes, entre 3 et 4 liens pourront être testés dans cette expérience, ce qui est suffisant étant donné le nombre réduit de paramètres d’intérêts (richesse et abondance des invertébrés benthiques et pélagiques, taux de décomposition de la litière). Compte tenu d'études antérieures, il s'avère que pour obtenir un effet mesurable de l’abondance de poissons sur les paramètres écosystémiques, le nombre minimal de poissons est de 20 individus pour 1100 litres (20*32 = 640 individus au total).
Raffinement
Les mésocosmes de 1100 L sont utilisés pour l’étude des effets à long terme sur les écosystèmes aquatiques. Ces dispositifs simulent des conditions naturelles avec un habitat complexe (graviers, abris solides, plantes naturelles) avec une faible densité de poissons. La nourriture (zooplancton et macro-invertébrés) est en quantité suffisante pour assurer une croissance positive des adultes et des juvéniles. Un élevage pilote préliminaire a montré que G. holbrooki est une espèce résistante au stress qui se prête très bien à la captivité et aux expériences multigénérationnelles. Elles se reproduisent très bien en captivité et expriment leur comportement dans ces conditions. Néanmoins, le comportement naturel des populations originaire de zones non polluées peut être affecté par les doses de polluants environnementales retrouvées dans les milieux non pollués.
Choix des espèces
La gambusie (Gambusia holbrooki) est une espèce invasive largement répandue dans l’ensemble du sud de la France et qui impacte fortement les espèces non invasives présentes dans ces milieux pouvant alors causer des altérations du fonctionnement des écosystèmes. Cette espèce peut supporter une grande amplitude de changements environnementaux (salinité, température, pollution) et elle s’adapte rapidement à de nouvelles conditions. C’est un modèle de choix en écologie évolutive avec un temps de génération réduit. Présente en abondance dans les milieux naturels variés (fortement et peu pollués), c’est l’espèce la plus pertinente pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux introduits dans les mésocosmes seront au stade adulte pour pouvoir contrôler le nombre d’individus de chaque sexe (5 mâles et 2 femelles par mésocosme). Les femelles seront gravides afin de rapidement générer des F1 (environ 10 individus par femelles, soit environ 50 individus F1 par mésocosmes qui produiront ensuite environ 640 individus F2).
Rôle de forces mécaniques dans le développement du système nerveux chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux, 3 120 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 180 d'entre eux. Une partie subit un prélèvement de nageoire caudale pour génotypage et un prélèvement de gamètes sous anesthésie, gestes dont le porteur reconnaît qu'ils peuvent être douloureux au réveil. D'autres sont exposés trente minutes à des molécules odorantes dont certaines sont connues pour leur effet répulsif, ou immobilisés une heure pour l'imagerie de l'activité neuronale, l'isolement lié au génotypage et à l'analyse de nage étant lui aussi compté comme une nuisance. Les poissons sont tués par excès d'anesthésiant ou par refroidissement rapide, faute de porter le génotype voulu, à la limite d'âge de 24 mois fixée par l'animalerie ou en fin d'expérience, à l'exception de 360 gardés en vie pour des projets ultérieurs.
Objectifs
Nous étudions le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux. Les mouvements cellulaires sont omniprésents dans le développement des circuits neuronaux : dans l’embryon, les neurones migrent vers leur destination finale et forment de longues protrusions qui s'allongent avant de se connecter au niveau des synapses. L'étude de ces processus s'est jusqu'ici focalisée sur les signaux chimiques qui guident la migration neuronale et la navigation des axones. Or les mouvements des neurones et de leurs protrusions sont aussi influencés par des forces mécaniques, dont la fonction reste largement inconnue in vivo. Disséquer le rôle des forces mécaniques dans l'assemblage des circuits neuronaux représente donc un défi majeur pour les neurosciences modernes.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur la construction du système nerveux en mettant en lumière l'importance des signaux mécaniques, contribuant ainsi à une meilleure compréhension du développement neuronal. Au-delà de son impact fondamental en neurosciences, ce projet a des implications biomédicales dans l'étude de l'origine des maladies du système nerveux et la bioingénierie des tissus. Ici, nous nous concentrons sur la contribution des forces mécaniques dans la migration neuronale et la croissance des axones, deux événements clés de la construction des circuits neuronaux. Si l'un de ces deux processus ne se produit pas correctement, la fonction du système nerveux est affectée, comme en témoignent les troubles neurodéveloppementaux graves résultant de défauts de migration neuronale et de formation des axones, tels que les lissencéphalies, le retard mental, les épilepsies et le syndrome de Kallmann. La contribution des forces mécaniques dans l'origine de ces maladies est loin d'être comprise et nécessite plus d'attention. De plus, décrypter la réponse des neurones aux signaux mécaniques in vivo fournira des informations précieuses pour la conception de systèmes de culture neuronale et d'échafaudages 3D associés dédiés à la réparation du cerveau et de la moelle épinière. Nos travaux alimenteront ainsi potentiellement les développements futurs en ingénierie biomédicale pour aider à traiter à long terme les lésions du cerveau et de la moelle épinière.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des prélèvements de fragments de nageoire pour identification génétique (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 3 minutes), à des prélèvements de gamètes pour préservation des lignées (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 10 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse du comportement de nage sur animaux vigiles (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse de l'activité des neurones par microscopie sur animaux immobilisés (durée de l'immobilisation : 60 minutes, durée de l'imagerie pendant la stimulation avec des molécules odorantes : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes sur animaux vigiles suivie d'une euthanasie par refroidissement rapide (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 5 minutes), à une euthanasie par excès d'anesthésiant (1/poisson).
Impact sur les animaux
La substance appliquée aux poissons pour l'anesthésie et l’euthanasie provoque un comportement d'aversion et/ou de stress. De plus, même s’il se fait sous anesthésie, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale (fin clip) peut générer une douleur après le réveil, ainsi que le prélèvement du sperme et des ovocytes. L’isolement des poissons au moment du génotypage par fin clip ou de l’analyse de la nage représente également une nuisance. Enfin, certains stimulis odorants que nous allons utiliser sont connus pour avoir un effet répulsif sur les poissons, ce qui peut stresser les animaux. L’immobilisation des animaux pour l’imagerie de l’activité neuronale peut également stresser ou générer un inconfort chez les larves analysées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures décrites dans ce projet, exceptés pour 360 d’entre eux qui seront gardés en vie et réutilisés pour des projets ultérieurs dédiés à de nouvelles études du développement de la fonction olfactive chez le poisson-zèbre. Les poissons seront euthanasiés parce qu'ils ne portent pas le génotype d'intérêt, parce qu'ils ont atteint la limite d'âge imposée dans l'animalerie (24 mois), ou en fin de procédure expérimentale (après stimulation olfactive et analyse du comportement de nage ou de l'activité des neurones - il est impossible de les ré-utiliser car ils seront sortis physiquement du système d'élevage, et après stimulation olfactive pour prélèvement/analyse du cerveau sur échantillons fixés).
Remplacement
L’expérimentation sur le poisson-zèbre est essentielle pour répondre à notre question scientifique, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus complexes qui sous-tendent le développement du système nerveux et la contribution des forces mécaniques. L'utilisation du poisson-zèbre comme modèle est notamment essentielle pour étudier les interactions mécaniques entre les neurones en développement et les tissus environnants, car de telles interactions sont encore très difficiles à reproduire in vitro.
Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place, lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des embryons à des stades précoces (avant 5 jours). Pour chaque expérience, le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, grâce à un calcul de puissance. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux employés dans le projet est de 3120.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’élevage des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28 degrés, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2 ou 3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet d’exprimer leur comportement de chasse/prédation. Les étagères pour les bacs de croisements sont recouvertes de posters figurant des galets, de manière à diminuer le stress généré par le changement d’environnement/d’étagères pendant les croisements. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Nous allons mettre en place la congélation de sperme pour conserver les lignées qui sont transitoirement inutilisées. Outre le gain de place, ceci évite de renouveler les lignées et de procéder à des expériences de génotypage qui produiraient des animaux sauvages qu’il faudrait ensuite euthanasier. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de modification du génome en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse (comprendre comment les organes acquièrent leur forme et leur fonction) et de développement du système nerveux. Pour produire des animaux mutants, nous réalisons une micro-injection dans l’embryon au stade 1-4 cellules. Nous suivons les animaux aux stades larvaires, juvéniles et adultes sur plusieurs générations (sur 5 ans : 3 générations) pour détecter toute anomalie potentiellement nuisible dans les poissons injectés ou porteurs d’une mutation. Quand cela est nécessaire nous génotyperons (génotyper signifie analyser l'ADN) les poissons adultes de nos lignées par prélèvement d’un fragment de nageoire. En effet, il n’est pas toujours possible de réaliser le génotypage aux stades précoces c’est à dire avant 5 jours (incompatibilité avec le calendrier et/ou les expériences) et nous devons dans ce cas effectuer le génotypage à partir de 3 mois. Les prélèvements de sperme et d’ovocytes se font à l’âge adulte. Les tests comportementaux consistant à exposer les poissons à des odeurs puis analyser leur nage seront réalisés aux stades juvénile et adulte. En effet, c’est à partir du stade larvaire que le système olfactif commence à être fonctionnel et en état de répondre aux odeurs. L’analyse de l’activité des neurones par imagerie sera réalisée au stade larvaire. C’est à partir de ce stade que le système olfactif commence à être fonctionnel. Nous exposerons des poissons juvénile et adulte à des stimuli odorants puis nous les euthanasierons par choc thermique avant de réaliser des analyses sur leurs cerveaux fixés.
Rôle de la farine de krill dans la résistance au stress hypoxique chez la truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries douze semaines avec quatre aliments expérimentaux contenant de la farine de krill, pesées cinq fois en lot, 720 truites arc-en-ciel passent de 30 à 200 grammes. La moitié est alors tuée dans un bain d'anesthésiant, sang, foie, muscle, fèces et carcasse prélevés. Les 360 restantes sont maintenues trois semaines de plus dans une eau appauvrie en oxygène, obtenue en baissant le niveau et le débit d'eau pour augmenter la densité, avant d'être tuées de la même façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur attend un pompage operculaire excessif, une nage désorientée et une remontée en surface avec tentatives de fuite, tout en écrivant qu'aucun signe de stress grave ne devrait apparaître, l'objet étant d'optimiser un aliment pour la première espèce piscicole produite en France.
Objectifs
Les salmonidés sont sensibles à un faible niveau d'oxygène dissous (OD), qui doit être supérieur à 7 mg/L dans les fermes piscicoles. Bien que les niveaux d'OD soient étroitement surveillés, des baisses soudaines et temporaires peuvent se produire pour de multiples raisons : hausse de la température de l'eau, de la densité de poissons dans les bassins mais également lors des manipulations des poissons. Une limite inférieure aiguë de 4,0 mg/L d'OD a été définie pour les systèmes de production de salmonidés. Ces baisses d’OD risquent de se produire plus fréquemment dans les années à venir en raison des températures extrêmes associées au changement climatique, ce qui peut poser des problèmes de bien-être et de performance. L’apport optimisé de micronutriments anti-oxydants tels que sélénium, la vitamine C et l’astaxanthine peut faire partie d'une stratégie de gestion préventive du stress dans les exploitations piscicoles. Des travaux ont montré qu’une supplémentation en sélénium, un anti-oxydant, dans un aliment à base de farines végétales améliorait la résistance au stress hypoxique des alevins de truite arc-en-ciel et des études ont suggéré une sensibilité au stress oxydant différente entre mâles et femelles. La farine de krill pourrait être un ingrédient fonctionnel intéressant du fait de sa richesse en anti-oxydants. Plusieurs études ont par ailleurs souligné les effets bénéfiques du remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill sur la qualité de la chair, la croissance et la santé des poissons. Ce projet a donc trois objectifs : 1) étudier l'impact du remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill sur les performances des truites arc-en-ciel juvéniles nourries avec un aliment à base de protéines végétales, 2) étudier l'impact nutritionnel de la farine de krill sur les défenses anti-oxydantes des truites en situation d'hypoxie, 3) étudier l’impact du sexe des poissons sur les performances de croissance et le métabolisme du stress.
Bénéfices attendus
Il est difficile d’éviter des baisses soudaines et temporaires des niveaux d'OD qui peuvent rapidement entraîner des mortalités massives, événements qui risquent de se produire encore plus fréquemment dans les années à venir en raison des températures extrêmes associées au changement climatique. Comme les poissons capturés ne peuvent échapper à des conditions d'élevage sous-optimales, cela peut poser des problèmes de bien-être et de performance avec des croissances et des consommations alimentaires plus faibles ainsi qu'une augmentation des paramètres liés au stress oxydant. Les micronutriments tels que le sélénium, la vitamine C et l’astaxanthine interviennent dans le métabolisme anti-oxydant et leur apport optimisé peut faire partie d'une stratégie de gestion préventive du stress. Les besoins en anti-oxydants nutritionnels dans les aliments piscicoles modernes à base d’ingrédients végétaux ne sont pas clairement identifiés par rapport aux aliments traditionnels riches en ingrédients marins où les farines et huiles de poissons sont progressivement remplacées par des ingrédients plus durables. En effet, cette transition crée de nouveaux défis car les recommandations nutritionnelles pour la plupart des vitamines et minéraux sont largement basées sur les aliments traditionnels et peuvent désormais s’écarter considérablement dans les nouveaux aliments alternatifs. Les données issues de ce projet devraient permettre de mieux caractériser le rôle de la farine de krill dans le métabolisme du stress chez les mâles et femelles de truite arc-en-ciel, première espèce piscicole produite en France. Les niveaux de remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill ont été sélectionnés car décrits comme bénéfiques pour la chair, la croissance et la santé des poissons mais leurs effets sur la résistance au stress hypoxique ne sont pas connus. Une meilleure résistance au stress hypoxique des poissons d’élevage par une alimentation optimisée devrait permettre d’améliorer le bien-être et les performances de poissons.
Procédures
-Un total de 720 truites de 30 g sera nourri pendant 12 semaines avec 4 aliments expérimentaux contenant différentes teneurs de farine de krill couvrant tous les besoins nutritionnels des truites avec pesée en lot des 12 bassins toutes les 3 semaines, soit 5 pesées en tout sur animaux vigiles (conformes aux pratiques d’élevage). -Parmi ces 720 truites de 30 g nourries pendant 12 semaines, 360 seront euthanasiées au bout des 12 semaines à un poids d’environ 200 g par euthanasie dans un bain de tricaïne à 150 mg/L avec prélèvement de sang (1 mL) et de tissus : nageoires, foie, muscle, carcasses entières ainsi que les fèces. -Les 360 truites restantes de 200 g seront alimentées pendant 3 semaines supplémentaires avec les 4 aliments expérimentaux et soumises à un stress hypoxique chronique avec une teneur en OD de 5 ppm. Elles seront ensuite anesthésiées et euthanasiées dans les mêmes conditions que précédemment à l’issue des 3 semaines en conditions d’élevage hypoxique et les mêmes prélèvements seront réalisés.
Impact sur les animaux
Lors de l'essai nutritionnel, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu du fait de la structure d'élevage adaptée et de la formulation des aliments utilisée. Lors du stress hypoxique réalisé dans les mêmes conditions d’élevage que l’essai nutritionnel mais avec une faible concentration d’OD (5 mg d’oxygène par litre, obtenu sur les 3 premiers jours par diminution du niveau d’eau dans les bassins pour augmenter la densité et diminution du débit d’eau), peu d'effets indésirables sont attendus car le niveau et la durée ont été définies de telle sorte à minimiser le stress. Cependant nous pourrions observer les comportements suivants qui ont été décrits dans la littérature chez des truites en situation de stress hypoxique aigu : pompage operculaire excessif, comportement de nage anormal (par exemple, perte d’équilibre), respiration près de la surface de l’eau avec ou sans tentative de fuite. Il convient de noter qu’aucun signe de stress grave ne devrait être observé chez les poissons car un niveau de 4 ppm est considéré comme la limite inférieure aiguë. Un niveau d’oxygène de 5 ppm est considéré comme un facteur de stress modéré lorsqu’il est testé pendant de courtes périodes.
Devenir
Après élevage des truites dans des conditions classiques optimisées avec des aliments fonctionnels contenant de la farine de krill pendant 12 semaines, la moitié (360 poissons) sera euthanasiée et prélevée pour analyse et l'autre moitié (360 poissons) sera remis en élevage pour 3 semaines supplémentaires en conditions d'élevage hypoxique (OD = 5 mg/L) avant euthanasie et prélèvement pour analyse.
Remplacement
S’agissant d’un essai nutritionnel chez des truites juvéniles et dans le but d’étudier le rôle de la farine de krill sur le métabolisme du stress chez les poissons d’élevage mâles et femelles, l’étude ne peut donc pas être réalisée sur des lignées cellulaires ou par des calculs et des modélisations informatiques.
Réduction
La réduction est un objectif réel, le nombre de poissons prélevé est calculé à minima, compte-tenu de la variabilité individuelle observée dans les essais nutritionnels et les analyses antérieurs, tout en maintenant des conditions d’élevage optimales pour les poissons avec une densité adaptée tout au long de l’essai (30-50 kg/m3). Ainsi le nombre de poissons mis en essai nutritionnel est de 60 poissons par bassin avec 3 bassins par régime alimentaire qui est le nombre standard de réplicats utilisé dans le domaine des essais d’alimentation des poissons. Le nombre de poissons par bassin correspond au minimum requis pour observer un comportement alimentaire normal et permettre d’avoir des nombres représentatifs dans l’analyse prévue. Le plan expérimental est défini de telle sorte qu’un seul échantillon tissulaire permettra d’explorer différents niveaux biologiques : analyse génétique (expression de gènes) et analyses enzymatiques et métaboliques.
Raffinement
Des conditions d’élevage classiques et optimisées seront utilisées : photopériode naturelle, température stable à 17°C +/- 1°C, qualité d'eau optimale avec dégazage (afin d’éliminer l’azote dissous) et niveau d’OD compris entre 8,5 et 9,5 ppm avec un débit adapté de 0,3 litre par seconde permettant un renouvellement de 5 à 7 fois par heure, taille et type de bassins adaptée à la taille des poissons (bassins extérieurs de 80 cm de diamètre et de 50 cm de haut pouvant contenir 150 à 220 L d’eau munis d’un couvercle et demi-couvercle occultant assurant la sécurité des poissons vis-à-vis des nuisibles (oiseaux) et limitant les perturbations liées à l’activité des agents de la pisciculture), densité optimale des truites, nettoyage régulier des bassins lors de chaque pesée toutes les 3 semaines. Les animaux seront nourris manuellement à satiété visuelle. Un suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Lors du stress hypoxique, le comportement des poissons sera étroitement surveillé et des points-limites définis pour éviter toute souffrance grave. Cependant, aucun signe de stress grave ne devrait être observé chez les poissons car un niveau de 5 ppm peut être considéré comme un niveau de stress modéré.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai, en plus de son intérêt scientifique pour l’étude du métabolisme du stress et des défenses anti-oxydantes avec un nombre très important de protéines anti-oxydantes. Animaux au stade juvénile. Le but est de se placer dans des conditions de croissance optimales où l’effet de l’aliment sera le plus visible chez le poisson mais aussi de pouvoir récupérer différents tissus en quantité importante, ce qui justifie cette période et le poids moyen initial de 30 grammes permettant d'atteindre un poids moyen final de 200 grammes.
Santé du juvénile de bar exposé à un scénario de réchauffement climatique d’acidification et de désoxygénation- etablissement n°1
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Jusqu'à 90 % de mortalité dans les bassins lors des épreuves infectieuses : 3 400 bars juvéniles vont être utilisés, dont 1 606 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les survivants étant tous tués pour analyses immunologiques. Pendant dix-huit mois, ils vivent dans une eau réchauffée puis acidifiée, appauvrie en oxygène à 60 % pendant trois semaines, avec une ration limitée à 60 % de ce qui est distribué en aquaculture. Chacun est pêché, sédaté, anesthésié, marqué par une puce implantée dans le muscle, pesé chaque mois et transféré entre bassins. L'infection expérimentale, bactérienne puis virale, provoque déformations de l'œil, lésions cutanées, nage anormale et léthargie, sur des poissons pesant trois grammes au départ, choisis à l'âge où les bars sauvages rejoignent les nourriceries côtières.
Objectifs
Plus de la moitié des espèces connues de poissons vivent en zone côtière ou estuarienne. Les nourriceries en milieu côtier dont dépendent l’accomplissement du cycle de vie et le renouvellement des populations sont, de ce fait, considérées comme des habitats essentiels. De plus, l'élevage des poissons s'effectue également principalement en zone côtière. Or, il est bien établi que les zones côtières et estuariennes sont les plus vulnérables face aux pressions combinées du changement climatique et notamment au réchauffement, à l'acidification et aux épisodes de désoxygénation des océans. Ainsi, la santé des poissons (sauvages ou d'élevage) présents dans ces zones, et notamment leurs capacités à croitre et à se défendre contre les pathologies dépendront de leur capacité à faire face à la combinaison de ces contraintes environnementales en milieu côtier. Les questions abordées dans le projet sont : 1) L’exposition à long terme de juvéniles de bar à des conditions environnementales (température, acidification, oxygénation) prédites à l’horizon 2100 va-t-elle modifier des paramètres physiologiques associés à la santé du poisson ? et 2) ces effets vont-ils modifier leurs performances de croissance, de survie, leur maturation sexuelle et leur résistance à une exposition à des pathogènes ? Ce projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs (EU) qui coupleront leurs expertises.
Bénéfices attendus
A court terme, les différentes analyses de performances et les caractérisations physiologiques réalisées au cours des différentes phases d’exposition donneront une vision globale de la capacité des poissons à faire face à une combinaison de facteurs environnementaux. A moyen terme, les données générées contribueront à déterminer des marqueurs d’exposition à ces différents facteurs environnementaux. Plus globalement, ce projet s’inscrit dans la volonté de mieux comprendre et prédire les interactions des poissons pêchés ou élevés avec leur environnement dans l’écosystème côtier et ainsi élaborer des politiques solides en matière de gestion des pêches et de l’aquaculture dans un contexte de changement global.
Procédures
De 3 à 5 mois, 50 poissons par bassin et par mois, aléatoirement pêchés, seront pesés (sous anesthésie, durée de la pesée par poisson: 1 minute). A partir du cinquième mois, tous les poissons (n=3400) seront pesés mensuellement après avoir été marqués individuellement par injection d'une puce électronique intramusculaire (sous anesthésie). Ces interventions nécessiteront la pêche des poissons. Afin de limiter le stress lié à la manipulation, les poissons pêchés seront sédatés dans leur bac puis anesthésiés. L'intervention de micro-injection n'excèdera pas 5 minutes (pêche, anesthésie, et injection comprises). La durée par poisson d'une intervention de pesée n'excèdera pas non plus 5 minutes. Des transferts entre bassins seront également effectués au cours du projet. Ces transferts se feront sous anesthésie en utilisant des bacs de transferts transitoires opaques et oxygénés. Les étapes de transfert n'excèderont pas 15 minutes. Les conditions de température et d'acidification, prises indépendamment les unes des autres ou en interaction représentent une nuisance légère durant les 15 premiers mois. A 16 mois, la moitié des poissons survivants (non mis à mort pour analyse post mortem) seront placés en niveau d'oxygénation de l'eau à 60% pendant 3 semaines. Nous supposons, sur la base d'études précédentes, que cette exposition représente une nuisance légère dans le contexte de l'élevage (absence de prédation; autres facteurs environnementaux contrôlés). Tous les éléments décrits précédemment seront réalisés dans l’EU n°1. Au début du 18ème mois, l'exposition expérimentale à des pathogènes, nécessaire pour évaluer le statut immunitaire des poissons, constitue une nuisance sévère. L'exposition durera entre 2 et 6 semaines. L’EU n°1 aura en charge un pathogène bactérien et l’EU n°2, vers qui sera transférée une partie des animaux, une bactérie et un virus. Les animaux seront alimentés pendant toute la durée du projet avec un aliment commercial d'élevage et seront rationnés au niveau alimentaire à 60% de ce qui est distribué en aquaculture afin de mieux calquer les réalités écologiques. Ce rationnement ne représente pas une nuisance car il permet aux poissons de croitre à un rythme moindre comparé aux conditions aquacoles standards où l'on vise à diminuer les durées d'élevage.
Impact sur les animaux
Un stress léger pourra intervenir lors de la manipulation des poissons pour estimer la prise de poids mensuelle. A raison d'1mn de stress par poisson pour chaque pesée, la durée de ce stress léger est estimée à 16 mn sur l'ensemble du projet ( x 16 mesures biométriques). Un stress léger pourra aussi intervenir lors du transfert des poissons dans les différents bassins ; au début de l’expérimentation et au cours des étapes d’hypoxie et des épreuves infectieuses avec les différents pathogènes. Pour les transferts intra-structure, la durée du transfert sous anesthésie n'excédera pas 5 minutes. Les lots de poissons qui seront exposés aux prétests et challenges avec les pathogènes viraux et de type vibrio seront transférés au sein du site, dans une structure située à 200 mètres. Le transfert durera 15 minutes et se fera sous anesthésie. Du fait de l' anesthésie, le stress associé aux transferts est léger; de plus, les caractéristiques physicochimiques (températures, pH, salinité) de l'eau des bacs avant et après transferts seront identiques. Les poissons seront alimentés 24h après transfert, délai nécessaire pour leur acclimatation à leur nouveau bassin. Les changements des caractéristiques physicochimiques de l'eau des bassins ne pourront s'effectuer que 48h après transfert. Les conditions abiotiques (température, pH, niveau d’oxygénation) prises indépendamment les unes des autres constituent des stress légers (18 mois) pour les facteurs température et pH ou modérés (3 semaines) pour l'hypoxie modérée. La contrainte hypoxique peut se traduire par une diminution de l’activité de nage des poissons traduisant une dépression métabolique. La durée de l’hypoxie (3 semaines) limite toutefois le risque de forte sévérité ; la mortalité devant être évitée lors de cette étape d’hypoxie, dans le cas contraire, le niveau d’hypoxie pourra être adapté. Un stress léger interviendra au moment des prises de sang (1mn par poisson). Les épreuves infectieuses virale et bactérienne constituent des stress très sévères puisqu’ils induisent l’apparition de signes cliniques (déformation de l'oeil, changement de couleur de robe, lésions cutanées, nage anormale, léthargie, déséquilibre, anorexie) et une mortalité sur les poissons (% de mortalité variable dans les bassins en fonction de la résistance des poissons mais pouvant aller jusqu’à 90%).
Devenir
A l'issue des challenges aux pathogènes, tous les poissons survivants seront mis à mort pour prélèvement et analyse de paramètres immunologiques
Remplacement
Cette étude vise à étudier l'effet de facteurs environnementaux (température, pH, oxygénation) sur l’état de santé du poisson. La caractérisation de ces effets se fait à l'échelle de l'organisme entier. Les méthodes de substitution telles que la culture cellulaire par exemple ne permettent pas de répondre à un questionnement physiologique dépendant de réponses complexes de différents tissus. Le maximum d’analyses sera réalisé au niveau de prélèvements sanguins, ce qui permettra dans le futur de trouver des marqueurs de l’état de santé du poisson. Les épreuves infectieuses sont à ce jour la seule possibilité d’évaluer et de prédire les capacités de résistance des poissons face à des agents pathogènes prévalents dans le milieu environnant (contexte écologique et aquacole); cette capacité de résistance dépend de nombreux facteurs, en particulier de différentes composantes du système immunitaire dans divers organes mais également (par exemple) du statut énergétique du poisson ou encore de son microbiote. Les données obtenues au cours du projet pourront permettre de développer dans le futur des marqueurs (au niveau sanguin et tissulaire) prédictifs des capacités de résistance des poissons face aux pathogènes.
Réduction
Le bar européen juvénile est un animal vivant en groupe et le nombre d'animaux par bac répond tout d'abord à cette contrainte. Le nombre de poissons tient donc compte de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles, et permet donc de répondre à leur bien-être. De plus, le nombre de poissons a été réduit à son minimum et défini en fonction du nombre nécessaire pour réaliser la cinétique de prélèvements (à 6, 9 et 18 mois post-éclosion) ainsi que les épreuves infectieuses expérimentales. Ce nombre tient également compte des taux de mortalités communément observés au cours des 18 premiers mois de vie juvénile. Le nombre de prélèvements prévus a été déterminé en fonction du seuil de la pertinence scientifique et statistique. De même, le nombre de poissons prévus pour les épreuves infectieuses permet de réaliser une analyse statistique de résistance.
Raffinement
Pour la phase 2, les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement, à savoir, un volume d'eau adapté en circuit ouvert avec une oxygénation suffisante en fonction de la biomasse, un rythme jour/nuit naturel, la présence de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche, une distribution d’aliment adaptée. Une importance particulière sera donnée à l’observation des animaux, 1 fois/jour minimum (plus pour suivre l'évolution de poissons présentant des signes de stress). Les infections expérimentales bactériennes ou virales peuvent provoquer une mort rapide sans qu'il soit possible d'observer des symptômes cliniques. Toutefois, pour éviter toute souffrance, les animaux présentant un comportement de nage anormal marqué avec des périodes sur le flanc / sur le ventre et/ou des signes de détresse respiratoire avancée et/ou des hémorragies faciales / au niveau des flancs et/ou des signes nerveux seront mis à mort de manière compassionnelle avec une surdose d’anesthésique.
Choix des espèces
Le bar est une espèce de poisson marin d'intérêts halieutique, aquacole et écologique. La communauté scientifique s'intéresse à mieux prédire l'impact du changement global sur cette espèce. Les poissons sont des juvéniles (non matures sexuellement). Agés d’environ 3 mois, ils pèseront en moyenne 3 grammes au début de l’expérimentation. Ce stade de développement est particulièrement pertinent pour notre étude puisque c'est à ce stade de vie que les poissons regagnent les nourriceries côtières dans la nature et qu’ils sont donc plus exposés aux contraintes environnementales associées au changement global.
Projet d’éradication des poissons du genre Ancistrus en tant qu’Espèces Exotiques Envahissantes (EEE) : test en conditions expérimentales de leur sensibilité au sel en comparaison aux espèces indigènes
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
La mise au point d'une méthode de mise à mort par choc salin conduit à exposer 183 poissons à une eau salée pendant vingt-cinq minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les ancistrus, poissons laveurs de vitres échappés de l'aquariophilie, sont capturés par pêche électrique qui les paralyse, transportés une heure trente, gardés jusqu'à trente heures sans leur alimentation naturelle, puis tués par choc osmotique et hypoxie. 45 individus d'espèces indigènes, cabots bouche-ronde et anguilles, sont soumis au même test à titre de comparaison et seront relâchés dans leur rivière d'origine si leur état clinique le permet. Le porteur compte parmi les bénéfices attendus la proposition d'une nouvelle méthode de mise à mort applicable aux poissons d'eau douce, y compris dans les programmes de pêche commerciale.
Objectifs
Les EEE sont identifiées comme une principale cause de perte de biodiversité à l’échelle Mondiale. Les milieux aquatiques d’eau douces insulaires, malgré leur relatif isolement, ne sont pas épargnés par ces introductions. De plus, dans ces territoires, les milieux aquatiques présentent des conditions hydrologiques et thermiques souvent variées du fait d’une amplitude saisonnière de pluies et d’un gradient altitudinal important. Ainsi, dans ces milieux, on observe l’acclimatation d’espèces aux préférendums très variés, depuis la truite arc-en-ciel (O. mykiss) jusqu’aux tilapias (Oreochromis sp.). Parmi les dernières en date, on note le poisson laveur de vitre (Ancistrus sp.) et la crevette red cherry (Neocaridina heteropoda). Ces espèces non natives sont issues de l’aquariophilie. Leur introduction peut être accidentelle ou malveillante. Ces espèces représentent un risque de compétition avec les espèces indigènes.
Bénéfices attendus
La réalisation d’un choc salin est une méthode de lutte contre les EEE encore non appliquée et innovante. Elle a déjà été évoquée dans le cadre de la gestion d'EEE dans des milieux d'interface, mais n’a jamais été documentée ni étudiée d’un point de vue scientifique. Les bénéfices attendus sont : - Lutte contre Ancistrus sp en tant qu’EEE (réduction voire éradication), à courte échéance ; - Connaissance de la sensibilité des espèces indigènes (amphihalines) pour réplication possible de l'action en lutte précoce sur d'autres EEE (territoires insulaires tropicaux), à courte échéance ; - Développement d’une méthode de lutte reproductible et efficace pour des EEE aquatiques sensibles, à moyenne échéance. - Proposition d’une nouvelle méthode de mise à mort applicable aux poissons d’eau douce, dans le cadre de l’Utilisation d’Animaux à des Fins Scientifiques, ou dans des programmes de pêche commerciale (moyenne à longue échéance).
Procédures
- Capture des individus : paralysie par décharge électrique lors de la pêche électrique (30 secondes) - Transport des individus en contenants fermés jusqu’au laboratoire (1h30) - Captivité dans des bacs d’eau (30h maximum) - Individus privés de l’accès à leur alimentation naturelle (30h maximum) - Exposition à une substance chimique mortelle, le NaCl (25 minutes maximum)
Impact sur les animaux
- Induction d’un choc osmotique et d’une hypoxie potentielle conduisant à la mort des animaux (25 minutes maximum)
Devenir
Tous les individus Ancistrus qui ne seraient pas morts seront euthanasiés. Les individus des espèces poissons cabot bouche ronde et poissons anguille seront maintenus en vie si leur état clinique le permet. Ils seront alors relâchés dans leur milieu naturel où ils avaient été prélevés initialement.
Remplacement
Les expérimentations portent sur l’étude d'un choc salin sur des poissons de rivière, pour évaluer le potentiel létal de ce choc. Leur remplacement remettrait en cause la possibilité de mener l'expérience, et notamment les 2 phases suivantes du projet global qui sont : la documentation de la méthode de mise à mort par choc salin pour les demandes d’autorisations en milieu naturel et la réalisation des opérations en milieu naturel.
Réduction
Les procédures ont été réfléchies dans le but de diminuer au maximum le nombre d’animaux tout en ayant des résultats exploitables. Pour la procédure 1, l’objectif est de décrire les observations cliniques et comportementales, les effets indésirables et les points limites. Nous avons choisi d’utiliser des groupes de 3 individus par lots en s’inspirant des études pilotes menées en toxicologie, puisque nous n’allons pas effectuer d’études statistiques sur ces groupes. Nous avons déterminé plusieurs lots pour chaque espèce, en fonction de leur stade de développement, pour s’assurer que chaque lot de 3 individus soit le plus homogène possible.
Raffinement
Pour la capture des individus, les équipements de pêche électrique seront calibrés pour un voltage n’engendrant pas de blessures aux animaux, et uniquement une paralysie courte de 30 secondes environ. Pour la captivité, les animaux seront hébergés dans des aquariums enrichis avec des galets provenant de leur milieu naturel, afin qu’ils puissent exprimer un comportement naturel (support et cache). La température de l’eau sera contrôlée pour être dans les gammes de confort de chaque espèce (20 à 24 °C). Chaque lot sera hébergé dans un aquarium séparé afin de limiter le nombre de poisson par aquarium et permettre l’observation individuelle. L’hébergement temporaire n’excédera pas 30 heures (avec période d’accoutumance de 24h) et sera fait dans une salle dédiée et calme, avec une alternance jour/nuit calée sur l’alternance naturelle. Pour pallier à l’accès à l’alimentation naturelle, les poissons seront nourris avec une alimentation adaptée aux espèces : salade, épinard, courgette pour les poissons ancistrus et poissons cabot bouche ronde ; des vers de terre pour les anguilles. Afin de limiter au maximum les effets indésirables liés à l’exposition toxique au sel, nous proposons une étude pilote afin de déterminer les points limites précoces. Pour cela, nous observerons sur chaque individu les paramètres comportementaux et cliniques suivants : aspect général, posture, nage, couleur, décubitus... Une fiche de suivi individuel servira de support pour l’observateur pour noter tous les signes cliniques et comportementaux. Nous pourrons alors établir une cinétique d’apparition des différents symptômes.
Choix des espèces
L’objectif de l’étude est d’étudier le choc salin comme méthode de mise à mort de poissons ancistrus dans le cadre de la lutte contre une EEE. Nous souhaitons réaliser une éradication de cette espèce, tout en préservant les espèces de poissons indigènes présentes dans les cours d’eau traités. C’est pour cela que nous réalisons des expérimentations sur des poissons cabot bouche ronde et des anguilles, qui sont les poissons présents naturellement dans ces zones. Les animaux seront utilisés à des stades de développement différents. Nous avons déterminé 3 stades différents chez les poissons ancistrus (un stade juvénile, un stade intermédiaire, un stade adulte), 2 stades chez les poissons cabot bouche ronde (un stade juvénile et un stade adulte), et un seul stade juvénile chez l’anguille. Ce choix se justifie par le fait que la résistance à la salinité risque de varier en fonction du stade de développement. Pour l’anguille, nous savons que les adultes effectuent des séjours en milieux marins (avec une salinité à 35 g/l), c’est pour cela que nous n’envisageons pas de tester un choc salin car nous savons qu’à ce stade de développement, les individus sont résistants à la salinité marine.
Etude de l’effet de nouvelles stratégies thérapeutiques (vaccins, immunostimulants) lors d’une infection bactérienne ou virale chez la truitelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Toutes tuées à l'issue, parce qu'un protocole d'infectiologie interdit leur réutilisation, 4 500 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. Elles sont mises à jeun 24 ou 48 heures, anesthésiées, puis infectées par bain ou par injection avec des bactéries et des virus contre lesquels on teste des vaccins et des additifs immunostimulants. Le porteur classe la douleur en sévère chez les poissons infectés, chez qui l'infection peut conduire à la perte d'appétit, à une nécrose au point d'injection, à une nage erratique et à la mort, tout en indiquant qu'aucun élément concret d'appréciation de cette souffrance n'existe dans la littérature. Il affirme qu'aucun test in vitro ne permet de mesurer le bénéfice apporté à l'"organisme entier" et présente ces travaux comme un service rendu au bien-être des poissons d'élevage.
Objectifs
De nombreux agents pathogènes (bactéries, virus) affectent les salmonidés en Europe et dans le monde pouvant conduire à des taux de mortalité et à des pertes économiques considérables. En l’absence de vaccins efficaces, les antibiotiques sont le seul moyen de lutte contre les maladies bactériennes. Pour limiter leur utilisation et les risques de développement d’antibiorésistances, la mise au point de stratégies alternatives de lutte (immunostimulants, vaccins) est essentielle pour l’avenir de ce secteur d'activités. La vaccination devra être complétée par de bonnes pratiques d’élevage et par l’utilisation de substances stimulant le système immunitaire car l’optimisation des formules alimentaires modernes avec des ingrédients d’origine végétale est un facteur fragilisant le système immunitaire des poissons d’élevage carnivores. Parmi les nombreux additifs présents sur le marché et revendiquant des propriétés immunostimulantes, les prébiotiques (constituants alimentaires), les probiotiques (bactéries), les concentrés de protéines (hydrolysats) et les ingrédients d’origine marine représentent une solution d’avenir pour améliorer les performances de l’aquaculture. Leur richesse en peptides bioactifs (antimicrobiens, antioxydants, immuno-modulateurs…), et leur très haute valeur nutritionnelle pourraient permettre d’améliorer significativement le statut physiologique des animaux et, par conséquent, leur résistance aux pathogènes. L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets protecteurs de ces nouvelles stratégies chez la truite arc-en-ciel soumise à une infection expérimentale maîtrisée avec des pathogènes d’intérêt agronomique
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l’évaluation d’aliments expérimentaux contenant des immunostimulants ou de vaccins pour les industriels de la filière aquacole avec une potentielle mise sur le marché de ces nouvelles stratégies. Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les animaux seront soumis à des vaccinations et des infections par balnéation ou injection (1 seule et sous anesthésie durant moins d’une minute) Les infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une seule injection par poisson en moins de 15 secondes sur 4500 poissons au maximum. Les animaux sont mis à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection.
Impact sur les animaux
Les manipulations (tri, pesée, transfert, injection) ainsi que la mise à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection engendrent un stress chez les animaux. Aucun élément d’appréciation très concret de la souffrance éprouvée lors de l’évolution de la maladie n’est disponible dans la littérature. Cependant, le niveau de douleur sera considéré comme nul chez les contrôles non infectés en bonne santé, et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. L’infection peut également conduire certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc euthanasiés en fin d'expérience.
Remplacement
Les procédures décrites ne peuvent être remplacées par des expériences sur des lignées cellulaires (in vitro) car elles visent à comprendre la réaction de l'organisme dans son intégralité au pathogène. Il n'est pas actuellement possible d'évaluer l'effet immunostimulant/protecteur sur le système immunitaire d’un animal in vitro. Les tests in vitro permettent d'évaluer des effets sur certains types cellulaires, mais pas de mesurer le bénéfice apporter à l'organisme entier, via la stimulation intégrée du système immunitaire.
Réduction
La mise en évidence de différences significatives entre les conditions nécessite un effectif total de 90 poissons par condition (60 infectés et 30 témoins). Des effets-bac étant classiquement observés lors des épreuves infectieuses, il est indispensable de dupliquer les groupes infectés (2 x 30 poissons). Les effectifs proposés sont ceux utilisés récemment pour les analyses statistiques lors d’autres projets.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation et à l’injection est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales sont rigoureusement respectées. La qualité de l’eau est optimale et surveillée en permanence. Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés. Une anesthésie par bain jusqu’à sédation est réalisée avant de procéder à l’injection intramusculaire. Les aquariums sont équipés de bulleur qui est un élément d'enrichissement ayant un impact positif d'après la littérature (Colson et al. 2022 et 2023).
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la principale espèce d’élevage en France et c’est l’hôte naturel des bactéries et virus pathogènes étudiés dans ce projet. Pour l’évaluation de la sensibilité/résistance à l’infection par la bactérie et virus d’intérêt, les animaux sont utilisés soit au stade alevin, soit à des stades relativement précoces où la sensibilité à des infections par la bactérie ou le virus est maximale.
Génotypage de poisson-zèbre par biopsie de nageoire caudale
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Reproducteurs d'au moins 90 jours, mis en croisement pour fournir les embryons et les larves d'autres projets, 5 280 poissons zèbres vont être utilisés dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun perd 20 % de sa nageoire caudale, coupée sous anesthésie à la tricaïne, avec de la lidocaïne ajoutée à l'eau contre la douleur. Le porteur indique que la nageoire repousse en sept à dix jours et que le poisson nage correctement entre-temps. Le prélèvement sert à trier les individus, 2 400 porteurs de la mutation recherchée partant vers des projets ultérieurs, les 2 880 autres étant tués.
Objectifs
Permettre de déterminer le statut génétique des poissons adultes âgés d'au moins 90 jours de vie.
Bénéfices attendus
Le projet nous permet de conserver uniquement les individus de génotypes désirés et s'intègre dans la Réduction du nombre d'animaux dans les projets de recherche.
Procédures
Prélèvement de 20% de la nageoire caudale sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
La procédure est de classe légère. L'eau des poissons sera supplémentée de lidocaine, antalgique, pour diminuer la douleur et le stress de la procédure. Pendant 7-10 jours, le poisson nagera avec une nageoire caudale plus petite le temps que celle-ci régénère mais cela ne l'empêche pas de nager correctement ou de chercher sa nourriture.
Devenir
Les animaux porteurs de la mutation seront utilisés ultérieurement dans des projets scientifiques (n=2400), les animaux non porteurs de la mutation d'intérêt seront euthanasiés (n=2880).
Remplacement
Le poisson zèbre est un modèle de choix pour l'analyse du développement précoce du système nerveux central et entérique car il permet une visualisation de ces organes au cours du développement embryonnaire et larvaire grâce à la transparence des embryons et larves et à la rapidité de son développement précoce. Le développement des organes et leurs fonctions sont assez similaires avec les organes humains, ce qui fait du poisson zèbre un organisme de choix. Nous travaillons sur la meilleure compréhension du développement d'organes qui communiquent entre eux (cerveau et intestin), il n'est donc pas possible de réaliser nos projets de recherche en utilisant des lignées cellulaires in vitro.
Réduction
Les animaux utilisés dans ce projet sont les reproducteurs qui seront mis en croisement pour obtenir les embryons et larves pour les études scientifiques. Le nombre d'animaux est maintenu le plus bas possible tout en maintenant un nombre d'individus suffisants (40 couples d'adultes par lignée) pour éviter une dérive génétique. Les larves et embryons issus des croisements peuvent être analysés au niveau de plusieurs organes (cerveau, intestin, nageoires, cartilage de la face) en même temps ce qui limite le nombre de reproducteurs nécessaires et donc le nombre de poissons à génotyper.
Raffinement
La dose de tricaine, anesthésique, a été validée par notre vétérinaire. La gestion de la douleur est également pris en charge par l'ajout de lidocaine, antalgique, dans la solution d'anesthésique avant la procédure, pendant la procédure de biopsie et ensuite pendant la phase de convalescence du poisson. Des publications récentes nous ont permis de choisir le meilleur antalgique et la dose à utiliser pour notre procédure. Au cours du projet, une veille bibliographique nous permettra de connaitre d'autres signes possibles de douleur ou d'angoisse chez le poisson et nous pourrons prendre des mesures de raffinement appropriées.
Choix des espèces
Pour réaliser des études de gènes impliqués dans les maladies développementales de l'enfant, il faut pouvoir suivre l'effet des mutations d'un gène donné sur le développement de l'organe atteint (dans notre cas le cerveau et l'intestin) et ce, dans sa globalité et dans son contexte d'interaction moléculaire avec les autres organes environnants. Ce type d'études ne peut donc se réaliser sur des lignées cellulaires in vitro. Le poisson zèbre est un modèle approprié pour nos études sur la fonction des gènes responsables de troubles du neurodéveloppement. Le poisson zèbre est un vertébré et possède des régions cérébrales identiques à celles de l'être humain. Il a un développement ex-utero, ce qui nous permet de réaliser l'ensemble de nos études sur des embryons et des larves âgées de moins de 5 jours de développement. Pour obtenir ces embryons et larves, nous avons besoin de reproducteurs, mâles et femelles, pour produire des oeufs fécondés. Ces reproducteurs sont des poissons adultes âgés de 90 jours. A ce stade, les nageoires caudales sont assez grandes pour procéder à une biopsie de 20% sans altérer le comportement du poisson adulte. Les 20% de cette nageoire caudale repousse en 7-10 jours.
Caractérisation de la migration de retour en mer des anguilles argentées des marais salés
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturées au verveux et laissées piégées jusqu'à quatorze heures, 900 anguilles européennes sont ensuite versées dans une cuve, endormies au bain d'anesthésique, mesurées, puis équipées d'une puce injectée dans la cavité abdominale. L'espèce est classée en danger critique d'extinction, et c'est au nom de sa sauvegarde que le porteur prévoit d'en marquer 300 par an pendant trois ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Il décrit le marquage comme un stress de moins d'une minute et l'anesthésie comme une nuisance de moins de cinq minutes, le temps de piégeage restant la contrainte la plus longue. Toutes les anguilles marquées sont remises à l'eau, le bac de réveil étant versé directement dans le fossé à poissons.
Objectifs
L’anguille européenne (Anguilla anguilla) est un poisson migrateur amphihalin (espèce migrant entre le milieu marin et le milieu d'eau douce) classé en danger critique d’extinction. Afin d'assurer sa sauvegarde, un plan de gestion national a été validé en 2010 pour mettre en place des mesures de reconstitution du stock d'anguilles européennes. Les actions se font sur les différents habitats (estuaire, marais, fluvial) et dans une démarche de suivi de l’évolution de la population des entrées de civelles (recrutement) aux sorties d’argentées (échappement). Le projet vise la migration de dévalaison (retour en mer) des anguilles sortant des marais salés. L’étude se fera sur une entité hydraulique indépendante, appelé localement fossé à poissons, alimenté en eau salée par les marées par un ouvrage unique d’entrée et de sortie et sans arrivée d’eau douce. Nous suivrons la cinétique de dévalaison des anguilles dans leur phase argentée, c’est-à-dire lorsqu’elles sont prêtes à retourner en mer pour effectuer leur migration de reproduction. Les anguilles seront capturées dans le fossé à poissons. Elles seront marquées avec une puce afin de suivre en continue leur dévalaison par la sortie unique qui sera équipée d’un système d’antennes de détection de marques automatique qui permettra de repérer l’identité et les horaires de passage des individus. Le projet permettra de connaître la cinétique de dévalaison des anguilles afin de caractériser notamment la vitesse du processus ainsi que les mécanismes qui l’expliquent. Le principal objectif est d’analyser les fréquences de sortie des anguilles en lien avec les facteurs déclenchants cette migration (par exemple la luminosité, les conditions hydroclimatiques, la température, les coefficients de marée…). Par ailleurs, le suivi permettra de vérifier les périodes favorables de dévalaison pour proposer, le cas échéant, des mesures de gestion et connaitre le temps de transformation des anguilles jaunes en anguilles argentées dans ce type de milieu salé très particulier.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter des connaissances sur la phase d’argenture des anguilles une fois leur croissance effectuée en marais salé. Également, il permettra de caractériser la cinétique de migration de dévalaison (retour en mer) et notamment, les périodes, la vitesse du processus ainsi que les mécanismes qui l’expliquent. L’aspect important du projet vise à mettre en avant l’apport des marais salé pour la production de géniteurs d’anguilles et de promouvoir sa conservation et sa gestion pour arriver à une sortie efficace de ces individus et au final un échappement en mer pour la reproduction. La production d’anguilles argentées est la première cible à atteindre (Plan de gestion national de 2010). Aussi, les résultats de ce suivi permettront de sensibiliser les propriétaires de fossés à poissons au fort potentiel de leur marais en production de géniteurs et à proposer une optimisation de la gestion des ouvrages de vidange.
Procédures
Les anguilles seront capturées en une seule fois avec un engin de pêche dans un fossé à poissons. Elles resteront piégées dans l’engin de pêche pendant maximum 14 heures. Puis, l’engin de pêche sera vidé directement vers un bac de stabulation composée d’une cuve cylindrique de 50L, et les anguilles seront prélevées par groupe de 20 avec une épuisette de taille adaptée à la taille de l'individu capturé (épuisettes en filet non abrasif) pour être déposées dans un bac contenant de l’anesthésiant. Une fois anesthésiés, elles seront prélevées une par une à la main (mains humides) et déposées sur un linge humide pour être mesurées et marquées avec une puce magnétique d'un poids permettant de respecter le ratio inférieur à 2% du poids de l'individu (marquage bref de quelques secondes). Elles seront ensuite déposées dans un bac de réveil avant d'être libérée directement dans le milieu naturel une fois réveillées. Afin de limiter la manipulation des individus, ils sont relâchés en versant le bac de réveil directement dans le milieu naturel, les anguilles repartent naturellement à l’eau.
Impact sur les animaux
La capture des anguilles constitue un premier moment stressant pour les individus d'une durée de 14h maximum. L'anesthésie constitue également une nuisance d'intensité légère de courte durée moins de 5 min. Le marquage constitue un autre moment stressant d'une durée très brève (moins d'une minute).
Devenir
Tous les poissons marqués seront conservés vivants et relâchés dans le milieu naturel.
Remplacement
L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et la cinétique des déplacements dans le fossé à poissons donc en milieu naturel, il n’est pas possible d’appliquer la règle du remplacement. Il est donc indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (anguilles jaunes de plus de 20 cm et argentées) afin d’obtenir des données pertinentes.
Réduction
L'objectif du projet est d’enrichir les connaissances scientifiques sur le comportement de la migration de dévalaison des anguilles argentées en marais salé. La bibliographie montre une estimation d’anguilles argentées de 44 kg/ha soit 30% du stock total (120 kg/ha) avec des individus de 25-35 cm. Le fossé à poissons étudié est suivi depuis 2007. Nous pouvons estimer un stock en place dans ce fossé de 1500 anguilles. En prenant le pourcentage de 30% pour la quantité d’argentées produites sur le premier hiver, on obtient un nombre d’argentées estimées de 450 individus. Pour comprendre la cinétique de sortie des argentées sur ce fossé sur les 3 années du suivi, nous prévoyons de marquer chaque année les anguilles argentées mais également les anguilles jaunes qui pourront s’argenter. Pour avoir des résultats robustes et avec la pose de 5 verveux nous pouvons estimer une capture autour de 20% du stock en place, soit une capture de 300 anguilles. Sur ce lot de 300 individus, 200 seraient anguilles jaunes et pourront se transformer en argentées, et 100 seraient anguilles argentées et prêtent à dévaler. L’objectif est de marquer 300 anguilles chaque année et de le répéter pendant 3 ans afin d’avoir des statistiques robustes. Ce choix de marquer 900 individus sur la durée du projet correspond au minimum d'individus nécessaires pour rendre compte des variabilités intra-spécifique (sachant que la mortalité naturelle pourrait réduire légèrement cet effectif) et les paramètres environnementaux impliqués dans la phase de migration (saisonnalité, débit, température, blocages…). Ce nombre de poissons représente une part extrêmement faible de prélevement sur l’ensemble des fossés à poissons du marais (surface totale de plus de 9000 Ha, estimation à 0,025% de prélèvement du stock en place).
Raffinement
Pour la phase de capture, l’oxygène et la température sont mesurés à la pose des verveux. Les verveux sont vidés délicatement dans des cuves cylindriques de 50 L pleines d’eau prélevées dans le même milieu que celui de capture des anguilles. L’opération sera faite à l’abri du soleil pour protéger les anguilles d’une exposition lumineuse trop forte. Un couvercle sera disposé sur les bacs pour éviter de stresser les anguilles. La stabulation des individus a lieu pendant un temps réduit (moins de 2h). La teneur en oxygène sera mesurée, un bulleur sera ajouté dans les bacs et l’oxygène sera contrôlé régulièrement. Si la teneur en oxygène est inférieure à 3 mg/L les anguilles ne seront pas manipulées ni marquées. Les individus présentant des pathologies externes ou amaigris sont écartés de la manipulation et remis à l’eau directement. Des lots de 20 anguilles maximum sont ensuite prélevés à l’aide d’épuisette nylon de maille 1,5 mm pour ne pas abimer les anguilles, pour être placées dans un bac noir avec couvercle contenant l'anesthésique. L’eau est claire et une vérification des différentes phases de l’anesthésie des individus est effectuée. Le stade d’anesthésie recherché est l’immobilisation. Une fois anesthésiée, les marques stériles sont insérées par injection dans la cavité abdominale. Le marquage se fera à l'abri du soleil et prendra quelques secondes. Puis les anguilles seront placées dans un bac de réveil de contenance 50 L rempli avec l’eau du milieu naturel du fossé. L’oxygène de ce bac est vérifié en permanence. Un bulleur sera placé pour améliorer la teneur en oxygène. Une vigilance des opérateurs sera apportée au raffinement dans toutes les étapes de la procédure : • Acclimatation à l’eau de la rivière (contrôle de la température et de l’oxygène dans les bacs), • Marquage de poissons sains, • Capture avec épuisette réduite, • Cuve de réveil avec l’eau du milieu de libération pour observer le comportement du poisson marqué, • Surveillance des poissons pendant toutes les phases, de la capture au lâcher.
Choix des espèces
L’objectif étant l’apport de connaissances sur les comportements migratoires et la cinétique de dévalaison des anguilles en milieu naturel dans les fossés à poissons de marais salé, il est indispensable de recourir à des individus des espèces et du stade visé (anguilles jaunes et argentées). Nous utiliserons les anguilles jaunes de plus de 20 cm et les anguilles argentées afin d’analyser les cinétiques de migration de dévalaison dans un fossé à poissons de marais salé en connexion avec l’estuaire.