Poissons

780 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Trois lignées mutantes sont créées par inactivation de gènes, avec un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie et des imageries au micro-scanner à huit, douze et seize semaines, pour chercher si ces mutations reproduisent une scoliose. Le porteur annonce comme phénotype attendu une possible déformation de la colonne sans empêcher la nage ni l'alimentation, et euthanasie les poissons présentant des anomalies handicapantes. Il retient le poisson zèbre pour sa colonne longitudinale autorisant une torsion axiale, absente chez les modèles quadrupèdes.

Objectifs

La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3 pourcents des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. (ce projet se fera dans 2 établissements utilisateurs)

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage génomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).

Procédures

EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.

Devenir

Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.

Remplacement

Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.

Réduction

Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons par aquarium. Nous avons besoin de 3 générations de 260 individus pour chaque lignée soit au total 780 individus. La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses, soit 120 poissons mutants et 60 contrôles sauvages.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux, nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une euthanasie (présence de points limites).

Choix des espèces

Le modèle poisson-zèbre partage 71pourcents de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro-scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte.

6000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit un poinçon d'un millimètre dans la nageoire caudale pour génotyper des lignées génétiquement modifiées, puis un isolement pouvant durer cinq jours chez cette espèce grégaire. Le porteur indique que le prélèvement peut provoquer douleur, infection ou déchirure et que certains poissons ne se réveillent pas de l'anesthésie, une partie des individus étant gardée vivante pour des projets ultérieurs et le reste tué. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces modèles pour l'étude du rôle des gènes.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir maintenir et reproduire nos lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés en réalisant des génotypages à partir de prélèvements de nageoires.

Bénéfices attendus

Les études qui pourront être menées à l'aide de ces différents modèles biologiques génétiquement modifiés permettront d'étudier l'implication des gènes délétés dans des processus physiologiques clefs, ainsi que les mécanismes de perturbations de ces processus par des substances chimiques. De plus, les modèles transgéniques permettent d'étudier certains processus physiologiques de manière non invasive au cours du temps (cinétiques), permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations. Chaque étude fera l'objet de demandes spécifiques auprès du comité d'éthique dès que nécessaire.

Procédures

Les animaux subiront un prélèvement de nageoire par poinçonnage de la nageoire caudale (poinçon d'un mm de diamètre). Le temps de réalisation du poiçon est de moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les manipulations réalisées pour pêcher le poisson peuvent représenter un stress pour l'animal (pêche du poisson à l'aide d'une épuisette et transfert dans un nouveau bac). Dans de rares cas, il peut arriver que les poissons ne se reveillent pas de leur anesthésie. Le trou laissé par le prélèvement de nageoire (1mm de diamètre) peut entrainer une douleur pour l'animal et dans de rares cas une perte d'ions des poissons, une infection localisée de la nageoire ou encore une déchirure de la nageoire caudale. La procédure de génotypage nécessite également l'isolement des poissons pendant maximum 5 jours, le temps de déterminer leur génotype, ce qui représente un stress pour cette espèce grégaire.

Devenir

Une partie des animaux génotypés sera gardée en vie pour être utilisés dans des procédures ultérieures faisant l'objet d'autres demandes d'autorisation de projet à venir.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode in vitro/in silico intégrant l'ensemble des interactions entre les organes et les processus de biotransformation des substances chimiques, nous permettant de remplacer ces modèles animaux. L'utilisation de ces modèles transgéniques/mutants est indispensable à l'étude du mode d'action des gènes. En effet, les mutations génétiques engendrent des modifications biologiques et physiologiques complexes qui ne peuvent être étudiées que sur des êtres vivants.

Réduction

Pour chaque souche (4 souches différentes), nous envisageons de réaliser les prélèvements de nageoires sur 1500 poissons en 5 ans, soit 300 par an, ce qui représente un échantillon aléatoire des animaux qui seront produits. Ce chiffre a été estimé au minimum afin de reproduire les lignées tout en gardant un effectif suffisamment conséquent pour maintenir une diversité génétique correcte.

Raffinement

Il est actuellement impossible de conserver ces lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés sans réaliser de génotypage. La méthodologie pour le prélèvement de nageoire a été nettement améliorée au laboratoire en réduisant considérablement la taille du prélèvement de nageoire. En effet, la plupart des publications présentent un prélèvement d'au moins un tiers de la nageoire caudale. Le raffinement de notre protocole nous permet actuellement de réaliser le génotypage sur des prélèvements de nageoire par poinçon d'un mm de diamètre. Les conditions d'anesthésie ont également été raffinées en entourant les aquariums d'anesthésie et de réveil par des décors reproduisant une végétation naturelle afin de permettre au maximum un isolement vis-à-vis des expérimentateurs. De plus, les conditions d'isolement ont été raffinées afin que les individus puissent conserver des échanges visuels et olfactifs avec leurs congénères. Enfin l'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale. En dehors des procédures, tout au long de leur vie, les poissons zèbres du laboratoire sont gardés dans des environnements connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Le poisson zèbre étant une espèce grégaire, ils sont hébergés en groupes afin d’éviter les comportements d’anxiété engendrés par l’isolement, tout en conservant des densités de population faibles évitant ainsi les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris pour partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux par le comportement de chasse.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est une des espèces recommandées par l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques (OCDE) dans différents tests réglementaires. Sa petite taille permet des manipulations aisées comparé à d’autres espèces de poissons. De plus, ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents et efficaces à la fois pour la détection des substances chimiques (incluant les perturbateurs endocriniens) tout en réduisant le nombre d'animaux et le coût des analyses, mais également pour la compréhension des mécanismes physiologiques impliqués dans des processus clefs tels que la reproduction ou le développement.

720 killifishs (classés en autres poissons) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Hébergés individuellement, ils subissent des tests de locomotion spontanée, d'anxiété et de cognition, un protocole d'exercice forcé de trois heures par jour et des séances de locomotion forcée, pour étudier un vieillissement accéléré. Le porteur décrit un amaigrissement et des changements comportementaux d'anxiété ou de résignation liés au vieillissement rapide de l'espèce. Il justifie le choix du killifish par sa rapidité et son coût moindre par rapport au rongeur et le présente comme un modèle "unique et indispensable".

Objectifs

Une problématique importante inhérente à la recherche sur les maladies associées au vieillissement est le temps nécessaire pour laisser les animaux développer naturellement certains phénotypes symptomatiques du vieillissement. En effet, les animaux modèles vertébrés utilisés couramment dans la recherche biomédicale comme la souris ou le poisson-zèbre ont des durées de vie pouvant dépasser les 3 ans. Ce temps incompressible ralentit énormément, les avancées de la recherche visant à diminuer les effets négatifs associés à l’âge. Afin de bénéficier de modèles de vieillissement accélérés permettant d’augmenter considérablement l’efficacité de la recherche, nous proposons d'utiliser le modèle de vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish, et d'étudier l'efficacité (i) de modulations nutritionnelles, (ii) de traitements chroniques avec des substances naturelles ou synthétiques, (iii) des protocoles d'exercice chronique ou (iv) l'impact d'une manipulation génétique

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de l'âge. Nous pourrons évaluer quels événements biologiques sont à l'origine de la diminution de la locomotion, du déclin cognitif. Ceci permettra de désigner de nouvelles approches thérapeutiques comme les modulations nutrionnelles ou certains types d'exercice physique afin de mieux prendre en charge les pathologies liées à l'âge.

Procédures

Interventions: 1/génotypage: ne concerne que les animaux GMO, 1 intervention de deux minutes (sous anesthésie) 2/Locomotion spontanée: 3 interventions/poisson pour une durée de 90 minutes 3/Anxiété/cognition: deux interventions/poisson pour une durée de 60 minutes 4/Exercice chronique: 1 intervention/poisson 3heures/jours, 3 jours par semaine pendant 4 semaines 5/ Locomotion forcée: 2 interventions /poisson 120 minutes

Impact sur les animaux

Globalement pour l'ensemble de ces interventions, les nuisances où effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anixiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).

Devenir

L'ensemble des poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés puisqu'il nous est nécessaire de prélever principalement le cerveau, le foie, l'intestin, ou le muscle squelettique (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les composantes moléculaires (attrition des télomères, cassures du double brin d'ADN, sénescence, séquençage ARN etc) qui nécessitent de prélever le tissu musculaire et donc l'euthanasie préalable des poissons.

Remplacement

Dans le cadre de ce protocole nous comptons générer 3 lignées génétiquement modifiées. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle killifish font de ces poissons un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du vieillissement (principe de remplacement).

Réduction

Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 10 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction) (tests non paramétriques, e.g t-tests, test de Mann&Whitney, One or two-Way ANOVA).

Raffinement

Les animaux soumis inclus dans les procédures sont hébergés individuellement dans un bac de 3 litres dans l'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés controlés avec notamment une temperature de 28°C, un pH de 7, 5 et une salinité de 1000uS. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie* lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement). * :La procédure d'anesthesie se fait en plongeant le poisson dans un volume de 200mL d'eau osmosée où l'anesthésique est administrée par voie balnéatoire. L'anesthésie est jugée satisfaisante, lorsque le poisson est ventre en l'air avec mouvement operculaire lent.

Choix des espèces

L'African Turquoise Killifish ou Nothobranchius furzeri est génétiquement modifiable et permet des études de grandes envergures de la même portée tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses, que celles menées chez le rongeur. De plus, un nombre quasi indéfini d’événements biologiques est quantifiable par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un nombre croissant de lignées transgéniques ont été générées et sont disponibles dans la communauté scientifique, et permettent de répondre à de vraies questions biomédicales. En tant que laboratoire académique nous pouvons facilement avoir accès à un grand nombre de lignées transgéniques (peu onéreuses). Pour toutes ces raisons, le Turquoise killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser et étudier les pathologies liées à l'âge.

66 roussettes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces petits requins pêchés en mer sont soumis à des changements de salinité et de température pendant 24 heures avec quatre prélèvements sanguins, avant d'être tués pour disséquer leur moelle épinière et caractériser des cellules nerveuses, afin d'étudier l'adaptation des requins aux variations de leur milieu. Le porteur affirme que ces variations restent dans la gamme naturelle et n'attend de stress que lors des manipulations et des prises de sang. Il indique qu'aucune culture de ces cellules n'est possible faute de connaissances, et qu'il n'existe donc "pas d'alternative" in vitro.

Objectifs

Chez les poissons, comme chez les autres vertébrés, l’organisme adapte sa physiologie aux variations de son environnement grâce à la perception des fluctuations environnementales comme par exemple les variations de températures ou de lumière par son système nerveux central qui contrôle alors les sécrétions hormonales, notamment au niveau de l’hypophyse, qui régulent différentes fonctions biologiques. En plus du cerveau, il existe chez les poissons un système nerveux supplémentaire situé à l'extrémité caudale de la moelle épinière, appelé système neurosécréteur caudal. Ce système neurosécréteur caudal jouerait un rôle dans la coordination de différents processus physiologiques de l’organisme en réponse à des variations de salinité ou de température, comme montré récemment dans la littérature chez le flétan. Chez les requins, le système neurosécréteur caudal est constitué de neurones géants appelés cellule de Dahlgren. Bien qu’identifiées depuis longtemps, aucune étude récente n'a porté sur la caractérisation plus poussée de ces cellules. L'objectif du présent projet est d’analyser et de comparer les sécrétions hormonales des cellules de Dhalgren isolées à partir de roussettes adultes mâles qui auront été soumises à des changements de température et de salinités sur un temps court et dans le respect du principe des 3R.

Bénéfices attendus

L’analyse de la réponse hormonale des cellules de Dahlgren chez des animaux soumis à des variations de température et de salinité nous permettra d’établir ou non si ces cellules peuvent jouer un rôle essentiel dans l’adaptation des requins aux contraintes environnementales liées au changement climatique. A plus long terme, les bénéfices susceptibles de découler de cette étude chez une espèce de requin largement abondante sont de différents niveaux : (1) apporter des connaissances sur un modèle de requin qui seront bénéfiques à la compréhension des capacités d’adaptation d’autres espèces de requins dont les populations sont en danger ; (2) comparer les résultats obtenus sous un angle de l’évolution des espèces et d’identifier ainsi des processus fondamentaux conservés ; (3) disposer de marqueurs hormonaux en tant qu’outil pour caractériser les capacités d’adaptation d’une espèce donné en fonction de son environnement et ainsi adapter cet environnement pour un meilleur bien-être dans le cadre de programmes de préservation d’espèces aquatiques ou d’élevages. L’absence de variations hormonales des cellules de Dahlgren posera la question d’un autre rôle de ces cellules et c’est pourquoi nous prélèverons, en fin d’expérimentation, un maximum de tissus biologiques chez un même animal pour explorer différentes fonctions physiologiques.

Procédures

Des roussettes mâles adultes seront pêchées puis acclimatées dans des bacs de grande dimension alimentés avec de l'eau de mer naturelle à 15°C et sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D correspondant aux conditions optimales décrites dans la littérature. Trois procédures dont les paramètres seront dans la gamme des conditions naturelles pour les requins, seront mises en place : (1) Test de salinité de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer non diluée (100%) vers une eau de mer 100% (lot contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer diluée (eau de mer à 80%) vers une eau de mer 100% ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer 100% vers une eau à 80%. (2) Test thermique de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 15°C (contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 10°C ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 20°C. (3) Test combinant les changements de température et de salinité et qui portera sur 5 lots, chacun de 6 animaux, sur une durée de 24h : eau de mer 100% vers 100% à 15°C; eau de mer 80% vers100% à 10°C; eau de mer de 80% vers 100% à 20°C; eau de mer 100% vers80% à 10°C; eau de mer de 100% vers 80% à 20°C. Pour l’ensemble des animaux, une série de 4 prélèvements sanguins à 0h, 6h, 12h et 24h après les transferts, de moins de 1mL et n’excédant pas, au total, 10% du volume sanguin de l’animal sera effectuée pour des analyses biochimiques. A la fin des expérimentations, les animaux seront mis à mort pour récupérer un grand nombre de tissus biologiques dont les moelles épinières pour la caractérisation des cellules de Dahlgren. Ces dernières seront analysées par des approches techniques hautement résolutives afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un minimum de cellules, et donc d’animaux, collectées.

Impact sur les animaux

Les variations de température et/ou de salinité qui seront appliquées sont dans des gammes physiologiques et naturellement rencontrées par les requins, dont la roussette ; il n’y a donc pas de nuisance ou d’effet indésirable attendu sur la base de ces variations. Par contre, un stress et inconfort est attendu lors de la prise (manipulation) des animaux lors des transferts d’une condition à l’autre ainsi que lors des prélèvements sanguins. Ces derniers correspondent à un degré de sévérité de classe légère. Une acclimatation et une sédation sont envisagées.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement des cellules de Dahlgren en vue de leur caractérisation moléculaire et le prélèvement de différents organes pour analyser l’impact des variations de température et/ou de salinité sur différentes fonctions biologiques. Du fait de leurs localisations dans la moelle épinière, les cellules de Dahlgren ne peuvent être prélevées qu’après dissection.

Remplacement

L’impact des variations environnementales sur la physiologie de ce requin sera abordé en ciblant les cellules de Dahlgren mais également en prélevant un nombre maximum de tissus biologiques chez un même animal afin d’avoir une analyse plus large et plus intégrée. L'accès à la veine caudale, dans laquelle les hormones des cellules de Dahlgren sont libérées, est facilement accessible et permettra une analyse des sécrétions dans le temps et évitera ainsi d’utiliser des animaux supplémentaires. L’utilisation de culture de cellules de Dahlgren n’est actuellement pas possible du fait, justement, de l’absence de connaissances sur ces cellules spécifiques et il n’y a donc pas d’alternative in vitro disponible. Cependant, les hormones identifiées au niveau des cellules de Dahlgren au cours de ce projet seront, par ailleurs, testées in vitro sur des lignées cellulaires pour étudier leur mode d’action.

Réduction

L’expérimentation in vivo est réduite à 6 animaux par condition expérimentale pour permettre une analyse statistique appropriée pour les faibles effectifs. Les variations testées de température et de salinité, la durée de l’expérimentation ainsi que les temps de prélèvement des échantillons sanguins ont été définis et réduits au minimum sur la base des données bibliographiques. Ces données ont notamment montré qu’une exposition de la petite roussette, ou d’une autre espèce de requin, dans un milieu de salinité différente provoquait une variation significative des paramètres plasmatiques à 6h et que la réponse de tissus biologiques impliqués dans l’osmorégulation était observée entre 12h et 24h après le changement de milieu. Les températures choisies correspondent à celle qui impacte (20°C) ou non (10°C) la spermatogenèse et à celle qui impacte (20°C) ou non (15°C) la croissance embryonnaire de la roussette. Ces températures correspondent également à une augmentation de 5°C des température moyennes de surface des océans dans les scénarios de changement climatique. Ces données bibliographiques nous ont donc permis de bien cerner les conditions à tester et d’éviter l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux. De plus, l’utilisation de technologies performantes à haute résolution permet d'obtenir des données statistiquement analysables à partir de faibles quantités d’échantillons, ce qui permet de limiter le nombre de cellules de Dahlgren à prélever, et donc d’animaux. Un maximum d’organes sera prélevé sur un même animal pour des études ultérieures liées au projet et pour leurs utilisations dans des projets différents réalisés par d’autres chercheurs s’intéressant à cette espèce.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant au minimum 4 semaines avant les expériences dans des systèmes à flux ouvert avec de l'eau de mer naturelle à 15°C, sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D et ils seront en groupe à raison d’une densité de 5 animaux / 100L (environ 35kg/m3). Cette période de 4 semaines est justifiée par une préconisation généralement admise de 2 semaines de délai entre le transport des animaux et leur inclusion expérimentale auxquelles sont rajoutés 2 semaines minimum qui permettront une manipulation des animaux (caresses du museau, caresses ventrales, prise en main dans les bacs, tests d’immobilité tonique). Au cours de cette période, les animaux seront nourris de poissons ou de mollusques ad libitum à une fréquence d'une fois par semaine, ce qui est en accord avec le mode d'alimentation des requins. Les animaux seront également pesés et mesurés puis identifiés par un marquage externe (fil de couleur placé autour du corps devant la nageoire dorsale). Lors des tests, les animaux seront transférés dans un bac de 100L (hauteur de 60 cm) permettant une nage sans contrainte et ainsi assurer une bonne irrigation des branchies et, selon les conditions, permettant également aux animaux de boire. Lors de ces tests une observation de comportements de stress (nage rapide et comportement de fuite hors du bassin, rougeurs de la peau) entrainera aussitôt l’exclusion des animaux. Pour les prélèvements sanguins les animaux seront transférés dans un bac de petite dimension (1m x 0.30m) pour permettre leur sédation et la mise en place d’une pompe buccale non invasive pour assurer l’irrigation des branchies. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour procéder aux prélèvements des tissus biologiques.

Choix des espèces

L’espèce utilisée, Scyliorhinus canicula est un requin Carcharhiniforme non classé comme vulnérable (Least Concern) sur la liste rouge de l’UICN (Union internationale pour la conservation de la nature). Du fait de son abondance et de la disponibilité de données scientifiques, dont génomiques, cette espèce est considérée comme une espèce modèle pour l’étude des requins. Ces derniers appartiennent au groupe des poissons cartilagineux (Chondrichtyens) qui regroupe également les holocéphales (ou chimères) et les raies. Au cours de l’évolution, les poissons cartilagineux ont divergé des vertébrés osseux il y a environ 420 millions d’années. Ils constituent donc un taxon d’intérêt pour les études phylogénétiques. De plus, les études en physiologie des poissons s’intéressent très peu à celle des requins et des raies alors qu’ils constituent un groupe très différent des poissons osseux et qu’ils sont de plus en plus menacés dans nos écosystèmes marins. Seuls des animaux adultes de sexe mâle seront utilisés. Les roussettes mâles atteignent une maturité sexuelle à 6,6 ans pour une taille de 54 cm. Afin d’utiliser des lots homogènes, nous identifierons les animaux au préalable dans une gamme de taille de 60±3 cm et de poids de 680±30g. L’utilisation d’adultes est justifiée par le fait de prélever des animaux en milieu naturel qui aient eu des cycles de reproduction, donc moins impactant pour la ressource, et de disposer d’animaux de taille suffisante pour le prélèvement des échantillons biologiques.

2 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés dès le stade embryonnaire à de l'éthinylestradiol et à des bisphénols ajoutés à leur eau, larves, juvéniles et adultes sont ensuite tués et fixés pour observer au microscope le développement de leur cerveau. Le porteur indique que ces perturbateurs endocriniens peuvent modifier le sex-ratio, le comportement locomoteur et provoquer de l'anxiété. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le fonctionnement du cerveau et de sa barrière hémato-encéphalique sur le long terme.

Objectifs

Le projet vise à comprendre les effets d'une exposition à des molécules polluantes de notre environnement : l'ethinyl estradiol (EE2), molécule très souvent utilisée en contraception et très largement retrouvée dans les milieux aquatiques, et certains bisphénols, molécules utilisées dans la fabrication de nombreux objets plastiques et emballages alimentaires. L'effet de ces expositions sera observé sur le développement et le fonctionnement du système nerveux central chez le modèle poisson zèbre (Zebrafish). Ces molécules sont déjà décrites pour être des perturbateurs endocriniens. Cette étude se fera sur des lignées transgéniques de poissons zèbres

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d'évaluer l'effet de ces molécules polluantes/pertubatrices endocriniennes à court (larve), moyen (juvénile) et long terme (adulte) sur le développement et le fonctionnement du cerveau de vertébrés. La mise en place notamment des vaisseaux dans le cerveau (voie d'entrée de toutes substances dans le cerveau) et des cellules souches neurales devraient être observés facilement par la création de la lignée doublement transgénique et le traitement des échantillons permettant ainsi de les rendre transparent (transparisation). La mise au point de cette nouvelle lignée et sa transparisation devrait aussi permettre à l'avenir d'analyser rapidement l'exposition à d'autres molécules polluantes de notre environnement et leur impacts sur la mise en place et le bon fonctionnement du cerveau.

Procédures

Les animaux aux stades embryonnaires seront uniquement traités à des doses environnementales, ou légèrement supérieures, du 1er Jour au 4eme jour de développement embryonnaire. Le traitement des oeufs/embryons se fera par simple addition de la molécule dans le milieu aquatique d'incubation des oeufs/embryons. 2700 animaux (larves, juvéniles et adultes) traités dériveront de ces oeufs/embryons. L'analyse des animaux se fera après leur euthanasie. Pour rappel une seule ponte d'une femelle poisson zèbre correspond à environ 500 embryons.

Impact sur les animaux

Les effets de perturbateurs endocriniens sont en général subtiles, surtout aux doses utilisées (proche des doses environnementales). Pour certains perturbateurs endocriniens, et en fonction de la concentration, les effets suivants ont été observés dans la litérature : comportements reproducteurs modifiés, changement du sex-ratio avec des possibilités de féminisation chez certaines espèces, modification du comportement locomoteurs et anxiété. Certains perturbateurs peuvent aussi avoir des effets obésogènes.

Devenir

La visualisation au microscope confocal (microscope à haute résolution) des cerveaux des animaux transgéniques traités ne peut se faire que sur des animaux fixés (non vivants)

Remplacement

Le cerveau est un des organes les plus complexe de notre organisme. Il contient de nombreux types cellulaires (neurones, astrocytes, oligodendrocytes, cellules microgliales, ependymocytes). Son fonctionnement ne peut se faire que par sa vascularisation et les échanges de métabolites et de gaz qui se font avec le tissu neural passent par la barrière hémato-encéphalique, structures complexes présentes partout dans le cerveau. Il n'existe pas de modèles physiologiques in vitro qui mimerait le fonctionnement du cerveau et celui de la barrière hématoencéphalique. Par ailleurs les effets des perturbateurs endocriniens sont visibles très souvent à moyen et long terme : c'est ce qu'on appelle" le concept de l'origine développementale des maladies humaines". Les effets à moyen/long terme ne sont pas compatibles avec des modèles de cultures de cellules (2 dimensions, sphéroides, organoides....) dont l'utilisation dans le temps est limité

Réduction

Les groupes d'animaux seront mis en place de façon suivante afin de pouvoir réaliser de solides statistiques. Nombre de molécules à tester : 4 (éthylniestradiol, Bisphenol A, Bisphenol S et Bisphenol AF) Nombre de concentrations des molécules à tester : 4 (Emax, EC50, EC20) et Condition contôle : DMSO (solvant pour les molécules à tester). Donc 5 conditions par expérience. Nombre d'animaux par condition : 15. Ce nombre de 15 est justifié par le fait qu'il peut y avoir une perte d'échantillon : l'individu ne survit pas jusqu'à la fin de l'expérience ou encore la qualité des coupes de cerveau obtenue à partir des échantillons biologiques est insuffisante pour permettre une quantification des marqueurs d'intérêt. 3 répétitions indépendantes : pour collecter et comparer des données avec un pouvoir statistique suffisant pour générer des conclusions. Les tests statistiques paramétriques de comparaison multiple one way ANOVA seront utilisés car ils sont les plus appropriés aux tests statistiques d’échantillons paramétrés ayant une distribution de type gaussienne. La répétition de 3 expériences permet aussi de stopper le projet si l’analyse des données des première et deuxième expériences se révèle être non encourageante. L’état de santé des animaux, la souffrance et l’angoisse seront évalués. La survenue répétitive d’épisodes de nage agitée, de diminution de la prise alimentaire, d’augmentation de comportement agressif nous indiquera un problème de bien-être chronique.

Raffinement

L’état de santé des animaux, la souffrance et l’angoisse seront évalués. La survenue répétitive d’épisodes de nage agitée, de diminution de la prise alimentaire, d’augmentation de comportement agressif nous indiquera un problème de bien-être chronique.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est utilisé car nous possédons déjà les deux lignées transgéniques à partir desquelles la lignée doublement transgénique sera réalisée par simple reproduction des geniteurs. Le modèle poisson zebre est largement utilisé en biologie du développement et toxicologie/perturbation endocrinienne. 675 larves (entre 5 et 10 jours), non sexé 675 juvéniles (entre 30 et 40 jours), non sexé 675 X 2 adultes (entre 90 et 120 jours) Males/femelles = 1350 adultes

44 200 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à terme, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet est de créer des lignées génétiquement modifiées, huit par an sur cinq ans, vendues comme prestation à des laboratoires publics ou privés, chaque poisson étant identifié à trois mois par une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les modifications génétiques peuvent provoquer des phénotypes dommageables comme une scoliose ou des troubles de la reproduction. Les individus non modifiés sont tués, dix par lignée étant gardés pour l'entretien puis tués à dix-huit mois, et le recours au poisson est justifié par la part de gènes partagés avec l'humain et l'usage d'un "organisme entier".

Objectifs

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui puisse se rapprocher le plus possible du génome humain. Il a été montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. C’est pourquoi nous l’avons choisi pour créer des lignées génétiquement modifiées afin de fournir ces dernières à des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Ces lignées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. L’objectif est de créer 8 lignées par an durant les 5 ans à venir.

Bénéfices attendus

Notre plateforme a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant le modèle poisson zèbre pour comprendre certaines maladies humaines et progresser dans leur traitement.

Procédures

Les poissons doivent être identifiés génétiquement à l’âge de 3 mois. Pour cela ils sont isolés et anesthésiés successivement afin de minimiser la souffrance de l’animal lors du prélèvement de tissu de la nageoire caudale qui est réalisé par la suite. Un seul prélèvement est réalisé par individu, ne durant qu’une minute. Une fois la biopsie terminée, le poisson est remis à l’eau dans un bac de réveil. Il ne sera réhabilité dans un aquarium d’élevage qu’après rétablissement complet de l’anesthésie. Cette biopsie ne doit entrainer aucune séquelle sur la nage ou l’alimentation du poisson. Il est nécessaire de maintenir l’animal isolé jusqu’à l’obtention des résultats d’analyse (maximum 2 semaines). Il est possible qu’un phénotype dommageable apparaissent sur l’ensemble des animaux suite aux modifications génétiques.

Impact sur les animaux

Les poissons vont être pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Le risque lié à l’anesthésie est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Un traumatisme peut faire suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale, qui est une petite plaie de quelques millimètres. Il s’en suit ensuite un processus cicatriciel qui prend 2 semaines durant lequel le poisson est isolé. Il est possible que les modifications génétiques entraînent des phénotypes dommageables, par exemple une scoliose ou un problème lors de la reproduction.

Devenir

Au cours du projet, les animaux produits qui ne sont pas génétiquement modifiés seront euthanasiés. Nous conserverons 10 individus par lignée produite qui permettront d’obtenir et de garantir le maintien de la lignée nouvelle lignée. Enfin, ces animaux seront également euthanasiés à l’âge de 18 mois après confirmation de l’implantation de la lignée dans le laboratoire demandeur. Les animaux ne seront pas conservés au-delà afin d’éviter qu’ils ne développent des anomalies qui s’intensifient avec le vieillissement des animaux ou qu’ils ne deviennent le réservoir d'infection.

Remplacement

Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement larvaire et l’imagerie. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.

Réduction

Aux vues de la physiologie du poisson-zèbre et de notre expérience sur la création de lignées génétiquement modifiées au cours des dernières années, nous estimons que le minimum requis de lignée à créer est de 8 par an sur les 5 ans à venir. Nous allons générer 850 individus fondateurs (F0) et 255 individus de la génération suivante (F1) soit 8 lignées x (850 F0 + 255 F1) x 5 ans = 44200 poissons zèbres. Afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaire à la création de ces lignées, nous essayerons d’insérer un rapporteur fluorescent lorsque cela sera possible. Ce qui nous permettra de sélectionner et de garder que les poissons génétiquement modifiés diminuer le nombre de poissons à élever par 4 d’après nos précédentes études soit élever 11 050 poissons zèbre.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Ainsi les paramètres environnementaux comme la qualité de l’eau, la température et le cycle lumineux seront à surveiller. La température de l’air devra être comprise entre 25 degrés Celsius et 27 degrés Celsius et le cycle lumineux de 14-10 avec aube et crépuscule. Le poisson zèbre est une espèce grégaire, ils seront donc placés en groupe de 5 à 20 congénères adultes maximum dans les aquariums d'élevage. Seul les poissons à génotyper seront isolés et maintenus dans le système afin de garantir un environnement contrôlé. Cela leur permettra de maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils seront surveillés quotidiennement et un affichage assurera la traçabilité et le respect de la durée de l’isolement. Pour préserver l'ensemble des poissons hébergés, une limite d'âge de 18 mois sera appliquée pour éviter que les animaux vieillissants puissent être le réservoir d'infection. En effet, la durée de vie moyenne d’un poisson zèbre est de 24 mois. De la nourriture vivante sera fournie 2 fois par jour afin que les animaux puissent exercer un comportement de chasseur pour se nourrir. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Pour cela nous utiliserons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels. Cela permettra d’évaluer quels poissons doivent être euthanasiés ou non. Si nous observons des problèmes physiques nous ferons une évaluation pour en définir la gravité et mettre en place des solutions adaptées pour garantir le bien-être des animaux. Si cela s’avère une demande d’autorisation sera effectuée.

Choix des espèces

Le modèle poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser ce modèle pour créer des lignées génétiquement modifiées. De plus, il atteint l’âge de la maturité sexuelle à 3 mois et les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus attrayante. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. Ils seront donc utilisés pour générer une lignée afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses recherches sur le modèle. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à partir de 3 mois et nous ne les utiliserons pas au-delà de 18 mois. Le prélèvement pour génotypage se fait aux alentours de 3 mois, lorsqu’ils ont atteint une taille suffisante. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle.