Poissons

200 petites roussettes, une espèce de requin, vont être utilisées dès le stade œuf dans des procédures classées en gravité légère, avec l'objectif de les relâcher en mer sous réserve de l'accord d'un vétérinaire. Elles sont marquées, mesurées chaque mois et exposées pendant un an à des champs électromagnétiques reproduisant ceux des câbles de parcs éoliens, avec des tests de respirométrie de 24 heures et des enregistrements vidéo de leur comportement. Le porteur reconnaît que la littérature manque de points limites pour l'expérimentation sur les poissons et que l'exposition prolongée pourrait altérer leur santé, auquel cas les individus seraient tués. Il présente le projet comme un appui à la fois à la conservation et à l'"exploitation durable" des espèces marines, dans le contexte du développement des énergies marines.

Objectifs

Dans le contexte de changement climatique, la production d’énergie constitue l’un des défis socio-économiques et environnementaux majeurs des décennies à venir et soulève d’importants enjeux stratégiques, économiques et financier. Les énergies marines renouvelables (EMR), basées sur le vent, les marées et les courants marins font des océans et des mers une source inépuisable d’énergie permettant de produire de l’électricité. Parmi elles, les parcs éoliens offshores (OWF) sont aujourd’hui en plein essor notamment en Europe. Les OWF peuvent induire du bruit, des vibrations, l’interruption de continuité écologique et des perturbations liées aux champs électromagnétiques qui peuvent avoir des impacts potentiellement négatifs sur les espèces marines. En transportant l’énergie produite, les câbles électriques sous-marins au sein des OWF génèrent des champs électromagnétiques (CEM) qui peuvent affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles , qui utilisent les champs électromagnétiques pour se déplacer et se nourrir. La forte croissance de l’éolien offshore risque d’amplifier ces effets mais les informations existantes sur leurs conséquences sur les communautés ichtyologiques restent aujourd’hui encore insuffisantes. Les études réalisées sont limitées à quelques espèces d’intérêt commercial et sur une durée relativement courte. Ce projet vise à répondre à cette lacune et à identifier et évaluer les effets des parcs éoliens en mer et leur raccordement sur les requins, espèces élétro-sensibles. L’état de santé des individus sera évalué à travers un panel d’indicateurs : survie, mesures taille/poids (i.e. biométrie) et suivi de la croissance, développement, métabolisme énergétique (i.e. indicateur de stress évalué via des mesures de consommation d’oxygène au repos et à l’effort)

Bénéfices attendus

L’implantation d’un parc éolien offshore entraine une modification de l’habitat. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. Il existe très peu de connaissances à ce sujet les requins. Ces connaissances relatives à la biologie de ces espèces d’intérêt serviront de cas concrets pour la mise en place de suivi pérennes des populations aux sein des OWF afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général. Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment les requins réagissent aux champs électromagnétiques. Ils permettront d’améliorer les connaissances des impacts des EMR sur les espèces marines et ainsi apporteront les informations essentielles aux gestionnaires et décideurs pour répondre aux enjeux de développement des EMR sans nuire au maintien de la biodiversité marine.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de marquage sous cutané juste apres l'éclosion. Ce marquage durera une minute environ par individu. Cette marque permettra d'identifier chaque individu durant la phase expérimentale juvenile. Il y aura une procédure par individu qui durera 12 mois. Biométrie : une fois par mois les individus seront pesés et mesurés pour assurer un suivi de leur croissance et de leur bonne condition (indice de fulton) Mesures de respirométrie : chaque mois, chaque individu sera testé en respirométrie afin d’évaluer sa capacité métabolique aérobie. Ce test durera 24 h et 12 juvéniles par condition (i.e. contrôle, 3 différents champs électromagnétiques) seront testés soit 6 poissons par bassin. Tests comportementaux : les tests comportementaux auront lieu 1 fois par mois au stade juvenile soit pour 6 fois sur 6 mois. Une camera placée au dessus de chacun des bassins permettra d'enregistrer leur comportement à différents temps de la journée. L'experimentateur n'interviendra pas dans le bassin ni sur les animaux mais enclanchera les enregsitrement à des temps donné (1fois 2h le matin, 1 fois 2h l'apres midi, 1 nuit).

Impact sur les animaux

La littérature récente souligne le manque de connaissances s'agissant des points limites (objectifs et quantitatifs) applicables pour l'expérimentation sur les poissons, les réponses à la douleur étant par ailleurs très variables entre les espèces. L’ensemble des manipulations (mise en bassin, anesthésie, mesures taille poids, réveil, chasse avec un stick, respirométrie) seront réalisées sur une période de temps optimisée afin de minimiser un maximum ce stress. La condition des poissons (indice de condition, état général) sera évaluée au niveau individuel durant toute l’expérimentation. Le manque de connaissances sur l’impact des champs électromagnétiques sur les requins de manière générale ne permet pas de déterminer la sévérité de ce type d’exposition en amont. L’exposition aux champs électromagnétiques pourrait avoir des effets indésirables sur l’espèce étudiée. Li’solement sensoriel des individus dans les respiromètres pourrait engendrer un léger stress.

Devenir

Les individus seront relâchés dans l’environnement après accord d’un vétérinaire. Le cas échéant les individus seront euthanasiés. En effet les individus vont etre exposés de manière prologée à des champs électromagéntiques. SI cette expostion altere le développement ou a santé des individus ils ne pourront etre relachés dans l'environnement. Les individus marqués sont maintenus en vie et utilisés durant toute l’expérimentation

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser l’impact des champs électromagnétiques sur les requins, aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne peut être envisagée puisqu’aucune méthode de remplacement ne saurait reproduire le développement et le comportement de cette espèce. Nous ne pouvons pas imiter la complexité d’un organisme en entier subissant des conditions particulières impactant sa biologie et son comportement en milieu naturel Aussi, pour atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines, l’évaluation de l’état écologique de l’écosystème marins doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie et la biologie des espèces vivants dans l’habitat impacté.

Réduction

Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique L’exposition se fera au stade œuf de 4 semaines jusqu’au stade juvénile. En prenant en compte l’incertitude de la fécondation des œufs, du bon développement des embryons et la littérature existante, un nombre total de 25 individus par bassin est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques et des résultats pouvant être extrapolé à l’échelle de la population.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors de l’élevage, de mesures biologiques telles que le poids et la taille, des tests comportementaux et l’évaluation de l’état de santé de l’organisme via des indicateurs de stress Une surveillance de routine sera effectuée quotidiennement dans les bassins d’élevage. Une bonne oxygénation du milieu et une température de 16°C seront maintenus tout au long de l’expérience, un cycle jour/nuit de 13h/11h. Les bassins seront enrichis de tubes PVC permettant de mettre à disposition des cachettes pour les individus. Lors de leur manipulation, en plus de l’utilisation d’anesthésiant, les individus seront placés en immobilité tonique afin de limiter le stress et la douleur. Les individus seront retirés de la procédure dès qu’un point limite sera atteint. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). Une fois éclos, les juvéniles seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bon état de santé des individus et bon état des installations. Des suivis plus poussés, notamment des tests comportementaux (e.g. prise alimentaire, locomotion) et écophysiologiques (métabolismes aérobie, indice de condition, croissance) , seront assurés par les agents une à deux fois par mois. Au bout d’un an, un point d’étape sera réalisé sur les travaux effectués sous la forme d’un rapport intermédiaire et d’une réunion dédiée. A l’issue de ces expérimentations, si les résultats le permettent, les données seront analysées et valorisées sous forme d’article(s) scientifique(s).

Choix des espèces

Les requins sont des espèces électrosensibles susceptible être impactées par les champs électro- magnétiques générés par les OWF. L’ensemble de ces espèces sont présentes sur les différents sites d’étude avec un degré de mobilité plus ou moins importants. La petite roussette (classée « préoccupation mineure » par l’IUCN) présente globalement une sédentarité au site avec des déplacements relativement limités. L'étude débutera au stade embryonnaire (oeuf de 3-4 semaines) jusqu'au stade juvénile de 6 mois. Les oeufs sont fixés par les femelles sur le lieu de ponte qui peut être par consequent un parc éolien. Ensuite, les juvéniles sont très peu mobiles à la naissance et vont rester sur la zone de ponte quelques mois. Afin d' évaluer l'impact des champs électromagnétiques sur le développement il est donc nécessaire d'exposer les individus à partir du stade embryonnaire. Le stade de 3-4 semaines permet de s'assurer de l'a viabilité et de la fécondation des oeufs avec un embryon qui commence à être visible. Cela permet de ne pas exposer d'oeufs dits "clairs" et non fécondés.

156 animaux, 140 poissons zèbres et 16 xénopes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les poissons zèbres tués à l'issue et les xénopes femelles réutilisées d'une année sur l'autre. Les xénopes reçoivent une injection d'hormone puis un prélèvement d'ovocytes par massage abdominal, les poissons zèbres un prélèvement de gamètes et une biopsie de nageoire sous anesthésie. Ces gestes servent à des travaux pratiques de formation réglementaire, pour que des stagiaires s'entraînent aux manipulations, anesthésies et mises à mort sur espèces aquatiques. Le porteur indique privilégier des animaux de réforme et affirme que le remplacement par un modèle alternatif est "impossible" pour la partie pratique.

Objectifs

Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté définit le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procédures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de ces séances, les expérimentateurs maîtriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.

Bénéfices attendus

A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, mais également les éléments zootechniques fondamentaux acquis seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenus en captivité.

Procédures

Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Nous utilisons deux modèles expérimentaux, le xénope et le poisson zèbre, qui ne sont pas soumis aux mêmes procédures. Pour les Xénopes, les animaux sont soumis à une injection sous-cutanée pouvant induire une douleur brève et localisée au point d’injection. De plus, ils peuvent ressentir du stress lors de la contention qui est nécessaire à l’immobilisation de l’animal. Les poissons zèbres sont exposés à une anesthésie par balnéation à faible dose d’anesthésiants qui est maitrisée depuis plusieurs années et n’induit pas d’effet indésirable.

Devenir

Poisson-zèbre : En fin de procédure les animaux seront euthanasiés. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.

Remplacement

Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (Cellules souches pluripotentes induites IPS, organöides, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.

Réduction

le nombre total d’animaux impliqués dans cette demande est de 156 animaux pendant 5 ans(140 poissons-zèbre, 16 xenope). Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années, dans la limite de 6 prélèvements d’ovocytes par individu.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal. des plantes en plastqiues sont presents dans les aquariums de Xénopes. Les poissons sont toujours hebergés en groupe. Les poissons et xénopes sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect physique ou comportement anormal et de lui attribuer un score . Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie.

Choix des espèces

Les poissons-zèbres et les xénopes sont couramment utilisés à des fins scientifiques en raison de leur facilité d'élevage, de la disponibilité d'une vaste documentation et de l'existence d'une large communauté scientifique travaillant sur ces espèces. Ils sont considérés comme des modèles de choix en raison de leurs caractéristiques biologiques et des connaissances zootechniques disponibles. Ces deux espèces présentent des caractéristiques spécifiques qui les rendent adaptées aux procédures expérimentales telles que le prélèvement du sperme et d’ovocytes afin de réaliser des fécondations in vitro. Pour obtenir des pontes ou prélever du sperme, il est important d'utiliser des animaux matures sexuellement. Les xénopes nécessitent généralement une période d'environ un à deux ans pour atteindre cette maturité, tandis que les poissons-zèbres peuvent être utilisés à partir de trois mois, car ils ont un développement plus rapide.

560 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et 186 maintenus en élevage jusqu'à l'âge de réforme. La seule procédure déclarée est le prélèvement de deux millimètres carrés de nageoire caudale sous anesthésie, pour génotyper des lignées mutantes, le travail scientifique portant sur les embryons précoces. Le porteur revendique le poisson zèbre pour éviter, contrairement à la souris, de tuer la mère afin d'accéder aux œufs. Il indique tester des méthodes de génotypage moins invasives, encore trop peu fiables pour être utilisées.

Objectifs

La construction d’un organisme, mais aussi la dissémination de cellules cancéreuses, implique des migrations cellulaires, qui sont souvent des processus collectifs : les interactions entre cellules sont nécessaires à la bonne migration des cellules et à la coordination de leurs mouvements. Nous avons ainsi mis en évidence dans l’embryon précoce de poisson un nouveau type de guidage des cellules par celles qui les suivent, basée sur la transmission d’une information mécanique. Le projet vise d’une part à mieux comprendre ce mécanisme (comment une information mécanique oriente-t-elle l’activité migratoire d’une cellule), et d’autre part à comprendre comment, à partir des interactions cellule-cellule, émergent des mouvements morphogénétiques complexes et coordonnés.

Bénéfices attendus

Nos travaux trouvent des applications en cancérologie, de nombreuses cellules métastatiques migrant collectivement, et en médecine régénérative, où l’un des grands enjeux actuels est de réussir à reproduire et contrôler in vitro les processus de morphogenèse. Ces questions peuvent en partie être abordées sur des modèles cellulaires en culture (cicatrisation de monocouches épithéliales), mais la complexité et la diversité de l’environnement cellulaire physiologique est impossible à reproduire in vitro, impliquant la nécessité d’analyser ces phénomènes in vivo.

Procédures

Sur certains animaux, l'extrémité de la nageoire caudale inférieure est prélevée, afin de séquencer leur ADN. Le prélèvement est réalisé sous anesthésie générale. L'intervention prend moins d'une minute. Le tissu prélevé est de 2 mm2, et repousse en 2 semaines environ. Un animal ne subit cette intervention qu'une seule fois au cours de sa vie.

Impact sur les animaux

D'après la littérature disponible, le prélèvement de l'extrémité de la nageoire caudale inférieure peut causer une douleur à l'animal. Pour l'éviter, une analgésie est mise en place avant l'intervention, et maintenue après intervention en cas de signes de douleur.

Devenir

A l'issue du prélèvement de l'extrémité de la nageoire caudale, les animaux de génotype d'intérêt sont conservés (2/3 des animaux), les autres sont mis à mort. Tout au long du projet, les animaux atteignant l'âge de réforme (2 ans), sont mis à mort. La moitié des animaux seront de ce fait mis à mort au cours du projet. Ainsi, en fin de projet, sur les 560 animaux ayant subi un prélévement de l'extremité de la nageoire caudale, 560 * 2/3 * 1/2 = 186 animaux, qui seront maintenus en élevage jusqu'à l'âge de réforme.

Remplacement

Nos travaux visent à mieux comprendre comment les interactions entre cellules modulent leurs déplacements et permettent la mise en place de grands mouvements morphogénétiques coordonnés. Ces questions peuvent en partie être abordées sur des modèles cellulaires en culture (cicatrisation de monocouches épithéliales) et elles le sont par d’autres équipes. Néanmoins, la complexité et la diversité de l’environnement cellulaire physiologique est impossible à reproduire in vitro, impliquant la nécessité d’analyser ces phénomènes in vivo. C’est d’ailleurs l’un des enjeux de ces travaux que de parvenir à comprendre les bases cellulaires des mouvements morphogénétiques pour pouvoir les reproduire in vitro, dans le cadre d’approches en médecine régénérative. L'embryon précoce de poisson permet l’analyse des phénomènes qui nous intéressent sans aucune procédure invasive, tout en assurant une proximité évolutive avec l'humain. Comparé à d’autres modèles, comme la souris, il permet ainsi de ne pas mettre à mort la mère pour accéder aux œufs. Aucune expérimentation n’est effectuée sur les animaux (embryons précoces uniquement). Par contre, le maintien de certaines lignées mutantes implique leur génotypage, qui nécessite le prélévement de tissu.

Réduction

Le projet nécessite l’utilisation de 7 lignées mutantes (phénotype non dommageable), dont le génotypage implique le prélèvement de l’extrémité de la nageoire caudale. Le nombre d’animaux nécessaires au projet est calculé comme suit : nombre de reproducteurs nécessaires à un instant donné (dépendant de la fréquence d’emploi de la lignée, varie de 5 à 10 couples), multiplié par le nombre de générations nécessaires pour couvrir la durée du projet (un couple restant fertile +/- 18 mois, 3 générations sont nécessaires), divisé par 0.8 (pour prendre en compte les animaux infertiles ou d’enventuels biais de sexe ratio, qui font que certains adultes ne sont pas utilisables). Pour les lignées mutantes, s’ajoute à cela le fait qu’un tiers des animaux élevés sont sauvages (les embryons homozygotes ne se développent pas et laissent donc 1/3 de sauvages et 2/3 d’hétérozygotes). Pour 7 lignées mutantes, cela représente 560 animaux environs. Les autres lignées utilisées sont des lignées transgéniques (phénotype non dommageable) porteuses de rapporteur fluorescents, qui peuvent donc être génotypées par simple observation des larves avant élevage. Ceci réduit le nombre d’animaux élevés, et réduit le nombre de prélèvement nécessaires au génotypage. Enfin, nous testons des méthodes alternatives au prélèvement de l’extrimité de la nageoire sur adulte, mais pour l’heure, elles ne sont pas suffisemment fiables pour être utilisées.

Raffinement

L’unique procédure de ce projet est le prélèvement de l’extrêmité de la nageoire caudale, afin de génotyper les lignées mutantes. Pour réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux : - la surface de nageoire prélevée est limitée à 2 mm2. - une analgésie est mise en place avant le prélévement, par traitement à la Lidocaïne, prolongée si nécessaire après prélévement. - après prélèvement, les animaux doivent être maintenus isolés, le temps que le génotypage soit réalisé. Celui-ci sera effectué le plus rapidement possible, pour limiter la durée de l’isolement. Les animaux isolés sont maintenus à proximité d’autres animaux, assurant un contact visuel. Si le génotypage n'a pas été effectué sous 15 jours, les animaux sont hébergés avec au moins 2 autres animaux d'un fond génétique différent, permettant une identification visuelle simple.

Choix des espèces

Nous utilisons le poisson zèbre pour ses qualités en terme d’accessibilité à l’embryon (développement externe), d’imagerie (embryon translucide autorisant l’imagerie de processus internes sans acte invasif), de génétique (génome séquencé, nombreuses lignées disponibles), et de proximité à l'humain. L’accessibilité et la transparence de l’embryon permettent d’effectuer nos travaux sans les gestes invasifs qui seraient nécessaires sur un modèle mammifère, et de limiter le nombre d’embryons utilisés (embryons suivis sur plusieurs heures au lieu de sacrifier de nombreux embryons). Enfin, il existe une large littérature scientifique utilisant le poisson pour aborder des questions proches des nôtres sur lesquelles nous nous appuyons pour concevoir nos expériences. Le prélèvement de l’extrêmité de la nageoire pour génotypage sera réalisée entre 1 et 6 mois.

5000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à terme. Chaque poisson subit sous anesthésie une biopsie de la nageoire caudale (fin clip) pour prélever son ADN et le génotyper, puis reste isolé jusqu'à quinze jours. Les individus non retenus sont euthanasiés et ceux conservés comme reproducteurs sont gardés jusqu'à dix-huit mois avant d'être tués à leur tour. Le porteur indique que le travail sur le génome ne peut se faire que sur un "organisme entier" et signale que certaines nouvelles lignées peuvent développer des phénotypes dommageables comme une scoliose ou un retard de croissance.

Objectifs

L’élevage et le maintien de lignées sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques qui mènent leurs travaux de recherche sur le poisson zèbre au stade embryonnaire. Pour que les animaux soient des reproducteurs intéressants nous devons les choisir en connaissant leur patrimoine génétique. Pour ce faire nous devons avoir accès à leur ADN. Le prélèvement qui est alors pratiqué est ce que l’on appelle le « fin clip ». Ce geste consiste à faire une biopsie de moins de 3 millimètres de la nageoire caudale des poissons de plus de 3 mois de manière à récupérer l’ADN qui se trouve dans ce tissu. Lors de création de nouvelles lignées ou de nouveaux croisements entre mutants, dont nous ne connaissons pas encore la résultante phénotypique, les poissons peuvent pour certains avoir un phénotype qui serait qualifié de dommageable. L’impact que l’on peut avoir aux vues des maladies ciblées vont être des impacts sur la reproduction : retard de croissance, mort subite ou anomalies au cours du développement, diminution de la fécondité, anomalies physiques (déformations de la colonne de type scoliose). Une évaluation de ces observations sera faite en accord avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal) pour suivre les animaux et éviter toute souffrance. Une évaluation éthique complémentaire sera alors demandée Ne seront prélevés, que les animaux que nous pensons pouvoir élever par la suite sans impact important sur la nage, la capacité à se nourrir et à se reproduire.

Bénéfices attendus

Le prélèvement tissulaire permet d’accéder à de l’ADN en quantité suffisante pour réaliser un génotypage complet ou pour rechercher les séquences génétiques d’intérêt. Ce travail permet de connaître le génome du poisson et de rapprocher ces informations génétiques des signes cliniques, des modifications histologiques et moléculaires étudiés. Ces corrélations vont permettre de mieux appréhender certaines maladies du système nerveux chez l’Homme.

Procédures

Les animaux ont un prélèvement cutané unique au niveau de la nageoire caudale qui dure moins d’une minute par poisson, inférieur à 3 mm réalisé sous anesthésie, cela nécessite une prise en charge de 3 à 5 minutes par poisson avec la surveillance du réveil. Les poissons demeurent ensuite isolés au plus 15 jours dans des bacs cloisonnés au sein du système commun d’hébergement. Exceptionnellement pour les poissons hébergés dans la pièce de quarantaine, si un prélèvement de ce type doit être réalisé, il suivra le même procédé et l‘isolement aura lieu en dehors du système, dans un aquarium plus petit, dont l’eau sera renouvelée tous les 2 jours après le nourrissage pour en préserver les qualités physico-chimiques.

Impact sur les animaux

Les poissons vont être pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Une biopsie cutanée de moins de 3 millimètres va être faite au niveau de la nageoire caudale provoquant un léger traumatisme avant cicatrisation et régénération en 2 semaines. Ils seront maintenus isolés jusqu’à l’obtention des résultats de l’analyse génétique. Cet isolement se fait dans le système pour leur garantir un environnement contrôlé et dure au maximum 15 jours. Si le prélèvement doit avoir lieu en quarantaine, ce qui est très rare, l’isolement se fera en dehors du système avec un changement d’eau tous les 48hrs et au maximum pendant une dizaine de jours. Le risque lié à l’anesthésie est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Si des symptômes en relation avec les manipulations génétiques apparaissaient de manière répétée, nous pourrions avoir l’émergence d’un phénotype dommageable tel que des anomalies au cours du développement (mort prématurée, malformation) ou des signes cliniques visibles une fois le poisson développé (malformations sur la colonne vertébrale (scoliose), des retards de croissance, des absences ou modifications de certaines organes ou fonctions…), ces effets indésirables seront évalués au fur et à mesure des lignées et pourront faire l’objet d’une évaluation éthique complémentaire s’ils semblent s’installer sur une lignée de poisson.

Devenir

Nous ne conserverons que les animaux avec le patrimoine génétique d’intérêt, les autres seront euthanasiés. Ces poissons seront regroupés en fonction de leur génotype et maintenus en tant que reproducteurs pour obtenir œufs et larves d'intérêt. Les animaux seront gardés jusqu'à l'âge de 18 mois, puis euthanasiés.

Remplacement

Le travail sur le génome corrélé à l’expression clinique (symptômes physiques), histologique et moléculaire (analyses des tissus), ne peut se faire que sur un organisme entier. Le poisson zèbre a 70% de son génome qui est commun à l’Homme d’où l’intérêt de pouvoir l’utiliser comme modèle pour la recherche scientifique. Les modifications génétiques sont bien maitrisées dans ce modèle animal et cela permet d’explorer de nouvelles pistes de recherche, et mettre en lumière de meilleures possibilités de traitement pour les maladies qui impliquent ces parties du génome notamment ici les maladies neurologiques.

Réduction

Les poissons génotypés sont les poissons qui sont issus de croisement d’intérêt ou qui ont eu des injections pour modifier leur génome au stade de l’œuf. Nous utilisons un minimum de 10 couples pour maintenir une lignée. Nous entretenons environ 200 lignées. Nous réaliserons ce geste au maximum sur un total de 5000 poissons au cours de ce projet qui doit courir sur 5 ans. En effet le nombre d’œufs par ponte peut être important, mais c’est une espèce qui accuse toujours une perte conséquente d’individus au cours du développement larvaire, et suite aux injections destinées à obtenir les modifications génétiques recherchées. Nous ferons le prélèvement sur les animaux de taille adaptée (corps d’une taille de 2 cm minimum) et qui semblent en apparente bonne santé pour ensuite être destinés à la reproduction. Ces croisements doivent générés des œufs et des larves qui seront inclus dans des recherches sur le développement, le phénotype, le comportement ou encore en imagerie.

Raffinement

L’hébergement est fait dans des aquariums de 3.5L (densité de 20 poissons maximum par aquarium) en groupe constitués à partir des connaissances génétiques et contient un sexe ratio si possible à 50-50. L’eau du système est contrôlée et circule de manière automatisée. Des contrôles indépendants de la qualité de l’eau sont réalisés en plus, régulièrement. Les animaux sont nourris plusieurs fois par jour à la fois avec une nourriture sèche et une nourriture vivante, pour que le comportement de prédation puisse s’accomplir. Les cultures, l’eau et les poissons font l’objet d’un contrôle sanitaire tous les 4 mois. Un cycle lumineux est mis en place 14-10 avec un changement progressif (aube et crépuscule). Un enrichissement visuel est prévu sur les paillasses pour limiter l’éblouissement (sticker de graviers). Lors des mises en accouplement des bacs spéciaux, mimant une plage sont utilisés pour favoriser le fraie et la récupération des œufs. De l’enrichissement social est également disponible à l’animalerie, en élevant des poissons sauvages physiquement différents de manière à pouvoir compléter les effectifs pour éviter les animaux isolés et maintenir les animaux au moins par 3 en conservant la possibilité de les reconnaitre facilement. La biopsie de la nageoire a lieu sur des animaux en apparente bonne santé, ayant atteint un développement (environ 3 mois, taille corporelle de 2 cm) qui limite le risque de l’anesthésie. Les gestes sont réalisés dans le calme et par des personnes formées (tutorat et vérification régulière de la pratique). L’utilisation de l’épuisette se fait avec des mouvements tranquilles et respectueux de l’animal pour limiter le stress. Les conditions environnementales sont adaptées à l’espèce et contrôlées par un système automatique. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Toute anomalie est rapidement signalée, prise en charge et tracée. Si un phénotype dommageable émerge au cours du suivi, il sera évalué, et un avis éthique complémentaire sera demandé.

Choix des espèces

Le zebrafish a une reproduction rapide et efficace qui se déroule à l’extérieur du corps des animaux adultes (ovipares). Les spermatozoïdes du mâle et les ovules de la femelle sont émis de manière concomitante dans le milieu extérieur pour assurer la fécondation qui conduit à la formation des œufs. Ces œufs, puis l’embryon qui s’y développe, sont transparents ce qui permet un accès très facile à ces cellules pour en modifier le génome lors des premiers stades de développement pour obtenir des animaux génétiquement modifiés (mutants, perte ou gain d’ADN). Ce travail va pouvoir être rapproché de ce qui se passe dans le génome humain lors de certaines maladies impliquant la génétique. Ces modifications vont avoir des conséquences moléculaires, cellulaires, histologiques et anatomiques qui vont pouvoir faire progresser les connaissances et aider à l’émergence de nouvelles pistes pour la recherche médicale. Les animaux seront en général prélevés aux alentours de l’âge de 3 mois (exceptionnellement sur des animaux de 2 mois mais ayant atteint une taille suffisante, autrement dit 2cm de long, nageoires non comprises). Cela nous permet d’avoir trié et conservé à un stade précoce, les animaux qui nous semblent en mesure d’assurer la génération d’œufs et de larves pour permettre les recherches scientifiques. Cet âge assure également une gestion plus facile de l’anesthésie par rapport aux stades plus jeunes.

4 260 médakas et cichlidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Ils sont élevés pour fournir des œufs et des animaux dans le cadre de "prestations" à des laboratoires, les femelles voyant leur abdomen gratté pour récolter les œufs, et une partie est soumise à des tests de conditionnement opérant pendant une vingtaine de jours avant une étude neuroanatomique après leur mise à mort. Le porteur veut montrer que ces poissons disposent d'une mémoire de travail et de fonctions cognitives comparables à celles des mammifères et des oiseaux. Il affirme que les comportements observés "ne peuvent être remplacés" et nécessitent une approche sur l'animal vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de maintenir des élevages de médakas et de cichlidés dans le but 1/ de la fourniture d’oeufs et d’animaux dans le cadre de prestations à des laboratoires privés ou publiques, 2/ d’études comportementales. Les fonctions exécutives représentent les capacités cognitives nécessaires pour organiser une séquence d’actions vers un but (comportements dirigés par un but). Cela implique une mémoire de travail, de l’attention et un contrôle inhibiteur (capacité à ne pas être distrait par des stimuli non pertinents), qui sont les composantes de base de tâches telles que la planification, la prise de décision, le raisonnement ou la résolution de problèmes. L’observation comportementale des poissons téléostéens suggère que les fonctions cognitives d’ordre supérieur ne sont pas limitées aux mammifères et aux oiseaux. Certains poissons téléostéens comme les Labres et les Cichlidés présentent des comportements semblables à ceux de l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la pensée logique telle l'inférence transitive (la reconnaissance d'un lien entre deux objets), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier le comportement de cichlidés (Neolamprologus Brichardi, Amatitlania nigrofasciata) et de médaka (Oryzias latipes) lors de taches de conditionnement opérant afin d'évaluer la mémoire de travail.

Bénéfices attendus

Ces tests comportementaux ont déjà donné de bons résultats sur une autre espèce de poisson. L'idée de ce projet est de pouvoir montrer que ces tests sont applicables sur différentes espèces de poissons mais aussi de montrer que les poissons ont une mémoire de travail fonctionnelle. Par la suite, en combinant des approches anatomiques, comportementales et pharmacologiques, il serait possible d’identifier les zones de cerveau impliquées dans les fonctions exécutives chez les poissons.

Procédures

Lors de l'elevage de médaka, la récolte des œufs s’effectue le matin, en grattant l’abdomen des femelles. Nous veillons à ce que le geste soit rapide et que la femelle soit maintenue dans l’eau afin de limiter le stress de l’animal. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux de type conditionnement opérant basé sur un système d'apprentissage par récompense. Il y a aura 4 tâches comportementales différentes mais chaque animal ne sera soumis qu'à une seule de ces tâches. Les tâches comportementales sont répétées pendant 20 jours maximum à raison d'une quinzaine de minutes par jour.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de l’élevage des animaux, aucune nuisance ne devrait être détectée sur les animaux. Si un quelconque effet délétère est observé (mal-être, maladie, blessure), une grille de point limite déterminera la marche à suivre concernant le devenir du poisson (ajout d’enrichissement, isolement, soin, ou euthanasie).

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés à la fin du projet afin de pouvoir procéder à une étude neuroanatomique après les tests comportementaux.

Remplacement

Dans le cas de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Les comportements observés sur les animaux aquatiques sont non prévisibles ou reproductibles. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les études comportementales se font directement sur l’animal vivant et sont réalisées dans des conditions optimales de bien être pour l’animal. De plus les études comportementales peuvent apporter des informations fondamentales en relation avec de grandes questions biologiques.

Réduction

Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via le logiciel Anibio, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires au maintien du cheptel et aux prestations de services. Pour le comportement, nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses et nous privilégierons des tests statistiques non-paramétriques (Mann Whitney U test, test de Kruskal Wallis, test de Wilcoxon). Par ailleurs, lors d’analyses comportementales l’animal pourra être son propre témoin ou encore être utilisé lors de plusieurs procédures expérimentales diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Il est à noter que les animaux pour l’étude du comportement seront issus de l’élevage dédié à la production d'œufs.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Le médaka est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Les cichlidés étant des poissons territoriaux, nous avons mis en place des cachettes sous forme de tuyau pvc afin de réduire les comportements agressifs. Les paramètres de la qualité de l ‘eau seront surveillés, ainsi que le bien être et la santé de nos poissons. Nous n'attendons pas de souffrance lors de nos tests mais dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une euthanasie. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, rétraction des pigments.

Choix des espèces

Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses comportementales, aussi bien pour des comportements « innés » (fonctions motrices et sensorielles) que pour des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage).Ces comportements ont déjà été observé chez plusieurs espèces de cichlidés. De plus la croissance rapide du médaka, son développement externe dans un œuf avec tous les stades de développement directement accessibles et sa facilité de modification génétique en font un modèle de choix. Nos tests de comportement font appel à l'apprentissage ce qui nécessite la maturité du système nerveux ; celle-ci est atteinte à partir de 3 mois chez le médaka ce qui correspond à la maturité sexuelle. Pour avoir des individus de bonne taille, les tests sont donc généralement réalisés sur des individus âgés de six mois à un an chez le médaka. Les cichlidés n'ayant pas la même croissance les tests peuvent être réalisé à partir de 6 mois.