Poissons zèbres
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Réponses des cellules T du poisson zèbre à des lésions d’organes chez des individus jeunes et âgés : promotion de la régénération des tissus
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Soumis à une cryolésion du cœur ou à l'amputation de leurs nageoires, 1 704 poissons zèbres vont subir des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, auxquels s'ajoutent 888 poissons génotypés par prélèvement de quelques millimètres de nageoire caudale, soit 2 592 individus en tout. Tous sont tués pour que leur cœur, leurs nageoires et d'autres tissus soient prélevés. L'objectif déclaré est d'identifier les programmes de cellules T qui stimulent ou freinent la régénération des organes, le poisson zèbre reformant son cœur là où les mammifères produisent une cicatrice définitive. Le porteur limite les effets indésirables aux douze premières heures, tout en décrivant des poissons anxieux ou résignés qui cessent de s'alimenter, et d'autres à la nage erratique qui "meurent généralement en quelques heures" et sont alors tués.
Objectifs
Les mammifères, y compris les humains, sont généralement incapables de régénérer leurs organes, ce qui constitue un obstacle aux nouvelles stratégies thérapeutiques pour plusieurs événements traumatiques et maladies dégénératives (infarctus du myocarde, ostéoporose, fracture osseuse, entre autres). Cette incapacité à se régénérer contribue à une diminution à long terme de la fonction des organes et à une augmentation de la morbidité, et devient particulièrement importante dans les populations âgées. Après un infarctus du myocarde, par exemple, le tissu mort est remplacé en permanence par du tissu cicatriciel, ce qui diminue la fonction cardiaque. D'autres maladies dégénératives, comme l'ostéoporose, qui est de plus en plus répandue dans les populations âgées et qui est associée à des conditions pro-inflammatoires, diminuent également la qualité de vie et constituent un fardeau important pour la santé. Contrairement aux mammifères, le poisson zèbre peut régénérer entièrement ses organes, y compris le cœur et la nageoire, et retrouver leur fonction. Alors que la régénération du cœur implique la formation d'un tissu cicatriciel transitoire qui se résorbe avec la formation de nouveaux muscles, la régénération de la nageoire ne s'accompagne d'aucune formation de tissu cicatriciel.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d'identifier les programmes de cellules T qui stimulent la régénération des organes et ceux qui l'inhibent. Cela permettra d'identifier des stratégies immunomodulatrices pour stimuler la régénération des tissus tout en minimisant les dommages causés aux tissus après une blessure.
Procédures
Un nombre de 1776 animaux seront soumis au génotypage, où quelques millimètres de la nageoire caudale seront prélevés sous anesthésie pour extraire l'ADN génomique et identifier les individus porteurs des mutations souhaitées. Parmi ceux-ci, certains individus (888) seront soumis à une cryoblessure cardiaque pour étudier le processus de régénération et la réponse immunitaire correspondante. L'intervention elle-même dure environ 2 minutes. Le processus de régénération sera suivi pendant les 7 à 14 premiers jours, avec un petit nombre d'animaux (48) suivis jusqu'aux stades de régénération tardive et complète. Le 888 animaux restants (le nombre équivalent d'animaux hétérozygotes) sera seulement génotypé et ne sera pas soumis à la cryoblessure ou à tout autre traitement. Un nombre de 816 animaux seront soumis à une amputation des nageoires. La procédure prend quelques secondes et le processus de régénération sera suivi jusqu'à 14 jours. Les autres interventions légères comprennent l'imagerie en direct (jusqu'à 10 minutes), la coloration des os en direct (15 minutes) et l'incorporation d'EdU par injection (quelques secondes pour la procédure ; 24 heures jusqu'à l'analyse). En résumé, 888 poissons seront soumis à des traitements considérés comme modérés (génotypage uniquement) et 1704 seront soumis à des traitements considérés comme sévères, notamment des cryolésions (888) ou une amputation des nageoires (816).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indesirables chez le poisson concerné : - La cryoblessure pour étudier la régénération cardiaque. Les effets indésirables potentiels surviennent généralement dans les 12 premières heures suivant la blessure. Il s'agit notamment de l'hyperventilation et de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Occasionnellement, un petit nombre d'animaux peut présenter une nage erratique (c'est-à-dire des poussées de nage verticale) immédiatement après l'opération. Ces animaux meurent généralement en quelques heures et sont donc immédiatement euthanasiés lorsque ce comportement est observé.
Devenir
Tous les poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés après la dernière intervention, car nous devons prélever le cœur ou la nageoire caudale (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les cellules et les composants moléculaires (réponse immunitaire et marqueurs de régénération), ce qui nécessite de prélever du tissu pour un traitement ultérieur après l'euthanasie du poisson.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole, nous prévoyons d'étudier la réponse immunitaire et la capacité de régénération, en utilisant une combinaison de plusieurs outils transgéniques. Ces outils génétiques, ainsi que le pouvoir exploratoire du modèle du poisson zèbre, le rendent unique pour ces processus de manière intégrée chez les mêmes individus. En raison de la nature systémique et physiologique de la réponse régénérative, ainsi que de la réponse immunitaire, des modèles plus simples tels que les systèmes in vitro et organoïdes sont incapables de répondre aux questions scientifiques de ce projet.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe et de la durée des protocoles, des groupes de 6 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement).
Choix des espèces
Le poisson zèbre, ou Danio rerio, est génétiquement modifiable, ce qui permet de réaliser des études à grande échelle de même portée plus rapidement et à un coût bien moindre qu'avec les rongeurs. En outre, les approches invasives, un grand nombre d'événements biologiques peuvent être quantifiés par des approches non invasives, y compris l'imagerie en direct. Aujourd'hui, un très grand nombre de lignées transgéniques et mutantes ont été générées et sont à la disposition de la communauté scientifique, apportant des réponses à des questions biomédicales réelles et pertinentes. En tant que laboratoire académique, nous avons facilement accès à un grand nombre de lignées transgéniques (peu coûteuses). Le poisson zèbre est également un modèle pertinent pour l'étude des dysfonctionnements liés à l'âge, et récapitule de manière similaire aux rongeurs les processus physiopathologiques du vieillissement observés chez l'homme.
Le raccourcissement des télomères affecte l’intestin et le comportement du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une partie des poissons zèbres utilisés porte une mutation de la télomérase qui les fait vieillir prématurément : dès six à neuf mois, ils perdent en fertilité et en mobilité, maigrissent et développent infections et cancers. 4 976 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 1 280 d'entre eux relevant du niveau sévère. Ils subissent des gavages, des traitements antibiotiques, des transplantations de microbiote fécal, des injections, des prélèvements sanguins et des tests d'endurance, de fertilité et de cognition, une partie étant suivie jusqu'à la mort. Tous sont tués, avec ou sans prélèvement, pour savoir si l'intestin déclenche le vieillissement du reste du corps.
Objectifs
Le raccourcissement des extrémités des chromosomes, appelées télomères, est lié au vieillissement et favorise l'apparition de maladies liées à l’âge. Ces télomères jouent un rôle essentiel dans la protection de notre matériel génétique. L’enzyme télomérase aide à ralentir leur raccourcissement, mais son action devient moins efficace avec l’âge. Des recherches ont montré que chez la souris, une augmentation temporaire de la télomérase peut allonger la durée de vie sans effets secondaires importants. Cependant, d’autres études indiquent qu’une activation permanente de cette enzyme pourrait favoriser le développement de cancers. Cela montre que la manière dont la télomérase est utilisée est cruciale : une activation ponctuelle semble bénéfique, alors qu’une stimulation continue peut-être risquée. Le vieillissement d’un organe peut aussi affecter l’ensemble du corps, mais ce phénomène reste encore mal compris. Le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier ces mécanismes, car son vieillissement ressemble à celui de l’être humain. Dans notre laboratoire, nous avons développé un modèle de vieillissement accéléré en modifiant la télomérase. Les poissons affectés par cette mutation montrent dès 6 à 9 mois une baisse de fertilité et de mobilité, une perte de poids importante, ainsi qu’un risque accru d’infections et de cancers. Chez les poissons non modifiés, ces signes apparaissent plus tard, vers 18 à 24 mois. L’intestin est l’un des premiers organes touchés par ce vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir si l’intestin possède un rôle central d’initiateur du vieillissement. En repoussant le vieillissement, ce projet permettra ainsi d'approfondir la compréhension du rôle du microbiote et des télomères dans le vieillissement et de tester de nouvelles approches thérapeutiques, en particulier à travers la manipulation du microbiote et des métabolites, pour ralentir le déclin comportemental lié à l’âge.
Procédures
Les poissons-zèbres seront soumis à différentes interventions au cours de l’étude. Certains recevront une modification génétique unique visant à activer ou inactiver le gène tert dans les cellules intestinales. Des analyses ponctuelles seront réalisées sur l’intestin ainsi que sur des organes périphériques comme les testicules, le cerveau, les muscles et le foie. Les animaux participeront également à des tests fonctionnels : l’endurance et la fertilité seront évaluées vers l’âge de six mois, les capacités cognitives à l’âge adulte, et la longévité sera suivie tout au long de la vie. Le microbiote intestinal sera modifié soit par gavage, soit par traitement antibiotique sur quelques jours, soit par transplantation de microbiote fécal ; chaque poisson sera exposé à une ou deux de ces interventions, généralement autour de deux mois d’âge. Certains groupes recevront des molécules anti-inflammatoires, administrées par gavage ou ajoutées dans l’eau, sur des durées variables selon le protocole. Enfin, les animaux pourront être soumis à des manipulations courantes comme des injections, des prélèvements sanguins, des transports ou des tests comportementaux.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues peuvent entraîner différents effets secondaires. Les injections et prélèvements sanguins provoqueront une douleur locale ponctuelle et un inconfort transitoire, parfois accompagnés de stress aigu. Les manipulations répétées, telles que la contention, pourront générer un stress, une agitation ou une détresse comportementale. Le transport et les changements d’environnement risquent d’entraîner une désorientation et une anxiété passagère. Les tests comportementaux peuvent causer de la fatigue et du stress liés à l’exposition à des environnements nouveaux ou stimulants. Enfin, l’administration de substances expérimentales peut provoquer des effets secondaires tels que de la léthargie, une perte d’appétit ou une réduction de l’activité.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort avec ou sans prélèvements.
Remplacement
Les études faites en laboratoire sur des cellules (appelées "in vitro") ont permis de mieux comprendre le vieillissement des cellules. Mais ces modèles ne permettent pas d’étudier comment les différents organes interagissent entre eux dans un corps vivant. Comme nous nous intéressons aux maladies liées à l’âge, qui touchent tout l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un animal vivant pour faire ces recherches. Nous avons donc choisi un poisson comme modèle, car il vieillit de façon similaire à l’humain, notamment à cause du raccourcissement de ses télomères (des structures liées au vieillissement des cellules).
Réduction
Nous utilisons des modèles génétiques spéciaux qui permettent d’avoir, dans une même portée, à la fois les poissons testés et les poissons témoins (non traités). Cela garantit qu’ils ont exactement le même patrimoine génétique, ce qui rend les résultats plus fiables et évite d’avoir besoin de poissons témoins en plus. Cela permet donc de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Après la fin des expériences, plusieurs analyses seront faites sur différents organes d’un même poisson. Cela permet d’obtenir un maximum d’informations sans avoir à utiliser plus d’animaux. Le nombre de poissons nécessaires a été estimé à partir de nos expériences précédentes, et confirmé à l’aide de logiciels statistiques. Ces outils nous aident à calculer le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables dans nos tests scientifiques.
Raffinement
Toutes les expériences pouvant causer une douleur aux poissons seront faites sous une anesthésie générale de courte durée (5 à 10 minutes). Après les expériences, les poissons seront suivis tous les trois jours par les chercheurs, en plus d’un contrôle quotidien effectué par le personnel de l’animalerie. Pour s’assurer du bien-être des poissons, une grille d’observation spécifique à chaque procédure sera utilisée. Elle permet de repérer des signes de souffrance ou de malaise, comme des problèmes de nage, de respiration, d’alimentation, ou des saignements. Si un poisson montre des signes de détresse importants ou atteint un certain niveau de souffrance, il pourra recevoir un traitement antidouleur ou être endormi de façon définitive, pour éviter toute souffrance prolongée. Certains poissons présentent des problèmes de santé liés à leur âge ou à des caractéristiques génétiques. Si ces problèmes apparaissent (comme un arrêt de l’alimentation ou un état affaibli prolongé), cela sera également considéré comme un signal pour mettre fin à leurs souffrances, selon les mêmes procédures.
Choix des espèces
Nous nous intéressons aux effets du vieillissement de l’intestin sur l’ensemble du corps, en particulier sur le risque de développer des maladies comme le cancer, et à leur lien avec la longueur des télomères, des structures situées à l’extrémité des chromosomes. Pour explorer ces mécanismes, nous avons besoin d’un organisme dont le vieillissement reflète celui de l’être humain, notamment en ce qui concerne le raccourcissement des télomères avec l’âge. Le poisson-zèbre est un modèle particulièrement pertinent pour cette recherche. Nos travaux antérieurs ont montré qu’il présente de nombreuses similarités avec l’humain en matière de vieillissement, notamment le développement de cancers liés à l’âge. Contrairement à la souris, qui est pourtant souvent utilisée dans les études sur le vieillissement mais qui ne présente pas de raccourcissement progressif de ses télomères, le poisson-zèbre possède des télomères de longueur comparable à ceux des humains et qui se raccourcissent naturellement avec le temps. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser le poisson-zèbre pour mieux comprendre l’impact des télomères sur le vieillissement. Les manipulations expérimentales seront réalisées uniquement chez les poissons adultes, car c’est à ce stade que nous pouvons étudier les effets du vieillissement. Certaines études nécessiteront le suivi des poissons tout au long de leur vie pour évaluer leur fertilité, leur durée de vie et l’apparition de tumeurs. D’autres examens impliqueront l’analyse de tissus à différents âges clés, notamment à 3, 9 et 18 mois, ce qui nécessitera l’euthanasie d’un certain nombre de poissons à ces moments-là pour effectuer des prélèvements. Les plus jeunes poissons, comme les embryons et les larves, ne seront utilisés que pour produire les lignées adultes nécessaires aux expériences.
Etude des mécanismes des réponses immunitaires spécifiques du poisson-zèbre contre des agents infectieux viraux et bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 640 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont anesthésiés puis injectés, ou plongés deux à quatre heures dans un bain contenant l'agent infectieux, certains subissant ensuite une épreuve virulente destinée à mesurer si le vaccin protège. L'infection peut provoquer une nécrose au point d'injection, une perte d'appétit, une nage erratique et la mort, et les résultats intéressent autant la recherche sur les maladies humaines que les industriels de l'aquaculture, avec une mise sur le marché en perspective. Le porteur formule le tout ainsi : "pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre", il sera nul chez les témoins et sévère chez les infectés.
Objectifs
L’étude des maladies infectieuses repose sur la caractérisation de l’agent pathogène (nature, propriétés de virulence…) et de la réponse de l’animal infecté, par une combinaison d’approches expérimentales menées in vitro en culture cellulaire et in vivo chez l’animal. La complexité des mécanismes engagés nécessite la reproduction expérimentale des maladies étudiées. Cela nous permet d’aborder des études de virulence des agents pathogènes causant les infections. Ces études sont effectuées dans une perspective de comparaison entre les agents émergents qui affectent les élevages et ceux qui causent des maladies chez l’Homme. Nous disposons de multiples modèles d’infections du poisson zèbre par des agents pathogènes de poissons ou de mammifères. Les infections par injection permettent de contrôler finement la dose de pathogène administrée à chaque poisson et constituent donc un modèle d’infection reproductible. Les infections par balnéation restent une alternative importante pour reproduire la voie naturelle d’infection des poissons. Les protocoles engagés peuvent être associés à des vaccins et à des prélèvements de matériel biologique après euthanasie des animaux pour caractérisation de la réponse immunitaire induite par les infections. Les antibiotiques sont le seul moyen de lutte contre les maladies bactériennes quand il n’existe pas de vaccin efficace. Pour limiter leur utilisation et les risques associés, la mise au point de stratégies alternatives de lutte faisant appel à des immunostimulants est une solution possible pour améliorer les performances de l’aquaculture. Les objectifs de ce projet sont donc, en utilisant le poisson zèbre (1) de caractériser les mécanismes des réponses immunitaires des poissons lors d’infections par des virus ou des bactéries, (2) d’évaluer les effets protecteurs des vaccins et de comprendre les réponses immunitaires qu’ils induisent chez ces espèces, et (3) d’évaluer la capacité de nouvelles stratégies d’immunostimulations à augmenter la résistance à une infection expérimentale maîtrisée avec des pathogènes d’intérêt agronomique (Flavobactérie, virus responsable de la septicémie hémorragique virale (SHV), virus de la Nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI), …).
Bénéfices attendus
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - Compréhension des mécanismes de réponses à l’immunisation - Compréhension des mécanismes de la pathogenèse associée aux infections - Validation expérimentale de nouveaux vaccins contre différents virus chez le poisson zèbre - Evaluation des effets immunostimulants et/ou protecteur des différentes conditions pour les industriels de la filière aquacole avec une potentielle mise sur le marché de ces nouvelles stratégies. Ces résultats seront utilisés pour valider les modèles d’étude des maladies infectieuses, des mécanismes de réponses associés, et des stratégies de prévention ou de lutte contre ces maladies. Ces éléments sont essentiels pour le développement du modèle poisson zèbre en infectiologie, qui permet de remplacer en partie les modèles mammifères et qui peut offrir un contexte expérimental particulièrement pertinent. Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les immunisations ou infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une injection est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. L’immunisation des poissons par injection implique une ou deux injections (si rappel nécessaire) effectuées sous anesthésie. Le cas échéant, les prélèvements de mucus sous anesthésie seront effectués une ou deux fois, à un intervalle de temps d’au moins 3 jours. L’anesthésie associée est courte (de l’ordre de la minute) comme pour les injections. L’immunisation des poissons par balnéation implique une séance de 2 à 4 heures éventuellement réalisée de nouveau une seconde fois si rappel nécessaire, l’injection nécessite une anesthésie de 1-2 minutes. Les infections par injection ou par bain correspondent à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène. Dans le cas d’épreuve virulente post immunisation, pour tester l’efficacité d’un vaccin, l’infection correspond à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène.
Impact sur les animaux
Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) est compensé par anesthésie par bain. Pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre, il sera nul chez les contrôles non infectés, très modéré chez les animaux immunisés et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. Le niveau de douleur sera modéré chez les animaux vaccinés/immunostimulés et protégés, même après infection. L’infection peut conduire chez certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons. La compréhension de la pathogenèse liée à l’infection, la quantification des réponses immunitaires à l’échelle de l’organisme entier et en particulier la protection induite par les vaccins/immunostimulants, les migrations des lymphocytes B ou T responsables de la protection et de la mémoire immunitaire, plus généralement la compréhension des interactions hôte-agent infectieux nécessitent de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez le poisson zèbre ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’induction d’une réponse spécifique de l’antigène par les lymphocytes B ou T, ou l’efficacité d’un vaccin/immunostimulant lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
Réduction
Les infections par balnéation ou par injection, et les expériences de vaccination/immunostimulation permettent de comparer plusieurs conditions expérimentales (différents génotypes, différents agents infectieux, différents protocoles d’immunisation/immunostimulation, etc). Les effectifs requis pour la mise en évidence de différences significatives de survie et de réponses entre les conditions dépendent de l’homogénéité des réponses et de la mortalité, et sont calibrés sur la base de notre connaissance de la sensibilité du poisson zèbre à chaque virus, chaque fois que cela est possible. Les groupes peuvent être de 10 à 15 individus, selon les informations disponibles. Les effectifs sont fixés pour l’obtention de résultats statistiquement représentatifs permettant d’apporter des résultats interprétables dans nos études. Des tests statistiques sont utilisés La taille des groupes (10-15 individus) a été fixée pour permettre à la fois d’évaluer des taux de survie ou de protection et de réaliser les échantillonnages pertinents sur un nombre suffisant d’individus. Un effectif minimal de 15 poissons permet de mettre en évidence une protection qui doit assurer 90 à 100% de survie pour une vaccination efficace. Par ailleurs, les groupes de 15 poissons permettent d’évaluer la mortalité induite par un agent pathogène chez des poissons non vaccinés ou stimulés, en utilisant un minimum d’animaux et en gardant des conditions d’effectif standardisées. Cet effectif permet de réaliser des prélèvements en nombre suffisants pour étudier la réponse immunitaire induite par une immunisation, une infection, ou une vaccination/stimulation chez les survivants. Un effectif de 10 à 15 permet en effet, pour un même groupe de poissons, de consacrer 3 à 5 poissons entiers à des expériences d’histologie et 7 à 10 à des prélèvements de tissus pour des études d’expression ; il doit être noté que la taille du poisson zèbre peut imposer pour certains tissus, de réaliser des pools de prélèvements de 2 individus. Des groupes de 10-15 individus permettent donc de travailler dans des conditions reproductibles (même taille de groupe, mêmes conditions expérimentales par exemple, même taille d’aquarium), et correspondent à des effectifs minimums, des groupes plus petits ne permettraient pas de fournir, de manière systématique et standardisée, les échantillons et informations requises pour nos projets de recherche. Ainsi ces effectifs permettent une utilisation optimale des animaux.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation et à l’injection est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères. L’enrichissement mécanique dans ce type d’expérimentation n'est sera pas sans impact sur les résultats (blessure avec voie d’entrée du pathogène, difficulté d’observation des poissons situés dans les caches, développement de biofilm, …). Sous les aquariums, nous positionnerons un poster imitation « substrat ». Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle d’étude important des relations hôte-pathogène. La transparence des premiers stades de développement de cette espèce facilite la mise en œuvre des techniques d’imagerie in vivo. Des outils de manipulations de l’expression des gènes, de nombreux mutants, et la séquence complète du génome de cette espèce concourent aussi à son succès. De nombreux modèles de maladies humaines ont été développés chez le poisson-zèbre, non seulement chez la “larve” ou le jeune alevin, mais aussi aux stades plus tardifs. Le modèle poisson zèbre est aussi un modèle de criblage de drogues. Il est donc important de comprendre les mécanismes et modalités des réponses immunitaires contre des agents infectieux, dans ce modèle. Pour l’étude des réponses immunitaires spécifiques et de la protection vaccinale/immunostimulant, le système immunitaire des poissons doit être mature, et ils sont donc utilisés au stade adulte, à 4-6 mois. L’étude des réponses immunitaires innées et de la pathogenèse sera effectuée à différents stades, chez les juvéniles (3 à 8 semaines) et chez l’adulte (4-6 mois)
Etudes comportementales du poisson zébre en Réalité Virtuelle pour étudier son interaction avec des objets perçus visuellement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Tués parce qu'ils ont dépassé vingt-quatre mois : la plateforme ne conserve aucun poisson zèbre au-delà de cet âge. 400 individus adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, le champ structuré déclarant 200 adoptions et 200 mises à mort. Chacun est prélevé à l'épuisette dans un bac collectif puis isolé quatre-vingt-dix minutes dans un dispositif de réalité virtuelle, où neuf stimuli de dix minutes lui sont présentés sans personne dans la pièce, à raison de seize poissons par jour. Le porteur qualifie toutes les techniques de non invasives et présente la réalité virtuelle comme un moyen de réduire le recours aux procédures plus lourdes, alors que la seule raison de devenir qu'il donne est la mise à mort de tous les poissons passé vingt-quatre mois.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui permettent aux animaux d’adapter leurs réponses comportementales à leur environnement en établissant un lien précis entre leurs mouvements et leurs perceptions sensorielles. L’objectif est d’étudier comment les informations visuelles influencent leurs comportements, en s’appuyant sur nos modèles théoriques récents décrivant le rôle du champ visuel dans le contrôle des actions. Pour tester ces modèles, nous utiliserons la réalité virtuelle, qui offre un cadre expérimental contrôlé permettant de manipuler précisément l’environnement visuel et d’analyser les réactions comportementales face à des objets ou des individus dont les caractéristiques visuelles (formes, couleurs, textures, mouvements) sont modulées. Le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour cette approche en raison de son système visuel bien caractérisé et de la disponibilité de systèmes automatisés permettant d’enregistrer et d’analyser précisément ses déplacements tridimensionnels. Cette espèce est particulièrement adaptée à l’étude des comportements sensorimoteurs en milieu aquatique, et ses réponses comportementales ont déjà été largement explorées dans divers contextes expérimentaux, fournissant ainsi un cadre de référence robuste. En exposant ces animaux à des environnements visuels dynamiques et en analysant leurs interactions avec ces stimuli, nous explorerons comment ils perçoivent et interprètent leur environnement, ce qui nous permettra d’affiner nos modèles et de mieux comprendre les représentations cognitives impliquées. Ce projet s’inscrit aussi dans une démarche comparative : les données obtenues sur le poisson zèbre serviront de base pour des études sur d’autres espèces, notamment les insectes et les humains, permettant ainsi d’évaluer la généralité des principes étudiés et d’identifier des mécanismes communs ou spécifiques aux différentes classes d’organismes. Enfin, cette approche contribuera à valider l’usage de la réalité virtuelle comme un outil d’étude du comportement animal, positionné entre l’expérimentation in vivo et la simulation numérique, ouvrant la voie à de nouvelles méthodologies expérimentales tout en réduisant le recours aux procédures plus invasives. En intégrant ces nouvelles technologies aux sciences comportementales, nous espérons également améliorer la reproductibilité des expériences et affiner les protocoles expérimentaux, ce qui pourrait bénéficier à l’ensemble de la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Le projet contribuera à enrichir les connaissances fondamentales en éthologie, à développer des outils méthodologiques innovants sur la réalité virtuelle et à fournir des données exploitables pour des applications interdisciplinaires, au travers d’une base de données riche et diversifiée sur les réponses comportementales des poissons zèbres.
Procédures
Le poisson zèbre adulte est sélectionné avec une épuisette dans un bac contenant une vingtaine d’individus, puis transféré dans le système de réalité virtuelle. Chaque poisson y passe 90 minutes, exposé à 9 stimuli de 10 minutes chacun. Les stimuli sont programmés par ordinateur, sans présence de l’expérimentateur dans la pièce. L’expérience se déroule en 4 sessions quotidiennes, avec 4 systèmes simultanés, mobilisant 16 poissons par jour. Les individus sont sélectionnés indépendamment de leur âge ou sexe..
Impact sur les animaux
Les poissons seront soumis à un stress léger et transitoire lié à deux manipulations à l’épuisette (transfert entre le bac collectif et le système de réalité virtuelle, puis retour au bac collectif). Ce stress est de courte durée (quelques secondes par manipulation). Durant l’expérience, les poissons seront isolés individuellement dans le système de réalité virtuelle pour une durée maximale de 90 minutes. Cette situation peut générer un stress léger, bien que le poisson zèbre soit une espèce grégaire. Toutefois, le dispositif présente des stimulis visuels mimant d’autres poissons, ce qui limite l’impact de l’isolement.
Devenir
La plateforme expérimentale prévoit de ne conserver que les poissons âgés de moins de 24 mois. Tous les animaux sont donc mis à morts après ce délai. Cette restriction permet de garantir des animaux jeunes, en bonne santé et bien adaptés aux protocoles expérimentaux.
Remplacement
L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle de la perception dans le contrôle du mouvement. Bien que des approches alternatives telles que l’étude de systèmes robotiques, de modèles théoriques, ou de simulations numériques aient été développées, elles ne permettent pas de recueillir des données directes sur les mécanismes biologiques sous-jacents au contrôle du mouvement. Ces méthodes sont néanmoins utilisées en amont pour restreindre et affiner les hypothèses comportementales testées. Nos travaux incluent également l’étude d’autres organismes, comme les plantes, mais les processus perceptifs et les mécanismes de contrôle du mouvement y sont bien moins complexes et riches que chez les animaux. Par ailleurs, des expériences complémentaires sont en cours chez l’humain et l’insecte, ce qui reflète une démarche comparative large. Cependant, les systèmes permettant une analyse fine des réponses comportementales chez l’insecte restent encore à optimiser. L’utilisation d’animaux vivants, en particulier les poissons zèbres, demeure essentielle pour cette étude, car elle permet d’obtenir des données indispensables pour valider les modèles théoriques développés. Cette démarche comparative, incluant plusieurs espèces, est cruciale pour vérifier l’universalité des principes théoriques proposés.
Réduction
Dans une démarche visant à limiter le nombre d’animaux utilisés, nous proposons de ne pas imposer de critères trop stricts concernant l’âge, la taille ou le sexe des poissons zèbres. Cette approche permettra d’élargir les conditions d’inclusion des sujets tout en répondant aux objectifs scientifiques du projet. De plus, les mêmes individus seront utilisés tout au long des expériences, réduisant ainsi le besoin de production de nouveaux animaux. Sur l’ensemble du projet, nous estimons qu’un total de 400 poissons sera nécessaire, soit environ 60 individus par cycle de 21 mois. Cette gestion raisonnée des effectifs reflète notre volonté de minimiser l’impact sur les animaux tout en garantissant la robustesse des données collectées. Enfin, cette méthode de réutilisation et de suivi individuel des animaux permet d’optimiser les observations tout en favorisant une approche respectueuse du bien-être animal.
Raffinement
Toutes les techniques utilisées dans ce projet sont non invasives et visent à minimiser tout stress ou inconfort pour les poissons. L’environnement expérimental est conçu pour être le plus naturel possible, en permettant aux animaux d’interagir avec des stimuli visuels sans contrainte physique. Un suivi comportemental en temps réel sera mis en place afin d’identifier tout signe de mal-être (ex. nage anormale, isolement, agitation excessive). Une grille d’évaluation des points limites spécifique aux poissons zèbres sera appliquée pour déterminer les actions à entreprendre en cas de stress ou de souffrance. Si un poisson présente des signes de détresse persistants malgré des ajustements, il sera retiré de l’étude. En cas de nécessité, une mise à mort sera réalisée selon les recommandations en vigueur, sous la supervision de la Structure chargée du Bien-Être Animal (SBEA).
Choix des espèces
Le choix du poisson zèbre (Danio rerio) pour ce projet repose sur plusieurs critères qui en font un modèle particulièrement adapté : Compatibilité avec le dispositif de réalité virtuelle : Le système de réalité virtuelle utilisé dans ce projet a été développé et optimisé sur plusieurs générations pour permettre un suivi en temps réel des déplacements des poissons et la projection de stimuli tridimensionnels interactifs. Le poisson zèbre, avec sa capacité à se déplacer librement dans les trois dimensions de son environnement, répond parfaitement aux exigences techniques de ce dispositif. Réponse comportementale favorable : Le poisson zèbre réagit de manière robuste et cohérente aux stimuli visuels présentés en réalité virtuelle, ce qui garantit la pertinence des données comportementales collectées. De plus, cette espèce montre une aptitude à s’adapter rapidement aux conditions expérimentales en laboratoire, y compris à l’environnement spécifique de la réalité virtuelle. Modèle biologique bien établi : Le poisson zèbre est une espèce modèle largement utilisée en recherche scientifique, notamment en éthologie, neurobiologie, et biologie du développement. Cette reconnaissance comme modèle standard permet de contextualiser les résultats obtenus dans un cadre scientifique plus large et facilite les comparaisons avec d’autres études. Nous utiliserons des poissons zèbres adultes âgés de 3 à 24 mois. Ce choix repose sur plusieurs considérations. Les poissons zèbres adultes présentent un comportement moteur et cognitif pleinement développé, ce qui est essentiel pour les objectifs de l’étude visant à explorer les réponses comportementales complexes à des environnements visuels tridimensionnels. Travailler avec des larves nécessiterait une production continue et un renouvellement fréquent des poissons, augmentant ainsi le nombre total d’animaux utilisés. En revanche, l’utilisation d’adultes permet de réduire ces besoins, en cohérence avec les principes de réduction des animaux dans les expérimentations scientifiques. Le projet étant exploratoire, il n’est pas nécessaire de restreindre les observations à une tranche d’âge spécifique chez les adultes. Cette approche permet de maximiser les observations et de s’assurer que les résultats obtenus sont généralisables à une large gamme d’individus adultes.
Étude de la résistance à la colonisation dans un modèle d’infection poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
La mort par infection est retenue comme point limite, le porteur indiquant que les signes de souffrance sont mal connus et peu observables au stade larvaire. 42 282 poissons zèbres vont être utilisés, dont 38 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Les larves sont plongées trois ou vingt-quatre heures dans une eau contenant une bactérie pathogène, chacune seule dans deux millilitres d'eau au fond d'un puits, la mort survenant en vingt-quatre à quarante-huit heures quand la flore ne protège pas. Le porteur écrit que la douleur et le stress liés à l'infection ne sont pas quantifiables à ce stade, tout en concluant qu'ils restent de courte durée puisque la mort arrive vite.
Objectifs
La flore microbienne joue de nombreux rôles en santé humaine et contribue notamment à la protection contre l’infection, plus communément appelé l’effet probiotique. Cependant, ces effets bien que décrits restent peu caractérisés du fait de la diversité et complexité de la flore intestinale chez les mammifères et des limites pratiques intrinsèques aux modèles in vivo correspondants (coûts d’hébergement, manipulation...). Dans ce contexte, la larve du poisson zèbre constitue un modèle de choix puisque la flore y est moins complexe, l’observation microscopique non invasive plus aisée, tout en arborant un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables aux mammifères, en faisant ainsi un modèle pertinent pour étudier les interactions hôte-pathogène. L’objectif de ce projet est ici de caractériser les mécanismes moléculaires responsables de la protection conférée par la flore contre un pathogène en utilisant un modèle de colonisation par immersion chez la larve de poisson-zèbre. Pour cela, trois aspects seront étudiés : (i) la réponse de l’hôte face au pathogène ainsi que l’influence d’un microbiote, protecteur ou non, sur celle-ci (ii) le pathogène et ses potentiels facteurs de virulence, et (iii) l’établissement et la dynamique de la flore commensale, les interactions entre les différents membres, la composition minimale permettant la protection et les facteurs moléculaires impliqués.
Bénéfices attendus
La flore joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote-pathogène sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles. Dans ce contexte, notre projet vise à caractériser les facteurs de protection développés par le microbiote et l’influence de l’hôte, et permettra ainsi de mettre en lumière des bactéries probiotiques capables de protéger les poissons-zèbre contre une infection par des pathogènes invasifs. L’étude du rôle protecteur de ces potentiels probiotiques contre des pathogènes de poissons pourrait être ensuite envisagée chez des poissons économiquement importants en aquaculture tels que la truite. Enfin, l’identification de mécanismes moléculaires responsables de l’effet protecteur aboutira, de manière plus générale, à une meilleure compréhension du rôle du microbiote dans la santé de l’hôte.
Procédures
Les larves de poisson-zèbre vigiles seront exposées une fois à un pathogène par balnéation pendant 3 ou 24 heures selon la procédure. Cela pourra entrainer le développement d’une infection, notamment en l’absence d’une flore protectrice. L’infection est probablement associée avec un certain niveau de douleur et/ou stress non quantifiables à ce stade de développement de la larve, qui peut aboutir à la mort de l’animal en 24 à 48 heures.
Impact sur les animaux
Nos expériences consistant à évaluer soit la protection conférée par la flore contre le pathogène soit la capacité des pathogènes sélectionnés à infecter et tuer les larves, la mort des poissons sera alors majoritairement considérée comme point limite. Des signes de souffrance en amont ne sont en fait que très peu listés et /ou adaptés au stade larvaire et à notre procédure d’élevage. Leur niveau d’appétit ou leur taille exacte ne peuvent pas être mesurés dans notre système et à ce stade de développement, et l’absence de réponse au stimulus souvent synonyme de souffrance n’est pas observée de manière systématique avant la mort de l’animal. Le développement de l’infection doit engendrer une douleur et/ou un stress à l’animal que l’on ne peut quantifier mais qui reste de courte durée puisque la mort intervient alors très rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car : (i) une majorité aura été en contact avec le pathogène et ils ne peuvent ainsi pas être réutilisés, ni replacés, ni adoptés. (ii) cela permettra les différentes analyses prévues (à différents temps ou en fin d’expérience)
Remplacement
Le rôle de la flore dans la protection contre l’infection et les interactions de celle-ci avec l’hôte ne peut être étudié que dans un contexte in vivo. Le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et nous utiliserons ici des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est basé essentiellement sur des données de la littérature. L’analyse statistique pour la comparaison de la survie des larves dans de multiples conditions expérimentales au cours du temps s’appuiera sur l’utilisation d’un modèle de survie. Des ajustemenst seront réalisés afin de prendre en compte la multiplicité des tests.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence et comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la protection conférée par la flore contre un pathogène. L’ensemble des procédures consiste ainsi en l’infection des poissons-zèbres en ajoutant l’agent pathogène dans l’eau des larves de poissons et le suivi de la survie en fonction notamment de la composition de la flore reconstituée au préalable. Des mutants du pathogène utilisé seront également testés afin de mettre en lumière les facteurs de virulence impliqués dans le développement de l’infection. Les symptômes chez la larve étant peu connus et non systématiques, la mort de l’animal par l’infection ne peut majoritairement pas être évitée sans interférer avec nos résultats. Certains signes cliniques propres à la pathologie du pathogène donné seront néanmoins recherchés quotidiennement et aboutiront à la mise à mort du poisson par surdose d’anesthésique. Une observation quotidienne des poissons sera ainsi réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de quinze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau.
Choix des espèces
La flore intestinale joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-pathogène ainsi que l’identification du rôle du microbiote sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Le Danio zébré est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement), avec un génome connu et de nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles. De plus, nos procédures impliquent de n’exposer aux bactéries pathogènes invasives que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude. Outre l’obtention de pontes, qui nécessite des poissons-zèbres adultes, mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’exposer aux bactéries pathogènes que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de poissons au stade larvaire de développement se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables à ceux des mammifères.
Étudier le rôle des récepteurs immunitaires dans le développement des cellules souches sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
2 580 poissons zèbres vont être utilisés pour fabriquer six lignées génétiquement modifiées, 430 individus par lignée dont 30 seulement seront gardés au terme de la sélection. Les autres sont tués. Le génotypage passe par la coupe d'un morceau de nageoire, et le porteur envisage des conséquences allant de légères à graves : nage, alimentation ou respiration anormales, saignements, ulcères, inflammations. 840 poissons subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 1 740 un niveau léger. Les 180 poissons gardés en vie ne seront pas relâchés, ils resteront dans l'élevage pour entretenir les lignées.
Objectifs
Notre corps produit les cellules sanguines grâce à un processus appelé hématopoïèse. Tout commence avec des cellules très particulières : les cellules souches sanguines. Comprendre comment ces cellules se développent dès le début de la vie est essentiel pour progresser dans la recherche sur les maladies du sang. Des études ont montré que certains capteurs immunitaires jouent un rôle important dans ce développement. Ces capteurs fonctionnent de la même façon chez le poisson zèbre, la souris… et probablement aussi chez l’être humain. C’est pourquoi nous créons des poissons zèbres dont ces capteurs immunitaires sont modifiés. Cela nous aide à mieux comprendre leur rôle et à avancer dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
En effectuant deux étapes de sélection, ainsi que trois cycles de reproduction, nous serons en mesure de créer six lignées stables de poissons modifiés par des capteurs immunitaires d'ici la fin du projet. Une fois ces lignées de poissons prêtes, nous pourrons poursuivre les expériences pour étudier comment ces capteurs affectent le processus de fabrication des cellules sanguines, sans ajouter d'autres modifications génétiques aux animaux. Nous espérons que cela nous aidera à mieux comprendre comment les cellules sanguines sont fabriquées et comment cela pourrait aider à traiter les maladies du sang.
Procédures
La biopsie sera réalisée avec un temps opératoire de 5 minutes maximum, et le poisson sera placé dans un aquarium isolé pendant un maximum d’une journée afin d’obtenir les résultats du génotypage.
Impact sur les animaux
Lors de la création d'un nouvel animal transgénique ou lors d'une procédure invasive telle que la coupe des nageoires pour le génotypage, nous envisageons toutes les conséquences possibles, de légères à graves, y compris un comportement anormal en matière de natation, d'alimentation ou de respiration, une modification de la morphologie, des saignements, des ulcères ou des inflammations, qui sont des signes de stress.
Devenir
Pour chaque lignée, un total de 430 poissons sera utilisé pour les processus de sélection. Après 2 tours de sélection et 3 générations , seuls 30 poissons seront conservés pour maintenir la stabilité de la lignée, tandis que les autres seront mis à mort. Avec un total de 6 lignes de poissons, nous avons 30 x 6 = 180 poissons qui seront conservés à la fin du projet. Ils seront utilisés pour entretenir la ligne de pêche.
Remplacement
Nous voulons étudier le processus de formation des cellules souches hématopoïétiques au cours du développement embryonnaire. Il n’existe pas de système in vitro approprié pour cette étude intégrative. De plus, le poisson-zèbre s’avère être un très bon modèle vertébré pour étudier le processus d’hématopoïèse
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé sur la base du nombre minimum de poissons transgéniques réussis requis pour l'étude. Pour mener l'expérience avec 6 lignées de poissons transgéniques, au moins 30 poissons transgéniques par lignée doivent être utilisés pour poursuivre l'expérience avec leur progéniture.
Raffinement
Le poisson zèbre aime vivre en groupe. C’est pourquoi nous les gardons par groupes de 10 poissons par litre d’eau, afin qu’ils se sentent en sécurité et moins stressés. Nous prenons soin de leur environnement pour qu’il ressemble à ce qu’ils vivraient dans la nature. Par exemple, la lumière s’allume et s’éteint lentement, comme un lever ou un coucher de soleil. Chaque jour, ils reçoivent une nourriture vivante et équilibrée, pour rester en bonne santé et se comporter naturellement. Des personnes formées contrôlent les poissons tous les jours. Leur état de santé est évalué grâce à un système de notation allant de 0 (poisson en pleine forme) à 3 (problème grave). On observe leur façon de nager, de manger, de respirer, ainsi que tout signe de stress. Ce même système est utilisé pour suivre leur rétablissement après certains soins, comme lorsqu’un petit morceau de nageoire est retiré pour une étude
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal très utile pour étudier comment se forment les cellules du sang. En effet, son corps fabrique ces cellules de la même manière que chez l’être humain. Les gènes et les mécanismes responsables de cette production sont presque identiques. Ce petit poisson peut aussi développer des maladies du sang similaires à celles de l’homme, comme l’anémie ou la leucémie. Cela permet aux scientifiques d’étudier ces maladies plus facilement et de tester de nouveaux traitements.
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Poissons zèbres : 140
Autres poissons : 60
Anciens reproducteurs ou individus écartés parce qu'ils ne répondent pas aux standards commerciaux, les carpes koï utilisées ici étaient de toute façon promises à la mise à mort. 16 xénopes, 140 poissons zèbres et 60 autres poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les xénopes femelles reçoivent une injection d'hormone gonadotropine puis, le lendemain, un massage abdominal de deux minutes pour prélever leurs ovocytes, les poissons zèbres subissent un prélèvement de gamètes et une biopsie de nageoire caudale sous anesthésie, les carpes koï une anesthésie de dix minutes. Les xénopes restent en vie et sont réutilisées d'une année sur l'autre dans la limite de six ponctions par individu, 70 poissons peuvent être adoptés et les autres sont tués, tout cela pour satisfaire l'obligation de formation pratique fixée par l'arrêté du 1er février 2013.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté définit le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procédures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de ces séances, les expérimentateurs maîtriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, mais également les éléments zootechniques fondamentaux acquis seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenus en captivité.
Procédures
Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie. Les carpes koï seront soumises à une anesthésie n’excédant pas 10min.
Impact sur les animaux
La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie par balnéation limitant les sources d’inconfort pour les animaux. Le seul effet indésirable potentiel pourrait apparaître suite à la biopsie de la nageoire caudale. Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, il présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement. Les animaux seront manipulés à l’aide d’une épuisette, pouvant présenter une légère source de stress lors des transferts de bac à bac.
Devenir
Poisson-zèbre et carpe koï : En fin de procédure les animaux seront mis-à-mort ou adopté si leur état de santé le permet. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (Cellules souches pluripotentes induites IPS, organöides, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs ou individus ne présentant pas les standards commerciaux (carpes-koï), dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années, dans la limite de 6 prélèvements d’ovocytes par individu.
Raffinement
Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie, l'application d'un analgésique sera systématique afin de minimiser toute douleur potentielle. Des éléments d'enrichissement environnemental seront installés dans les aquariums / bac de stabulation / sur les paillasses (ex : image de cailloux, tubes, fausses plantes) et de l'enrichissement alimentaire (proies vivantes, nourriture congelée plus appétente) sera proposé.
Choix des espèces
Poisson-zèbre et xénope sont les principales espèces utilisées à des fins scientifiques. Leurs facilités d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font des modèles de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'oeufs, température, etc.) de ces 2 espèces permettent de présenter l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en oeuvre dans les projets de recherche. Les poissons étant un groupe paraphylétique composé d'une immense diversité d’espèces, il est important de pouvoir effectuer les manipulations sur un modèle différent. Cette formation est ouverte à une large communauté scientifique, travaillant sur un éventail d’animaux très varié. La carpe koï, poisson téléostéen d’eau froide, présente des caractéristiques complémentaires au poisson- zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie, elle permettra de mettre en évidence des aspects spécifiques à prendre en considération notamment lors des anesthésies. Xenopes et poissons-zèbre : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures, d'autre part l'induction de pontes par injection d'hormone ne peut s'effectuer que sur des femelles xénopes adultes. Carpe koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés.
Le rôle des granulines dans la régénération des organes du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
936 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués pour prélever leur cœur, leur nageoire ou d'autres tissus, dont 768 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 432 subissent l'amputation au scalpel d'une partie de la nageoire caudale, d'autres une cryolésion du cœur de deux minutes sous anesthésie, et 168 sont écartés après génotypage parce qu'ils ne portent pas la modification recherchée. Le porteur décrit ensuite de l'hyperventilation, une prise alimentaire réduite et des comportements qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation, prostration au fond du bac ou nage exclusive en surface, et prévoit de tuer immédiatement les poissons dont la nage devient erratique. Le bénéfice annoncé se limite à l'identification de stratégies immunomodulatrices capables de stimuler la régénération des organes chez les mammifères, perspective lointaine face aux lésions cardiaques et aux amputations infligées maintenant.
Objectifs
Les mammifères, y compris les humains, sont généralement incapables de régénérer leurs organes, ce qui constitue un obstacle aux nouvelles stratégies thérapeutiques pour plusieurs événements traumatiques et maladies dégénératives (infarctus du myocarde, ostéoporose, fracture osseuse). Cette incapacité à se régénérer contribue à une diminution à long terme de la fonction des organes et à une augmentation de la morbidité, et devient particulièrement importante dans les populations âgées. En particulier, selon l'Organisation Mondiale de la Santé (World Health Organization), les cardiopathies ischémiques telles que l'infarctus du myocarde représentent la première cause de mortalité dans le monde (13% du nombre total de décès dans le monde) et la deuxième cause de morbidité, juste après le COVID-19, dans la dernière évaluation (2021). Après un infarctus du myocarde, par exemple, le tissu mort est remplacé en permanence par du tissu cicatriciel, ce qui diminue la fonction cardiaque. Avec l'allongement de la durée de vie des populations modernes, l'ostéoporose, qui est de plus en plus répandue dans les populations âgées et qui est associée à des conditions pro-inflammatoires, diminuent également la qualité de vie et constituent un fardeau important pour la santé - elle touche une femme sur trois et un homme sur cinq de plus de 50 ans dans le monde (Organisation Mondiale de la Santé). Contrairement aux mammifères, le poisson zèbre peut régénérer entièrement ses organes, y compris le cœur et la nageoire (c'est-à-dire un modèle de régénération osseuse), et retrouver leur fonction. Le moment, l'étendue et le type de réponse immunitaire après une lésion d'organe influencent fortement les résultats de la régénération. En particulier, une vague inflammatoire autolimitée est essentielle pour parvenir à une régénération correcte des organes. Les granulines sont molécules naturellement produites par l'organisme pour aider à contrôler l'inflammation et potentiellement soutenir la réparation des tissus, et jouent un rôle important dans la prolifération cellulaire. De plus, elles sont régulées à la hausse dans les tissus en régénération chez le poisson zèbre. Nous émettons l'hypothèse que les granulines jouent un rôle clé dans le processus de régénération. Ce projet vise à étudier le rôle des granulines pendant la régénération des organes du poisson zèbre (cœur et nageoire). Cette étude sera essentielle pour stimuler la régénération dans des scénarios non régénératifs.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d'étudier les aspects immunitaires particuliers qui stimulent la régénération des organes. Cela permettra d'identifier des stratégies immunomodulatrices pour stimuler la régénération des tissus tout en minimisant les dommages causés aux tissus après une blessure.
Procédures
Pour les études cardiaques, 336 animaux seront soumis au génotypage par prélèvement caudal sous anesthésie. Parmi eux, 50 % (168) n'auront pas le bon génotype et ne subiront donc pas d'autres procédures (ils sont donc classés comme modérés). 168 animaux seront génotypés sur la base de la seule fluorescence. Cela est réalisé en analysant rapidement la fluorescence au niveau des yeux sous un stéréomicroscope, sous anesthésie. Parmi ces derniers, 336 seront soumis à une cryoblessure cardiaque pour étudier le processus de régénération et la réponse immunitaire correspondante. L'intervention elle-même dure environ 2 minutes. Le processus de régénération sera suivi pendant les 7 premiers jours, avec un petit nombre d'animaux (48) suivis jusqu'aux stades de régénération tardive et complète. Pour les études de régénération de la nageoire caudale, certains poissons-zèbres (432) seront soumis à une amputation d'une partie de nageoire, une procédure considérée comme légère. Pour ce faire, les poissons anesthésiés sont placés sur le côté dans une boîte de Pétri et, à l'aide d'un scalpel, une coupe rapide est effectuée sur la nageoire caudale et une petite partie du tissu est enlevée, sans affecter les autres tissus environnants. La procédure prend quelques secondes et le processus de régénération sera suivi jusqu'à 14 jours (nous n'étudions ici que les 7 premiers jours, lorsque le processus de régénération est très actif). Les autres interventions légères comprennent l'imagerie en direct (jusqu'à 10 minutes) du tissu de la nageoire caudale en cours de régénération, et la coloration des os en direct (15 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent : - La cryoblessure (cryoinjury) pour étudier la régénération cardiaque. Les effets indésirables potentiels surviennent généralement dans les 12 premières heures suivant la blessure. Il s'agit notamment de l'hyperventilation et de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Occasionnellement, un petit nombre d'animaux peut présenter une nage erratique (c'est-à-dire des poussées de nage verticale) immédiatement après l'opération. Pour éviter que ces animaux meurent en quelques heures ils sont donc immédiatement euthanasiés lorsque ce comportement est observé. - Amputation de la nageoire caudale. Les effets indésirables potentiels se produisent généralement immédiatement après la blessure et comprennent l'hyperventilation et des changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Celles-ci ne durent généralement que quelques minutes. Aucun fardeau phénotypique n'a été identifié pour les mutants grn1/2, mais on s'attend à ce qu'ils présentent une immunosuppression à un moment donné de leur vie, car ils pourraient être plus sensibles aux infections/maladies. Ce phénomène sera donc surveillé. Les animaux surexprimant le gène grn1 ne devraient avoir des niveaux de grn1 affectés que lors d'un choc thermique, car il s'agit d'une lignée inductible. La surexpression de grn1 peut également conduire à des altérations immunitaires et sera donc également surveillée, en particulier après un choc thermique. Toutes les autres interventions n'entraînent généralement pas de nuisances ou d'effets indésirables en elles-mêmes, à l'exception de l'anesthésie qui leur est associée et qui entraîne généralement une hyperventilation pendant quelques minutes après la récupération.
Devenir
Tous les poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés après la dernière intervention, car nous devons prélever le cœur ou la nageoire caudale (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les cellules et les composants moléculaires (réponse immunitaire et marqueurs de régénération), ce qui nécessite de prélever du tissu pour un traitement ultérieur après l'euthanasie du poisson.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole, nous prévoyons d'étudier la réponse immunitaire et la capacité de régénération, en utilisant une combinaison de plusieurs outils géniques. Ces outils génétiques, ainsi que le pouvoir exploratoire du modèle du poisson zèbre, le rendent unique pour ces processus de manière intégrée chez les mêmes individus (principe de remplacement). En raison de la nature systémique et physiologique de la réponse régénérative, ainsi que de la réponse immunitaire, des modèles plus simples tels que les systèmes in vitro et organoïdes sont incapables de répondre aux questions scientifiques de ce projet.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau : nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement). NB: L’évaluation du poids sera effectuée toutes les deux semaines. Les poissons ne seront pas anesthésiés pour évaluer leur poids. Ils seront placés vigiles dans un bac d’eau sur une balance préalablement tarée.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est génétiquement modifiable, ce qui permet des études à grande échelle rapides et peu coûteuses. De nombreuses lignées transgéniques et mutantes sont disponibles pour répondre à des questions biomédicales clés. Le poisson-zèbre adulte est capable de régénérer ses organes, offrant des perspectives pour favoriser la régénération dans des contextes non régénératifs. Cette capacité diminue avec l’âge, reflétant la réduction de la capacité réparatrice et le dysfonctionnement des organes observés chez les mammifères. Le système immunitaire du poisson-zèbre est conservé chez les mammifères. Ces caractéristiques font du poisson-zèbre un modèle précieux pour l’étude de la régénération des organes et de la réponse immunitaire. Toutes les expériences seront réalisées sur des poissons adultes, car toute la pathophysiologie que nous étudions se développe à l'âge adulte, et le protocole se concentre sur la réponse immunitaire (et la réponse immunitaire adaptative n'est mature que chez les animaux adultes). En outre, l'objectif proposé se concentre sur l'étude de la régénération chez les individus adultes.
Test d’efficacité d’un anti-inflammatoire au cours d’un stress metabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Caractériser la toxicité et l'effet anti-inflammatoire d'une molécule développée par une start-up : 880 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont incubées douze heures avec un marqueur fluorescent des lipides, la veille de leur mise à mort. Le porteur reconnaît qu'une létalité est possible aux doses les plus élevées, et prévoit cent larves par dose pour établir des courbes de survie. Le RNT détaille l'incubation au marqueur, mais ne décrit ni le stress métabolique auquel les larves sont soumises ni les doses testées, alors que ce stress est l'objet même du protocole.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de caracteriser la toxicité, les effets anti-inflammatoires sur la cellule d'un composé synthétique, au cours d'un stress métabolique chez la larve de poisson zèbre. Cette molécule qui est développée par une start-up est connue pour inhiber la réaction inflammatoire via le bloquage d'acteurs intracellualires favorisant la réaction inflammatoire.
Bénéfices attendus
Déterminer l'effet d'une molécule anti-inflammatoire, la fenêtre de dose efficace et non toxique sur des larves de poisson zèbre.
Procédures
Les animaux seront soumis pour chacune des phases, à un traitement avec une molécule fluorescente, appelée BODIPY (Minchin JEN et al 2011) qui a une affinité toute particulière pour les lipides. Nous incuberons les larves, une seule fois, la veille de l'euthanasie, avec du BODIPY- comme déjà decrit dans la litterature (Minchin JEN et al 2011) - pour une durée de 12 heures.
Impact sur les animaux
A haute dose, il est possible que nous observions de la letalité meme si à ce jour, et aux doses testées aucune toxicité n'a été repertoriée in vitro sur les cellules et in vivo chez la souris au cours d'etudes préliminaires chez la souris.
Devenir
Toutes les larves seront euthanasiées pour les 3 procédures.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole nous comptons manipuler 3 lignées génétiquement modifiées de larves de poisson zèbre. Ces lignées combinées à la puissance exploratoire du modèle poisson zèbre font de ce poisson un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée le rôle de l'anti-inflammatoire dans le développement de l'inflammation associée à la progression de l'obésité (principe de remplacement).
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 20 larves par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les tests de toxicité, nous utiliserons 100 larves par dose, pour avoir des courbes de survie robustes et fiables et être sur de nos conclusions (principe de réduction).
Raffinement
Les larves inclues dans les procédures sont hébergées dans un bac d'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés controlés, comme la température ou le pH. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotioncou leur fonction respiratoire (battements cardiaques et mouvements des branchies) (principe de raffinement).
Choix des espèces
Le poisson zèbre ou Brachydanio rerio est génétiquement modifiable et permet des études de grandes envergures de la même portée que celles réalisées chez la souris, tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteûses. De plus, un nombre quasi indéfini d’événements biologiques est quantifiable par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées transgéniques ont été générées et sont disponibles dans la communauté scientifique, et permettent de répondre à de vraies questions biomédicales. En tant que laboratoire académique nous pouvons facilement avoir accès à un très grand nombre de lignées transgéniques (peu onéreuses). Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle trés pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller trés en profondeur pour l'exploration mécanistique. Les animaux seront utilisés au stade larvaire. L'idée est d'abord d'établir une preuve de principe de l'efficacité d'action de l'anti-inflammatoire, chez la larve avant de passer en cas de résultats encourageants à une étude chez le poisson adulte.
Rôle des mécanismes de sélection compétitifs dans la voie asymétrique chez les larves de poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Anesthésiés pour une collecte de sperme ou une biopsie de la nageoire caudale, 950 poissons zèbres adultes servent à produire et identifier les lignées, puis sont tués à la fin de la période de reproduction. Leurs larves, âgées de cinq à sept jours, forment l'essentiel des 11 750 animaux du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 5 400 d'entre elles sont immobilisées dans un gel, parfois avec un agent paralysant, et restent vigiles pendant trente minutes d'imagerie du cerveau, sous des impulsions électriques que le porteur compare à une brève piqûre d'aiguille. 5 400 autres passent jusqu'à trois heures de tests de locomotion, sous variations de lumière et champ électrique. Toutes sont tuées à l'issue, puis fixées pour être observées au microscope.
Objectifs
Une bonne réponse aux situations stressantes est essentielle pour la survie. Face à des menaces, les animaux ont tendance à réagir de manière automatique : ils fuient ou se figent sur place, avant de revenir à une activité normale. Ces comportements ne peuvent pas être réalisés en même temps, mais se produisent successivement. Si ces réactions sont mal adaptées, cela peut entraîner des troubles comme la dépression, l'anxiété ou la dépendance chez l'homme. Bien que les scientifiques aient déjà repéré des zones du cerveau impliquées dans ces comportements, il reste difficile de comprendre précisément pourquoi certaines régions s'activent plutôt que d'autres. Une zone spécifique, appelée le noyau habénulointerpédonculaire (Hb-IPN), est particulièrement importante pour les réponses liées à la peur et au stress. Cette zone fonctionne grâce à deux circuits opposés qui se régulent mutuellement : quand l'un est activé par un stimulus négatif, l'autre est inhibé. En utilisant les larves de poisson zèbre, dont le cerveau est transparent et facile à observer, ce projet cherche à mieux comprendre comment une structure asymétrique du cerveau gère les informations provenant de l'extérieur et influence nos réactions face au stress.
Bénéfices attendus
Les troubles mentaux, comme la dépression, l’anxiété, le syndrome de stress post-traumatique ou la toxicomanie, représentent un problème de santé majeur. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), une personne sur cinq en France sera touchée par l'un de ces troubles au cours de sa vie. Pourtant, on comprend encore mal ce qui déclenche ces troubles et comment ils se développent. En outre, les traitements actuels sont souvent peu efficaces, surtout pour plus de la moitié des patients. Ces troubles mentaux sont liés à un dérèglement des comportements de réaction au stress, qui sont des réponses physiques et émotionnelles aux stimuli extérieurs. Avant de pouvoir trouver de meilleurs traitements, il est essentiel de comprendre comment ces réactions se mettent en place, au niveau biologique et moléculaire. Ce projet se concentre sur une zone particulière du cerveau, appelée la voie Hb-IPN, qui est impliquée dans les réactions à la peur et au stress. Bien qu'elle soit présente chez de nombreuses espèces, cette zone reste peu étudiée. Grâce à des techniques modernes, nous cherchons à comprendre comment les deux circuits principaux de cette voie fonctionnent et interagissent pour moduler les réponses physiques face à des situations stressantes. L’objectif est de mieux comprendre comment cette voie influence les comportements liés au stress, à l’anxiété ou à la dépendance, comme celle à la nicotine. Ce travail pourrait permettre de découvrir de nouvelles cibles pour des médicaments plus efficaces contre ces troubles. La voie Hb-IPN contient des récepteurs qui réagissent à certaines substances chimiques. En étudiant ces récepteurs, nous pourrions identifier de nouveaux composés capables de modifier leur activité. L’utilisation du poisson zèbre pour la recherche de médicaments a déjà montré son efficacité. À long terme, notre projet pourrait contribuer à trouver de nouvelles molécules qui aideraient à soulager les symptômes de troubles mentaux, tels que le stress post-traumatique ou l’anxiété.
Procédures
150 poissons zèbres seront soumis à une seule collecte de sperme par individu de manière non invasive et sous anesthésie pour préserver la lignée. L'ensemble de la procédure ne dépassera pas 3 minutes hors de l'eau. Pour identifier le génotype des 800 poissons adultes issus de la génération de nouvelles lignées, nous réaliserons une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie. La nageoire servira à extraire l'ADN utilisé pour le génotypage. C'est la méthode la moins invasive pour génotyper les poissons. Cette procédure ne dépasse pas 20 secondes par individu et n’est réalisée qu’une fois dans la vie de l’animal. Les procédures suivantes seront réalisées sur des larves âgées de 5 à 7 jours. Afin d'enregistrer l'activité neuronale, nous réaliserons une imagerie calcique de larves transgéniques. Nous mesurerons d'abord l'activité spontanée des larves puis elles seront soumises à des tests pharmacologiques ou à un faible potentiel de champ électrique. Il s'agit d'une approche à haut débit qui réduit le temps de manipulation des poissons : la procédure est limitée à 30 minutes par larve. Les 5400 larves seront vigiles durant l’imagerie calcique. Pour modifier l'activité neuronale dans le cerveau, nous réaliserons des expériences pharmacologiques, soit par une application aiguë (30 min) soit par une application chronique (3 jours). L'expérience pharmacologique sera réalisée lors d'imagerie calcique (aiguë) ou de tests comportementaux (aigus ou chroniques). L'activité locomotrice sera enregistrée lors d'une activité spontanée (pas de stimulus externe), de changements de lumière (présence ou absence de lumière) ou d'applications de potentiels de champ électrique doux (10 minutes de base, application d'un faible potentiel de champ électrique, d’une durée inférieure à 100 millisecondes, 10 fois à 1 minute d'intervalle, 10 minutes de récupération). Ces tests ne dépasseront pas 3 heures. Les 5400 larves utilisées dans cette procédure seront vigiles.
Impact sur les animaux
Nous immobiliserons les larves dans un gel avec ou sans ajout d’un agent paralysant. Il s'agit d'une procédure de routine dans le domaine qui est nécessaire pour réaliser une séance d’'imagerie à l'aide d'un microscope (30 minutes maximum). Nous administrerons un léger champ électrique aux larves immobilisées pour effectuer une imagerie afin d'analyser leur activité́ cérébrale et les mouvements de la queue. Les animaux peuvent ressentir un certain inconfort dû à l’immobilisation. Le champ électrique sera délivré́ pendant une durée inférieure à 100 millisecondes. Les animaux peuvent ressentir une douleur comparable ou inferieure à celle d'une brève piqûre d’aiguille. Concernant les poissons adultes nous devrons les génotyper afin de savoir s’ils ont ou non la mutation désirée. Pour ce faire nous réaliserons sous anesthésie une biopsie de la nageoire caudale. Les animaux peuvent ressentir une douleur inférieure ou égale à celle occasionnée par une brève piqûre d’aiguille au réveil de l’anesthésie qui n’affecte en rien leurs capacités motrices. Ils seront par la suite placés dans des bacs d’hébergement individuel, ce qui peut occasionner un stress si ce mode d’hébergement dure trop longtemps. Le stress disparait aussitôt que les animaux sont remis en groupe d’au moins 2 individus.
Devenir
Les animaux ayant été génotypés et/ou dont le sperme a été prélevé seront euthanasiés à la fin de la période de reproduction. Concernant les larves, elles sont euthanasiées à l’issue des procédures d’imagerie calcique et de comportement. Elles sont alors fixées pour une étude immunohistochimique
Remplacement
L’étude dynamique des processus de la morphogenèse (mise en place du système nerveux, dont la synaptogenèse) est essentielle pour comprendre de nombreuses étapes du développement embryonnaire normal et pathologique. La morphogenèse de tissus et d’organes complexes, comme le système nerveux central, ne peut être reproduite totalement in vitro et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux.
Réduction
Afin d’appliquer le principe de réduction nous limitons le nombre d’animaux au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement fiables et significatifs. Nous utilisons une approche statistique pour déterminer le nombre d'indivudus nécessaire et obtenir des données valides. Par ailleurs, dès que cela est possible, nous partageons les poissons entre plusieurs projets et nous mutualisons toutes les lignées de poissons sauvages et certaines lignées transgéniques entre les différentes équipes utilisatrices. De même, lorsqu’il y a suffisamment d’œufs fécondés, nous partageons les pontes entre plusieurs expérimentateurs. Dans le but de réduire le nombre d’animaux présents dans l’animalerie, d’éviter de renouveler des lignées transitoirement inutilisées et de ne pas procéder à des expériences de génotypage, nous avons mis en place la congélation de sperme afin de conserver ces lignées. En tenant compte de tous ces paramètres nous estimons que nous aurons besoin de 11750 animaux âgés de plus de 5 jours afin de mener à bien ce projet.
Raffinement
Nous surveillons les conditions d’hébergement des animaux et leur état de santé (établissement de points limites). Les conditions salines (conductivité-pH) et de température de l’eau sont contrôlées en permanence et quotidiennement reportées sur un registre. En cas d’anomalie, les conditions sont modifiées pour revenir à la normale. Les teneurs en ammoniaque, nitrates et nitrites sont vérifiées hebdomadairement. Les poissons zèbres sont élevés en groupe dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure). Les poissons zèbres sont maintenus à une température de 26 degrés Celsius, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères (nourriture vivante), ce qui leur permet de chasser. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les utilisateurs. Des points limites ont été établis : maigreur, nage lente ou anormale, perte d’appétit. Une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout changement physique ou comportemental et de lui attribuer un score a été établie. Un animal est surveillé plus attentivement que d’habitude lorsque le score est de 1. Un score de 2 requiert, en plus d’une surveillance attentive, un hébergement individuel et des soins en cas de besoin sur une semaine puis réévaluation de l’état de l’animal. Un score de 3 est le point limite pour lequel il faut euthanasier l’animal. Par ailleurs dès que les procédures le permettent, nous anesthésions les animaux.
Choix des espèces
Le poisson zèbre (Danio rerio, zebrafish) est un modèle vertébré reconnu pour l'étude du développement embryonnaire. Il se développe rapidement et à l'extérieur de la mère, de sorte qu'il n'est pas nécessaire d'euthanasier la mère pour étudier son développement. Il pond un grand nombre d'œufs en même temps (jusqu'à 200 œufs) ce qui permet de réaliser de nombreuses expériences à la fois. Les embryons sont transparents permettant une visualisation aisée de l'activité neuronale et du développement cellulaire par l'expression de molécules fluorescentes spécifiques. Les embryons sont faciles à élever car ils se développent dans un incubateur à 28 degrés Celsius. Pour de nombreux projets, nous travaillons sur des embryons de moins de 5 jours, qui n'entrent pas dans le cadre de la réglementation sur l'expérimentation animale. Nous utilisons des embryons jusqu'à 7 jours, afin d'étudier la formation des synapses et l'activité neuronale dans une zone peu étudiée du cerveau appelée le système habénulo-interpédonculaire. Cette zone du cerveau est extrêmement difficile à étudier chez les rongeurs car elle est située en profondeur, alors que chez le poisson zèbre, elle se trouve à la surface même du cerveau.
Evaluation des effets chroniques de substances chimiques sur le poisson zèbre (Danio rerio)
- Protection de l’environnement
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Exposés en continu à une substance chimique depuis l'œuf jusqu'à trente jours après l'éclosion, 19 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 3 200 un niveau léger. Le porteur liste parmi les effets attendus des convulsions, une tétanie, une ventilation irrégulière, une exophtalmie, un œdème et une hémorragie. Aucune manipulation n'est pratiquée pendant l'essai, et tous les poissons sont tués à la fin pour être mesurés et pesés, ces données conditionnant la validité du test. Cet essai ne répond à aucune question de recherche, il est déclenché par le règlement REACH dès qu'une substance est produite ou importée à partir de 100 tonnes.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de répondre à une exigence gouvernementale dans le cadre de la réglementation REACH (règlement européen visant à sécuriser la fabrication et l’utilisation des substances chimiques dans l’industrie européenne). Depuis la mise en place de cette réglementation les industriels sont soumis à l’obligation, pour chaque substance produite ou importée, de faire réaliser des études physico-chimiques, toxicologiques et écotoxicologiques. L’essai de toxicité chronique sur le poisson d'eau douce intervient obligatoirement dans le cas où la substance détenue est fabriquée ou importée en quantité égale ou supérieure à 100 tonnes. Ce projet vise à déterminer les effets toxiques d’un produit chimique à l’essai, sur les stades de développement d’une espèce étudiée, ici le poisson zèbre.
Bénéfices attendus
Le projet, vise à fournir des données relatives à l’utilisation de la substance chimique. Les données de toxicité collectées à l’issu des essais réalisés permettront, par exemple, l’enrichissement de la fiche de données de sécurité propre à la substance, en avertissant des risques environnementaux associés à son utilisation.
Procédures
Au cours du projet de toxicité chronique, les poissons seront en contact constant avec une substance chimique à l'essai associée à leur milieu de vie, de l’œuf après la ponte jusqu'au stade juvénile (J30 post éclosion). Aucune manipulation ni prélèvement ne sera effectuée sur les poissons durant le test.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les poissons sont : - hypo ou hyperactivité, pendant 1 minute d’intensité modérée - nage en tire-bouchon, pendant 1 minute d’intensité modérée - répartition anormale à la surface ou dans le fond de l’aquarium, pendant 1 minute d’intensité modérée - sous ou sur réaction à un stimulus, pendant 15 secondes d’intensité modérée - diminution ou augmentation de la nage en groupe ou en banc, pendant 1 minute d’intensité modérée - agressivité, perte de contrôle de la flottabilité, pendant 1 minute d’intensité modérée - convulsions, pendant 15 secondes d’intensité sévère - tétanie, pendant 15 secondes d’intensité sévère - hypo ou hyperventilation, pendant 15 secondes d’intensité sévère - ventilation irrégulière, pendant 1 minute d’intensité sévère - exophtalmie, pendant 5 secondes d’intensité sévère - œdème, pendant 5 secondes d’intensité sévère - hémorragie, pendant 5 secondes d’intensité sévère.
Devenir
L'ensemble des poissons en fin d'essai réglementaire seront mis à mort. Des mesures de taille et poids humide de tous les poissons doivent être réalisées en fin d'essai, ces dernières faisant partie intégrante de l'exploitation des résultats ainsi que de la validité de l'essai.
Remplacement
Dans notre laboratoire nous réalisons des analyses d’écotoxicologie sur des modèles invertébrés (daphnies) ou encore des modèles de plantes aquatiques (algues). Le ratio actuel des organismes utilisés pour les essais d’écotoxicologie est le suivant : 49% sur daphnie, 35% sur algues, 16% sur poissons (dont 5% de tests sur œufs de poissons zèbres). L’essai de toxicité chronique sur poissons zèbre intervient uniquement lorsque les autorités compétentes réglementaires demandent la réalisation d’essais de toxicité chronique sur espèce aquatique.
Réduction
Le nombre minimal de poissons-zèbres utilisé pour les essais de toxicité chronique est imposé par un texte règlementaire. Ce nombre d’individus a été calculé afin d’assurer la fiabilité des analyses statistiques réalisées à l’issu de l’essai mais si deux essais chroniques sont lancés en parallèle sur deux substances différentes, les groupes témoins seront mutualisés pour les études afin de réduire le nombre d’individus utilisés.
Raffinement
Les conditions environnementales de l’essai chronique sont pensées et appliquées afin de limiter le stress chez les poissons zèbres sollicités pour l’essai. En raison d’interférences possibles avec la substance testée les cuves d’essai ne sont pas enrichies directement ; cependant le bac d’hébergement dans lequel elles reposent est tapissé avec des images apaisantes de fonds marins. À partir de l’étape de répartition des œufs dans les cuves d’essai, et jusqu’à la dernière observation des poissons avant mise à mort, les poissons font l’objet d’une surveillance journalière accrue par les opérateurs. Si un alevin présente des anomalies corporelles avérées telle que des malformations ou encore un état de souffrance, il est retiré de l’essai pour être aussitôt mis à mort. Il sera alors noté pour mort dans le registre de l’essai. Si, au cours d’une des observations quotidiennes, un alevin est noté mort, alors ce dernier est aussitôt retiré de la cuve d’essai. Aucun prélèvements biologiques, analyses ou autres ne sont réalisés sur cet individu.
Choix des espèces
Le poisson zèbre fait partie des poissons d’eau douce recommandé par un texte règlementaire. C’est une espèce très largement documentée : sa facilité de maintien en laboratoire et sa grande sensibilité aux polluants fait de cette espèce modèle un organisme d’intérêt dans le domaine de l’écotoxicologie. A l'issue du processus de ponte, les œufs fraîchement fécondés sont sélectionnés et triés à l’aide d’une loupe binoculaire. Ils sont ensuite répartis aléatoirement dans les cuves d’essais au stade de division 16 – 32 cellules. Les essais sont menés jusqu’à 31 jours post éclosion. L’utilisation de la procédure expérimentale à l’origine de cette demande d’autorisation de projet intervient dans l’unique cas ou la règlementation l’impose. En effet, le laboratoire privilégie autant que possible les essais d’écotoxicologie sur organismes invertébrés et sur algues d’eau douce. A ce jour, la règlementation ne donne pas la possibilité d’alternative au test chronique sur poisson d’eau douce, et cet essai reste, dans certains cas (production/importation supérieure à 1000 tonnes) l’unique procédure expérimentale de référence.